專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提取蛋清中溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提取蛋清中溶菌酶的方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶(lysozyme )又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶(muramidase )或N-乙酰胞壁質(zhì)聚 糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase )，是一種能水解致病菌中#占 多糖的堿性酶。主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡 糖之間的(3-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性翻多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致 細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白 直接結(jié)合，與DNA、 RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽， -使病毒失活。因此， 該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
該酶廣泛存在于人體多種組織中，鳥(niǎo)類(lèi)和家禽的蛋清、哺乳動(dòng)物的淚、 唾液、血漿、尿、乳汁等體液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最 為豐富。從雞蛋清中提取分離的溶菌酶是由18種129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成 的單一肽鏈。它富含堿性氨基酸，有4對(duì)二硫鍵維持酶構(gòu)型，是一種堿性 蛋白質(zhì)，其N(xiāo)端為賴(lài)氨酸，C端為亮氨酸?？煞纸馊鼙谖⑶蚓?、巨大芽孢 桿菌、黃色八疊球菌等革蘭陽(yáng)性菌。
現(xiàn)有提取雞蛋蛋清中溶菌酶主要采用直接結(jié)晶、離子交換吸附、親和 色語(yǔ)、反膠團(tuán)萃取、親和膜色語(yǔ)和擴(kuò)張床吸附等技術(shù)手段，上述技術(shù)手段 中由于提取效率的限制，大多數(shù)還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，沒(méi)有大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng) 用；直接結(jié)晶和離子交換是提取雞蛋蛋清中溶菌酶最常用的兩種方法，已 有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道，但是提取的溶菌酶活力及其純度不能滿(mǎn)足醫(yī) 藥等領(lǐng)域的使用要求，而且提取成本較高。
中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200410060632.3公開(kāi)了 一種雞蛋提取溶菌酶的方法，該 方法采用離子交換樹(shù)脂分離溶菌酶，其吸附過(guò)程是將樹(shù)脂置入直接蛋清 中，該方法靜態(tài)吸附蛋清中的溶菌酶，離子交換容量小，導(dǎo)致整個(gè)提取效 率很低，而且提取的溶菌酶純度也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了 一種提取蛋清中溶菌酶的方法，該方法解決了現(xiàn)有離子 交換吸附法提^L溶菌酶效率不高，提取得到的溶菌酶活性不高的問(wèn)題。
一種提取蛋清中溶菌酶的方法，包括以下步驟
(1) 取蛋清，均質(zhì)后加水稀釋?zhuān)鬟^(guò)裝填有Na型樹(shù)脂的吸附柱，所 述的Na型樹(shù)脂由大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂轉(zhuǎn)換而成；
現(xiàn)有的蛋清吸附法均是靜態(tài)吸附，其主要原因是蛋清粘度很大，給動(dòng) 態(tài)吸附帶來(lái)了困難，但是靜態(tài)吸附時(shí)樹(shù)脂的交換容量較小，影響提取效率， 為了進(jìn)一步減小蛋清粘度，在流過(guò)吸附柱之間，可以將蛋清在均質(zhì)機(jī)中進(jìn) 行均質(zhì)，然后加水稀釋?zhuān)|(zhì)壓力不宜過(guò)大，防止溶菌酶變性而失活，優(yōu) 選設(shè)置為3 6MPa;加水量越多，蛋清的粘度會(huì)越小，但同時(shí)增加了過(guò)柱 時(shí)間，優(yōu)選添加量為蛋清體積的5 % ~ 15 % 。
因?yàn)閯傎?gòu)買(mǎi)的樹(shù)脂或者使用過(guò)的樹(shù)脂含有雜菌和其余雜質(zhì)，在轉(zhuǎn)換之 前需要進(jìn)行清洗、滅菌和除雜等預(yù)處理，其預(yù)處理過(guò)程一般4喿作如下
a. 先用清水沖洗樹(shù)脂至無(wú)色，除去沒(méi)有吸附在樹(shù)脂上易分離的雜質(zhì)， 然后浸入酒精2-4小時(shí)，取出后用水沖洗除去殘留酒精。
b. 為了便于操作，可以將樹(shù)脂裝如吸附柱，然后用重量百分比為6% 的氫氧化鈉流過(guò)吸附柱，再用清水流過(guò)吸附柱，直至pH為8 9,除去樹(shù) 脂中的有機(jī)雜質(zhì)。
c. 用重量百分比為3%的鹽酸流過(guò)吸附柱，再用清水流過(guò)吸附柱，直 至pH為6 7，除去樹(shù)脂中的無(wú)機(jī)雜質(zhì)，預(yù)處理完成。
上述預(yù)處理完成的樹(shù)脂還是H型樹(shù)脂，再用重量百分比為6%的氫氧 化鈉流過(guò)吸附柱，即可轉(zhuǎn)化成Na型樹(shù)脂。上述樹(shù)脂應(yīng)選用大孔弱酸性陽(yáng) 離子交換樹(shù)脂，優(yōu)選為D152型。蛋清流過(guò)樹(shù)脂層的流速可以任意，優(yōu)選 4 ~ 6L/mirrm2,表示每分鐘流過(guò)每橫截面的蛋清體積為4 ~ 6L。
(2) 用水反向沖洗吸附柱內(nèi)的Na型樹(shù)脂，除去殘留的蛋清；
(3 )用重量百分比為0.5 ~ 0.8%的NaCl溶液沖洗吸附柱內(nèi)的Na型 樹(shù)脂，除去雜蛋白；所述的雜蛋白主要是除溶菌酶之外的其余蛋白質(zhì)。
(4)用重量百分比為2 ~ 4 %的NaCl溶液洗脫Na型樹(shù)脂，洗脫后將 NaCl溶液的濃度以重量百分比為0.5 ~ 1 %的梯度遞增，繼續(xù)洗脫Na型樹(shù) 脂2~8次，合并所有的洗脫液；因?yàn)殡x子交換吸附存在動(dòng)態(tài)吸附平衡，采用梯度洗脫可以收集盡量多
的溶菌酶；洗脫液的流速和體積影響洗脫效率，流速小洗脫量多，但是操 作時(shí)間長(zhǎng)，流速大洗脫量小，洗脫次數(shù)會(huì)增加；本發(fā)明洗脫液流速優(yōu)選8~ 10 L/mhvm2,每次洗脫所用的NaCl溶液體積優(yōu)選蛋清體積的1 ~ 2倍。
(5)將洗脫液通過(guò)生物膜分離濃縮至固形物含量達(dá)4~8%，噴霧干 燥后制得溶菌酶成品。
生物膜采用現(xiàn)有常規(guī)的人工膜，如聚醚砜膜、改性聚砜膜以及聚偏氟 乙烯膜等，生物膜孔徑優(yōu)選1 ~2nm,通過(guò)生物膜分離可以除去NaCl和大 部分的水，達(dá)到濃縮的目的；為了便于噴霧干燥，本發(fā)明將固形物含量控 制在4~8%。
噴霧干燥的原理是將原料液物化后與熱空氣接觸，從而將水分瞬間蒸 發(fā)，得到固形物。因?yàn)槿芫甘且环N蛋白質(zhì)，對(duì)溫度比較敏感，現(xiàn)有的噴 霧干燥其熱空氣溫度為180°C，濕度大于60%，制得的溶菌酶活性不高， 本發(fā)明選擇熱空氣溫度為100~105°C,濕度低于15%,噴霧干燥效果差 不多，但是溶菌酶活性較高。
本發(fā)明方法通過(guò)離子交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附蛋清，增大了樹(shù)脂的交換容 量，提高了提取效率，提取得到溶菌酶活性和純度較高。本發(fā)明方法通過(guò) 梯度洗脫溶菌酶，洗脫效率高。


圖1為本發(fā)明方法工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
樹(shù)脂預(yù)處理
(1) 用100升純凈水沖洗D152型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂至排水無(wú)色，放掉 水后，再用酒精浸泡3小時(shí)，放掉酒精用水沖洗除去殘留酒精，樹(shù)脂為H 型。
(2) 將清洗好的樹(shù)脂裝入吸附柱(直徑40cm,吸附柱總長(zhǎng)2.5m,樹(shù) 脂裝填高度1.5m),用重量濃度6%的氫氧化鈉溶液400升經(jīng)離心泵以 5L/min的流速動(dòng)態(tài)流過(guò)吸附柱內(nèi)的樹(shù)脂層，除去樹(shù)脂中的有機(jī)雜質(zhì)，再用 純凈水動(dòng)態(tài)清洗至PH值為8.5,此時(shí)樹(shù)脂為Na型。(3 )用重量百分比3%的鹽酸500升經(jīng)離心泵以5L/min的流速動(dòng)態(tài) 流過(guò)吸附柱內(nèi)的樹(shù)脂層，除去樹(shù)脂雖的無(wú)機(jī)雜質(zhì)，再用純水動(dòng)態(tài)清洗至流 出液呈PH值為6.5，此時(shí)樹(shù)脂為H型。
(4 )在用重量百分比為6%的氫氧化鈉溶液500升以5L/min的流速 流過(guò)吸附柱內(nèi)的樹(shù)脂層，將H型樹(shù)脂轉(zhuǎn)化為Na型樹(shù)脂。
實(shí)施例1
(1) 取1000kg新鮮雞蛋，清洗、殺菌、噴淋后用打蛋器將蛋清和蛋 黃分離，可得600升蛋清。
(2) 蛋清用均質(zhì)機(jī)在3Mpa的壓力下均質(zhì)一遍，加入占蛋清總體積 15%的水，對(duì)蛋清進(jìn)行稀釋。
(3) 用離心泵將稀釋后的蛋清經(jīng)以3L/min的流速流過(guò)吸附柱內(nèi)的 Na樹(shù)脂。
(4) 吸附完畢為用清水反向沖洗吸附柱內(nèi)的Na樹(shù)脂，除去殘留的蛋(5 )然后再用重量百分濃度為0.5 %的NaCl溶液沖洗吸附柱內(nèi)的Na 樹(shù)脂，除去雜質(zhì)蛋白。
(6) 最后用600L重量百分濃度為2 %的NaCl溶液以流速4L/min對(duì) 吸附柱內(nèi)的Na樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，接著將NaCl溶液的濃度以1 %的梯度遞增繼續(xù)對(duì)Na樹(shù)脂進(jìn)行洗脫4次，最后一次NaCl溶液的重量百 分比濃度為6%。
(7) 合并所有的洗脫液，通過(guò)聚偏氟乙烯膜(孔徑lnm)分離，將 洗脫液濃縮至固形物含量為4%，最后送入噴霧干燥塔干燥，制得溶菌酶 成品。其中噴霧干燥塔內(nèi)熱空氣的溫度105。C,濕度為10%。
上述溶菌酶成品經(jīng)分光光度法檢測(cè)，其活性為19500國(guó)際單位，含氮 量為15.3%。
實(shí)施例2
(1) 取1000kg新鮮雞蛋，清洗、殺菌、噴淋后用打蛋器將蛋清和蛋 黃分離，可得600升蛋清。
(2) 蛋清用均質(zhì)機(jī)在6Mpa的壓力下均質(zhì)一遍，加入占蛋清總體積5%的水，對(duì)蛋清進(jìn)行稀釋。
(3)用離心泵將稀釋后的蛋清經(jīng)以2L/min的流速流過(guò)吸附柱內(nèi)的 Na樹(shù)脂。
(4 )吸附完畢為用以清水反向沖洗吸附柱內(nèi)的Na樹(shù)脂，除去殘留的蛋清。
(5 )然后再用重量百分濃度為0.8 %的NaCl溶液沖洗吸附柱內(nèi)的Na 樹(shù)脂，除去雜質(zhì)蛋白。
(6 )最后用600L重量百分濃度為4 %的NaCl溶液以流速5L/min對(duì) 吸附柱內(nèi)的Na樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，接著將NaCl溶液的濃度以 0.8 %的梯度遞增繼續(xù)對(duì)Na樹(shù)脂進(jìn)行洗脫5次，最后一次NaCl溶液的重 量百分比濃度為8%。
(7)合并所有的洗脫液，通過(guò)聚偏氟乙烯膜(孔徑2nm)分離，將 洗脫液濃縮至固形物含量為8%,最后送入噴霧干燥塔干燥，制得溶菌酶 成品。其中噴霧干燥塔內(nèi)熱空氣的溫度100°C,濕度為8%。
上述溶菌酶成品經(jīng)分光光度法檢測(cè)，其活性為21000國(guó)際單位，含 氮量為15.7%。
權(quán)利要求
1、一種提取蛋清中溶菌酶的方法，包括以下步驟(1)取蛋清，均質(zhì)后加水稀釋?zhuān)鬟^(guò)裝填有Na型樹(shù)脂的吸附柱，所述的Na型樹(shù)脂由大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂轉(zhuǎn)換而成；(2)用水反向沖洗吸附柱內(nèi)的Na型樹(shù)脂，除去殘留的蛋清；(3)用重量百分比為0.5～0.8％的NaCl溶液沖洗除去殘留蛋清的Na型樹(shù)脂，除去雜蛋白；(4)用重量百分比為2～4％的NaCl溶液洗脫除去雜蛋白的Na型樹(shù)脂，洗脫后將NaCl溶液的濃度以重量百分比為0.5～1％的梯度遞增，繼續(xù)洗脫Na型樹(shù)脂2～8次，合并所有的洗脫液；(5)將洗脫液通過(guò)生物膜分離濃縮至固形物含量達(dá)4～8％，噴霧干燥后制得溶菌酶成品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔弱酸性陽(yáng) 離子交換樹(shù)脂為D152型。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(l)中所述的均 質(zhì)壓力為3 6MPa,加入的水與蛋清的體積比為0.5: 1.5~10。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的稀 釋后的蛋清流過(guò)吸附柱的流速為4 ~ 6L/mirvm2。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中NaCl溶 液的洗脫速度為8 ~ 10 L/mirvm2，每次洗脫所用的NaCl溶液與蛋清的體 積比為1 ~2。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中所述的生 物膜孔徑大小為1 ~2納米。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中噴霧干燥 所使用的熱空氣溫度為100~105°C，濕度低于15%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提取蛋清中溶菌酶的方法，包括以下步驟(1)取蛋清，均質(zhì)后加水稀釋?zhuān)鬟^(guò)裝填有Na型樹(shù)脂的吸附柱，所述的Na型樹(shù)脂由大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂轉(zhuǎn)換而成；(2)用水反向沖洗吸附柱內(nèi)的Na型樹(shù)脂，除去殘留的蛋清；(3)用NaCl溶液沖洗吸附柱內(nèi)的Na型樹(shù)脂，除去雜蛋白；(4)用NaCl溶液梯度洗脫Na型樹(shù)脂，合并所有的洗脫液；(5)將洗脫液通過(guò)生物膜分離濃縮、噴霧干燥后制得溶菌酶成品。本發(fā)明方法通過(guò)離子交換樹(shù)脂吸附蛋清，增大了樹(shù)脂的交換容量，提高了提取效率，提取得到溶菌酶活性和純度較高。
文檔編號(hào)C12N9/36GK101580824SQ20091010012
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者徐克成 申請(qǐng)人:浙江省長(zhǎng)興艾格生物制品有限公司