專利名稱：一種用于固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化技術(shù)。
背景技術(shù)：
釀醋工業(yè)是我國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，2009年我國食醋產(chǎn)量達(dá)400萬噸，居世界首位。食醋的釀造方法可分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩大類。我國的食醋大多采用傳統(tǒng)“固態(tài)開放式多菌種混合發(fā)酵釀醋工藝”，即醋酸發(fā)酵時物料呈固態(tài)的釀醋工藝。該方法釀制的食醋不僅具有酸味，還具有獨(dú)特的風(fēng)味和保健功能。食醋發(fā)酵過程中，醋酸等風(fēng)味物質(zhì)以及川芎嗪等功能性物質(zhì)的生成是一個十分復(fù)雜的生化和物化反應(yīng)過程，其中主要以微生物的代謝作用為主。傳統(tǒng)的食醋固態(tài)發(fā)酵工藝包括淀粉質(zhì)原料的酒精發(fā)酵、酒精醪的固態(tài)好氧醋酸發(fā)酵和厭氧封醅陳釀等主要步驟，其中好氧醋酸發(fā)酵是食醋發(fā)酵的關(guān)鍵步驟，所用的發(fā)酵劑主要為前一批次發(fā)酵成熟的醋醅，發(fā)酵過程中不接種純培養(yǎng)醋酸菌，因而食醋發(fā)酵微生物的主要來源是接種用醋醅中的微生物菌群，包括各種醋酸菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等，同時也受到生產(chǎn)原料、車間環(huán)境微生物的影響。迄今為止，包括我國眾多的傳統(tǒng)名優(yōu)醋在內(nèi)的食醋行業(yè)，生產(chǎn)過程以傳統(tǒng)的經(jīng)驗為主，發(fā)酵過程中醋醅溫度偏高或偏低，出現(xiàn)異味、產(chǎn)率下降等異?，F(xiàn)象時有發(fā)生，存在批次產(chǎn)品品質(zhì)，尤其是風(fēng)味差異較大等問題。究其原因，主要還是對我國傳統(tǒng)的釀醋工藝機(jī)理的理解，尤其是對釀造過程中微生物的組成、功能等了解甚少，這在很大程度受限于研究方法(微生物純培養(yǎng)技術(shù))和化學(xué)分析儀器的缺陷。例如，環(huán)境中可培養(yǎng)的細(xì)菌不到細(xì)菌總數(shù)的0. 1 %，因此對醋醅中的微生物，尤其是功能性微生物知之甚少，這將難以使我們?nèi)娼沂敬柞形⑸锏淖饔脵C(jī)制。近年來，隨著分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們可以快速地擴(kuò)增遺傳物質(zhì)的DNA， 從而從基因水平上來研究特定環(huán)境中微生物的功能，這在很大程度上有助于人們了解復(fù)雜微生物環(huán)境的信息。國內(nèi)外很多研究人員把分子生態(tài)學(xué)技術(shù)運(yùn)用到對糞便、土壤、海底污泥、污水等體系中原核生物和真核生物的微生態(tài)研究中，同時在傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域也有非常廣泛的應(yīng)用，其中包括墨西哥發(fā)酵玉米團(tuán)、日本黑醋、朝鮮泡菜、奶酪意大利香腸等的微生物組成和分布的研究，取得了令人矚目的成果，為我們更好地了解國內(nèi)外傳統(tǒng)發(fā)酵的機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)，同時也為傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的改革和進(jìn)步提供了非常寶貴的理論數(shù)據(jù)支撐。本發(fā)明基于微生物強(qiáng)化技術(shù)，主要通過對食醋釀造微生物的群落優(yōu)化調(diào)控，達(dá)到縮短發(fā)酵周期、提高出醋率和原料利用率，改善和提高食醋風(fēng)味品質(zhì)。生物強(qiáng)化技術(shù) (Bioaugmentation)，又叫生物增強(qiáng)技術(shù)，產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代中期，80年代后已在廢水處理、城市垃圾處理、土壤修復(fù)等領(lǐng)域得以研究和應(yīng)用。目前，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用生物強(qiáng)化技術(shù)的研究鮮有報道。主要原因有①對于很多傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物菌種的研究開展得尚不深入，其菌落結(jié)構(gòu)中起到主導(dǎo)作用的優(yōu)勢菌群的組成及其功能的信息也還知之甚少，而這些正是生物強(qiáng)化研究開展的前提；②食品安全問題越來越成為食品生產(chǎn)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)，如果采用外源菌種或者高效基因工程菌進(jìn)行生物強(qiáng)化研究，其潛在的生物安全性問題目前并沒有得到很好地解決，這就直接制約了生物強(qiáng)化技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)行業(yè)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有食醋固態(tài)釀造技術(shù)的不足，提供了一種生物強(qiáng)化技術(shù)用于固態(tài)釀造食醋的發(fā)酵過程，以優(yōu)化食醋釀造微生物群落結(jié)構(gòu)，縮短食醋釀造周期、 改善食醋產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)及功能性、提高原料利用率，更好的發(fā)揮微生物資源在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下方案實現(xiàn)1.釀醋功能性微生物的確定采用PCR-DGGE等分子生態(tài)學(xué)技術(shù)解析固態(tài)釀造食醋醋醅中微生物群落的結(jié)構(gòu)，結(jié)合與食醋產(chǎn)品品質(zhì)和功能性相關(guān)的關(guān)鍵理化指標(biāo)確定食醋釀造過程的功能性微生物。醋醅中微生物總DNA提取方法采用液氮研磨+溶菌酶+SDS高鹽抽提法，醋醅中微生物群落結(jié)構(gòu)采用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行解析。2.釀醋功能性微生物菌株的純培養(yǎng)根據(jù)分子生態(tài)學(xué)分析結(jié)果，合理設(shè)計微生物培養(yǎng)條件，采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)從食醋醋醅中獲得釀醋功能性微生物菌株。通過3.食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化選用食醋釀造功能性微生物菌劑或其組合，在食醋固態(tài)發(fā)酵階段進(jìn)行生物強(qiáng)化。該方法具有縮短食醋釀造周期、改善并控制食醋產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)及功能性、提高原料利用率等優(yōu)點(diǎn)。具體實施路線如下醋醅微生物群落總DNA的提取。選擇正常發(fā)酵過程的醋醅2g，采用液氮研磨、溶菌酶處理、氯仿-異戊醇抽提、乙醇洗滌、RNaseA消化等步驟提取基因組DNA。合成引物并利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)序列。利用電泳儀對擴(kuò)增的16S rDNAV3片段進(jìn)行DGGE電泳。其條件為8%聚丙烯酰胺凝膠，30% 50%變性梯度(100%變性劑濃度為7M尿素，40%甲酰胺)，上樣量為200ng， 緩沖液為 1XTAE，60°C，200V 電壓電泳 4h, SYBR Green I 染色 45min。優(yōu)勢微生物的序列測定。選擇DGGE膠上10 20個最為顯著的條帶，切割膠條， 并進(jìn)行序列分析，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，初步確定優(yōu)勢微生物的種屬。功能性微生物篩選。利用醋酸菌、乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基，以醋醅為篩選樣品， 篩選醋醅中醋酸菌、乳酸菌微生物。挑選生長較快、分布密度較大但菌落形態(tài)不同的20 30株菌落，純化后保存。功能性微生物的確定。對上述篩選獲得的純培養(yǎng)微生物進(jìn)行16S rDNA測序，測序結(jié)果與DGGE獲得的優(yōu)勢微生物進(jìn)行比較，選擇2 5株優(yōu)勢微生物用于生物強(qiáng)化。若本步驟未獲得優(yōu)勢微生物，則按照功能性微生物篩選方法進(jìn)行重復(fù)篩選和鑒定。所述的醋酸菌培養(yǎng)基為葡萄糖1%，酵母膏1%，PH 5.5，1211滅菌201^11，冷卻至55°C以下加入6% (ν/ν)的無水乙醇；所述的乳酸菌篩選培養(yǎng)基為葡萄糖2%，蛋白胨
41%，酵母膏 0. 5%，KH2P040. 1 %, K2HP040. 25%, MgS040. 1 %, NaCl 0. 25%, pH 7. 0,121°C 滅菌20min，冷卻至55°C以下加入6% (ν/ν)的無水乙醇。生物強(qiáng)化菌株的預(yù)培養(yǎng)。采用斜面、三角瓶、一級種子、二級種子擴(kuò)培方法，對生物強(qiáng)化的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。醋酸發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化。將上述培養(yǎng)的菌株種子液，按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基的 1 2%的接種量，于醋酸發(fā)酵開始的1 7天進(jìn)行接種，其中強(qiáng)化所用的醋酸菌直接添加到醋醅的表面，而乳酸菌拌入到培養(yǎng)基底部。生物強(qiáng)化每批次可進(jìn)行1 3種微生物的強(qiáng)化，可以同時開展，也可以分開進(jìn)行， 其最優(yōu)強(qiáng)化方案應(yīng)根據(jù)效果進(jìn)行選擇。


圖1醋醅微生物群落的DGGE分析圖譜圖2微生物培養(yǎng)流程圖3釀醋功能性微生物的培養(yǎng)過程曲線圖4生物強(qiáng)化過程的醋醅溫度變化圖5生物強(qiáng)化過程的醋醅總酸變化
具體實施例方式實施例1 醋醅微生物群落總DNA的提取1.醋醅樣品預(yù)處理取2g醋醅樣品，用20mL 0. IM的PBS (pH 7. 0)懸浮，加入玻璃珠，vortex充分振蕩5min ；200 Xg離心5min，收集上清(含菌體)，棄取沉淀；洗滌3次；9000 Xg高速離心 5min。棄上清，收集沉淀；收集的菌體用5mL 0. IM的PBS (pH 7. 0)懸浮，9000 Xg離心；洗滌 3次；洗凈的菌體懸浮在ImL PBS (pH 7. 0)中，用槍吹打后vortex振蕩均勻，轉(zhuǎn)入1. 5mLEP 管中，-20°C凍存?zhèn)溆谩?.醋醅基因組DNA的提取稱取2g醋醅，在研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)移至50mL離心管。向離心管中加入 6mL DNA抽提緩沖液和100 μ L溶菌酶(50mg/mL)，于225r/min搖床上37°C搖動30min。向離心管中加入1. 5mL 10% 505，651水浴》1，每隔15 20min輕輕顛倒幾下，室溫6000X g 離心IOmin。收集上清。用等體積的氯仿-異戊醇04 1體積比)抽提一次，以0. 6倍體積的異丙醇室溫沉淀lh，16000Xg離心20min，收集核酸沉淀，用冷的70%乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μ L TE中，加入終濃度為0. 5 μ g/mL RNaseA,并在37°C下水浴消化2h，以去除 RNA,置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。實施? =PCR-DGGE技術(shù)解析醋醅微生物群落的結(jié)構(gòu)LPCR 擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增所用的引物P2-P3可以擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)約196bp 的片段，對應(yīng)Ε. colil6S rDNA 341到534的位點(diǎn)。2. DGGE 分析
細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DyNA QuantTM 200 濃度儀(Hoefer Pharmacia Biotech)測定 DNA 濃度。用 Bio-Rad DCode DGGE 系統(tǒng)進(jìn)行電泳。DGGE電泳條件為8%聚丙烯酰胺凝膠，DGGE采用30% 50%變性梯度(100%變性劑濃度為7M尿素，40%甲酰胺)，上樣量為200ng。電泳緩沖液為1 X TAE，60°C，200V電壓電泳 4h，SYBR Green I 染色 45min，UVP2GDS8000 凝膠成像系統(tǒng)(Ultraviolet Product L.td)成像。結(jié)果如圖1所示。3.割膠測序?qū)D1中的各條帶進(jìn)行割膠測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對確定其種屬，結(jié)果如表1所示。表1醋醅微生物群落的鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化技術(shù)，其特征在于釀醋生物強(qiáng)化技術(shù)按以下步驟進(jìn)行(1)醋醅微生物群落總DNA的提取。選擇正常發(fā)酵過程的醋醅2g，采用液氮研磨、溶菌酶處理、氯仿-異戊醇抽提、乙醇洗滌、RNaseA消化等步驟提取基因組DNA。(2)合成引物并利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增出細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)序列。(3)利用電泳儀對擴(kuò)增的16SrDNAV3片段進(jìn)行DGGE分析。其條件為8%聚丙烯酰胺凝膠，30% 50%變性梯度(100%變性劑濃度為7M尿素，40%甲酰胺)，上樣量為200ng， 緩沖液為 1XTAE，60°C，200V 電壓電泳 4h, SYBRGreen I 染色 45min。(4)優(yōu)勢微生物的序列測定。選擇DGGE膠上10 20個最為顯著的條帶，切割膠條，并進(jìn)行序列分析，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，初步確定優(yōu)勢微生物的種屬。(5)功能性微生物篩選。利用醋酸菌、乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基，以醋醅為篩選樣品，篩選醋醅中醋酸菌、乳酸菌等微生物。挑選生長較快、分布密度較大但菌落形態(tài)不同的20 30株菌落，純化后保存。(6)功能性微生物的確定。對上述篩選獲得的純培養(yǎng)微生物進(jìn)行16SrDNA測序，測序結(jié)果與DGGE獲得的優(yōu)勢微生物進(jìn)行比較，選擇2 5株優(yōu)勢微生物用于生物強(qiáng)化。若本步驟未獲得優(yōu)勢微生物，則按照功能性微生物篩選方法進(jìn)行重復(fù)篩選和鑒定。(7)生物強(qiáng)化菌株的預(yù)培養(yǎng)，采用斜面、三角瓶、一級種子、二級種子擴(kuò)培方法，對生物強(qiáng)化的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(8)醋酸發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化。將上述培養(yǎng)的菌株種子液，按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基的1 2%的接種量，于醋酸發(fā)酵開始的1 7天進(jìn)行接種，其中強(qiáng)化所用的醋酸菌直接添加到醋醅的表面，而乳酸菌拌入到培養(yǎng)基底部。生物強(qiáng)化每批次可進(jìn)行1 3種微生物的強(qiáng)化，可以同時開展，也可以分開進(jìn)行，其最優(yōu)強(qiáng)化方案應(yīng)根據(jù)效果進(jìn)行選擇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的用于固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化技術(shù)，其特征在于，所述步驟(5)中的醋酸菌培養(yǎng)基為葡萄糖1%，酵母膏1%，ρΗ 5.5，121°0滅菌20!11士11， 冷卻至55°C以下加入6% (ν/ν)的無水乙醇；所述的乳酸菌篩選培養(yǎng)基為葡萄糖2%，蛋白胨 1%，酵母膏 0. 5%, KH2PO4O. 1%, K2HPO4O. 25%, MgSO4O. 1%, NaCl 0. 25%, ρΗ 7. 0， 121°C滅菌20min，冷卻至55°C以下加入6% (ν/ν)的無水乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化技術(shù)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的操作方法流程為(1)釀醋功能性微生物的確定采用PCR-DGGE等分子生態(tài)學(xué)技術(shù)解析固態(tài)釀造食醋醋醅中微生物群落的結(jié)構(gòu)，結(jié)合與食醋產(chǎn)品品質(zhì)和功能性相關(guān)的關(guān)鍵理化指標(biāo)確定食醋釀造過程的功能性微生物；(2)釀醋功能性微生物菌株的純培養(yǎng)采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)從食醋醋醅中獲得釀醋功能性微生物菌株；(3)食醋發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化選用食醋釀造功能性微生物菌劑或其組合，在食醋固態(tài)發(fā)酵階段進(jìn)行生物強(qiáng)化。該方法具有縮短食醋釀造周期、改善并控制食醋產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)及功能性、提高原料利用率等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12R1/225GK102226142SQ20111011623
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者史勁松, 許偉, 許正宏, 陸震鳴 申請人:江南大學(xué)