專(zhuān)利名稱(chēng)：一種有包膜rna病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品平臺(tái)及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品平臺(tái)，主要通過(guò)由攜帶外源目的序列的載體與含MLV gag-pol元件的載體，包括或不包括病毒膜蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株制作而成，是有包膜RNA病毒的擬似病毒，模擬了病毒表面的磷脂雙分子層或者更進(jìn)一步地模擬了病毒膜蛋白表面活性，具有具體有包膜RNA病毒結(jié)構(gòu)及理化學(xué)特性特點(diǎn)，無(wú)復(fù)制能力，無(wú)傳染性。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)重組病毒技術(shù)從真核細(xì)胞中包裝出來(lái)，平臺(tái)可通過(guò)基因操作技術(shù)讓參照品/標(biāo)準(zhǔn)品顆粒內(nèi)部攜帶外源目的RNA序列，參照品/標(biāo)準(zhǔn)品具有與目標(biāo)病毒同樣的病毒包膜蛋白和相近的病毒結(jié)構(gòu)特性以及拓?fù)鋵W(xué)特性，能真實(shí)反應(yīng)各種理化學(xué)環(huán)境因素對(duì)目標(biāo)病毒的影響。
背景技術(shù)：
核酸檢測(cè)技術(shù)，主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)和核酸分子雜交技術(shù)，因其靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、快速、高效高通量等在病毒的診斷方面發(fā)揮了巨大的作用，并逐步成為傳染病檢測(cè)的一線方法。核酸檢測(cè)技術(shù)通過(guò)對(duì)病毒核酸的定性定量對(duì)病毒進(jìn)行診斷，是早期病毒感染的有效診斷技術(shù)，而對(duì)于慢性病毒感染，核酸檢測(cè)定量病毒核酸是評(píng)價(jià)病毒復(fù)制情況以及抗病毒治療效果的主要方法。針對(duì)RNA病毒的檢測(cè)診斷，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，增加了逆轉(zhuǎn)錄步驟(RT)，把病毒RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增，即是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)。RT-PCR檢測(cè)診斷RNA病毒的步驟主要有1、樣品采集儲(chǔ)存；2、樣品處理提取核酸； 3、RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；4、cDNA模板擴(kuò)增；5、檢測(cè)擴(kuò)增。上面所述的每一個(gè)步驟都會(huì)影響最后的檢測(cè)結(jié)果。在這些過(guò)程中，存在各種理化學(xué)環(huán)境因素，這些環(huán)境因素可能來(lái)源于采樣不合格，核酸抽提時(shí)化學(xué)試劑酚類(lèi)、鹽和乙醇等在核酸洗脫液中的殘留等造成，也可以起源于樣本本身的內(nèi)在因素造成，如血紅素、白細(xì)胞DNA、肝素、膽汁和抗體等。另外，保存、運(yùn)輸環(huán)境中RNA酶和溫度等引起的目標(biāo)病毒核酸自身降解也不容忽視。因此，為了反映核酸檢測(cè)結(jié)果的可靠性和排除各種理化學(xué)環(huán)境因素引起的假陰性結(jié)果，在樣品中設(shè)置參照品(包括內(nèi)參照品和陽(yáng)性參照品)是核酸定性定量檢測(cè)中不可缺少的部分。RNA病毒中又分為無(wú)包膜RNA病毒和有包膜RNA病毒，但是目前針對(duì)于RNA病毒檢測(cè)的參照品只有兩種(1)裸露RNA，(2)病毒樣顆粒。裸露RNA參照品主要來(lái)自體外轉(zhuǎn)錄，將檢測(cè)靶標(biāo)插入帶有體外轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的質(zhì)粒，用體外轉(zhuǎn)錄酶合成的一段帶有檢測(cè)靶標(biāo)RNA，然后用DNA酶去除RNA中的DNA模板。但是RNA本身不穩(wěn)定，容易被環(huán)境中的RNA 酶消化降解而不能夠長(zhǎng)期保存，不便于運(yùn)輸，更不能與病毒內(nèi)的RNA相提并論。病毒顆粒型參照品最具代表性的就是“Armored RNA", 1996年由Ambion公司開(kāi)發(fā)，"Armored RNA”是利用MS2噬菌體載體將檢測(cè)靶標(biāo)插入MS2噬菌體包裝質(zhì)粒，將包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌培養(yǎng)，然后裂解細(xì)菌通過(guò)有機(jī)溶劑抽提純化得到帶有檢測(cè)靶標(biāo)的MS2噬菌體。"Armored RNA”具有制作容易，提取純化簡(jiǎn)單，常溫或4°C能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，無(wú)感染性等特點(diǎn)，其中RNA由噬菌體衣殼蛋白保護(hù)，從病毒生物結(jié)構(gòu)上看，噬菌體病毒顆粒是一種正二十面體的致密結(jié)構(gòu)， 因而能夠抵抗核酸酶以及各種理化學(xué)環(huán)境因素，是作為標(biāo)準(zhǔn)品或陽(yáng)性參照品的選擇。然而，針對(duì)不同種類(lèi)的病毒病原體，其生物生理結(jié)構(gòu)特性的差異造成了對(duì)外界的抵抗能力差異。特別是對(duì)于有包膜RNA病毒，由于包膜病毒其包膜為脂質(zhì)雙分子層，其RNA 既不是裸露在外，也沒(méi)有衣殼蛋白的堅(jiān)固保護(hù)，在拓?fù)鋵W(xué)上不可能被裸露RNA或衣殼病毒噬菌體模擬，因而簡(jiǎn)單地使用裸露RNA或衣殼病毒噬菌體作為有包膜RNA病毒檢測(cè)中的參照品是不合適的。有包膜RNA病毒中嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的病毒病原體，包括人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，流感病毒，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV) 等，都是臨床上需要早期診斷，早期發(fā)現(xiàn)，及時(shí)治療和檢測(cè)治療效果的病毒病原體。為了確保對(duì)于這些有包膜RNA病毒的檢測(cè)診斷的可信性，并且在考慮有包膜RNA病毒的病毒結(jié)構(gòu)生物學(xué)特性和病毒拓?fù)鋵W(xué)特性，樣品采集后使用裸露RNA參照品或使用衣殼病毒噬菌體作為內(nèi)參照品都不能準(zhǔn)確反映樣品在處理檢測(cè)等過(guò)程中的變化，實(shí)現(xiàn)內(nèi)參照品的功能，模擬有包膜RNA病毒樣品，對(duì)因理化學(xué)環(huán)境因素造成的假陰性結(jié)果很難進(jìn)行鑒別。因而理想的參照品應(yīng)具有跟檢測(cè)對(duì)象生物學(xué)特性一致的生物生理結(jié)構(gòu)特性，只有開(kāi)發(fā)與目標(biāo)有包膜 RNA病毒具有相同生物學(xué)特性的核酸檢測(cè)參照品才能真正對(duì)病原體檢測(cè)全方位監(jiān)測(cè)。病毒的研究近年來(lái)得到了巨大的發(fā)展，如禽流感病毒反向基因重組技術(shù)，2003年法國(guó)科學(xué)家作成了具有感染力及靶器官識(shí)別能力的HCV擬似病毒，這些技術(shù)不僅標(biāo)志著人類(lèi)病毒生物工程技術(shù)進(jìn)入了“藝術(shù)”時(shí)代，更重要的是人們可以用之來(lái)評(píng)價(jià)中和抗體，尋找特殊的抗原表位(印itope)，篩選可能的受體，找出可能的疫苗株，創(chuàng)立具有靶向性的藥物載體和診斷技術(shù)等等。擬似病毒一般指具有擬似相應(yīng)病毒結(jié)構(gòu)或功能單位的納米顆粒，經(jīng)人類(lèi)基因操作后失去復(fù)制功能從而失去了病毒毒性。對(duì)于擬似病毒的種種應(yīng)用，可見(jiàn)擬似病毒能良好地模擬有包膜病毒，反映有包膜病毒的病毒結(jié)構(gòu)生物生理特性和拓?fù)鋵W(xué)特點(diǎn)， 因而能模擬有包膜病毒在樣品中經(jīng)受各種理化學(xué)環(huán)境因素以及這些因素對(duì)有包膜病毒的影響。從病毒的檢測(cè)診斷角度看，將擬似病毒開(kāi)發(fā)成有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)的參照品/ 標(biāo)準(zhǔn)品，較之使用裸露核酸或無(wú)包膜的衣殼病毒噬菌體，更能反映有包膜病毒及其在樣品中的真實(shí)情況。擬似病毒的包裝技術(shù)，目前主要利用人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)，鼠白細(xì)胞病毒 (MLV)等逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol蛋白，該蛋白能通過(guò)識(shí)別并結(jié)合特定的序列捕獲含有該序列的基因片段，并將該基因片段包裝在蛋白顆粒的內(nèi)部，同時(shí)將表達(dá)病毒膜蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裝成顆粒，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體等途徑分泌到細(xì)胞外，形成人工擬似病毒?；诓《局亟M技術(shù)和基因操作對(duì)人工擬似病毒進(jìn)行改造，把擬似病毒開(kāi)發(fā)有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)的參照品/標(biāo)準(zhǔn)品。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品的病毒生物結(jié)構(gòu)僅為脂質(zhì)雙分子層包裹，內(nèi)部為Gag蛋白結(jié)合核酸的非致密結(jié)構(gòu)，其病毒生物學(xué)結(jié)構(gòu)上具有跟檢測(cè)對(duì)象生物學(xué)特性一致的生物生理結(jié)構(gòu)特性以及拓?fù)鋵W(xué)特點(diǎn)。而在核酸檢測(cè)中(包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)PCR和核酸分子雜交技術(shù))，理想的參照品還應(yīng)滿(mǎn)足模擬目標(biāo)病毒被核酸檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)的過(guò)程，包括同樣的特異性和靈敏度，與目標(biāo)病毒同步被檢測(cè)，以達(dá)到最大限度模擬目標(biāo)病毒核酸檢測(cè)過(guò)程。
本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品平臺(tái)，并以HCV病毒核酸診斷為例說(shuō)明該有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品平臺(tái)的應(yīng)用，達(dá)到以下目的 具有跟檢測(cè)對(duì)象生物學(xué)特性一致的病毒結(jié)構(gòu)生物學(xué)特性和拓?fù)鋵W(xué)特性，能真實(shí)反應(yīng)各種理化學(xué)環(huán)境因素對(duì)目標(biāo)病毒的影響；參照品/標(biāo)準(zhǔn)品核酸為RNA，包含目標(biāo)有包膜RNA病毒檢測(cè)的靶標(biāo)序列或獨(dú)特人工靶標(biāo)序列，與目標(biāo)病毒檢測(cè)具有相同的特異性和靈敏度，同步被檢測(cè)，最大限度模擬目標(biāo)病毒核酸檢測(cè)過(guò)程；有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品可使用于核酸檢測(cè)技術(shù)，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)和核酸分子雜交技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)由攜帶外源目的序列的參照品靶標(biāo)載體，含MLV gag-pol元件的載體與病毒膜蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株制作而成，是有包膜RNA病毒的擬似病毒，能模擬具體有包膜RNA病毒結(jié)構(gòu)生物學(xué)特性和拓?fù)鋵W(xué)特性以及理化學(xué)特性特點(diǎn)，無(wú)復(fù)制能力，無(wú)傳染性。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品平臺(tái)通過(guò)重組病毒技術(shù)從真核細(xì)胞中包裝出來(lái)，平臺(tái)可通過(guò)基因操作技術(shù)讓參照品顆粒內(nèi)部攜帶外源目的RNA序列，攜帶外源目的RNA序列通過(guò)基因操作技術(shù)可插入或替換。為了使有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)與目標(biāo)病毒具有相同的特異性和靈敏度，能夠最大限度模擬目標(biāo)病毒的核酸檢測(cè)過(guò)程，參照品/標(biāo)準(zhǔn)品顆粒內(nèi)部攜帶外源目的RNA序列可包括針對(duì)目標(biāo)病毒的PCR —對(duì)或多對(duì)檢測(cè)引物，一條或多條針對(duì)目標(biāo)病毒的檢測(cè)探針或與目標(biāo)病毒無(wú)關(guān)的探針，參照品/標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)靶標(biāo)與目標(biāo)病毒檢測(cè)靶標(biāo)的長(zhǎng)度，核苷酸成分，以及溶解溫度必須三者一致；也可單獨(dú)或同時(shí)包括與核酸分子雜交檢測(cè)靶標(biāo)特異性和靈敏度一致的靶標(biāo)序列。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品作為陽(yáng)性參照品時(shí)，其內(nèi)部攜帶的目的RNA序列包含與目標(biāo)病毒檢測(cè)一致的檢測(cè)靶標(biāo)或目標(biāo)病毒基因的整個(gè)可檢測(cè)區(qū)段的一段或多段。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品作為內(nèi)參照品時(shí)，其內(nèi)部攜帶的目的RNA序列包含與目標(biāo)病毒無(wú)關(guān)的定量PCR檢測(cè)探針或者包含核酸分子雜交檢測(cè)靶標(biāo)特異性和靈敏度一致的但與目標(biāo)病毒無(wú)關(guān)的靶標(biāo)序列。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品可應(yīng)用在有包膜RNA病毒，包括但不限于人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，流感病毒，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)。發(fā)明詳述1.將逆轉(zhuǎn)錄病毒上游非翻譯序列以及識(shí)別序列R-U5-PSI和下游非翻譯序列U3-R 從鼠白血病病毒MLV分別克隆出來(lái)，并在這兩個(gè)順式元件中加入多克隆酶切位點(diǎn)MCS，利用 Infusion技術(shù)進(jìn)行拼接連接到pCMV載體上，命名為pTAR，見(jiàn)實(shí)施例1使該載體質(zhì)?？煞奖悴迦牖蛱鎿Q外源目標(biāo)序列，可插入或替換外源目的序列的最大長(zhǎng)度至少為3000bp，可插入或替換外源目的基因包含在有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品內(nèi)部，建立靶標(biāo)載體。2.參照品/標(biāo)準(zhǔn)品靶標(biāo)載體pTAR提供的多克隆插入位點(diǎn)MCS可插入多種病毒的靶標(biāo)序列，靶標(biāo)序列可以是一個(gè)目標(biāo)病毒的一段檢測(cè)靶標(biāo)序列或多段檢測(cè)靶標(biāo)的嵌合序列，或是多個(gè)目標(biāo)病毒檢測(cè)靶標(biāo)的嵌合序列。實(shí)施例2通過(guò)序列比對(duì)分析設(shè)計(jì)丙型肝炎病毒(HCV)的檢測(cè)靶標(biāo)序列和人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(HIV)的檢測(cè)靶標(biāo)序列的嵌合序列，在參照品靶標(biāo)載體PTAR多克隆酶切位點(diǎn)MCS插入針對(duì)PCR檢測(cè)的HCV和HIV內(nèi)參照品靶標(biāo)序列，使其與HCV檢測(cè)或HIV檢測(cè)具有相同的特異性和靈敏度，同步被檢測(cè)，最大限度模擬HCV或HIV核酸檢測(cè)過(guò)程。具有相同的特異性和靈敏度，具體表現(xiàn)為，內(nèi)參照品靶標(biāo)序列中含有的引物序列與檢測(cè)病毒的引物一致，內(nèi)參照品靶標(biāo)序列中含有的探針序列與檢測(cè)病毒核酸的探針序列長(zhǎng)度相同，堿基成分相同，溶解溫度相同，但是具體序列不同，檢測(cè)報(bào)告信號(hào)不同。含有HCV和HIV嵌合靶標(biāo)的內(nèi)參照品命名為pTAR-HCV/HIV。pTAR-HCV/HIV內(nèi)參照品靶標(biāo)質(zhì)粒，MLV gag-pol元件質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株293T，同時(shí)轉(zhuǎn)染HCV膜蛋白質(zhì)粒或不轉(zhuǎn)染膜蛋白質(zhì)粒，包裝出攜帶或不攜帶病毒表面膜蛋白的HCV/HIV內(nèi)參照品。表面攜帶HCV膜蛋白HCV/HIV內(nèi)參照品命名為IC-HCV/HIV-1，表面不攜帶病毒膜蛋白，僅為細(xì)胞磷脂雙分子層的HCV/HIV內(nèi)參照品命名為IC-HCV/HIV-0。 有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品，在于模擬了病毒表面的磷脂雙分子層或者更進(jìn)一步地模擬了病毒膜蛋白表面活性。經(jīng)過(guò)確切定性定量的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品與病毒樣品混合后，在與目標(biāo)病毒處于同一理化學(xué)環(huán)境時(shí)能反映目標(biāo)病毒因同樣原因引起的生物生理降解過(guò)程，從而反映目標(biāo)病毒的最終核酸檢測(cè)結(jié)果的可靠性。3. HCV/HIV內(nèi)參照品的靶標(biāo)序列，理論上具有相同的特異性和靈敏度，具體設(shè)計(jì)為內(nèi)參照品靶標(biāo)序列中含有的引物序列與檢測(cè)病毒的引物一致，內(nèi)參照品靶標(biāo)序列中含有的探針序列與檢測(cè)病毒核酸的探針序列長(zhǎng)度相同，堿基成分相同，溶解溫度相同，但是具體序列不同。通過(guò)具體的HCV陽(yáng)性參照品與HCV內(nèi)參照品的靶標(biāo)序列RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)，比較內(nèi)參照品和陽(yáng)性參照品中檢測(cè)靶標(biāo)的擴(kuò)增效率，驗(yàn)證理論設(shè)計(jì)與實(shí)踐實(shí)驗(yàn)基本一致，驗(yàn)證內(nèi)參照品設(shè)計(jì)的合理性和可行性。4.在HCV的核酸檢測(cè)中，除了 HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品與HCV病毒樣品的檢測(cè)靶標(biāo)靈敏度在理論上和實(shí)際檢測(cè)上相互一致，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，由于內(nèi)參照品和病毒核酸競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系的各種成分，內(nèi)參照品過(guò)量會(huì)引起目標(biāo)病毒檢測(cè)信號(hào)的偏差，或者內(nèi)參照品不足則不能達(dá)到內(nèi)參照的目的，因此需要在一定的范圍內(nèi)合理使用HCV病毒核酸內(nèi)參照品。實(shí)施例4結(jié)果顯示內(nèi)參品滴度在IO4或以下不影響陽(yáng)性參照品的檢測(cè)，即是不影響病毒樣品的檢測(cè)，而內(nèi)參照品滴度在IO3以上時(shí)，不會(huì)因?yàn)殛?yáng)性參照品滴度的影響而發(fā)生較大偏離，即不會(huì)因?yàn)椴《緲悠泛慷鴮?duì)內(nèi)參照品定量造成偏差，因此IO4是內(nèi)參照品的最適使用滴度。5. HCV/HIV內(nèi)參照品為有膜擬似病毒，其病毒膜蛋白在理論上具有與真病毒一樣的耐受特點(diǎn)與病毒樣品混合后，在與目標(biāo)病毒處于同一理化學(xué)環(huán)境時(shí)能反映目標(biāo)病毒因同樣原因引起的生物生理降解過(guò)程。實(shí)施例5評(píng)價(jià)了 HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品在HCV陽(yáng)性血清中以及各種條件下，內(nèi)參照品核酸的檢測(cè)變化與HCV病毒核酸的檢測(cè)變化的相關(guān)性，反映HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)參照品與HCV病毒的耐受相關(guān)性。6. HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品的作用，一方面反映HCV病毒因各種原因引起的生物生理降解過(guò)程，通過(guò)對(duì)一定量的內(nèi)參照品的檢出效率和檢出值，評(píng)價(jià)HCV病毒核酸檢測(cè)過(guò)程的可靠性；另一方面，HCV內(nèi)參照品和病毒具有非常接近的檢測(cè)靈敏度，已知滴度的內(nèi)參照品可用于對(duì)目標(biāo)病毒進(jìn)行相對(duì)定量。而HCV病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，與病毒具有相同的檢測(cè)靶標(biāo)和檢測(cè)信號(hào)，可作為HCV病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，用于在核酸檢測(cè)過(guò)程中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于將HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品是擬似RNA病毒，其核酸為RNA，與過(guò)去質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品核酸與樣品核酸性質(zhì)一致，在檢測(cè)過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在逆轉(zhuǎn)錄效率上一致，因此在定量或者比較等應(yīng)用更具有參考意義，更能反映檢測(cè)過(guò)程中人為的或系統(tǒng)的誤差影響。


圖1 靶標(biāo)載體pTAR圖譜圖2 :HCV/HIV檢測(cè)靶標(biāo)構(gòu)建圖譜圖3 :HCV/HIV檢測(cè)靶標(biāo)構(gòu)建鑒定4 =HCV-PC與HCV-IC擴(kuò)增效率比較，HCV內(nèi)參照品與HCV陽(yáng)性參照品的檢出Ct 與稀釋度的負(fù)對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，相近的斜率反映了相近的檢測(cè)靈敏度，通過(guò)計(jì)算擴(kuò)增效率=10(1/斜率)-l，HCV內(nèi)參照品與HCV陽(yáng)性參照品的擴(kuò)增效率分別為1. 07與1. 01圖5 :HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品與HCV陽(yáng)性參照品共檢測(cè)中的探索使用量及其檢出值。內(nèi)參照品滴度在IO4或以下不影響陽(yáng)性參照品的檢測(cè)，即是不影響病毒樣品的檢測(cè)， 而內(nèi)參照品滴度在IO3以上時(shí)，不會(huì)因?yàn)殛?yáng)性參照品滴度的影響而發(fā)生較大偏離，即不會(huì)因?yàn)椴《緲悠泛慷鴮?duì)內(nèi)參照品定量造成偏差，因此IO4是內(nèi)參照品的最適使用滴度。圖6 =HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品在HCV陽(yáng)性血清中以及各種條件下， 內(nèi)參照品核酸的檢測(cè)變化與HCV病毒核酸的檢測(cè)變化的相關(guān)性。在常溫環(huán)境中由于樣品中可能存在核酸酶或其他未知因素導(dǎo)致樣品中病毒及其核酸降解，從而造成檢測(cè)量的變化。 溫度越低，越有利于樣品保存。圖7 =HCV病毒核酸內(nèi)參照品在多個(gè)血清樣品中檢出量穩(wěn)定。圖8 =HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品/標(biāo)準(zhǔn)品用于在核酸檢測(cè)過(guò)程中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的作了詳細(xì)說(shuō)明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1參照品靶標(biāo)載體的構(gòu)建參照品靶標(biāo)載體是基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制，將逆轉(zhuǎn)錄病毒上游非翻譯序列以及識(shí)別序列R-U5-PSI和下游非翻譯序列U3-R從鼠白血病病毒MLV分別克隆出來(lái)，并在這兩個(gè)順式元件中加入多克隆酶切位點(diǎn)MCS，利用hfusion技術(shù)進(jìn)行拼接連接到pCMV載體上，命名為pTAR，pTAR結(jié)構(gòu)圖譜見(jiàn)附圖1。根據(jù)hfusion技術(shù)要求設(shè)計(jì)R-U5-PSI和U3-R 兩對(duì)引物R-U5-PSI-f :5’ -AGATCCAGCTGGCTGAGCTGCCAGTCCTCCGATAGACTGAGT-3’R-U5-PSI-r :5，-GTCGACAGGCCTCGCGACGCGTTCTAGAGCATGCTCGAGGGCCCGAATTCCAACC CCCAAAACACTATGATTT-3’U3-R-f :5’ -GTCGCGAGGCCTGTCGACAATGAAAGACCCCACCAAATTG-3，U3-R-r :5’ -TAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTAAGATGCAACAGCAAGAGGATTT-3，
使用QIAGEN公司QIAamp Ultraseus virus試劑盒對(duì)鼠白血病病毒MLV的核酸進(jìn)行提取。具體方法取Iml病毒樣品至2ml EP管并平衡溫度至15°C _25°C，加800ul BufferAC,加5. 6ulcarrier RNA到EP管蓋子里，然后漩渦振蕩IOs混勻；室溫培育10分鐘， 3200rpm離心3分鐘，棄去全部上清；加300ul Buffer AR(60°C預(yù)熱)加20ul蛋白酶K，漩渦振蕩使沉淀全部溶解；40°C水浴10分鐘期間漩渦振蕩一次5秒鐘，將其全部移入QIAamp Spin Column6000rpm離心1分鐘棄去廢液；加500ul Buffer Affl 7500rpm離心1分鐘棄去廢液，加 500ulBuffer AW2 15000rpm離心 3 分鐘棄去廢液，加 30ul Buffer AVE 7500rpm 離心1分鐘，收集含RNA洗脫液，-20°C保存。用hvitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Super Script II)對(duì)抽提的病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體方法取1. 5ml離心管，加去離子水5ul、隨機(jī)引物(IOuM) Iul、樣品RNA 5ul、dNTP mix (IOmM) Iul，65°C孵育 5 分鐘后置于冰上，加 5XFirst-strand Buffer 4ul、0. 1M、DTT 2ul、RNaseOUTlul，25°C孵育 2 分鐘，加 Superscript II RT lul，25°C孵育 10 分鐘，42°C 孵育50分鐘，70°C孵育15分鐘，取2ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別使用R-U5-PSI和 U3-R兩對(duì)引物，得到R-U5-PSI和U3-R兩個(gè)片段。PCR反應(yīng)體系10XHigh Fidelity PCR Buffer 5ul；IOmM dNTP mixture lul ；50mM MgSO4 2ul；Primer IOuM Forward/Reward lul ；Platinum Taq High Fidelity 0. 5ul (2. 5unit)；水 37. 5ul ；逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2ul?？偡磻?yīng)體積50ul。反應(yīng)條件94°C 2分鐘；94°C 30秒，65°C 40秒，72°C 1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C 3 分鐘。用Me I線性化pCMV載體，R-U5-PSI和U3-R兩個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，分別進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳(TBE電泳緩沖液Tris 108克、Na2EDTA -2H20 7. 44克、硼酸55克，去離子水定容至1L)；切下回收目標(biāo)片斷和載體至以稱(chēng)重的1. 5ml EP管中，用QIAEX II Gel Extraction Kit 純化加入 3 倍體積的 Buffer QXl (IOOmg 加 300ul QXl)。加 30ul Buffer QIAEX II 然后50°C水浴10分鐘，期間每?jī)煞昼婁鰷u振蕩一次。13000rpm離心30秒，棄去上清，加 500ulQIAEX I洗一次，加Buffer PE 500ul洗兩次棄去上清，空氣干燥15分鐘直至沉淀變白。加入20ulTE漩渦振蕩30秒培育5分鐘，13000rpm,離心30秒將上清移入1. 5mlEP管， 測(cè)量濃度。根據(jù)hfusion技術(shù)原理，線性化pCMV載體與R-U5-PSI片段有15 25個(gè)堿基重合，R-U5-PSI片段與U3-R片段也有15 25個(gè)堿基重合，U3-R片段與線性化pCMV載體也有15 25個(gè)堿基重合，hfusion技術(shù)能使其根據(jù)重合部分定向拼接。使用Clonetech 公司的hfusion試劑盒，具體操作如下5 Xh-Fusion buffer 2ul, Enzyme lul，線性化 pCMV載體，R-U5-PSI片段，U3-R片段，水，總體積10ul。載體與各片段的用量滿(mǎn)足其摩爾比2 1。hfusion混合液37°C處理15分鐘，50°C處理15分鐘，加入40ul TE緩沖液，補(bǔ)足50ul，取2. 5ul轉(zhuǎn)化至DH5 α。經(jīng)轉(zhuǎn)化的DH5 α冰中放置30分鐘，42°C加熱45秒鐘后， 再冰中放置1分鐘。加入LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘。取IOOul涂含有氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落，挑單菌落至含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)，將培養(yǎng)8小時(shí)的菌液用QIApr印Spin Miniprep Kit小提質(zhì)粒將菌液倒入標(biāo)記好的1. 5ml離心管中，13000rpm，4°C，3分鐘，離心棄去上清；加250ul Buffer P1，混勻，加250ul Buffer P2，迅速輕輕顛倒4_6次；加入350ul Buffer N3，顛倒4_6次混勻， 有白色絮狀物析出，13000rpm，4°C，10分鐘；把QIAprep spin column放于1. 5ml EP管中 (收集廢液)然后將上清移入QIApr印spin column中，8000rpm 4°C 1分鐘；棄去廢液，加 750ul Buffer ΡΕ, 13000rpm, 4°C，1 分鐘，棄去廢液，13000rpm, 4°C，1 分鐘離心，將 QIApr印spin column移入新的1. 5ml離心管中，豎直加30ulBuffer EB于膜上，放置1分鐘后，4°C， 13000rpm，lmin離心獲得液體單克隆的質(zhì)粒。測(cè)序鑒定正確。見(jiàn)附圖1。
實(shí)施例2 pTAR的應(yīng)用與HCV/HIV內(nèi)參照品的建立通過(guò)序列比對(duì)分析設(shè)計(jì)丙型肝炎病毒(HCV)的檢測(cè)靶標(biāo)序列和人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(HIV)的檢測(cè)靶標(biāo)序列，并將兩種病毒的靶標(biāo)序列拼接為嵌合序列，嵌合序列中的靶標(biāo)序列不限于以上兩種病毒。在參照品靶標(biāo)載體PTAR多克隆酶切位點(diǎn)MCS插入針對(duì) PCR檢測(cè)的HIV和HCV內(nèi)參照品靶標(biāo)序列，命名為其中包括引物序列的上游和下游，內(nèi)參照品的探針序列。HCV內(nèi)參照品靶標(biāo)序列HCV-ICHCV-F 5' -AGTAGYGTTGGGTYGCGAAAG-3，HCV-R :5’ -GAGACCTCCCGGGGCACTC-3，HCV-IC 探針HEX-ACACCATACGTACCAGCGTAG-ECLIPSEHIV內(nèi)參照品靶標(biāo)序列HIV-ICHIV-F 5' -CAGGTCTTCCCGACGATGAC-3，HIV-R 5' -ACTTGACTGGCGACGTAATCC-3，HIV-IC 探針5’ -HEX-TGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGT-ECLIPSE-3’基因合成上述引物探針的靶標(biāo)序列，并將安裝在TA克隆上進(jìn)行下一步基因操作。1. pTAR 的應(yīng)用pTAR-HCV/HIV-IC 的構(gòu)建將合成得到的在靶標(biāo)TA克隆分別用EcoRlAalI酶切，同時(shí)用對(duì)應(yīng)的酶酶切載體， 使用T4連接酶將其連接到參照品靶標(biāo)載體pTAR。具體操作如下用上述限制性?xún)?nèi)切酶消化合成靶標(biāo)序列的TA克隆和參照品靶標(biāo)載體pTAR，酶切體系為10XNEBuffer3 IOulJg 制性?xún)?nèi)切酶各5ul、BSA lul、質(zhì)粒DNA 5ug、雙蒸水補(bǔ)足100ul，37°C溫育2小時(shí)。瓊脂糖電泳(TBE電泳緩沖液Tris 108克、Na2EDTA · 2H20 7. 44克、硼酸55克，去離子水定容至1L)；切下回收目標(biāo)片斷和載體至以稱(chēng)重的1.5ml EP管中，用QIAEX II Gel Extraction Kit 純化加入 3 倍體積的 Buffer QXl (IOOmg 加 300ul QXl)。加 30ul Buffer QIAEX II 然后50°C水浴10分鐘，期間每?jī)煞昼婁鰷u振蕩一次。13000rpm離心1分鐘，棄去上清，加 500ul QIAEX I洗一次，加Buffer PE 500ul洗兩次棄去上清，空氣干燥15min直至沉淀變白。加入20ul TE緩沖液漩渦振蕩30秒，放置5分鐘，13000rpm,離心30秒將上清移入 1.5ml離心管，測(cè)量濃度。經(jīng)過(guò)計(jì)算，將靶標(biāo)基因片段與pTAR載體基因片段按3 1摩爾數(shù)比例用T4連接酶(Invirtogen公司)分別進(jìn)行定向連接，連接體系:5X Ligase Reaction Buffer 4ul、pTAR 載體 30fmol、靶標(biāo)基因片段 90fmol、T4 DNA Ligase 0. 1U、去離子水補(bǔ)足至20ul，混勻后室溫靜止1小時(shí)。取2ul轉(zhuǎn)化至DH5 α，冰中放置30分鐘，42°C加熱45秒鐘后，再冰中放置1分鐘。加入LB培養(yǎng)基，37°C搖晃培養(yǎng)60分鐘。取IOOul涂布含有氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落，挑單菌落至含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)。將培養(yǎng)8小時(shí)的菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小提質(zhì)粒將菌液倒入標(biāo)記好的1. 5ml離心管中，13000rpm，4°C，3分鐘，離心棄去上清；加250ul Buffer PI, 混勻(不留塊狀沉淀)，加250ul Buffer P2，迅速輕輕顛倒4_6次；加入350ul Buffer N3， 顛倒4-6次混勻，有白色絮狀物析出，13000rpm，4°C，10分鐘；把QIApr印spin column放于一 1.5ml EP管中(收集廢液)然后將上清移入QIApr印spin column中，8000rpm 4°C離心1分鐘，棄去廢液；加750ul Buffer PE，13000rpm，4°C，離心1分鐘，棄去廢液；13000rpm, 4°C，離心1分鐘，將QIAprep spin column移入新的1. 5ml離心管中，豎直加30ul Buffer EB于膜上，放置1分鐘后，4°C，13000rpm，離心1分鐘獲得液體單克隆的質(zhì)粒。pTAR-HCV/ HIV-IC測(cè)序鑒定正確。見(jiàn)附圖22. HCV/HIV內(nèi)參照品的建立將pTAR-HCV/HIV-IC內(nèi)參照品靶標(biāo)質(zhì)粒，MLV gag-pol元件質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株^3T，同時(shí)轉(zhuǎn)染HCV膜蛋白質(zhì)?；虿晦D(zhuǎn)染膜蛋白質(zhì)粒，包裝出攜帶或不攜帶病毒表面膜蛋白的HCV/HIV內(nèi)參照品。表面攜帶HCV膜蛋白HCV/HIV內(nèi)參照品命名為 IC-HCV/HIV-1，表面不攜帶病毒膜蛋白，僅為細(xì)胞磷脂雙分子層的HCV/HIV內(nèi)參照品命名為IC-HCV/HIV-0。具體操作如下pTAR-HCV/HIV-IC內(nèi)參照品靶標(biāo)質(zhì)粒，MLV gag-pol元件質(zhì)粒，HCV膜蛋白質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度后，都調(diào)整到0. lug/ul，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株^3T，包裝表面攜帶HCV膜蛋白HCV/HIV內(nèi)參照品，命名為IC-HCV/ HIV-I ；同時(shí)在不添加HCV膜蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的情況下，僅pTAR-HCV/HIV-IC內(nèi)參照品靶標(biāo)質(zhì)粒，MLV gag-pol元件質(zhì)粒，兩質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株^3T，包裝表面不攜帶病毒膜蛋白，僅為細(xì)胞磷脂雙分子層的HCV/HIV內(nèi)參照品，命名為IC-HCV/HIV-0。使用Polyi^ect Transfection Kit，取 pTAR-HCV/HIV 內(nèi)參照品靶標(biāo)質(zhì)粒、MLV gag-pol 元件質(zhì)粒(0. Iug/ ul)各8ul、HCV膜蛋白質(zhì)粒(0. lug/ul) 3ul混合；取pTAR-HCV/HIV內(nèi)參照品靶標(biāo)質(zhì)粒、MLV gag-pol元件質(zhì)粒(0. lug/ul)各8ul混合，分別加DMEM 80ul充分混勻，加轉(zhuǎn)染試劑20ul混勻，室溫靜止5 10分鐘。細(xì)胞用0. OlM PBS洗兩遍，0. 25% Trypsin EDTA消化后， 加完全培養(yǎng)基吹打分散，計(jì)數(shù)，6孔板每孔種150萬(wàn)個(gè)細(xì)胞補(bǔ)足每孔培養(yǎng)基終體積1. 5ml，待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用600ul完全培養(yǎng)基稀釋后加入6孔板，輕拍，使質(zhì)粒復(fù)合體在細(xì)胞懸液中充分混勻。37°C 5% C02 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時(shí)，吸去轉(zhuǎn)染混合液，PBS輕輕洗細(xì)胞3遍，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。收集上清，用0. 45umPVDF膜過(guò)濾，4°C保存，即含有HCV/HIV 內(nèi)參照品上清。HCV/HIV內(nèi)參照品的驗(yàn)證，具體方法使用QIAGEN公司QIAamp Ultraseus virus 試劑盒提取HCV/HIV內(nèi)參照品核酸，提取步驟見(jiàn)實(shí)施例1描述。使用HCV-F，HIV-R引物 RT-PCR 擴(kuò)增 HCV/HIV 內(nèi)參照品核酸，用 One step primescr-iptTM RT-PCR Kit (TaKaRa 公司)RT-PCR 反應(yīng)體系2XOne Step RT-PCR Buffer III IOul、TaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ ul)0. 5ul、PrimeS-criptTM RT Enzyme Mix II 0. 5ul、上游引物終濃度 200nM、下游引物終濃度200nM、樣品核酸2ul、無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)足20ul。RT-PCR反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄42°C 5 分鐘反轉(zhuǎn)錄酶熱變性失活94°C IOs ；95°C變性5s，60°C退火延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。RT-PCR 產(chǎn)物通過(guò)電泳驗(yàn)證片段大小，見(jiàn)附圖3。實(shí)施例3 HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品與HCV病毒的檢測(cè)敏感性1. HCV檢測(cè)陽(yáng)性參照品的建立HCV陽(yáng)性參照品靶標(biāo)序列HCV-PCHCV-F 5' -AGTAGYGTTGGGTYGCGAAAG-3，HCV-R 5’ -GAGACCTCCCGGGGCACTC-3’HCV-PC 探針5，-FAM-AAGCACCCTATCAGGCAGTAC-ECLIPSE-3，基因合成上述引物探針的靶標(biāo)序列，并將安裝在TA克隆上進(jìn)行下一步基因操作，該靶標(biāo)序列中包含用于檢測(cè)HCV病毒的引物探針。使用實(shí)施例2中構(gòu)建pTAR-HCV/HIV-IC的方法，將HCV-PC的序列插入到載體 PTAR，獲得HCV陽(yáng)性參照品靶標(biāo)載體pTAR-HCV-PC。使用實(shí)施例2中建立HCV/HIV內(nèi)參照品的方法建立HCV陽(yáng)性參照品。2. HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品與HCV檢測(cè)陽(yáng)性參照品的檢測(cè)靈敏度比較為了最大限度模擬目標(biāo)病毒核酸擴(kuò)增過(guò)程，有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品的檢測(cè)探針的長(zhǎng)度與目標(biāo)病毒檢測(cè)探針一致，檢測(cè)探針的四種核苷酸殘基的比例與目標(biāo)病毒檢測(cè)探針一致，檢測(cè)探針的溶解溫度(Tm值)與目標(biāo)病毒檢測(cè)探針一致。為了檢驗(yàn)HCV內(nèi)參照品檢測(cè)靶標(biāo)和HCV病毒檢測(cè)靶標(biāo)的檢測(cè)敏感性，將HCV內(nèi)參照品與HCV陽(yáng)性參照品初始液等體積混合，然后10倍系列稀釋?zhuān)謩e為ΙΟΛ ΟΛ ΟΛΚΓ4，共4個(gè)稀釋度。使用 QIAGEN公司QIAamp Ultrasens virus試劑盒提取核酸，提取步驟見(jiàn)實(shí)施例1描述。使用 HCV-F, HCV-R引物，HCV-PC探針和HCV-IC探針對(duì)核酸樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，熒光定量 PCR 設(shè)置為 FAM 與 HEX 兩種熒光檢測(cè)，用 One step primescriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa 公司)RT-PCR反應(yīng)體系2X0ne Step RT-PCR Buffer III IOuUTaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ ul)0. 5ul、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0. 5ul、上游引物終濃度 200nM、下游引物終濃度200nM、HCV-PC探針和HCV-IC探針2. 5nM樣品核酸2ul、無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)足20ul。 RT-PCR反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄42°C 5分鐘反轉(zhuǎn)錄酶熱變性失活94°C IOs ；95°C變性k，60°C退火延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)PCR定量結(jié)果Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線與稀釋度作相關(guān)性分析， HCV內(nèi)參照品與HCV陽(yáng)性參照品的檢出Ct與稀釋度的負(fù)對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，相近的斜率反映了相近的檢測(cè)靈敏度，通過(guò)計(jì)算擴(kuò)增效率=10(1/斜率)-1，HCV內(nèi)參照品與HCV陽(yáng)性參照品的擴(kuò)增效率分別為1. 07與1. 01，見(jiàn)附圖4。實(shí)施例4HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品在HCV檢測(cè)中最適使用量在HCV的核酸檢測(cè)中，除了 HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品與HCV病毒樣品的檢測(cè)靶標(biāo)靈敏度在理論上和實(shí)際檢測(cè)上相互一致，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，由于內(nèi)參照品和病毒核酸競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系的各種成分，內(nèi)參照品過(guò)量會(huì)引起目標(biāo)病毒檢測(cè)信號(hào)的偏差，或者內(nèi)參照品不足則不能達(dá)到內(nèi)參照的目的，因此需要在一定的范圍內(nèi)合理使用HCV病毒核酸內(nèi)參照品。本方案中使用HCV內(nèi)參照品和HCV陽(yáng)性參照品模擬HCV病毒，分別作10倍系列稀釋并定量為105，IO4, IO3, IO2,10五個(gè)滴度，將內(nèi)參照品和陽(yáng)性參照品的五個(gè)滴度樣品分別混合得到25個(gè)混合樣品以及未有混合內(nèi)參照品的五個(gè)滴度的陽(yáng)性參照品作為對(duì)照。樣品混合后，按實(shí)施例1描述的方法提取核酸，和使用HCV-F，HCV-R引物，HCV-PC探針和HCV-IC探針對(duì)核酸樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，熒光定量PCR設(shè)置為FAM與HEX兩種熒光檢測(cè)，用One step primescriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa 公司)RT-PCR 反應(yīng)體系2 X One Step RT-PCR Buffer III IOul、TaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ul)0. 5ul,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0. 5ul、上游引物終濃度200nM、下游引物終濃度200nM、HCV-PC探針和HCV-IC探針2. 5nM樣品核酸2ul、無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)足20ul。RT-PCR反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄42°C 5分鐘反轉(zhuǎn)錄酶熱變性失活94°C IOs ；95°C變性k，60°C退火延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示內(nèi)參品滴度在IO4或以下不影響陽(yáng)性參照品的檢測(cè)，即是不影響病毒樣品的檢測(cè)，而內(nèi)參照品滴度在 IO3以上時(shí)，不會(huì)因?yàn)殛?yáng)性參照品滴度的影響而發(fā)生較大偏離，即不會(huì)因?yàn)椴《緲悠泛慷鴮?duì)內(nèi)參照品定量造成偏差，因此IO4是內(nèi)參照品的最適使用滴度，見(jiàn)附圖5。實(shí)施例5 HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)參照品與HCV病毒的耐受相關(guān)性HCV/HIV內(nèi)參照品為有膜擬似病毒，是有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，其病毒膜蛋白在理論上具有與真病毒一樣的耐受特點(diǎn)與病毒樣品混合后，在與目標(biāo)病毒處于同一理化學(xué)環(huán)境時(shí)能反映目標(biāo)病毒因同樣原因引起的生物生理降解過(guò)程。在實(shí)施例2中所建立的 HCV/HIV內(nèi)參照品是HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，含有HCV/HIV的內(nèi)參照靶標(biāo)，故本方案設(shè)計(jì)為HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品在HCV陽(yáng)性血清中以及各種條件下， 內(nèi)參照品核酸的檢測(cè)變化與HCV病毒核酸的檢測(cè)變化的相關(guān)性，反映HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)參照品與HCV病毒的耐受相關(guān)性。將經(jīng)過(guò)定量的HCV包膜的RNA病毒核酸檢測(cè)參照品調(diào)整至1100000拷貝/ml的起始量，與經(jīng)過(guò)病毒載量定量的HCV陽(yáng)性血清調(diào)整混合在Iml血清體積里，血清比例大于 90%，其中病毒核酸約1600000拷貝/ml (相對(duì)于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線定量)。該混合樣品準(zhǔn)備40 份，分別是第一組常溫環(huán)境放置10份；第二組在4°C環(huán)境放置10份；第三組-40°C環(huán)境放置10份；第四組-40°C環(huán)境放置但反復(fù)凍融的10份。起始時(shí)間點(diǎn)為0，隨后檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為6小時(shí)，M小時(shí)(第一天)，第2天，第3天，第7天，第14天，第21天，第觀天， 第42天，第56天。每次實(shí)驗(yàn)取出1份，第四組樣品每次均全部?jī)鋈凇Ｔ诔丨h(huán)境中由于樣品中可能存在核酸酶或其他未知因素導(dǎo)致樣品中病毒及其核酸降解，從而造成檢測(cè)量的變化。溫度越低，越有利于樣品保存，見(jiàn)附圖6。核酸提取過(guò)程使用QIAGEN公司QIAamp Ultraseus virus試劑盒提取HCV/HIV內(nèi)參照品核酸，提取步驟見(jiàn)實(shí)施例1描述。對(duì)所提取核酸同時(shí)進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)和內(nèi)參照品檢測(cè)。病毒核酸檢測(cè)與內(nèi)參照品檢測(cè)使用的弓I物相同，探針不同并且探針?biāo)鶐У臒晒庑盘?hào)不同。熒光定量RT-PCR設(shè)置為FAM與HEX兩種熒光檢測(cè)，使用HCV-F，HCV-R引物反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增樣品核酸，用One step primescriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa 公司)RT-PCR 反應(yīng)體系2 X One Step RT-PCR Buffer III IOul、TaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ul)0. 5ul,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0. 5ul、Rox校正染料0. 4ul、病毒檢測(cè)探針2. 5nM 2ul、內(nèi)參照品檢測(cè)探針2. 5nM 2ul、上游引物終濃度200nM、下游引物終濃度200nM、樣品核酸2ul、無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)足20ul。RT-PCR反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄42°C 5 分鐘反轉(zhuǎn)錄酶熱變性失活94°C IOs ；95°C變性5s，60°C退火延伸60s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)施例6HCV病毒核酸檢測(cè)參照品在HCV病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用1. HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品在HCV病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品的作用，一方面反映HCV病毒因各種原因引起的生物生理降解過(guò)程，通過(guò)對(duì)一定量的內(nèi)參照品的檢出效率和檢出值，評(píng)價(jià)HCV病毒核酸檢測(cè)過(guò)程的可靠性。將定量約1100000拷貝/ml的HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品與14個(gè)HCV血清樣品混合，核酸提取過(guò)程與RT-PCR檢測(cè)過(guò)程同時(shí)實(shí)施例5。HCV病毒核酸內(nèi)參照品在多個(gè)血清樣品中檢出量穩(wěn)定，可作為相對(duì)定量的基礎(chǔ)，見(jiàn)附圖7。另一方面內(nèi)參照品和病毒具有非常接近的檢測(cè)靈敏度，已知滴度的內(nèi)參照品可用于對(duì)目標(biāo)病毒進(jìn)行相對(duì)定量。具體方法如下將IO4拷貝數(shù)的HCV病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品和三個(gè)滴度HCV體外轉(zhuǎn)錄RNA混合，HCV體外轉(zhuǎn)錄RNA的拷貝數(shù)通過(guò)分光光度檢測(cè)和理論計(jì)算為4. 8 X 104，4. 8 X 103，4. 8 X IO2，通過(guò)對(duì)HCV病毒核酸內(nèi)參照品的檢測(cè)和HCV RNA的檢測(cè)Ct 值推算相對(duì)定量的RNA拷貝數(shù)，實(shí)驗(yàn)相對(duì)定量推算的HCV RNA拷貝數(shù)與理論計(jì)算值相符合，結(jié)果見(jiàn)表一。具體方法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR同時(shí)檢測(cè)樣品中HCV內(nèi)參照品和HCV體外轉(zhuǎn)錄RNA，熒光定量RT-PCR設(shè)置為FAM與HEX兩種熒光檢測(cè)，使用HCV-F，HCV-R引物反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增樣品核酸，用 One step primescriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa 公司)RT-PCR 反應(yīng)體系 2XOne Step RT-PCR Buffer III IOuUTaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ul)0. 5ul,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0. 5ul、Rox校正染料0.如1、病毒檢測(cè)探針2. 5nM 2ul、內(nèi)參照品檢測(cè)探針2. 5nM 2ul、上游引物終濃度200nM、下游引物終濃度200ηΜ、樣品核酸2ul、無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)足20ul。RT-PCR反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄42°C 5分鐘反轉(zhuǎn)錄酶熱變性失活94°C IOs ；95°C 變性k，60°C退火延伸60s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果表明，HCV病毒核酸檢測(cè)參照品除了評(píng)價(jià)HCV 病毒核酸檢測(cè)過(guò)程的可靠性，還可應(yīng)用于HCV病毒載量檢測(cè)。表一
RNA Ct值理論RNA拷貝數(shù)IC Ct值IC拷貝數(shù)相對(duì)定量RNA拷貝數(shù)25.0054.80E+0427.2951.E+0449424.1710429.0554.80E+0327.3751.E+043096.77099734.1854.80E+0227.331.E+0483.700349752. HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品/標(biāo)準(zhǔn)品在HCV病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品/標(biāo)準(zhǔn)品，是與病毒具有相同的檢測(cè)靶標(biāo)和檢測(cè)信號(hào)的參照品，可作為HCV病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，用于在核酸檢測(cè)過(guò)程中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于將HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品是擬似RNA病毒，其核酸為RNA，與過(guò)去質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品核酸與樣品核酸性質(zhì)一致，在檢測(cè)過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在逆轉(zhuǎn)錄效率上一致，因此在定量或者比較等應(yīng)用中更具有參考意義，更能反映檢測(cè)過(guò)程中人為的或系統(tǒng)的誤差影響。將已知量的HCV病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品提取核酸，將核酸10倍系列稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用HCV病毒檢測(cè)引物和探針，用One step primescriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa 公司)RT-PCR 反應(yīng)體系2X0ne Step RT-PCR Buffer III IOul、TaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ul)0. 5ul,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0.5ul、 Rox校正染料0.如1、病毒檢測(cè)探針2. 5nM 2ul、內(nèi)參照品檢測(cè)探針2. 5nM 2ul、上游引物終濃度200nM、下游引物終濃度200ηΜ、樣品核酸2ul、無(wú)RNA酶去離子水補(bǔ)足20ul。RT-PCR反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄42°C 5分鐘反轉(zhuǎn)錄酶熱變性失活94°C IOs ；95°C變性k，60°C退火延伸60s， 共40個(gè)循環(huán)。見(jiàn)附圖8。
權(quán)利要求
1.一種有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，其特征在于，參照品是具體有包膜RNA病毒的擬似病毒，能模擬有包膜RNA病毒結(jié)構(gòu)及理化學(xué)特性特點(diǎn)，能真實(shí)反應(yīng)各種理化學(xué)環(huán)境因素對(duì)目標(biāo)病毒的影響。無(wú)復(fù)制能力，無(wú)傳染性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，其特征在于，參照品包膜與有包膜RNA病毒一樣是磷脂雙分子層，可以表達(dá)或不表達(dá)具體有包膜RNA病毒的包膜蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具體有包膜RNA病毒的擬似病毒，被模擬的病毒包括但不限于人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，流感病毒，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，其特征在于，通過(guò)重組病毒技術(shù)從真核細(xì)胞中包裝出來(lái)，可通過(guò)基因操作技術(shù)讓參照品顆粒內(nèi)部攜帶外源目的RNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與具體有包膜RNA病毒的包膜蛋白，包括但不限于人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，流感病毒，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒 (SARS-CoV)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，其特征在于，含有RNA病毒核酸檢測(cè)的RNA靶標(biāo)序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的RNA病毒核酸檢測(cè)的RNA靶標(biāo)序列，其特征在于，該RNA靶標(biāo)序列是通過(guò)基因操作將其插入或替換。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的RNA病毒核酸檢測(cè)的RNA靶標(biāo)序列，其特征在于，該RNA靶標(biāo)序列可以是一個(gè)目標(biāo)病毒的一段檢測(cè)靶標(biāo)序列或多段檢測(cè)靶標(biāo)的嵌合序列，或是多個(gè)目標(biāo)病毒檢測(cè)靶標(biāo)的嵌合序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品和根據(jù)權(quán)利要求6所述的 RNA病毒核酸檢測(cè)的RNA靶標(biāo)序列，其特征在于，有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品能容納外源目的RNA靶標(biāo)序列長(zhǎng)度至少為3000bp。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的RNA病毒核酸檢測(cè)的RNA靶標(biāo)序列，其特征在于，含有檢測(cè)目標(biāo)病毒的引物序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的RNA病毒核酸檢測(cè)的RNA靶標(biāo)序列，其特征在于，含有檢測(cè)目標(biāo)病毒的特異性檢測(cè)探針序列，或含有與目標(biāo)病毒不同的檢測(cè)探針序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，其特征在于，在檢測(cè)過(guò)程中參照品與目標(biāo)病毒共用相同的檢測(cè)引物，相同或不同的檢測(cè)探針和報(bào)告信號(hào)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的相同的檢測(cè)探針和報(bào)告信號(hào)，其特征在于，有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品是作為檢測(cè)目標(biāo)病毒過(guò)程的陽(yáng)性參照品。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的不同的檢測(cè)探針和報(bào)告信號(hào)，其特征在于，有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品是作為檢測(cè)目標(biāo)病毒過(guò)程的內(nèi)參照品。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品，其特征在于，有包膜 RNA病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品的檢測(cè)與目標(biāo)病毒的檢測(cè)是獨(dú)立的檢測(cè)過(guò)程。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品，其特征在于，有包膜 RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品的檢測(cè)與目標(biāo)病毒的檢測(cè)是同一個(gè)檢測(cè)過(guò)程。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品，其特征在于，對(duì)內(nèi)參照品檢測(cè)與對(duì)目標(biāo)病毒檢測(cè)的報(bào)告信號(hào)相互獨(dú)立，對(duì)目標(biāo)病毒的檢測(cè)不產(chǎn)生影響。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品，其特征在于，內(nèi)參照品檢測(cè)探針的長(zhǎng)度與目標(biāo)病毒檢測(cè)探針一致，最大限度模擬目標(biāo)病毒核酸擴(kuò)增過(guò)程。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品，其特征在于，內(nèi)參照品檢測(cè)探針的四種核苷酸殘基的比例與目標(biāo)病毒檢測(cè)探針一致，最大限度模擬目標(biāo)病毒核酸擴(kuò)增過(guò)程。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品，其特征在于，內(nèi)參照品檢測(cè)探針的溶解溫度(Tm值)與目標(biāo)病毒檢測(cè)探針一致，最大限度模擬目標(biāo)病毒核酸擴(kuò)增過(guò)程。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，可用于有包膜RNA病毒核酸的定性檢測(cè)，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法與核酸分子雜交方法。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品，可用于有包膜RNA病毒核酸的定量檢測(cè)，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法與核酸分子雜交方法。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的定性檢測(cè)和根據(jù)權(quán)利要求22所述的定量檢測(cè)，其特點(diǎn)在于，其中有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)內(nèi)參照品在采樣后盡快加入樣品中，參與樣品各種處理及核酸檢測(cè)過(guò)程。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的定性檢測(cè)和根據(jù)權(quán)利要求22所述的定量檢測(cè)，其特點(diǎn)在于，其中有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性參照品不與樣品混合，與樣品并行參與各種處理及核酸檢測(cè)過(guò)程。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品平臺(tái)，主要通過(guò)由攜帶外源目的序列的載體與含MLV gag-pol元件的載體，包括或不包括病毒膜蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染參照品生產(chǎn)細(xì)胞株制作而成，是有包膜RNA病毒的擬似病毒，模擬了病毒表面的磷脂雙分子層或者更進(jìn)一步地模擬了病毒膜蛋白表面活性，具有具體有包膜RNA病毒結(jié)構(gòu)及理化學(xué)特性特點(diǎn)，無(wú)復(fù)制能力，無(wú)傳染性。有包膜RNA病毒核酸檢測(cè)參照品/標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)重組病毒技術(shù)從真核細(xì)胞中包裝出來(lái)，平臺(tái)可通過(guò)基因操作技術(shù)讓參照品/標(biāo)準(zhǔn)品顆粒內(nèi)部攜帶外源目的RNA序列，參照品/標(biāo)準(zhǔn)品具有與目標(biāo)病毒同樣的病毒包膜蛋白和相近的病毒結(jié)構(gòu)特性以及拓?fù)鋵W(xué)特性，能真實(shí)反應(yīng)各種理化學(xué)環(huán)境因素對(duì)目標(biāo)病毒的影響。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102199674SQ20111006361
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者張永輝, 林小靖, 王岳 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所