專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種對(duì)豬Hokovirus 進(jìn)行檢測(cè)的PCR方法。
背景技術(shù)：
豬Hokovirus (PHoV)是2008年在香港新發(fā)現(xiàn)的一種豬細(xì)小病毒(Lau等 Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4. J. Gen. Virol. 2008，89: 1840-1848)，其與牛Hokovirus 同屬于 Hokovirus亞型，兩者都屬于細(xì)小病毒屬(/^arraririaae)。豬Hokovirus與人4型和5型細(xì)小病毒(PARV4/5)的親緣關(guān)系非常接近。豬細(xì)小病毒可引起豬的繁殖障礙病，以懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊為特征。各種不同年齡、性別的家豬和野豬均易感。傳染源主要來(lái)自感染細(xì)小病毒的母豬和帶毒的公豬，后備母豬比經(jīng)產(chǎn)母豬易感染，病毒能通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播，感染母豬所產(chǎn)的死胎、 仔豬及子宮內(nèi)的排泄物中均含有很高滴度的病毒，而帶毒豬所產(chǎn)的活豬可能帶毒排毒時(shí)間很長(zhǎng)甚至終生。豬Hokovirus雖然屬于細(xì)小病毒屬，但目前尚無(wú)其致病的報(bào)道，不過(guò)Lau等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在健康豬群和患病豬群豬的淋巴結(jié)、血清、肝臟、鼻拭子和糞便中都能檢測(cè)出該病毒的存在，且感染率非常高，可達(dá)44. 4%。從而，推測(cè)豬Hokovirus病毒可能會(huì)感染豬的大部分組織，而且由于在健康豬和患病豬中豬Hokovirus的感染率沒(méi)有差異，所以該病毒是否會(huì)導(dǎo)致發(fā)病還需進(jìn)一步的研究。同時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)豬Hokovirus與豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)發(fā)生混合感染的現(xiàn)象十分普遍，混合感染率在64%左右。2010年，德國(guó)柏林的研究者Cornelia Adlhoch及其同事報(bào)道了豬Hokovirus在野豬中流行的石if究(Adlhoch 等 High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations. Virol. J. 2010, 7: 171)。該研究發(fā)現(xiàn)，在德國(guó)接受檢測(cè)的野豬當(dāng)中大約有三分之一攜帶豬Hokovirus病毒。另外，研究學(xué)者采用最新確立的定量實(shí)時(shí)PCR方法，在德國(guó)五個(gè)不同地區(qū)對(duì)野豬當(dāng)中豬Hokovirus感染情況進(jìn)行調(diào)查。在對(duì)收集的肝臟和血清樣本進(jìn)行分析之后發(fā)現(xiàn)，野豬中豬Hokovirus總體流行率非常高(32. 7%，51/156)。而且他們發(fā)現(xiàn)，該病毒的流行率因地區(qū)而異，隨年齡增大而升高。在1年齡以?xún)?nèi)的野豬當(dāng)中， 流行率為22%，但在成年野豬當(dāng)中流行率上升為41%。對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的三個(gè)分離株的兩個(gè)接近全長(zhǎng)的基因組和一個(gè)基因大片段進(jìn)行了序列測(cè)定，并進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明， 德國(guó)野豬Hokovirus的基因序列與香港分離株表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系，其推測(cè)是由于動(dòng)物產(chǎn)品的貿(mào)易往來(lái)導(dǎo)致該病毒從香港傳入德國(guó)。到目前為止，人們對(duì)豬Hokovirus在除香港和德國(guó)以外的世界其它地方的存在與流行情況一無(wú)所知。而在2010年以來(lái)，我國(guó)大陸地區(qū)新發(fā)現(xiàn)了 3種新亞型的細(xì)小病毒， 分別為豬博卡病毒(porcine bocavirus)、豬細(xì)小病毒4型(PPV4)和豬Cnvirus (Huang等 Detection of a novel porcine parvovirus, PPV4, in Chinese swine herds. Virol. J. 2010,7: 333 ；Wang 等 Novel parvovirus sublineage in the family of Parvoviridae. Virus Genes. 2010,41: 305-308 ;Zhai 等 High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch. Virol. 2010, 155: 1313-1317)。因此，豬Hokovirus是否會(huì)和這些新的細(xì)小病毒一同在我國(guó)大陸出現(xiàn)成為研究的熱點(diǎn)。 基于以上研究，申請(qǐng)人根據(jù)香港和德國(guó)研究者登錄在GenBank中豬Hokovirus的基因序列(登錄號(hào)GQ869539_GQ86卯43)設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)檢測(cè)豬Hokovirus的引物，建立了檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法，并發(fā)現(xiàn)了該病毒確實(shí)存在于我國(guó)豬群當(dāng)中。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低的檢測(cè)豬Hokovirus 的PCR方法。技術(shù)方案
參考GenBank登錄的豬Hokovirus基因組序列(登錄號(hào)GQ869539_GQ86卯43)，設(shè)計(jì)檢測(cè)豬Hokovirus PCR方法的引物，其上、下游引物序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2
上游引物PHoVF: 5，- GTTGGTCCTGGTAATCCTTTGG-3，，在基因組中的位置為 2775-2796
bp ；
下游引物PHoVR: 5，- AGTCCTGGTATGAGAAGTGACG-3，，在基因組中的位置為 3293-3314bp。檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法，包括以下步驟
(1)豬HokovirusDNA的提取取472. 5 μ 1血清或100 mg的動(dòng)物組織，加入1 ml PBS 緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1， 加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過(guò)夜或50°C水浴4小時(shí)，加入等量酚氯仿異戊醇(25 M 1)抽提2次，取上清加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20°C 1小時(shí)，12000 rpm離心10分鐘。棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超純水溶解，即為檢測(cè)用DNA模板。提取的DNA模板于-70°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)將上、下游引物與PCR混合液加入PCR反應(yīng)管中，混合后加入待檢樣品DNA；
(3)將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)；
(4)取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳；
結(jié)果判定有擴(kuò)增產(chǎn)物約為MO bp條帶，為陽(yáng)性；無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物約為MO bp為陰性。步驟(2)所述的PCR混合物包括采用25 μ 1的PCR反應(yīng)體系，在0. 2 ml PCR反應(yīng)管中分別加入 IOXPCR 緩沖液 2. 5 μ l,dNTP (2.5 mM) 1. O μ l，MgC12 (25 mM) 1. 5 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ1,5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0. 5 41，0嫩模板1 μ ，用滅菌超純水加至總體積，混勻。步驟(3)的擴(kuò)增條件為94°C，5分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94°C，1分鐘， 530C，1分鐘，72°C，1分鐘共循環(huán)35次；最后72°C延伸10分鐘。
本發(fā)明檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法，陽(yáng)性對(duì)照品為含有VP1/2基因的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，由PCR擴(kuò)增的MO bp產(chǎn)物連接到載體pMDIS-T (大連寶生物工程有限公司)制備而成，濃度為 1.68X1011 copies/μ L·有益效果
本發(fā)明根據(jù)GenBank中發(fā)表的有關(guān)豬Hokovirus的序列(登錄號(hào) GQ869539-GQ86卯43)，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析，選取VP1/2基因中保守的片段設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，對(duì)豬Hokovirus進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到MO bp的特異性條帶。本研究建立的豬Hokovirus檢測(cè)PCR方法對(duì)其他常見(jiàn)動(dòng)物病原體(豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、豬博卡病毒、豬輸血傳播病毒、乙型腦炎病毒、豬Cnvirus)均無(wú)反應(yīng)；敏感性試驗(yàn)表明，最小檢出量為IO4 copies。Hokovirus感染豬的血清、糞便、肝臟、肺臟、扁桃體、淋巴結(jié)等DNA提取物用本發(fā)明建立的PCR方法檢測(cè)，均擴(kuò)增出大小約MO bp的DNA片段，適用于臨床檢測(cè)。


圖1 檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法特異性試驗(yàn)電泳結(jié)果圖，其中泳道1為豬 Hokovirus ；泳道2-9分別為豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、豬博卡病毒、豬輸血傳播病毒、乙型腦炎病毒、豬Cnvirus ；M表示DNA Marker (DL2000)。圖2 檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法敏感性試驗(yàn)電泳結(jié)果圖，其中泳道1為未稀釋的含VP1/2基因的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒；泳道2-10為連續(xù)10倍稀釋的模板；M表示DNA Marker (DL2000)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
臨床采集的豬(江蘇省蘇州常熟市謝橋豬場(chǎng))血清和肝臟，進(jìn)行豬Hokovirus的檢測(cè)，具體步驟如下
(1)DNA的提取取472.5 μ 1血清；并取100 mg肝臟，加入1 ml PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，_20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1，加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過(guò)夜或50°C水浴4小時(shí)，加入等量酚氯仿異戊醇(2524:1)抽提2次，取上清，加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20°C 1小時(shí)，12000 rpm離心10分鐘。棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超純水溶解，即為檢測(cè)用DNA模板。提取的DNA模板于_70°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)采用25μ 1的PCR反應(yīng)體系，在0.2 ml PCR反應(yīng)管中分別加入10XPCR緩沖液 2.5 μ l,dNTP (2. 5 mM)l. 0 μ l，MgC12 (25 mM)l. 5 μ 1，上、下游引物各 0· 5 μ l,5U/y 1 Taq DNA聚合酶0.5 yl，DNA模板1 μ 1，用滅菌超純水加至總體積，混勻。(3)PCR擴(kuò)增條件為:94°C，5分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94°C，1分鐘，53°C，1分鐘， 720C，1分鐘共循環(huán)35次；最后72°C延伸10分鐘。
(4)取10 μ 1上述的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果血清和肝臟組織擴(kuò)增產(chǎn)物均約為討0 bp，結(jié)果大小相符，判為豬Hokovirus陽(yáng)性。實(shí)施例2
按實(shí)施例1方法，以豬Hokovirus陽(yáng)性病料作為陽(yáng)性對(duì)照，分別對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、豬博卡病毒、豬輸血傳播病毒、乙型腦炎病毒、豬Cnvirus進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未能擴(kuò)增出任何條帶，而豬Hokovirus陽(yáng)性病料擴(kuò)增出約 540 bp 大小的條帶，見(jiàn)圖 1。其序列為 SEQ ID NO. 3 GTTGGTCCTGGTAATCCTTTGGATAATGCTC CCGCTAAGGGACCAGTGGATGAAGCAGCGAAACACCACGATGAACGGTACGATGAAATGCTTCGCCATGGTGATTTG CCATACATCCATGGGAGAGGGGCTGATAGGTTGATGAATAAGGAGATAGAGAGGGCGGAGCAGGAGGGTAAAATTGA TAACCCTGTGGATGCATTGGTGGGTAATGCAATCCGGGGTATCTGGGAGGCAAAGGAGACTCTTGGGGATATTGCAG ATGTTCAATTATCACAGGTTTTACCGCCCGACCCGCCTACCAGCCAAGTGCTTCCGGGCTCTTCAGAAGACGCCCCC AGCCCGAAGAGACAGAGGGCTGGTACCCCTGATTCTGTTCCTACGCCTGGCAACCCATCCCCTGCGCCAATTGCTGA TCCTGCTACAATCATGGCTGCGCCGGTAACGGGCGCCACCGGTGGGGGTATCAAAGTTAAAGCTCAATGGTTGGGGG GCACTCATTTCTCTGATAATACCATCGTCACTTCCCATACCAGGACT。陽(yáng)性對(duì)照品為含有VP1/2基因的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，由PCR擴(kuò)增的MO bp產(chǎn)物連接到載體PMD18-T (大連寶生物工程有限公司)制備而成，濃度為1.68X1011 copies/μ L·實(shí)施例3 敏感性試驗(yàn)
將含VP1/2基因的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒(IO11 copies)用配置的TE (PH8. 0) 10倍遞增稀釋作為模板，每個(gè)稀釋度各取2 μ 1作為模板，按實(shí)施例1方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察陽(yáng)性條帶， 以出現(xiàn)陽(yáng)性預(yù)期條帶所用模板量的最高稀釋度計(jì)算其敏感性，結(jié)果表明最小檢出量為IO4 copies，見(jiàn)圖 2。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)豬Hokovirus的引物其上、下游引物序列分別為SEQID NO. 1和SEQ ID NO.2。
2.權(quán)利要求1所述引物用于檢測(cè)豬Hokovirus的PCR方法，包括以下步驟(1)豬HokovirusDNA的提取取472. 5 μ 1血清或100 mg的動(dòng)物組織，加入1 ml PBS 緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1， 加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過(guò)夜或50°C 水浴4小時(shí)，加入等量酚氯仿異戊醇體積比25:24:1抽提2次，取上清，加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于_20°C 1小時(shí)，12000 rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超純水溶解，即為檢測(cè)用DNA模板，提取的DNA模板于_70°C保存?zhèn)溆茫?2)將上、下游引物與PCR混合液加入PCR反應(yīng)管中，混合后加入待檢樣品DNA；(3)將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)；(4)取PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比為1%的瓊脂糖凝膠上電泳；(5)結(jié)果判定有擴(kuò)增產(chǎn)物約為540bp條帶，為陽(yáng)性，即豬Hokovirus存在；無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物約為540 bp為陰性，即豬Hokovirus不存在；其中步驟(2)所述的PCR混合液包括采用25 μ 1的PCR反應(yīng)體系，在0. 2 ml PCR反應(yīng)管中分別加入 IOXPCR緩沖液2. 5 μ 1,2. 5 mM WdNTP 1.0 μ 1,25 mM的MgCl2L 5 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ1,5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0. 5 41，0嫩模板1 μ ，用滅菌超純水加至總體積，混勻；步驟(3)的擴(kuò)增條件為94°C，5分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94°C，1分鐘，53°C，1分鐘， 720C，1分鐘共循環(huán)35次；最后72°C延伸10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于陽(yáng)性對(duì)照品為含有VP1/2基因的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為 1.68X1011 copies/μ L·
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)2或3所述的方法，其特征在于所述的擴(kuò)增產(chǎn)物約540bp，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬Hokovirus的PCR檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體采用25μl的PCR反應(yīng)體系，在0.2mlPCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入緩沖液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用滅菌超純水加至總體積，將試劑混合均勻后，至于PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行變性、退火、延伸，共循環(huán)35次；PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外投射儀下觀察PCR產(chǎn)物，并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，陽(yáng)性樣品可出現(xiàn)540bp片段。本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法敏感性高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、迅速，并且對(duì)檢測(cè)材料質(zhì)量要求低，便于臨床上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102154513SQ20111006335
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者何孔旺, 倪艷秀, 周俊明, 張雪寒, 李彬, 毛立, 溫立斌, 王小敏, 茅愛(ài)華, 郭容利 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院