專利名稱：一種用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種用于檢測豬Hokovirus 核苷酸的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
豬Hokovirus (PHoV)是2008年在香港新發(fā)現(xiàn)的一種豬細(xì)小病毒(Lau等 Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4. J. Gen. Virol. 2008，89: 1840-1848)，其與牛Hokovirus 同屬于 Hokovirus亞型，兩者都屬于細(xì)小病毒屬(Parvovirinae)。豬Hokovirus與人4型和5型細(xì)小病毒(PARV4/5)的親緣關(guān)系非常接近。豬Hokovirus雖然屬于細(xì)小病毒屬，但目前尚無其致病的報(bào)道，不過Lau等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在健康豬群和患病豬群豬的淋巴結(jié)、血清、肝臟、鼻拭子和糞便中都能檢測出該病毒的存在，且感染率非常高，可達(dá)44. 4%。從而，推測豬Hokovirus病毒可能會感染豬的大部分組織，而且由于在健康豬和患病豬中豬Hokovirus的感染率沒有差異，所以該病毒是否會導(dǎo)致發(fā)病還需進(jìn)一步的研究。同時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)，豬Hokovirus與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)發(fā)生混合感染的現(xiàn)象十分普遍，混合感染率在64%左右。2010年，德國柏林的研究者Cornelia Adlhoch及其同事報(bào)道了豬Hokovirus在野豬中流行的石if究(Adlhoch 等 High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations. Virol. J. 2010, 7: 171)。該研究發(fā)現(xiàn)，在德國接受檢測的野豬當(dāng)中大約有三分之一攜帶豬Hokovirus。另外，研究學(xué)者對德國五個(gè)不同地區(qū)野豬中豬 Hokovirus感染情況進(jìn)行調(diào)查。在對收集的肝臟和血清樣本進(jìn)行分析之后發(fā)現(xiàn)，野豬中豬 Hokovirus總體流行率非常高(32. 7%，51/156)。而且他們發(fā)現(xiàn)，該病毒的流行率因地區(qū)而異，隨年齡增大而升高。在1年齡以內(nèi)的野豬當(dāng)中，流行率為22%，但在成年野豬當(dāng)中流行率上升為41%。對來自不同地區(qū)的三個(gè)分離株的兩個(gè)接近全長的基因組和一個(gè)基因大片段進(jìn)行了序列測定，并進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，德國野豬Hokovirus的基因序列與香港分離株表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系，其推測是由于動物產(chǎn)品的貿(mào)易往來導(dǎo)致該病毒從香港傳入德國。到目前為止，人們對豬Hokovirus在除香港和德國以外的世界其它地方的存在與流行情況一無所知。而在2010年以來，我國大陸地區(qū)新發(fā)現(xiàn)了 3種新亞型的細(xì)小病毒， 分別為豬博卡病毒(porcine bocavirus)、豬細(xì)小病毒4型(PPV4)和豬Cnvirus (Huang 等 Detection of a novel porcine parvovirus, PPV4, in Chinese swine herds. Virol. J. 2010,7: 333 ；Wang 等 Novel parvovirus sublineage in the family of Parvoviridae. Virus Genes. 2010,41: 305-308 ;Zhai 等 High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch. Virol. 2010, 155: 1313-1317)。因此，豬Hokovirus是否會和這些新的細(xì)小病毒一同在我國大陸出現(xiàn)成為研究的熱點(diǎn)。 基于以上研究，申請人根據(jù)香港和德國研究者登錄在GenBank中豬Hokovirus的基因序列(登錄號GQ869539_GQ86卯43)，設(shè)計(jì)了用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的引物和探針。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的引物和探針序列。技術(shù)方案
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
1、一種用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的引物對，其特征在于所述的引物對為由序列為GCCTTTTCGGCGTTTAACC的上游引物HoVTF和序列為CGCGACGGAGGAATGG的下游引物 HoVTR組成的引物對。2、一種用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的探針，其特征在于所述的探針HoVTM 序列為 CCAAATCAAAGTCTGTACGCCCGGC。所述引物對和探針序列用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的方法，包括
1)待測模板的制備取472.5 μ 1血清；或取100 mg組織樣品，加入1 ml PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1。加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過夜或50°C水浴4小時(shí)，加入等量的體積比為25:24:1的酚氯仿異戊醇抽提2次，取上清，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇于_20°C放置1小時(shí)，12000 rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用 20 μ 1超純水溶解，即為檢測用DNA模板；
2)豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件
組分用量/終濃度
IOXBuffer 25mmol/L MgCl2 dNTP Mixture 引物
each
探針模板 iTaq 酶
IX 5mmol/L lmmol/L
0. 4μ mol/L
0.4 μ mol/L 10 μ 1 5Unit
將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下50°C，2分鐘，熱啟動；95°C，10分鐘預(yù)變性；95°C，15秒，60°C 40秒，45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果可以實(shí)時(shí)監(jiān)測。3)豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測結(jié)果判定經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有豬 Hokovirus則顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝/ml ；若待檢樣品中不含有豬Hokovirus則無擴(kuò)增信號。
有益效果本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個(gè)特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)和熒光淬滅基團(tuán) (TAMRA)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)所吸收，而在PCR 擴(kuò)增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異性結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝/ml，說明其具有非常良好的靈敏度；
2、本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有豬Hokovirus的檢測樣品均無擴(kuò)增信號，說明其具有良好的特異性；
3、由于本發(fā)明對已知的豬Hokovirus基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。4、由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測方法，整個(gè)反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了普通PCR檢測常出現(xiàn)假陽性結(jié)果的現(xiàn)象。由于對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，大大節(jié)省了檢測時(shí)間，節(jié)約了人力物力。


圖1 利用引物對HoVTF/HoVTR和探針pNPP檢測豬Hokovirus陽性樣品的熒光PCR 擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式1、引物和探針設(shè)計(jì)通過對豬Hokovirus基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)多對引物和探針，引物長度一般為20-30個(gè)堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下
上游引物 HoVTF :GCCTTTTCGGCGTTTAACC 下游引物 HoVTR :CGCGACGGAGGAATGG 探針 HoVTM CCCAAATCAAAGTCTGTACGCCCGGC
2、反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化利用感染豬Hokovirus的患病豬的組織樣品為待檢樣品， 用常規(guī)方法提取病毒基因組DNA，分裝后儲存于-20°C備用。2. 1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將豬Hokovirus的引物濃度分別從0. 1 μ mol/L至2. O μ mol/L做連續(xù)倍比稀釋，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0. 4 μ mol/L。2. 2鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從 lmmol/L至IOmmol/L以lmmol/L遞增，經(jīng)過多次試驗(yàn)最終確定5mmol/L為檢測體系中的鎂離子濃度。
2. 3 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量(以單位Unit計(jì)) 的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定5U作為檢測體系中Taq酶的用量。2. 4 dNTP濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTP進(jìn)行檢測，綜合評估后選lmmol/ L作為檢測體系中dNTP的使用量。2. 5探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將豬Hokovirus的探針濃度分別從0. 1 μ mol/L至0. 5 μ mol/L作連續(xù)倍比稀釋后進(jìn)行檢測，通過試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0. 4 μ mol/L。利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μ 1體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見表1。
表1.豬Hokiroims實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體.系中的各組分情況
組分用重鶴濃度IOxBuffo-Ix25mmol/L MgCl25mmol/LdNTP Mixturelmmol/L引物0.4μτηο1Λ_ each探針0.4μιηο1Λ模扳_Taq海SUnit
備注以上試剤均購買自寶生物工程(大連)有PP.公司。3.儀器檢測通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)對所使用儀器中反應(yīng)管熒光信號的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測通道與探針兩端所標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)相一致。本發(fā)明所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)和熒光淬滅基團(tuán)(TAMRA)的寡核苷酸，具體設(shè)置方法參照儀器使用說明書。4. PCR反應(yīng)條件選擇如下:50°C，2分鐘；95°C，10分鐘，1個(gè)循環(huán)；95°C，15秒，60°C 40秒，45個(gè)循環(huán)。5.檢測步驟 5.1選取引物和探針；
5.2制備待測模板，采用常規(guī)提取DNA方法提取各種來源樣品中豬Hokovirus的核
酸；
5.3反應(yīng)體系的建立表1。5. 4選擇儀器的檢測通道； 5.5上機(jī)檢測。6.實(shí)施例
6. 1待測模板的制備取472. 5 μ 1血清；或取100 mg組織樣品，加入1 ml PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1。加入 10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2.5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過夜或50°C水浴 4小時(shí)，加入等量酚氯仿異戊醇(25: : 1)抽提2次，取上清，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇于_20°C放置1小時(shí)，12000 rpm離心10分鐘。棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1 超純水溶解，即為檢測用DNA模板。提取的DNA模板于_70°C保存?zhèn)溆茫?br> 6. 2豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件根據(jù)表1加樣，將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀(ABI Prism 7500)中，設(shè)置相應(yīng)熒光收集條件后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下 500C，2分鐘，熱啟動；95°C，10分鐘預(yù)變性；95°C，15秒，60°C 40秒，45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果可以實(shí)時(shí)監(jiān)測。儀器檢測通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)對所使用儀器中反應(yīng)管熒光信號的收集進(jìn)行設(shè)置，與探針兩端所標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)相一致。本發(fā)明所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)和熒光淬滅基團(tuán)(TAMRA)的寡核苷酸，參照熒光PCR儀 (ABI Prism 7500)使用說明書具體設(shè)置選擇的熒光檢測參數(shù)。 6.3豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測結(jié)果經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有豬 Hokovirus則顯示陽性擴(kuò)增曲線(圖)，其檢測靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝/ml ；若待檢樣品中不含有豬Hokovirus則無擴(kuò)增信號，提示上述引物對和探針具有良好的靈敏度和特異性。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的引物對和探針序列，其特征在于，所述的引物對為由序列為GCCTTTTCGGCGTTTAACC的上游引物HoVTF和序列為CGCGACGGAGGAATGG 的下游引物HoVTR組成的引物對；探針HoVTM序列為CCAAATCAAAGTCTGTACGCCCGGC。
2.權(quán)利要求1所述引物對和探針序列組合物用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的方法，包括1)待測模板的制備取472.5 μ 1血清；或取100 mg組織樣品，加入1 ml PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心10分鐘，取上清液472. 5 μ 1 ；加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化過夜或 50°C水浴4小時(shí)，加入等量的體積比為25:24:1的酚氯仿異戊醇抽提2次，取上清，加2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇于_20°C放置1小時(shí)，12000 rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超純水溶解，即為檢測用DNA模板；2)豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件 組分用量/終濃度 IOXBuffer IX25mmol/L MgCl25mmol/LdNTP Mixturelmmol/L弓I物0. 4μ mol/L each探針0.4 μ mol/L模板10 μ 1Taq 酶5Unit將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下50°C，2分鐘，熱啟動；95°C，10分鐘預(yù)變性；95°C，15秒，60°C 40秒，45個(gè)循環(huán)，試驗(yàn)結(jié)果可以實(shí)時(shí)監(jiān)測；3)豬Hokovirus實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測結(jié)果判定經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有豬 Hokovirus則顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝/ml ；若待檢樣品中不含有豬Hokovirus則無擴(kuò)增信號。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測豬Hokovirus核苷酸片段的引物和探針序列，屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。引物對包括由序列為GCCTTTTCGGCGTTTAACC的上游引物HoVTF和序列為CGCGACGGAGGAATGG的下游引物HoVTR組成的引物對；探針HoVTM序列為CCAAATCAAAGTCTGTACGCCCGGC。該套引物和探針序列根據(jù)GenBank上豬Hokovirus全基因組序列(GQ869539-GQ869543)設(shè)計(jì)，具有較高的靈敏度和特異性。
文檔編號C12Q1/70GK102174661SQ20111006335
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者何孔旺, 倪艷秀, 張雪寒, 李彬, 毛立, 溫立斌 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院