專利名稱：熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，利用新型基因芯片進行核酸檢測，用于疾病的臨床基因診斷，基因多態(tài)性分析和物種鑒定等，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
為實現(xiàn)這樣的目的，在本發(fā)明中，采用一種新的基因芯片—熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列，進行核酸種類與數(shù)量的檢測。寡核苷酸片段兩端分別用熒光供體基團與熒光受體基團標(biāo)記，片段的中間用生物素標(biāo)記。
本發(fā)明的具體步驟如下第一步，制備待測核酸樣品，利用各種分子生物學(xué)常規(guī)方法(DNA抽提、PCR擴增、mRNA抽提)制備各種待測核酸樣品。
第二步，待測核酸樣品與寡核苷酸微陣列在雜交緩沖液中雜交，用雜交洗脫緩沖液在特定條件下洗脫，那些不能與寡核苷酸探針完全配對的目標(biāo)核酸將被洗脫，而那些能夠與寡核苷酸探針完全配對的核酸不會被洗去而結(jié)合在基因芯片上。寡核苷酸微陣列上寡核苷酸片段的序列特征是5’-末端的序列將與待測核酸樣品目標(biāo)區(qū)域的3’-序列配對，3’-末端的序列將與目標(biāo)區(qū)域的5’-序列配對，中間序列是寡聚胸腺核苷酸；這種片段的修飾特征是兩個末端分別用不同的熒光基團修飾，中間用生物素修飾。生物素的作用是將寡核苷酸固定于玻片表面；兩個熒光基團用于產(chǎn)生檢測信號，其信號產(chǎn)生原理基于兩個熒光基團在相互作用接近時將發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移。
第三步，根據(jù)熒光供體基團的激發(fā)光波長與熒光受體基團的發(fā)射光波長選擇對應(yīng)的光學(xué)檢測系統(tǒng)檢測微陣列的熒光信號及其位置，確定待測核酸樣品的結(jié)構(gòu)特征及其含量。
本發(fā)明與現(xiàn)有的基因芯片技術(shù)相比有顯著的進步。主要優(yōu)點如下(1)待測樣品無需預(yù)先用熒光基團標(biāo)記；(2)能夠檢測出待測核酸一個位點的核苷酸差異；(3)可以同時檢測多個核酸序列，且樣品間干擾??；(4)目標(biāo)分子可以是DNA、RNA、單鏈核酸、雙鏈核酸。
本發(fā)明利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，可用于檢測待測核酸的種類與含量，單核苷酸多態(tài)性分析以及疾病診斷等領(lǐng)域。與利用寡核苷酸微陣列檢測核酸種類與數(shù)量的其它方法相比，本發(fā)明的待測樣品不需要預(yù)先進行熒光標(biāo)記，操作簡單，成本低。
具體實施例方式以下通過一個具體的實施例來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
本實施例用熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列檢測胎兒性別，其寡核苷酸片段采用特異性堿基序列，其熒光供體基團是Fluorescein，熒光受體基團是Red640，利用生物素與streptavidin間相互作用固定探針分子于玻片上。用490nm波長激發(fā)Fluorescein，其發(fā)射光波長是518nm。如果存在熒光能量共振轉(zhuǎn)移，則Fluorescein的發(fā)射光進一步激發(fā)Red640，后者發(fā)射光的波長是640nm。在寡核苷酸微陣列檢測過程中，激發(fā)光波長是490nm，檢測微陣列在640nm波長處的信號強度。
現(xiàn)在胎兒性別檢測方法主要有B超、PCR檢測等。在PCR方法檢測胎兒性別操作中用兩對引物進行擴增反應(yīng)，一對引物(primer1tgggttcatctttgctcacac，primer2cttgaactcctgacctcgtg)可以擴增X染色體的一段556bp長的特異性核苷酸序列，另一對引物(primer3atgccctcaatgtcctgacg，primer4gcgggaagatgagtttggc)可以擴增Y染色體的一段441bp長的特異性核苷酸序列。用PCR擴增這兩段特異性核酸序列后，進行PAGE膠電泳可以進行產(chǎn)前胎兒性別鑒定。其主要操作為抽取孕婦羊水，4000rpm離心收集細(xì)胞，從收集細(xì)胞中抽提DNA。以抽提的DNA為模板，分別用引物12進行PCR擴增X染色體片段，引物34進行PCR擴增Y染色體片段。將PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)電泳的結(jié)果鑒別胎兒性別。如果只有引物12能夠擴增出DNA片段，表明待測對象女性；如果引物12，引物34都能夠擴增出DNA條帶，表明待測對象是男性。
PCR方法檢測胎兒性別的缺點是檢測靈敏度不高，而且定量測定效果差；B超檢測需待胎兒發(fā)育到一定階段才可以檢測。
本發(fā)明用寡核苷酸微陣列鑒別胎兒性別，可以克服這些缺點，且能測定性染色體的數(shù)目，其基本操作如下待測樣品用限制性內(nèi)切酶酶切，然后將酶切產(chǎn)物直接與寡核苷酸微陣列雜交。根據(jù)雜交信號的位置與強度確定待測樣品的性別。微陣列的寡核苷酸特異性堿基序列如下
Fx(Fa)GTGAAGAAAGATGCTGAGGG(T15-Tbiotin-T15)TGCATCTCTGTGATACCTG(Fd)Fy(Fa)CTGGCTGCTCTTCCTTAGT(T15-Tbiotin-T15)CTCCTGGGCCTGAGACT(Fd)也可根據(jù)本發(fā)明提出的原理設(shè)計檢測胎兒性別的其它寡核苷酸探針。
根據(jù)寡核苷酸微陣列各個位點的信號強度，以及這些信號強度間的比值，不僅能夠判斷性別，而且能夠?qū)θ旧w疾病進行診斷。胎兒性別檢測具體程序如下1.抽取孕婦羊水10mL，4000rpm離心收集細(xì)胞，從收集細(xì)胞中采用苯酚氯仿抽提法抽提DNA。
2.DNA酶解在20微升反應(yīng)體積中用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切DNA 2小時以上，使之徹底酶解。然后在95℃保溫30分鐘使酶失活，同時使DNA片段變性。
3.雜交溶液制備在DNA酶解溶液管中，加入25微升20×SSC，2微升1.0％SDS，53微升水。
4.雜交與洗脫將寡核苷酸微陣列置于Genomic Hybridization雜交室中，然后加入不含有核酸樣品的雜交溶液處理寡核苷酸微陣列(50℃，10分鐘)。在計算機提示下加入步驟3制備的100微升雜交溶液。按下列程序進行雜交和洗脫雜交50℃保溫8小時。
洗脫(1)5×SSC，0.1％SDS室溫洗滌5分鐘。
(2)1×SSC，0.1％SDS 42℃洗滌5分鐘。
(3)0.1×SSC，0.1％SDS 42℃洗滌5分鐘。
(4)0.1×SSC，42℃洗滌5分鐘。
(5)干燥。
5.用基因芯片掃描儀對洗脫后的基因芯片進行掃描，檢測熒光信號。在寡核苷酸微陣列檢測過程中，激發(fā)光波長是490nm，檢測微陣列在640nm波長處的信號強度。若基因芯片上只有一個探針分子(X)可以檢測到熒光信號，則胎兒性別為女性；若兩個探針分子(X，Y)都可以檢測到熒光信號，則胎兒性別為男性。若采用熒光強度定量分析的方法，還可以預(yù)測性染色體的數(shù)目。若熒光強度比值為Y/X接近0，則為女性；Y/X＝1，則為正常男性；Y/X＝1/2，則為異常男性(XXY男性)。
若抽提的DNA量過低，以DNA為模板，PCR擴增DNA片段。擴增用引物為兩對引物(引物1tgggttcatctttgctcacac，引物2cttgaactcctgacctcgtg，引物3atgccctcaatgtcctgacg，引物4gcgggaagatgagtttggc)，其中引物1與2用于擴增X染色體上的特異性核酸片段，引物3與4用于擴增Y染色體上的特異性核酸片段，進行PCR擴增反應(yīng)。PCR的操作條件為95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性45秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，進行30個循環(huán)擴增反應(yīng)后72℃延伸10分鐘。用擴增產(chǎn)物與基因芯片進行雜交檢測。
只要采用固定有其它寡核苷酸探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移微陣列，就可以進行其它的核酸序列檢測，例如鐮刀貧血病、病毒性疾病的檢測、物種鑒定和大通量基因多態(tài)性分析等。如果將多種疾病的寡核苷酸探針微陣化固定于同一張玻片上，就可以同時檢測多種疾病，并且病人的待測樣品不需進行熒光標(biāo)記，檢測速度快。
特別是在病毒性疾病的檢測中，現(xiàn)今的基因芯片由于待測樣品需要用熒光標(biāo)記，這種標(biāo)記是一種酶促反應(yīng)。因此，如果需要測定的目標(biāo)核酸中既有RNA病原體又有DNA病原體時，熒光標(biāo)記很難達(dá)到均一性，結(jié)果限制了待測目標(biāo)樣品的檢測通量。用本發(fā)明設(shè)計的寡核苷酸進行檢測，不存在待測樣品的熒光標(biāo)記，只需要簡單的核酸雜交就可以解決這個問題。
權(quán)利要求
1.一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，其特征在于采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列，將未進行熒光標(biāo)記的待測核酸樣品與寡核苷酸微陣列雜交、洗脫，使能夠與寡核苷酸探針完全配對的核酸結(jié)合在基因芯片上，寡核苷酸微陣列上寡核苷酸片段的序列特征是5’-末端的序列與待測核酸樣品目標(biāo)區(qū)域的3’-序列配對，3’-末端的序列與目標(biāo)區(qū)域的5’-序列配對，中間序列是寡聚胸腺核苷酸，兩個末端分別用不同的熒光基團修飾，中間用生物素修飾，根據(jù)熒光供體基團的激發(fā)光波長與熒光受體基團的發(fā)射光波長，檢測微陣列的熒光信號及其位置，確定待測核酸樣品的結(jié)構(gòu)特征及其含量。
2.如權(quán)利要求1所說的熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，其特征在于用于檢測胎兒性別的寡核苷酸片段采用特異性堿基序列，其熒光供體基團是Fluorescein，熒光受體基團是Red640，利用生物素與streptavidin間相互作用固定探針分子在玻片上，用490nm波長激發(fā)Fluorescein，其發(fā)射光波長是518nm。
3.如權(quán)利要求1所說的熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，其特征在于將多種疾病的寡核苷酸探針微陣化固定于同一張玻片上，同時檢測多種疾病。
全文摘要
一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法,將未進行熒光標(biāo)記的待測核酸樣品與寡核苷酸微陣列雜交、洗脫,使能夠與寡核苷酸探針完全配對的核酸結(jié)合在基因芯片上,寡核苷酸微陣列上寡核苷酸片段的序列特征是5′－末端的序列與待測核酸樣品目標(biāo)區(qū)域的3′－序列配對,3′－末端的序列與目標(biāo)區(qū)域的5′－序列配對,中間序列是寡聚胸腺核苷酸,兩個末端分別用不同的熒光基團修飾,中間用生物素修飾,根據(jù)熒光供體基團的激發(fā)光波長與熒光受體基團的發(fā)射光波長,檢測微陣列的熒光信號及其位置,確定待測核酸樣品的結(jié)構(gòu)特征及其含量。本發(fā)明可用于檢測目標(biāo)核酸的種類與數(shù)量、目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性、疾病的基因診斷等領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1358867SQ0113925
公開日2002年7月17日 申請日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者劉建華, 劉喜朋, 陳潔, 林志新 申請人:上海交通大學(xué)