重組神經(jīng)氨酸酶蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組神經(jīng)氨酸酶蛋白及其應(yīng)用，特別涉及一種可作為廣譜流感疫 苗的重組神經(jīng)氨酸酶蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒病毒為正粘液病毒科（Orthomyxoviridae)的成員，A型流感病毒 為包膜病毒，其含有單股、8段反義（anti-sen Se)RNA基因組，通常用以編碼11至12 個(gè)病毒蛋白。A型流感病毒的亞型已根據(jù)血凝素（hemagglutinin, HA)及神經(jīng)氨酸酶 (neuraminidase, NA)糖蛋白的抗原特性進(jìn)行分類，分別命名為H1-H16及N1-N9。最近的一 篇報(bào)導(dǎo)敘述有關(guān)被流感病毒感染的果蝠體內(nèi)，鑒定出H17N10及H18N11這兩個(gè)新種。根據(jù) 系統(tǒng)發(fā)育分析，N1-N9可以被分類為屬于第一群組（包括N1、N4、N5及N8)或第二群組（包 括N2、N3、N6、N7及N9)。迄今，只有Nl、N2、N7及N9亞型已知可引起人類流行病。
[0003] NA為具有四聚體復(fù)合體結(jié)構(gòu)的酶蛋白，又稱唾液酸酶（sialidase)。 其可切割細(xì)胞表面的唾液酸（sialic acid)連接，從而有利于病毒從受感染細(xì)胞釋放。 NA還可藉由摧毀纖毛的誘t耳受體（decoy receptors)、粘蛋白（mucins)、及細(xì)胞醣質(zhì)包被 (glycocalyx)因而利于病毒傳播及感染。NA的免疫原性（immunogenicity)最早見(jiàn)于以NA 特異性去活化疫苗所接種的人類受試者。使用表達(dá)于酵母菌或昆蟲細(xì)胞的重組NA(rNA)蛋 白質(zhì)在接種小鼠引起對(duì)抗致命病毒攻擊的保護(hù)作用。以rNA蛋白質(zhì)所接種的雪貂除了 HA 免疫本身所提供的保護(hù)力外，亦會(huì)產(chǎn)生抑制NA(NA-inhibiting，NI)抗體，以展現(xiàn)出獨(dú)特類 型的保護(hù)。NI抗體已知可限制病毒傳播并減輕A型流感病毒感染的臨床癥狀。以反向遺傳 工程技術(shù)生產(chǎn)含有季節(jié)性流感病毒NA的重組HlNl病毒（reverse-genetic reassortant HlNl virus)接種的小鼠展現(xiàn)交叉反應(yīng)性NI抗體以及在人類新興流感（pHINl)病毒攻擊時(shí) 降低死亡率。季節(jié)性H1NUH3N2及pHINl不同品系的減毒活流感疫苗（Live attenuated influenza vaccines, LAIVs)，已被報(bào)導(dǎo)在雪紹中可誘導(dǎo)對(duì)抗H5N1病毒的交叉反應(yīng)性NI抗 體，以及季節(jié)性的三價(jià)流感疫苗亦在雪貂中被報(bào)導(dǎo)可提供對(duì)抗致命的H5N1攻擊的交叉保 護(hù)性免疫。此外，含有NA、Ml及M2的NA類病毒顆粒（VLP)已顯示在小鼠中能引起更有效 的NI抗體，并賦予對(duì)抗H5N1及pHINl病毒攻擊的交叉保護(hù)性免疫力。NI抗體也已在以含 有H5N1的去活化疫苗接種的人類中檢測(cè)出，以及暴露于自然感染的人類中亦可檢測(cè)得到 NI抗體。但NA的免疫原性及交叉保護(hù)機(jī)制目前仍不清楚。
[0004] 綜合上述，開(kāi)發(fā)含有新穎性NA抗原的廣譜流感疫苗，是目前極需努力的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的為提供一種重組神經(jīng)氨酸酶蛋白，其可具有交叉保護(hù)性免疫，并作 為廣譜流感疫苗。
[0006] 依據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，一種重組神經(jīng)氨酸酶（NA)蛋白，其具有一胞外域 (Ectodomain)，該胞外域與SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少95%的相同性，其中 氨基酸序列具有下列之一或其任意組合：（i)在位置149,1被取代為V ; (ii)在位置344,N 被取代為Y或H;以及（iii)在位置365、366, IS被取代為TA、TN或ED。
[0007] 依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，一種多核苷酸，其編碼上述重組神經(jīng)氨酸酶蛋白。
[0008] 依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，一種重組流感病毒，其組成包含上述重組神經(jīng)氨酸 酶，或編碼上述重組神經(jīng)氨酸酶蛋白的多核苷酸。
[0009] 依據(jù)本發(fā)明的再另一實(shí)施例，一種流感疫苗，其包含上述重組神經(jīng)氨酸酶蛋白，或 編碼上述重組神經(jīng)氨酸酶蛋白的多核苷酸。其中流感疫苗可為滅活流感病毒疫苗、減毒流 感病毒疫苗、類病毒顆粒疫苗或重組亞單位蛋白疫苗。
[0010] 以下藉由具體實(shí)施例配合所附的圖式詳加說(shuō)明，當(dāng)更容易了解本發(fā)明的目的、技 術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)及其所達(dá)成的功效。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖IA至ID說(shuō)明水溶性重組NA (rNA)蛋白質(zhì)的建構(gòu)、表達(dá)及定性；
[0012] 圖2A至2E說(shuō)明由接種rNA所誘導(dǎo)的對(duì)抗Η5Ν1、ρΗ1Ν1、Η3Ν2及H7N9病毒的NA特 異性IgG抗體；
[0013] 圖 3A 至 3H 說(shuō)明由 H5Nl-rNA 及 pHINl-rNA 引起的對(duì)抗 Η5Ν1、ρΗ1Ν1、Η3Ν2 及 H7N9 病毒的NA抑制性抗體；
[0014] 圖4說(shuō)明由接種H5Nl-rNA及pHINl-rNA對(duì)同源及異源病毒所引起的相對(duì)應(yīng)IC50 值；
[0015] 圖5說(shuō)明在脾臟中所檢測(cè)到可分泌H5Nl-rNA及pHINl-rNA特異性抗體的B細(xì)胞；
[0016] 圖6A至6E說(shuō)明H5Nl-rNA及pHINl-rNA對(duì)抗不同病毒攻毒攻擊的保護(hù)性免疫反 應(yīng)；
[0017] 圖7A到7E說(shuō)明H5Nl-rNA及pHINl-rNA對(duì)抗不同的病毒攻毒攻擊后的體重恢復(fù) 情形；
[0018] 圖8說(shuō)明pmNl及H5N1的突變位點(diǎn)及比較結(jié)果；
[0019] 圖9說(shuō)明pHININA的頂視圖及側(cè)視圖；
[0020] 圖IOA至IOD說(shuō)明由WT及第1組突變pHINl-rNA對(duì)抗不同病毒株所產(chǎn)生的NA抑 制性抗體增加曲線；
[0021] 圖11說(shuō)明對(duì)抗同源病毒pHINl及異亞型H5N1、H3N2及H7N9病毒的相對(duì)應(yīng)IC50 值；
[0022] 圖12A及12B說(shuō)明不同群組的神經(jīng)氨酸酶（NA)的氨基酸比對(duì)；
[0023] 圖13A至13D說(shuō)明由WT及第2組突變pHINl-rNA接種對(duì)抗不同病毒攻毒攻擊所 產(chǎn)生的NA抑制性抗體增加曲線；
[0024] 圖14說(shuō)明對(duì)抗同源病毒pHINl及異亞型H5N1、H3N2及H7N9病毒的相對(duì)應(yīng)IC50 值；
[0025] 圖 15A 至 15C 說(shuō)明 PR8 病毒、pHlNl/PR8 病毒、及具有 I365T/S366N 突變的 pHINl/ PR8病毒的蝕斑塊形態(tài)、病毒效價(jià)及NA酶活性。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明提供了一種重組神經(jīng)氨酸酶，其系基于新興的野生型流感病毒 pHlNl-NA(A/Texas/05/2009)序列（SEQ ID N0:1)。本發(fā)明的重組神經(jīng)氨酸酶包含胞外域 (ectodomain)，其具有與SEQ ID N0:1實(shí)質(zhì)相同的氨基酸序列。
[0027] 參照表1，其顯示ρΗ1Ν1、Η5Ν1、Η3Ν2、Η7Ν9在特定位置149、344、365及366的相對(duì) 應(yīng)氨基酸。本發(fā)明的目的為提供在特定位置以H5NUH3N2、及H7N9的相對(duì)應(yīng)氨基酸進(jìn)行替 代，以便產(chǎn)生交叉保護(hù)性免疫力。具體而言，上述氨基酸序列包含以下氨基酸之一或其任意 組合：（i)在位置149, I被取代為V ; (ii)在位置344, N被取代為Y或H ;以及（iii)在位 置 365、366, IS 被取代為 TA、TN 或 ED。表 1 為 pHINl、H5N1、H3N2、H7N9 在特定位置 149、 344、365及366的相對(duì)應(yīng)氨基酸。 表1，pHINl、H5N1、H3N2、H7N9在特定位置149、344、365及366的相對(duì)應(yīng)氨基酸
[0028] 換言之，本發(fā)明的重組神經(jīng)氨酸酶蛋白，可使用編碼野生型pHINl基因 （SEQ ID NO :1)的質(zhì)粒作為模版，并利用定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis)在NA基因中導(dǎo)入 突變氨基酸制備所得。
[0029] 本發(fā)明所用的 H5N1、H3N2 及 H7N9 的序列如 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11所列。
[0030] 目前已知流感病毒NA的胞外域的氨基酸中94. 6%為保守（Conserved)序列。本 領(lǐng)域人士可了解流感病毒NA的胞外域的一些氨基酸序列可以加以變換而不明顯影響蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。因此本發(fā)明神經(jīng)氨酸酶蛋白的胞外域與SEQ ID N0:1具有至少95%的序 列相同性，較佳地，可