專利名稱：核酸分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人或其他動物受試者的核酸分析的總體領(lǐng)域，特別是來自生物樣品， 特別是微泡的高質(zhì)量核酸的獲取和分析。
背景技術(shù)：
細(xì)胞脫落的小微泡稱為“外來體(exosome) ” (Thery等人，2002)。有報告表明外來體直徑約為30-100nm，許多不同類型的細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下都可以脫落外來體 (Thery等人，200 。外來體通常由晚期內(nèi)涵體膜向內(nèi)內(nèi)陷和夾斷形成。這導(dǎo)致載滿小脂質(zhì)雙層囊泡(直徑為 40-100nm)的多泡體(MVB)形成，每個小脂質(zhì)雙層囊泡都含有母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)樣品(Moorvogel等人，2002)。MVB與細(xì)胞膜的融合導(dǎo)致這些外來體從細(xì)胞中釋放出來，并遞送到血液、尿或其他體液中。另一類源自細(xì)胞的囊泡稱為“脫落微泡”(Cocucci等人，2009)。由細(xì)胞質(zhì)膜直接出芽形成的這些微泡的尺寸比外來體的尺寸更不均勻，并且像外來體一樣，也包含母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)樣品。外來體和脫落微泡可以利用超速離心和超濾分離技術(shù)共分離，因此統(tǒng)稱為微泡。最新研究揭示微泡內(nèi)的核酸具有作為生物標(biāo)記的作用。例如，Skog等人除了描述其他內(nèi)容之外，還描述了從GBM患者血清中的微泡提取的核酸在醫(yī)療診斷、預(yù)后和治療評價中的用途(Skog等人，2008)。從微泡提取的核酸的使用被認(rèn)為潛在地避開活檢需要，強調(diào)了微泡生物學(xué)的巨大診斷潛力(Skog等人，2008)。在核酸生物標(biāo)記的研究和開發(fā)以及工業(yè)應(yīng)用中，希望以一致且可靠的方式從生物樣品中提取高質(zhì)量核酸。本發(fā)明提供了來自微泡和其他生物樣品的高質(zhì)量核酸提取物組成、制取此種提取物的方法，和在各種應(yīng)用中使用這些高質(zhì)量核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明是來自一個或多個分離自真核生物樣品的微泡的新核酸提取物，其中可在該提取物中檢測到18SrRNA。優(yōu)選地，可在該新提取物中檢測到的18S rRNA與^S rRNA的定量比率在約1 1 約1 2的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約1 2?？蓮闹蝎@取該新提取物的生物樣品包括，尤其是任何體液，優(yōu)選尿、血清或血漿，優(yōu)選來自哺乳動物，特別是人。對于蛋白質(zhì)濃度低于10mg/ml的體液樣品，如尿，該新核酸提取物可進(jìn)一步包含RNA完整性(在所有情況下，如在Agilent BioAnalyzer或其等效物上獲得的)大于或等于5的核酸提取物，和/或可以進(jìn)一步包含來自20ml生物樣品的大于或等于50pg/ ml的核酸產(chǎn)量。類似地，對于蛋白質(zhì)濃度大于10mg/ml的體液樣品，如血清或血漿，該新核酸提取物可以進(jìn)一步包含大于或等于3的RNA完整性，和/或可以進(jìn)一步包含來自Iml生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。在另一個方面，本發(fā)明是來自一個或多個分離自真核生物樣品的微泡的新核酸圖譜，其中可在該圖譜中檢測到18SrRNA。優(yōu)選地，可在該新圖譜中檢測到的18S 『1 ^與觀3 rRNA的定量比率在約1 1 約1 2的范圍內(nèi)，并優(yōu)選為約1 2?？蓮闹蝎@取該新圖譜的生物樣品包括，尤其是任何體液，優(yōu)選尿、血清或血漿，優(yōu)選來自哺乳動物， 特別是人。對于蛋白質(zhì)濃度低于10mg/ml的體液樣品，如尿，該新圖譜可進(jìn)一步包含大于或等于5的RNA完整性，和/或可以進(jìn)一步包含來自20ml生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。類似地，對于蛋白質(zhì)濃度大于10mg/ml的體液樣品，如血清或血漿，該新圖譜可以進(jìn)一步包含大于或等于3的RNA完整性，和/或可以進(jìn)一步包含來自Iml生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。在又一個方面，本發(fā)明是評價來自分離自真核生物樣品的微泡的核酸提取物質(zhì)量的方法，其包含以下步驟(a)從微泡中提取RNA ；和(b)通過測定提取物中的18S rRNA和 28S rRNA量來測量RNA的質(zhì)量。優(yōu)選地，在該新方法中測定的18S rRNA與^S rRNA的定量比率在約1 1 約1 2的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約1 2。該新方法可以在其上執(zhí)行的生物樣品包括，尤其是任何體液，優(yōu)選尿、血清或血漿，優(yōu)選來自哺乳動物，特別是人。對于蛋白質(zhì)濃度低于10mg/ml的體液樣品，如尿，該新方法可以進(jìn)一步產(chǎn)生具有大于或等于5的RNA 完整性的核酸提取物，和/或可以進(jìn)一步產(chǎn)生來自20ml生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。類似地，對于蛋白質(zhì)濃度大于10mg/ml的體液樣品，如血清或血漿，該新方法可以進(jìn)一步產(chǎn)生具有大于或等于3的RNA完整性的核酸提取物，和/或可以進(jìn)一步產(chǎn)生來自 Iml生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明是從生物樣品中獲取核酸的方法，其包含以下步驟(a)獲取生物樣品；(b)在該生物樣品上執(zhí)行提取促進(jìn)操作；和(c)從該生物樣品中提取核酸。該提取促進(jìn)操作由以下步驟組成(a)向該生物樣品中添加一種或多種促進(jìn)劑；或(b)在提取核酸之前執(zhí)行一個或多個促進(jìn)步驟；或(c)添加促進(jìn)劑和促進(jìn)步驟相結(jié)合。該促進(jìn)劑可以包括(i)RNA酶抑制劑；(ii)蛋白酶；(iii)還原劑；(iν)誘餌底物(decoy substrate)， 如合成RNA ； (ν)可溶性受體；(vi)小干擾RNA ； (vii)RNA結(jié)合分子，如抗-RNA抗體、伴侶蛋白，或RNA酶抑制蛋白；(ix)RNA酶變性物質(zhì)，如高滲透壓溶液或去污劑。該提取促進(jìn)步驟可以包括(x)洗滌；(xi)對樣品中的RNA酶進(jìn)行粗細(xì)分選；(xii)通過物理變化，如通過降低溫度，或執(zhí)行冷凍/解凍循環(huán)使RNA酶變性。該新方法可以在包括尤其是任何體液，優(yōu)選尿、血清或血漿，優(yōu)選來自哺乳動物，特別是人的生物樣品上執(zhí)行。在一個實施例中，從該生物樣品獲取衍生物，并在提取核酸之前對該衍生物執(zhí)行提取促進(jìn)操作。優(yōu)選地，該衍生物是來自生物樣品的微泡組分。在一個實施例中，該微泡組分通過過濾濃縮技術(shù)獲得，但也可以利用其他已知分離技術(shù)。在本發(fā)明方法的進(jìn)一步方面，在對該衍生物執(zhí)行促進(jìn)提取操作之前，可以用核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、或它們的組合對它進(jìn)行處理。在一些方面，該提取促進(jìn)操作包括在提取核酸之前在該生物樣品中，或在該衍生物中加入RNA酶抑制劑；優(yōu)選該RNA酶抑制劑在樣品等于或大于1μ 1時具有大于0.027AU(1X)的濃度；可替換地，在樣品等于或大于1μ 1時具有大于或等于0. 135AU(5X)的濃度；可替換地，在樣品等于或大于1 μ 1時具有大于或等于0. 27AU (10Χ)的濃度；可替換地，在樣品等于或大于1 μ 1時具有大于或等于0. 675AU(25X)的濃度；可替換地，在樣品等于或大于1 μ 1時具有大于或等于 1.35AU(50X)的濃度，其中該IX蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件，其中利用0. 027AU或更多蛋白酶處理從1 μ 1或更多體液中分離的微泡；5Χ蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件，其中利用0. 135AU或更多蛋白酶處理從1 μ 1或更多體液中分離的微泡；IOX蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件，其中利用0. 27AU或更多蛋白酶處理從1 μ 1或更多體液中分離的微泡；25Χ蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件，其中利用0. 675AU或更多蛋白酶處理從1 μ 1或更多體液中分離的微泡；50Χ蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件，其中利用1.35AU或更多蛋白酶處理從 1 μ 1或更多體液中分離的微泡。優(yōu)選地，該RNA酶抑制劑是蛋白酶。在又一個方面，本發(fā)明是用于從微泡中獲取核酸的新試劑盒，其在一個或多個容器中包含(a)核酸提取促進(jìn)劑；(b) DNA酶、RNA酶，或二者；和(c)裂解緩沖液。該新試劑盒可以進(jìn)一步包含使用該試劑盒的說明書。在本發(fā)明的新試劑盒中，該核酸提取促進(jìn)劑可以包括混合或單獨的(a)RNA酶抑制劑、(b)蛋白酶、(c)還原劑、(d)誘餌底物、(e)可溶性受體、(f)小干擾RNA、(g) RNA結(jié)合分子、(h) RNA酶變性物質(zhì)，或(i)任何前述試劑的組合物。在又一個方面，本發(fā)明是分析來自微泡的RNA的新方法，其包含以下步驟(a)獲取微泡樣品；(b)用DNA酶處理該樣品從而除去所有或基本所有位于該樣品中微泡的表面外或表面上的任何DNA ； (c)從該樣品中提取RNA ；和(d)分析所提取的RNA。該新方法可以在生物樣品上執(zhí)行，該生物樣品包括尤其是任何體液，優(yōu)選尿、血清或血漿，優(yōu)選來自哺乳動物，特別是人。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明是用于診斷、監(jiān)測，或治療受試者的新方法，該方法包括以下步驟(a)從受試者的尿樣中分離出微泡組分；(b)監(jiān)測該微泡組分中是否存在生物標(biāo)記；其中該生物標(biāo)記選自(i)核酸類物質(zhì)，(ii)核酸表達(dá)水平，(iii)核酸變體，和(iv) 前述中任何一種的任何組合；而且其中該生物標(biāo)記與疾病或其他醫(yī)學(xué)病況的存在與否，或治療選擇方案的可行性相關(guān)聯(lián)。在一些方面，該生物標(biāo)記是mRNA轉(zhuǎn)錄物；例如，該mRNA轉(zhuǎn)錄物可以選自NPHS2 (podocin (在足細(xì)胞裂孔隔膜處足突質(zhì)膜上有特異表達(dá)的寡聚體))、 LGALSl (半乳糖凝集素-1)、HSPG2 (硫酸肝素蛋白多糖)、CUBN(吞飲受體)、LRP2 (兆蛋白)、AQPl (水通道蛋白1)、CA4(碳酸酐酶4)、CLCN5 (氯離子通道蛋白5)、BDKRBl (緩激肽Bl受體)、CALCR (降鈣素受體)、SCNNlD (阿米洛利敏感鈉通道δ亞基)、SLC12A3 (噻嗪類敏感性氯化鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白)、AQP2(水通道蛋白2~)、ATP6V1B1 (V-ATP酶Bl亞基)、 SLC12A1 (經(jīng)由RiboAmped mRNA RT-PCR的腎特異Na-K-Cl同向轉(zhuǎn)運體)；更優(yōu)選的，該mRNA 轉(zhuǎn)錄物是AQP2 (水通道蛋白2~)或ATP6V1B1 (V-ATP酶Bl亞基)。在新方法的進(jìn)一步方面， 該生物標(biāo)記和疾病或其他醫(yī)學(xué)病況選自(a) NPHS2 (podocin)和腎小球疾病，如激素耐藥型腎病綜合征；(b)如herslimd- Cirasbeck綜合征(維生素B12選擇性吸收障礙綜合征) 中的CUBN(吞飲受體)和蛋白尿；以及(c)AQP2(水通道蛋白2~)和尿崩癥。在又一個方面，本發(fā)明是包含與選自SEQ ID NOS :1_29的第二核苷酸序列有至少 90%同一性的第一核苷酸序列的分離多核苷酸分子；包含選自SEQ ID NOS :1_29的核苷酸序列片段的分離多核苷酸；或包含具有與SEQ ID NOS 1-29的任何一個中的任何13-核苷酸序列相同的至少13個核苷酸的序列的分離多核苷酸。特別地，前述多核苷酸分子可以是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在其他方面，本發(fā)明是包含前述分離核酸分子中任何一種的載體。在又一些其他方面，本發(fā)明是包含前述載體中的任何一種或前述分離核酸中任何一種的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明是評估來自生物樣品的核酸提取物質(zhì)量的新方法，該方法包含(a)提供生物樣品；(b)從該生物樣品中獲取核酸提取物；(c)測量提取物中包含具有選自SEQ NOS 1-29的核苷酸序列的片段的多核苷酸分子的量；和(d)將該多核苷酸分子的量與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較從而評估核酸提取物的質(zhì)量。該新方法可以在任何生物樣品上執(zhí)行，例如，體液，特別是尿、血清或血漿，優(yōu)選來自哺乳動物如人。這種新方法可以結(jié)合前述新核酸提取物或新提取方法中的任何一種使用。特別地，用于評估核酸提取物質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物，可以通過測量來自5個以上的生物樣品的核酸提取物中包含具有選自SEQ NOS :1- 的核苷酸序列的片段的多核苷酸分子的量獲得。


圖1，畫面a f是尿多泡體的電子顯微鏡圖片。多泡體(MVB)可以在腎單位和集合導(dǎo)管的各個區(qū)域中識別到(見箭頭)。Podo-足狀突細(xì)胞，PT-近端小管，TDL-細(xì)下降枝 (thin descending limb)，TAL-粗上升枝(thick ascending limb)，CD-PC-集合導(dǎo)管主細(xì)胞，⑶-IC-集合導(dǎo)管閏細(xì)胞。定標(biāo)線條=對于a、c、d、e、f為200nm ；對于b為500nm。圖2是分離的尿微泡的電子顯微鏡圖片。人尿微泡經(jīng)由差速超離心分離并利用磷鎢酸作為著色劑經(jīng)由TEM成像。定標(biāo)線條=200nm。圖3是描述利用IOOkDa MWCO過濾器方法產(chǎn)生的RNA圖譜的圖表。利用Agilent BioAnalyzer產(chǎn)生該圖表。圖4是描述利用超速離心方法產(chǎn)生的RNA圖譜的圖表。利用Agilent BioAnalyzer 產(chǎn)生該圖表。圖5是描述利用x300g旋轉(zhuǎn)、xl7，000g旋轉(zhuǎn)，和0.8μπι過濾的三步預(yù)處理方法 (A)，或用僅0.8 μ m過濾(B)的一步預(yù)處理方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表，其中在每種情況下在處理后都緊接著進(jìn)行超速離心。利用Agilent BioAnalyzer產(chǎn)生該圖表。圖6是描述利用x300g旋轉(zhuǎn)、xl7，OOOg旋轉(zhuǎn)，和0. 8 μ m過濾的三步預(yù)處理方法 (A)，或用僅0. 8 μ m過濾(B)的一步預(yù)處理方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表，在每種情況下在處理后都緊接著進(jìn)行過濾濃縮。利用Agilent BioAnalyzer產(chǎn)生該圖表。圖7是描述利用提取促進(jìn)操作從尿中提取核酸的新方法的流程圖。圖8是描述利用使用5X與IOX濃縮的蛋白酶的方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。 通過過濾濃縮器從20ml尿樣中分離出微泡。表A表示利用5X蛋白酶獲得的圖譜。表B表示利用IOX蛋白酶獲得的圖譜。IX蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件涉及這樣的酶解條件， 其中利用0. 027AU或更多蛋白酶處理從1 μ 1或更多體液中分離的微泡。5Χ蛋白酶濃度涉及這樣的酶解條件涉及這樣的酶解條件，其中利用0. 135AU或更多蛋白酶處理從1 μ 1或更多體液中分離的微泡。ImAU是每分鐘釋放相當(dāng)于1 μ mol酪氨酸的folin陽性氨基酸和肽的蛋白酶活性。圖9是描述利用使用25X與50X濃縮的蛋白酶的方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。 通過過濾濃縮器從40ml尿樣中分離出微泡。表A表示利用25X蛋白酶獲得的圖譜。表B表示利用50X蛋白酶獲得的圖譜。IX蛋白酶是指0.027AU。ImAU是每分鐘釋放相當(dāng)于1 μ mol酪氨酸的folin陽性氨基酸和肽的蛋白酶活性。圖10是描述黑素瘤血清，樣品1的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖11是描述黑素瘤血清，樣品2的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖12是描述黑素瘤血清，樣品3的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖13是描述黑素瘤血清，樣品4的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖14是描述黑素瘤血清，樣品5的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為3. 2 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖15是描述黑素瘤血清，樣品6的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為3. 2 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖16是描述正常血清，樣品7的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖17是描述正常血清，樣品8的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖18是描述正常血清，樣品9的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖19是描述正常血清，樣品10的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為1. 6 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖20是描述正常血清，樣品11的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為3. 2 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖21是描述正常血清，樣品12的RNA圖譜的圖表。利用使用RNA酶抑制劑， Superase-In (Ambion公司)的方法從Iml血清中提取RNA。RNA酶抑制劑的最終濃度為3. 2 單位/μ 1微泡懸浮緩沖液。圖22是描述利用提取促進(jìn)操作從生物樣品中提取核酸的新方法的流程圖。圖23是描述利用帶有或不帶有DNA酶處理的方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。在裂解和核酸提取之前通過DNA酶消化從尿樣分離的微泡顆粒，除去未位于微泡內(nèi)的DNA。 A-使用RNeasy Micro試劑盒不經(jīng)過DNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。B-使用RNeasy Micro試劑盒經(jīng)過DNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。C-使用MirVana試劑盒不經(jīng)過DNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。D— 使用MirVana試劑盒經(jīng)過DNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。注意箭頭指示的小RNA峰高和面積的變化。D揭示，在基于苯酚/氯仿的提取之后，一些DNA被帶入該樣品中。圖M是描述利用帶有或不帶有DNA酶處理的方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。 在裂解和核酸提取之前通過DNA酶消化從尿樣分離的微泡顆粒，除去未位于微泡內(nèi)的DNA。 A-不經(jīng)過DNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。B-經(jīng)過DNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。C-表現(xiàn)出可以與源自血清的微泡共分離的“凋亡小體”樣梯狀物的假凝膠。圖25是描述利用帶有或不帶有RNA酶處理的方法產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。 在裂解和核酸提取之前通過RNA酶消化從尿樣分離的微泡顆粒，除去未位于微泡內(nèi)的RNA。 A-不經(jīng)過RNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。B-經(jīng)過RNA酶消化產(chǎn)生的圖譜。圖沈是描述從尿微泡和大鼠腎組織產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-來自大鼠腎組織的圖譜。B-來自尿微泡的圖譜。圖27是利用可以使小RNA提取物富集的方法從尿微泡和大鼠腎組織產(chǎn)生的RNA 圖譜的兩個圖表。A-來自大鼠腎組織的圖譜。B-來自尿微泡的圖譜。圖28是描述經(jīng)過或不經(jīng)過DNA酶處理，從已除去而且通過分離技術(shù)未捕獲到微泡的全尿產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-不經(jīng)過DNA酶處理從全尿分離的核酸。B-經(jīng)過DNA 酶處理從全尿分離的核酸。圖四是描述從尿微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-不經(jīng)過DNA酶處理從尿微泡分離的核酸。B-經(jīng)過DNA酶處理從尿微泡分離的核酸。圖30是描述由從在300g旋轉(zhuǎn)期間形成的顆粒中提取的核酸產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-不經(jīng)過DNA酶處理從300g旋轉(zhuǎn)顆粒中分離的核酸。B-經(jīng)過DNA酶處理從300g 旋轉(zhuǎn)顆粒中分離的核酸。圖31是描述由從在17’ OOOg旋轉(zhuǎn)期間形成的顆粒中提取的核酸產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-不經(jīng)過DNA酶處理從17，OOOg旋轉(zhuǎn)顆粒產(chǎn)生的核酸圖譜。B-經(jīng)過DNA酶處理從17’ OOOg旋轉(zhuǎn)顆粒產(chǎn)生的核酸圖譜。圖32是描述由經(jīng)過或不經(jīng)過微泡內(nèi)RNA酶消化，在微泡裂解之前外部經(jīng)受RNA酶和DNA酶消化的微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-不經(jīng)過微泡內(nèi)RNA酶消化產(chǎn)生的核酸圖譜。B-經(jīng)過微泡內(nèi)RNA酶消化產(chǎn)生的核酸圖譜。圖33是描述由經(jīng)過或不經(jīng)過微泡內(nèi)DNA酶消化，在微泡裂解之前外部經(jīng)受RNA酶和DNA酶消化的微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的兩個圖表。A-不經(jīng)過微泡內(nèi)DNA酶消化產(chǎn)生的核酸圖譜。B-經(jīng)過微泡內(nèi)DNA酶消化產(chǎn)生的核酸圖譜。在圖表B上，緊接在20秒之后的峰相比圖表A中的匹配峰減小。這種減小表明，外來體內(nèi)存在少量的DNA酶可消化物質(zhì)。圖34A)是通過尿微泡的RT-PCR分析，經(jīng)BioAnalyzer產(chǎn)生的“假凝膠”圖譜，其中可以明確鑒定出RiboAmp擴增的β -肌動蛋白和GAPDH的mRNA轉(zhuǎn)錄物；B)示出強調(diào)它的六個功能不同的區(qū)域的腎單位和集合導(dǎo)管。1.腎小球；2.近端小管；3.細(xì)下降枝；4.髓質(zhì)粗上升枝；5.遠(yuǎn)曲小管；6.集合導(dǎo)管。 圖35表示通過來自尿微泡的RiboAmped mRNA的RT-PCR分析檢測到的，經(jīng)BioAnalyzer產(chǎn)生的假凝膠圖譜，其中可以鑒定出來自腎單位和集合導(dǎo)管的區(qū)域1和2的 mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼特異基因，具體地1.腎小球NPHS2-p0d0Cin(在足細(xì)胞裂孔隔膜處足突質(zhì)膜上有特異表達(dá)的寡聚體)，LGALSl-半乳糖凝集素-1，HSPG2-硫酸乙酰肝素蛋白多糖。2.近端小管:CUBN-吞飲受體，LRP2-兆蛋白，AQPl-水通道蛋白1，CA4-碳酸酐酶4， CLCN5-氯離子通道蛋白5。圖36表示通過來自尿微泡的RiboAmped mRNA的RT-PCR分析檢測到的，經(jīng) BioAnalyzer產(chǎn)生的假凝膠圖譜，其中可以鑒定出來自腎單位和集合導(dǎo)管的區(qū)域3-6的 mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼特異基因，具體地3.細(xì)下降枝BDKRBl-緩激肽Bl受體。4.髓質(zhì)粗上升枝CALCR-降鈣素受體，SCNNlD-阿米洛利敏感鈉通道δ亞基。5.遠(yuǎn)曲小管SLC12A3-噻嗪類敏感性氯化鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白。6.集合導(dǎo)管AQP2-水通道蛋白2，ATP6VlBl-vATPaSe Bl 亞基，SLC12A1-腎特異Na-K-Cl同向轉(zhuǎn)運體。圖37A)是描述通過RT-PCR分析檢測到的，V-ATPase Bl Κ0(Β1_/_)和野生型 (Bi+/+)小鼠中V-ATPase Bl亞基和AQP2 mRNA的表達(dá)的兩個BioAnalyzer假凝膠圖譜； B)是描述通過實時PCR分析檢測到的，V-ATPase Bl KO(Bi-/-)和野生型(Bi+/+)小鼠尿微泡和腎細(xì)胞中V-ATPase B2亞基的表達(dá)的兩個圖表。“NS” -沒有統(tǒng)計學(xué)意義。圖38是描述由尿微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的三個圖表。在使微泡膜破裂用于核酸提取之前，未洗滌尿微泡或未用任何提取促進(jìn)劑對它進(jìn)行處理。三個樣品用于這組提取中。該圖譜分別在圖A、B和C中示出。圖39是描述由尿微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的三個圖表。在使微泡膜破裂用于核酸提取之前，未洗滌尿微泡但用RNA酶抑制劑，RNase-In (ftOmega)對它進(jìn)行處理。三個樣品用于這組提取中。該圖譜分別在圖A、B和C中示出。圖40是描述由尿微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的三個圖表。在使微泡膜破裂用于核酸提取之前，洗滌尿微泡但未用任何RNA酶抑制劑對它進(jìn)行處理。三個樣品用于這組提取中。該圖譜分別在圖A、B和C中示出。圖41是描述由尿微泡產(chǎn)生的RNA圖譜的三個圖表。在使微泡膜破裂用于核酸提取之前，洗滌尿微泡并用RNA酶抑制劑對它進(jìn)行處理。三個樣品用于這組提取中。該圖譜分別在圖A、B和C中示出。圖42是在從尿微泡提取的RNA的深度測序分析中存在500個以上的轉(zhuǎn)錄物結(jié)果數(shù)(“尖峰(spike)”)的染色體區(qū)域的列表。該數(shù)字表示，每個染色體區(qū)域的起點和終點。 例如，“chrl. -1. 91625366. 91625741”是指91625366和91625741號核苷酸之間的人染色體1上的區(qū)域。也指出相應(yīng)的SEQ ID NO。圖43是在PCR反應(yīng)中用于擴增所指出的10個染色體區(qū)域中的序列的引物列表。例如，“chrl. -1. 91625366. 91625741” 是指 91625366 和 91625741 號核苷酸之間的人染色體1上的區(qū)域。用于擴增這個區(qū)域的引物對是“tccagctcacgttccctatt IL和 ccaggtggggagtttgact 1R”。引物從左到右由5，伸展到3，。圖44是描述10個富含尖峰的染色體區(qū)域PCR擴增結(jié)果的兩個BioAnalyzer假凝膠圖譜。每幅圖頂部處的泳道編號對應(yīng)于圖43所示的染色體區(qū)域的編號。在A中，來自尿微泡的核酸提取物用作PCR模板。在B中，來自腎組織的核酸提取物用作PCR模板。圖45-73是描述四個染色體區(qū)域中的尖峰的圖表。該區(qū)域在每個圖表的頂部指出。例如，圖46中的圖表指出區(qū)域“chrl.-1.91625366. 91625741”，其是91625366和 91625741號核苷酸之間的人染色體1上的區(qū)域。
具體實施例方式微泡由真核細(xì)胞脫落或從質(zhì)膜中出芽到細(xì)胞外面。這些膜囊泡的直徑是不均勻的，其尺寸為約IOnm至約5000nm。由細(xì)胞內(nèi)多泡體胞吐釋放的小微泡(直徑為約10至 lOOOnm，更經(jīng)常為約10至200nm)在本領(lǐng)域中稱為“外來體(exosomes) ”。本文描述的組合物、方法和用途同樣適用于所有尺寸，優(yōu)選10至800nm，更優(yōu)選10至200nm的微泡。在一些文獻(xiàn)中，術(shù)語“外來體”也稱為含有參與mRNA降解和核仁小RNA (snoRNA)、 核內(nèi)小RNA(snRNA)和核糖體RNA(rRNA)加工的核糖核酸外切酶的蛋白質(zhì)復(fù)合體(Liu等人，2006;van Dijk等人，2007)。此種蛋白質(zhì)復(fù)合體不具有膜，并且不是這里使用的那些術(shù)語，“微泡”或“外來體”。本發(fā)明部分地基于這一發(fā)現(xiàn)不利因素可以阻止生物樣品中核酸的有效提取，新的意料不到的藥劑和步驟可以用于緩和或除去該不利因素，從而顯著提高所提取核酸的質(zhì)量。因此，本發(fā)明的一方面是從生物樣品提取高質(zhì)量核酸的新方法。通過本文描述的新方法獲得的高質(zhì)量提取物的特征是高產(chǎn)量和高完整性，使得所提取核酸對優(yōu)選高質(zhì)量核酸提取物的各種應(yīng)用都有用。概括地說，該新方法包括，例如以下步驟獲取生物樣品，緩和或除去阻止生物樣品中核酸的有效提取的不利因素，和從生物樣品中提取核酸，任選地接著進(jìn)行核酸分析?？蛇m用的生物樣品包括，例如，細(xì)胞、一組細(xì)胞、細(xì)胞片段、包括例如微泡的細(xì)胞產(chǎn)物、細(xì)胞培養(yǎng)物、來自受試者的身體組織，或體液。該體液可以是從受試者身體的任何地方，優(yōu)選外周區(qū)分離的液體，包括但不限于血液、血漿、血清、尿、痰、脊髓液、胸膜液、乳頭抽吸液、淋巴液、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的液體、淚液、唾液、母乳、淋巴系統(tǒng)液、精液、腦脊液、器官系統(tǒng)內(nèi)液體(intra-organ system fluid)、腹水、腫瘤囊液、羊水及其組合。生物樣品有時可以來自受試者。術(shù)語“受試者”傾向于包括顯示出或預(yù)料具有微泡的所有動物。在特定實施例中，該受試者是哺乳動物，人或非人靈長類動物、狗、貓、馬、牛， 其他農(nóng)場動物，或嚙齒動物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠等)。術(shù)語“受試者”和“個體”在本文可以互換地使用。在執(zhí)行緩和或除去不利影響的步驟之前、之后或同時，可以任選地對生物樣品進(jìn)行加工從而獲取生物樣品衍生物。該生物樣品衍生物可以是細(xì)胞、細(xì)胞碎片、膜囊泡、或微泡。在獲得生物樣品衍生物如微泡之前有時對生物樣品進(jìn)行預(yù)加工。在一些情況下， 該預(yù)加工步驟是優(yōu)選的。例如，可以預(yù)加工尿樣從而獲得尿微泡。該預(yù)加工可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)如低速離心和預(yù)過濾完成。例如，尿樣可以經(jīng)受300g的第一離心步驟從而除去該樣品中的大顆粒。尿樣可以經(jīng)受17’ OOOg的第二離心步驟從而除去該樣品中較小的顆粒。在第二離心步驟之后，尿樣可以進(jìn)一步經(jīng)受預(yù)過濾步驟，例如，0. Sum預(yù)過濾步驟。替換地，尿樣可以通過預(yù)過濾步驟進(jìn)行預(yù)加工，而不需經(jīng)受該離心步驟中的一個或多個?？梢詮纳飿悠帆@得膜囊泡，例如微泡。在一些情況下，此種分離可以在一些情況下在不預(yù)加工生物樣品的情況下執(zhí)行。在其他情況下，此種分離可以在預(yù)加工生物樣品之后執(zhí)行。該分離步驟對于來自生物樣品的高質(zhì)量核酸提取物可能是有利的。例如，該分離可以產(chǎn)生這些優(yōu)點，如1)存在選擇性地分析疾病或腫瘤特異性核酸的可能，通過將疾病或腫瘤特異性微泡與流體樣品內(nèi)其他微泡分離可以獲得該核酸；幻所獲得的核酸與直接從流體樣品提取核酸獲得的產(chǎn)量/完整性相比，具有顯著較高的產(chǎn)量和較高的完整性；3) 可量測性，例如，從而檢測以低水平表達(dá)的核酸，可以通過使來自更大體積血清的更多微泡成粒增大靈敏性；4)核酸較純，因為在核酸提取步驟之前從微泡顆粒中除去了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)、死細(xì)胞的碎片，以及其他潛在污染物和PCR抑制劑；和幻核酸提取方法方面的選擇更多，因為微泡顆粒比起始血清的體積小得多，使得利用小容積列過濾器從這些微泡顆粒中提取核酸成為可能。從生物樣品中分離微泡的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，差速離心方法描述在Raposo等人(Raposo等人，1996)的論文、Skog等人(Skog等人，2008)的論文和 Nilsson等人(Nilsson等人，2009)的論文中。陰離子交換和/或凝膠滲透色譜的方法描述在美國專利第6，899，863號和第6，812，023號中。蔗糖密度梯度或細(xì)胞器電泳的方法描述在美國專利第7，198，923號中。磁性活化細(xì)胞分選(MACS)的方法描述在Taylor和 Gercel-Taylor (Taylor和Gercel-Taylor，2008)的論文中。納米膜超濾濃縮方法描述在 Cheruvanky等人(Cheruvanky等人，2007)的論文中。進(jìn)一步地，可以通過新開發(fā)的使用獨特微流體平臺高效選擇性地分離腫瘤來源的微泡的微芯片技術(shù)，從受試者的體液中鑒定和分離微泡(Chen等人)。前述參考文獻(xiàn)中的每篇都通過引用合并在此，用于教導(dǎo)這些方法。在本文描述的方法的一個實施例中，在從體液分離的微泡中，對起源于特定細(xì)胞類型，例如，肺、胰腺、胃、小腸、膀胱、腎、卵巢、睪丸、皮膚、結(jié)直腸、乳房、前列腺、腦、食道、肝、胎盤、胎兒細(xì)胞的那些進(jìn)行富集。因為該微泡通常攜帶來自它們的供體細(xì)胞的表面分子如抗原，表面分子可以用于鑒定、分離和/或富集來自特定供體細(xì)胞類型的微泡 (Al-Nedawi等人，2008 ；Taylor和Gercel-Taylor，2008)。以這種方式，可以對起源于不同細(xì)胞群體的微泡中的核酸含量進(jìn)行分析。例如，腫瘤(惡性及非惡性)微泡攜帶與腫瘤關(guān)聯(lián)的表面抗原，并可以通過與這些特異性腫瘤關(guān)聯(lián)的表面抗原檢測、分離和/或富集。在一個實例中，該表面抗原是上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)，其對來自肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、頭部和頸部癌、和肝起源的微泡具有特異性，但對血液細(xì)胞起源的微泡沒有特異性 (Balzar等人，1999 ；Went等人，2004)。在另一個實例中，該表面抗原是CDM，CDM是對尿微泡具有特異性的糖蛋白(Keller等人，2007)。在又一個實例中，該表面抗原選自一組分子，如CD70、癌胚抗原(CEA)、EGFR、EGFRvIII，和其他變體、Fas配體、TRAIL、鐵傳遞蛋白受體、p38. 5、p97和HSP72。另外，腫瘤特異性微泡的特征是缺少表面標(biāo)記，如⑶80和⑶86。特定細(xì)胞類型的微泡分離可以通過，例如使用對期望表面抗原特異的抗體、適配體、適配體類似物或分子印跡聚合物完成。在一個實施例中，該表面抗原是對癌癥類型特異的。在另一個實施例中，該表面抗原是對細(xì)胞類型特異的，該細(xì)胞類型不一定是癌性的?；诩?xì)胞表面抗原的微泡分離方法的一個實例提供在美國專利第7，198，923號中。如美國專利第 5，840，867 號和第 5，582，981 號、W0/2003/050290 以及 Johnson 等人(Johnson 等人， 2008)的出版物中描述的，適配體及其類似物特異性地結(jié)合表面分子，并可以用作重新獲得細(xì)胞類型特異性的微泡的分離工具。分子印跡聚合物也特異性地識別表面分子，如美國專利第 6，525，154 號、第 7，332，553 號和第 7，384，589 號以及 Bossi 等人(Bossi 等人，2007)的出版物中描述的，并且是重新獲得和分析細(xì)胞類型特異性微泡的工具。前述參考文獻(xiàn)中的每篇均通過引用合并在此，用于教導(dǎo)這些方法。在期望生物衍生物是膜囊泡如微泡的情況下，有時執(zhí)行除去未位于微泡內(nèi)的核酸的步驟。除去核酸的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，為了從樣品中除去此種核酸，可以執(zhí)行酶消化步驟。此種酶可以是催化核糖核酸酶消化的核糖核酸酶類型，或催化脫氧核糖核酸酶消化的脫氧核糖核酸酶類型。在本發(fā)明的一個方面，該新核酸提取方法包括除去或緩和阻止生物樣品中核酸的高質(zhì)量提取的不利因素的步驟。此種不利因素是多種多樣的，因為不同生物樣品可以包含各個種類的此類不利因素。在一些生物樣品中，諸如過多微泡外(eXtra-miCr0VesiCle)DNA 的因素可能會影響來自此種樣品的核酸提取物的質(zhì)量，污染從微泡內(nèi)提取的DNA。在其他樣品中，諸如過多內(nèi)源性RNA酶的因素可能會影響來自此種樣品的核酸提取物質(zhì)量。許多藥劑和方法可以用于除去這些不利因素。這些方法和藥劑統(tǒng)稱為“提取促進(jìn)操作(extraction enhancement operation)，，。在一些情況下，提取促進(jìn)操作可以包括向生物樣品或向衍生物中添加核酸提取促進(jìn)劑。為了除去諸如內(nèi)源性RNA酶的不利因素，這里定義的此種提取促進(jìn)劑可以包括，但不限于，市售 RNA 酶抑制劑如 SuperaseHn (Ambion Inc. )、RNaseIN(Promega Corp.)或以類似方式起作用的其他藥劑、蛋白酶、還原劑、誘餌底物如合成RNA、可結(jié)合RNA酶的可溶性受體、小干擾RNA (siRNA)，RNA結(jié)合分子如抗-RNA抗體或伴侶蛋白，RNA酶變性物質(zhì)如高滲透壓溶液、去污劑或它們的組合。這些促進(jìn)劑可以各種方式發(fā)揮作用，例如，但不限于，通過抑制RNA酶活性(例如，RNA酶抑制劑)，通過蛋白質(zhì)中普遍存在的降解(例如，蛋白酶)，或通過結(jié)合并保護(hù)RNA的伴侶蛋白(例如，RNA-結(jié)合蛋白)。在所有情況下，此種提取促進(jìn)劑可以除去或緩和生物樣品的一些或全部不利因素，這些不利因素否則將會阻止或干擾生物樣品中核酸的高質(zhì)量提取。在其他情況下，該提取促進(jìn)操作可以包含，執(zhí)行一個或多個加工步驟。此種加工包括充分或基本上全面地洗滌樣品的含核酸組分，如微泡；對該生物樣品的RNA酶進(jìn)行尺寸分選(size separation)；通過各種技術(shù)使生物樣品中的蛋白質(zhì)變性，該技術(shù)包括，但不限于，產(chǎn)生特定PH條件、溫度條件(例如，降低或較低溫度的維持)、冷凍/解凍循環(huán)，及它們的組合。本文描述的提取促進(jìn)操作的使用的一個驚人表現(xiàn)是，檢測微泡的核酸提取物中是否存在顯著量核糖體RNA(rRNA)的能力。目前沒有任何現(xiàn)有研究可以證明在微泡核酸提取物中檢測到18SrRNA。相反，現(xiàn)有研究認(rèn)為，微泡的核酸提取物中不存在或僅存在很少的 rRNA (Skog 等人，2008 ；Taylor 和 Gercel-Taylor, 2008 ；Valadi 等人，2007)。在本發(fā)明另一方面，提取促進(jìn)操作的執(zhí)行將可以改進(jìn)所提取RNA在RNA 完整性(RNA質(zhì)量完整性指數(shù)，RIN)方面的質(zhì)量。RNA完整性(RIN)，由Agilent Technologies (http//www.chem.agilent.com/en-us/products/instruments/ lab-on-a-chip/pages/gpl4975. aspx，2010年7月15日訪問)設(shè)計，是設(shè)計用于評價總RNA 樣品完整性的軟件工具的產(chǎn)物。該軟件自動地給真核生物的總RNA樣品分配完整性。利用這個工具，樣品完整性不由18S和28S核糖體條帶的比率決定，而由RNA樣品的整個電泳跡線(trace)決定。這包括降解產(chǎn)物的存在與否。分配的RIN不依賴于樣品濃度、儀器、和分析人員，可以用作RNA完整性的標(biāo)準(zhǔn)物。在本發(fā)明的又一個方面，提取促進(jìn)操作的執(zhí)行將可以提高所提取核酸的量或產(chǎn)量。例如，利用如本文描述的提取促進(jìn)操作，可以從20ml低蛋白生物樣品如尿中獲得大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量?？商鎿Q地，可以從Iml高蛋白生物樣品如血清或血漿中獲得大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。通過本文描述的方法獲得的新的高質(zhì)量核酸提取物可以表現(xiàn)出，檢測到的，優(yōu)選約1 1 約1 2，更優(yōu)選約1 2比率的18S rRNA和^S rRNA的組合物；對于低蛋白生物樣品的大于或等于5的RNA完整性，或?qū)τ诟叩鞍咨飿悠返拇笥诨虻扔?的RNA完整性；和來自20ml低蛋白生物樣品或Iml高蛋白生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產(chǎn)量。高質(zhì)量RNA提取物是非常理想的，因為RNA降解會嚴(yán)重地影響所提取RNA，如在基因表達(dá)和mRNA分析，以及非編碼RNA如小RNA和微RNA分析中的下游評估。本文描述的新方法使得人們能夠從生物樣品如微泡中提取高質(zhì)量核酸，以便可以準(zhǔn)確地分析外來體內(nèi)的基因表達(dá)和突變水平。在一個實施例中，例如，當(dāng)增大用作提取促進(jìn)劑的蛋白酶濃度(5X， 10X)時，從尿微泡中分離的RNA量和完整性顯著增大。本發(fā)明的另一個方面提供了從生物樣品如尿中提取高質(zhì)量小RNA的方法。小RNA， 如miRNA在核酸提取過程中特別易于降解和損失。在這里公開的新方法中，利用高濃度的蛋白酶除去或緩和阻止小RNA的高質(zhì)量提取的不利因素。在一個實施例中，提取核酸，特別是小RNA的方法使用25X和50X蛋白酶作為提取促進(jìn)劑，可以獲得顯著增大的量的小 RNA。如本文使用的，諸如5X、10X、25X和50X的表達(dá)是指是市售核酸提取試劑盒如QIAamp MinElute Virus Spin試劑盒中目前使用或推薦的蛋白酶活性水平的5倍、10倍等。當(dāng)影響提取的不利因素已除去或緩和時，可以利用本領(lǐng)域眾所周知的許多程序從生物樣品中分離核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以選擇適合于特定核酸樣品的特定分離程序。提取方法的實施例提供在本文的實施例部分中。在一些情況下，利用一些技術(shù)，也可以在不從微泡中提取的情況下分析核酸。在一個實施例中，可以直接分析所提取的包括DNA和/或RNA在內(nèi)的核酸，無需擴增步驟。直接分析可以利用不同方法執(zhí)行，包括，但不限于，納米鏈(nanostring)技術(shù)。 Nanostring技術(shù)使人們能夠通過將彩色編碼的熒光指示劑附著于每種靶分子上來鑒定和量化生物樣品中的各個靶分子。這種途徑與通過掃描條形碼測量庫存的概念類似。指示劑可以由允許高度多重分析的數(shù)百種或甚至數(shù)千種不同的編碼制成。該技術(shù)描述在Geiss等人(Geiss等人，2008)的出版物中，并通過引用合并在此用于教導(dǎo)。在另一個實施例中，在分析微泡的核酸之前對它進(jìn)行擴增可能是有利的或其他期望的。核酸擴增方法在本領(lǐng)域中是常用的且是共知的，本文描述了它的許多實例。需要時， 可以這樣執(zhí)行擴增，以便它是定量的。定量擴增將允許定量地確定各種核酸的相對量從而產(chǎn)生如下面描述的圖譜。在一個實例中，所提取的核酸是RNA。然后，在進(jìn)一步擴增RNA之前，優(yōu)選將它逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA)。此種逆轉(zhuǎn)錄可以單獨執(zhí)行或與擴增步驟結(jié)合執(zhí)行。將逆轉(zhuǎn)錄和擴增步驟結(jié)合的方法的一個實例是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，其可以進(jìn)一步修改成定量的，例如美國專利第5，639，606號中描述的定量RT-PCR，該專利通過引用合并在此用于教導(dǎo)。核酸擴增方法包括，但不限于，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(美國專利第5，219，727號) 及其變體如原位聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利第5，538，871號)、定量聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利第5，219，727號)、巢式聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利第5，556，773號)、自主序列復(fù)制及其變體(Guatelli等人，1990)、轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)及其變體(Kwoh等人，1989)、Qb復(fù)制酶及其變體(Miele等人，1983)、冷PCR (Li等人，2008)，或任何其他核酸增殖方法，核酸擴增方法之后是所擴增分子利用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)的檢測。如果此種分子以非常少的數(shù)目存在，則尤其有用的是設(shè)計用于檢測核酸分子的那些檢測方案。前述參考文獻(xiàn)合并在此， 用于教導(dǎo)這些方法。存在于微泡中的核酸的分析是定量和/或定性的。對于定量分析，微泡內(nèi)感興趣的特定核酸的量(表達(dá)水平)，不論相對量或絕對量，都可以利用本領(lǐng)域已知的方法(下文描述的)測量。對于定性分析，微泡內(nèi)感興趣的特定核酸種類，不論野生型或其變體，都可以利用本領(lǐng)域已知的方法鑒定。這里公開的本發(fā)明也包括來自微泡的核酸提取物作為新物質(zhì)組成，其中可在該提取物中檢測到18SrRNA。此種核酸提取可以利用本發(fā)明公開的新核酸提取方法完成。生物樣品中微泡的高質(zhì)量核酸提取在許多情況下都是期望的。在一些情況下，組織樣品不容易取得(easily accessible)。例如，腦腫瘤樣品不經(jīng)過腦手術(shù)通常無法獲得。 相反，來自腦腫瘤患者血清的微泡樣品容易取得。為了分析腦腫瘤細(xì)胞中的核酸，分析腦腫瘤細(xì)胞分泌的血清微泡中的核酸比較容易。所以，在用組織細(xì)胞分泌的微泡中的核酸代替來自組織細(xì)胞的核酸的情況下，期望獲得這樣的高質(zhì)量核酸，其像從組織細(xì)胞直接獲得的那些一樣，包含可檢測的質(zhì)控物(quality controls)，如18S rRNA和^S rRNA。在其他情況下，高質(zhì)量小RNA是期望的。本文公開的核酸提取物包含此種高質(zhì)量小RNA，以及ISSrRNA 和^S rRNA。此種高質(zhì)量小RNA對于準(zhǔn)確評估用于各種目的核酸，例如，特定miRNA的表達(dá)水平是重要的。本文公開的本發(fā)明進(jìn)一步包括來自生物樣品中微泡的核酸的新的高質(zhì)量圖譜。此種圖譜通過分析包含18S rRNA和^S rRNA的核酸提取物產(chǎn)生。此種圖譜可以利用本文公開的新方法獲得。高質(zhì)量核酸圖譜是許多應(yīng)用，如作為醫(yī)學(xué)病況或療法選擇的標(biāo)記的應(yīng)用所高度期望的。期望此種圖譜在不同樣品之間是一致的。此種一致性在不存在高質(zhì)量核酸提取物的情況下幾乎無法獲得。在本發(fā)明的一個實施例中，核酸圖譜可以通過分析這些起源的細(xì)胞分泌的微泡中的核酸來獲得。此種微泡可以從容易取得的生物樣品，例如尿、血清或血漿中分離出來。此種核酸圖譜可以包括小RNA、信使RNA、微RNA、非編碼RNA或其組合。 在本發(fā)明的進(jìn)一步實施例中，此種核酸圖譜可以與其他生物標(biāo)記結(jié)合從容更準(zhǔn)確地獲得某些結(jié)果。核酸圖譜，例如可以是遺傳畸變的集合，該集合在本文用于指微泡內(nèi)的核酸量以及核酸變體。具體地，遺傳畸變包括，但不限于，基因(例如，致癌基因)或一組基因的過表達(dá)、基因(例如，腫瘤抑制基因如P53或RB)或一組基因的低表達(dá)、基因或一組基因的替換剪接變體的產(chǎn)生、基因拷貝數(shù)變異(CNV)(例如，DNA雙微體)(Hahn，1993)、核酸修飾(例如，甲基化、乙酰化和磷酸化)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、染色體重排(例如，倒置、缺失和重復(fù))，以及基因或一組基因的突變(插入、缺失、復(fù)制、錯義、無義、同義或任何其他核苷酸改變)，這種突變在許多情況下最終會影響基因產(chǎn)物的活性和功能，導(dǎo)致替換的轉(zhuǎn)錄剪接變體形成和/或?qū)е禄虮磉_(dá)水平改變。此種遺傳畸變可以通過技術(shù)人員已知的多種技術(shù)確定。例如，核酸表達(dá)水平、替換剪接變體、染色體重排和基因拷貝數(shù)可以通過微陣列技術(shù)(美國專利第6，913，879號、 第 7，364，848 號、第 7，378，245 號、第 6，893，837 號和第 6，004，755 號)和定量 PCR 確定。 特別地，拷貝數(shù)變化可以利用Illumina Infinium II全基因組基因分型分析或Agilent Human Genome CGH Microarray (Meemers等人，2006)檢測。核酸修飾可以通過例如美國專利第7，186，512號和專利申請W0/2003/023065中描述的方法分析。特別地，甲基化圖譜可以通過 Illumina DNA Methylation 0MA003Cancer Panel 測定。SNP 和突變可以通過利用等位基因特異性探針進(jìn)行的雜交、酶突變檢測、不匹配異源雙鏈的化學(xué)裂解(Cotton等人，1998)、不匹配堿基的核糖核酸酶裂解(Myers等人，1985)、質(zhì)譜(美國專利第6，994，960 號、第7，074，563號和第7，198，893號)、核酸測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) (Orita等人， 1989)、變性梯度凝膠電泳(DGGE) (Fischer 和 Lerman，1979a ；Fischer 和 Lerman，1979b)、 溫度梯度凝膠電泳(TGGE) (Fischer 和 Lerman ； 1979a ；Fischer 和 Lerman，1979b)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP) (Kan和Dozy，1978a ；Kan和Dozy，1978b)、寡核苷酸連接測定法 (OLA)、等位基因特異性PCR(ASPCR)(美國專利第5，639，611號)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)及其變體(Abravaya等人，1995 ；Landegren等人，1988 ；Nakazawa等人，1994)、流式細(xì)胞儀異源雙鏈分析(W0/2006/113590)及其組合/修飾檢測。特別地，基因表達(dá)水平可以通過基因表達(dá)(SAGE)技術(shù)(Velculescu等人，19%)的系列分析測定。一般而言，分析遺傳畸變的方法在許多出版物中有報道，不限于本文引用的那些，是技術(shù)人員可以獲得的。適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄈQ于分析的具體目標(biāo)、患者的狀況/病史，以及待檢測、監(jiān)測或治療的特定癌癥(或多種特定癌癥)、疾病或其他醫(yī)學(xué)病況。前述參考文獻(xiàn)合并在此用于教導(dǎo)這些方法。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文描述的特定方法、方案和試劑，它們是可以改變的。 本文使用的術(shù)語僅為了描述特定實施例，并不是要限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍僅由權(quán)利要求限定。本發(fā)明公開的主題的實施例在下面給出。本發(fā)明公開的主題的其他特征、目的和優(yōu)點可以明顯地從詳細(xì)說明、附圖、實施例和權(quán)利要求中看出?？梢岳没绢愃朴诨虻葍r于本文描述的方法、設(shè)備和材料的那些方法、設(shè)備和材料實施或測試本發(fā)明公開的主題。下面描述示例方法、設(shè)備、用途和材料。尿中的微泡實施例1 腎細(xì)胞含有多泡體為了檢查腎細(xì)胞是否脫落微泡，我們使用透射電子顯微鏡(TEM)測定腎細(xì)胞是否含有可產(chǎn)生微泡的多泡體。通過利用2. 0%的在0. IM pH為7. 4的二甲胂酸鈉緩沖液 (Electron Microscopy Sciences, PA)中的戊二醛進(jìn)行血管內(nèi)灌注來固定大鼠腎，并進(jìn)一步將腎切片在4°C下固定過夜。該樣品切片用0. IM二甲胂酸鈉緩沖液沖洗，室溫下經(jīng)1.0% 的在二甲胂酸鹽緩沖液中的四氧化鋨后固定lh，再次用緩沖液沖洗，然后用蒸餾水(dH20) 沖洗并整塊(en bloc)在室溫下在2. 0%乙酸鈾酰水溶液中染色1小時。該樣品用蒸餾水沖洗，通過梯度乙醇脫水至100%。通過將該樣品整夜浸泡在1 lWEpon 乙醇溶液中而完成該樣品的Epon樹脂(Ted Pella, CA)浸潤。第二日將該樣品放在新鮮Epon中數(shù)小時并于60°C下在Epon中包埋過夜。在Reichert Ultracut E ultramicrotome上切割薄切片，收集在聚乙烯醇縮甲醛(formvar)包覆網(wǎng)上，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。在SOkV的 JEOL JEM 1011 透射電子顯微鏡下檢查樣品。使用AMT(Advanced Microscopy Techniques, ΜΑ)數(shù)字成像系統(tǒng)收集圖像。如圖1所示，在大鼠腎組織細(xì)胞中看到MVB的透射電子顯微鏡 (TEM)圖像。可以在腎單位和集合導(dǎo)管的各個區(qū)域中鑒定到多泡體(MVB)，該區(qū)域包括足狀突細(xì)胞、近端小管、細(xì)下降枝、粗上升枝、集合導(dǎo)管主細(xì)胞，和集合導(dǎo)管閏細(xì)胞。這證明了，腎單位的各個區(qū)域以及集合導(dǎo)管的閏細(xì)胞和主細(xì)胞中確實可以釋放外來體。實施例2 尿中存在微泡為了檢查微泡本身，我們通過TEM檢查了人尿微泡。根據(jù)Massachusetts General Hospital批準(zhǔn)的IRB準(zhǔn)則獲取人尿。然后通過由三個步驟組成的方法預(yù)加工該尿于4°C 在300g下離心該尿10分鐘、于4°C在17，OOOg下離心上清液20分鐘，并通過0. 8 μ m過濾器(硝酸纖維素膜過濾裝置，Nalgene, NY)過濾上清液?？商鎿Q地，可以通過一步過濾，直接通過0. 8 μ m過濾器過濾預(yù)加工尿，不執(zhí)行任何預(yù)離心步驟。然后，在任一情況下，都將濾液在4°C下在118，OOOg下超速離心70分鐘，除去上清液，在PBS中洗滌含微泡顆粒，于4°C 在118，OOOg下再造粒70分鐘。也可以利用過濾濃縮代替離心來從預(yù)加工樣品中分離出微泡。根據(jù)制造商說明書調(diào)制過濾濃縮器(IOOkDa MWC0) (Millipore, ΜΑ) 0將預(yù)加工濾液加入到過濾濃縮器中，于 RT在4，OOOg下離心4分鐘。包括15ml PBS洗滌步驟。按1 1比例用4%的在dH20中的多聚甲醛固定微泡顆粒。用滴管吸取十(10) μ 1滴劑到formvar包覆的200目金網(wǎng)中，1分鐘后抽出。用(IH2O滴劑沖洗樣品2次。施加含水的2. 0%磷鎢酸(PTA) (10 μ 1) 10秒，抽出并用dH20沖洗一次。在80kV的JEOL JEM 1011透射電子顯微鏡下檢查樣品。利用AMT(Advanced Microscopy Techniques,ΜΑ)數(shù)字成像系統(tǒng)收集圖像。如圖2所示，該顆粒確實富含微泡。在TEM圖像中該微泡有時聚集在一起或仍然是單個的。從牛物樣品提取核酸的改講方法實施例3 過濾濃縮器可代替超速離心用于微泡分離我們在這里證明了，類似于超速離心方法，過濾濃縮器也可以產(chǎn)生用于提取RNA 的有活力(viable)微泡。我們按照實施例2詳細(xì)描述的，通過于4°C在300g下離心10分鐘，于4°C在17，OOOg離心20分鐘，然后通過0. 8 μ m過濾器過濾，預(yù)加工75ml尿。然后通過IOOkDa MWCO過濾濃縮器(Millipore，MA)和通過超速離心分離微泡，該兩種方法都分別利用RNA酶消化，并利用和不利用DNA酶消化除去微泡外核酸污染。如圖3和圖4所示，該超速離心方法和過濾濃縮方法從75ml尿樣中獲得相似的RNA濃縮物，其中超速離心(圖4) 為410士28pg/yl，過濾濃縮器(圖幻為381 士47pg/μ 1 (平均值士SD)。這兩個產(chǎn)量之間沒有統(tǒng)計顯著性差異。這些數(shù)據(jù)證明，過濾濃縮器的使用是使RNA分析用尿微泡溶膠化的可靠方法。實施例4 僅用0. Sum預(yù)過濾步驟預(yù)處理樣品的方法足以用于微泡分離進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)在300g和17，OOOg下的低速離心步驟可以除去，因為僅用0. Sum 預(yù)過濾步驟預(yù)加工尿的方法與包括低速離心步驟的方法的效果一樣。如圖5和圖6所示， 利用低速離心連同0. Sum預(yù)過濾的方法產(chǎn)生的核酸圖譜(A)與僅用0. Sum預(yù)過濾的方法產(chǎn)生的圖譜⑶相同。實施例5 利用包括除去或緩和不利因素的方法從尿微泡中提取核酸我們利用微泡中核酸提取的改進(jìn)方法。在這個方法中，我們在使微泡膜破裂之前除去了對高質(zhì)量核酸提取不利的因素。如圖7所示，通過經(jīng)由0. 8 μ m過濾器膜110過濾預(yù)加工尿樣100。然后通過超速離心或通過過濾濃縮分離濾液中的微泡120，細(xì)節(jié)類似于實施例2中描述的那些。然后使所分離的微泡經(jīng)受RNA酶和/或DNA酶消化從而除去未包含在微泡內(nèi)部的核酸130。具體地，將該微泡重懸在1 μ 1/ml在PBS中的RNA酶A(無DNA酶和蛋白酶)O^ermentas，MD)中，在37°C下溫育1小時。為了執(zhí)行DNA酶I消化，將該顆粒重懸在500 μ 1 PBS和稀釋(根據(jù)制造商說明書)在RDD緩沖液中的DNA酶I (無RNA酶) (Qiagen,CA)中，在室溫下溫育10分鐘。使該樣品在PBS中在118，OOOg下再造粒70分鐘。 為了執(zhí)行經(jīng)由過濾濃縮器分離的微泡的RNA酶A和DNA酶I消化，使用相同濃度的RNA酶和DNA酶，在過濾濃縮器中進(jìn)行溫育。然后執(zhí)行提取促進(jìn)140的步驟，例如，單獨或與蛋白酶處理結(jié)合的利用15ml PBS進(jìn)行的三個重懸/洗滌步驟。微泡分離之后，用核酸酶消化并用蛋白酶處理，提取核酸150。根據(jù)制造商說明書利用RNeasy Micro試劑盒Oliagen， CA)提取RNA。簡言之，使用350 μ 1 RLT緩沖液(帶有10 μ 1 β -巰基乙醇/mlRLT)裂解外來體，使用16 μ 1無核酸酶的水進(jìn)行洗脫。RNeasy Plus Micro試劑盒(Qiagen, CA)設(shè)計用于除去基因組DNA (gDNA)，根據(jù)制造商說明書執(zhí)行，并用16μ 1無核酸酶的水洗脫。為了使用RNeasy Micro試劑盒或RNeasy Plus Micro試劑盒分離小RNA，根據(jù)制造商說明書執(zhí)行 miRNA 分離方法。使用 Agilent BioAnalyzer (Agilent，CA)在 RNA Pico 6000 芯片 (Agilent, CA)上分析分離的RNA 160，該Agilent BioAnalyzer可以產(chǎn)生該樣品的電泳圖和相應(yīng)的“假凝膠”。如圖8和圖9所示，當(dāng)在使微泡膜破裂之前用來處理微泡的蛋白酶增多時，從尿微泡提取的RNA質(zhì)量(就產(chǎn)量和完整性而言)增大。在圖8中，利用上面的改進(jìn)方法從20ml 尿中的微泡中提取核酸，但使用Qiagen Qiamp minelute virus spin試劑盒執(zhí)行RNA提取。 利用過濾濃縮對該尿樣品進(jìn)行濃縮并用200 μ 1 PBS洗脫。這里，我們將IX蛋白酶定義為 0. 027AU ；5Χ蛋白酶定義為0. 135AU ；10Χ蛋白酶定義為0. 27AU ；25Χ蛋白酶定義為0. 675AU ； 50Χ定義為1. 35AU。當(dāng)?shù)鞍酌笣舛葟?Χ(A)增大到IOX(B)時，觀察到具有更大完整性的18S
rRNA峰。同樣地，如圖9所示，在較高的蛋白酶濃度，25X (A)和50X (B)下，除了小/miRNA水平增大之外，我們還觀察到具有更高完整性的18S rRNA和^S rRNA。這些數(shù)據(jù)表明，加入蛋白酶可以增大18S rRNA和^S rRNA的產(chǎn)量和完整性以及增多小RNA和微RNA。我們推測，蛋白酶的作用可能是由于它具有消化掉RNA酶和其他抑制因素的能力引起。增加洗滌微泡多次的步驟也顯著改進(jìn)了從尿微泡提取的核酸質(zhì)量。該洗滌步驟可以有效地除去阻止尿微泡的高質(zhì)量核酸提取的不利因素。按照上面的方法，但作一些修改， 將各20ml尿樣品用于四組核酸提取測試。對于第1組，分離的微泡直接用于核酸提取，而沒有進(jìn)行任何干預(yù)步驟。對于第2組，在核酸提取之前用RNA酶抑制劑處理微泡。對于第3組， 在核酸提取之前，洗滌微泡，但未用任何RNA酶抑制劑處理。對于第4組，在核酸提取之前， 洗滌微泡，并用RNA酶抑制劑處理。如圖38所示，對于第1組測試，所提取核酸的質(zhì)量非常差，其中RIN為3. 63士2. 3，RNA濃度為101. 3士27. 6pg/y L·對于第2組測試(圖39)，所提取核酸的質(zhì)量大致類似于1組測試中的，其中RIN為1.83士2. 2，RNA濃度為101.6±88pg/ μ Io對于第3組測試(圖40)，所提取核酸的質(zhì)量顯著改進(jìn)，其中RIN為9. 2士0.0，RNA濃度為347. 7 士97. 7pg/ μ 1。對于4組測試(圖41)，所提取核酸的質(zhì)量類似于第3組中的，其中RIN為7. 43 士 0. 2，RNA濃度為346. 3 士 32. 7pg/y L·這些數(shù)據(jù)表明，要是沒有洗滌步驟， 來自微泡的提取物質(zhì)量將會不一致，相比在核酸提取之前洗滌微泡的情況下的那些提取物具有相對較高的變化。實施例6 =RNA酶抑制劑在血清微泡的核酸提取中的應(yīng)用利用上面的改進(jìn)方法，也可以從血清微泡中獲取高質(zhì)量核酸提取物。這里，我們獲得來自黑素瘤的血清和正?；颊哐?，并使用RNA酶抑制劑雞尾酒SUPERase-In (Ambion Inc.)通過重懸處理微泡顆粒。在一批試驗中，我們從一式四份的Iml黑素瘤血清樣品分離出微泡，并用最終濃度為1. 6單位/ μ 1的SUPERase-h處理該微泡。該微泡分離方法是超速離心，在室溫下用DNA酶處理該微泡顆粒20分鐘。如圖10-13所示，來自四個黑素瘤血清樣品的RNA提取物質(zhì)量低下而且不一致，RNA產(chǎn)量為M3pg/l·! l、607pg/l·! l、1084pg/l·! 1、 1090pg/y 1，通過^s/18s比率估計RNA完整性分別為1. 7、1. 8、1. 3和0. 6。在另一批試驗中，我們從一式兩份的Iml黑素瘤血清樣品中分離出微泡，并用最終濃度為3. 2單位/ μ 1 的SUPEfcise-In處理該微泡。如圖14和圖15所示，來自經(jīng)3. 2單位SUPEfcise-In/μ 1處理的兩個黑素瘤血清樣品的RNA提取物質(zhì)量一般優(yōu)于經(jīng)1. 6單位SUPERase-In/ μ 1處理的那些的RNA提取物質(zhì)量。該兩個黑素瘤血清樣品的RNA產(chǎn)量為3433pg/ μ 1和781pg/ μ 1， 28S/18S比率分別為1. 4和1. 5。進(jìn)一步，我們測試了在1. 6單位SUPERase-In/μ 1的情況下的一式四份的Iml正常血清樣品，和在3. 2單位SUPERase-In/ μ 1的情況下的一式兩份的Iml正常血清樣品。如圖16-圖19所示，在1. 6單位SUPERase-In/ μ 1的情況下的RNA提取物質(zhì)量低下，RNA產(chǎn)量為 995pg/y lU257pg/y lU027pg/y 1 和 1206pg/y 1,28S/18S 比率分別為 1. 3、1· 6、1· 6、 1.8。相比之下，如圖20和圖21所示，在3. 2單位SUPERase-In/μ 1的情況下的RNA提取物質(zhì)量得到提高，RNA產(chǎn)率為579pg/y 1和952pg/μ 1，28S/18S比率為1. 6和2. 3。實施例7 提取促進(jìn)劑在來自生物樣品的核酸提取物中的應(yīng)用在實施例3和實施例4中，我們的測試結(jié)果表明，利用提取促進(jìn)劑處理可以提高來自微泡的RNA提取物質(zhì)量。期望此種提取促進(jìn)劑將對其他生物樣品有類似作用。如圖22所示，本發(fā)明的核酸提取新方法將需要對生物樣品執(zhí)行提取促進(jìn)操作的步驟。此種方法可以在下面設(shè)想的核酸提取實驗中舉例說明。醫(yī)生為患者開出腫瘤標(biāo)記測試。然后從該患者抽取5ml血。有時對血樣200進(jìn)行預(yù)加工從而得到血清。然后執(zhí)行促進(jìn)操作210，例如，在該血清中加入合適量的提取促進(jìn)劑，并將該混合物在37°C下溫育30分鐘。然后利用常規(guī)提取方法如實施例5中詳細(xì)描述的，從經(jīng)處理血清中提取核酸220，并利用Agilent BioAnalyzer 進(jìn)行分析230。期望此種提取可以從生物樣品中獲得高質(zhì)量核酸。來自尿微泡的核酸用作生物標(biāo)記實施例8 尿微泡被游離的微泡外非細(xì)胞DNA污染我們將尿樣分成兩個25ml完全一樣的樣品，并通過上面詳細(xì)描述的差速離心從該兩個子樣品中分離出微泡。在一個子樣品中，我們用DNA酶處理該微泡，并如上詳細(xì)描述的，從經(jīng)處理微泡中提取核酸。在另一個子樣品中，我們沒有用DNA酶處理該微泡，并從未經(jīng)處理的微泡中提取核酸。如圖23所示，游離的微泡外非細(xì)胞DNA使分離的尿微泡受到污染。當(dāng)使用RNeasy micro試劑盒提取核酸(圖23A和圖23B)時，結(jié)果顯示在未經(jīng)處理的樣品㈧中看到的核酸比在經(jīng)處理樣品⑶中看到的核酸多，因為㈧中的峰一般高于⑶ 中的峰。在另一個測試中，我們使用血清樣品代替尿樣進(jìn)行類似的測試。如圖對所示，游離的微泡外非細(xì)胞DNA也使得分離的血清微泡受到污染。在未經(jīng)DNA酶處理的樣品(A)中看到的核酸比在經(jīng)DNA酶處理的樣品⑶中看到的核酸多，因為㈧中的峰一般高于⑶中的峰。類似地，當(dāng)使用MirVana試劑盒提取核酸時，如圖23(C)和圖23(D)所示，結(jié)果也顯示，在未經(jīng)處理的樣品(C)中看到的核酸比在經(jīng)處理樣品(D)中看到的核酸多，因為(C)中的峰一般高于(D)中的峰。未經(jīng)處理的樣品中的多余核酸有可能來自于DNA酶易感的“凋亡小體”，因為看到DNA酶易感的“凋亡小體”-樣梯狀物，如圖MC中的假凝膠中所示的。 在尿和血清樣品中，游離的微泡外非細(xì)胞DNA的量在不同受試者之間有所不同，但這種DNA 的大小在大約25 1500個堿基對的范圍內(nèi)。實施例9 尿微泡大多沒有被游離的微泡外非細(xì)胞RNA污染我們將尿樣分成兩個25ml完全一樣的樣品，并通過上面詳細(xì)描述的差速離心從該兩個子樣品中分離出微泡。在一個子樣品中，我們用RNA酶處理該微泡，并如上詳細(xì)描述的，從經(jīng)處理微泡中提取核酸。在另一個子樣品中，我們沒有用RNA酶處理該微泡，并從未經(jīng)處理的微泡中提取核酸。如圖25所示，分離的尿微泡幾乎沒有被游離的微泡外非細(xì)胞 RNA所污染。未經(jīng)RNA酶處理的樣品㈧的曲線大部分與RNA酶處理的樣品⑶的曲線重疊，表明不存在與分離的微泡關(guān)聯(lián)的游離的微泡外非細(xì)胞RNA。這可能是由于尿中存在的核糖核酸酶引起的。實施例10 =Agilent BioAnalyzer測得尿微泡和腎細(xì)胞中的核酸圖譜相似我們從尿微泡和腎(腎臟)組織中提取了核酸，并將它們的圖譜加以比較。從尿微泡中提取核酸的方法詳細(xì)描述在實施例5中。經(jīng)由RNeasy Mini試劑盒和RNeasy Plus 試劑盒對大鼠腎臟樣品進(jìn)行加工。為了測定大鼠腎臟樣品中的小RNA量，還根據(jù)制造商說明書利用miRNA分離方法通過該兩個試劑盒對它們進(jìn)行加工。如圖26所示，它們的圖譜(A-腎臟，B-微泡)非常相似，包括18S rRNA峰和28S rRNA峰的存在和完整性。此種18S rRNA和^S rRNA峰在先前報道的血清來源或細(xì)胞培養(yǎng)基來源的微泡中未曾看到。除了 rRNA峰相似之外，尿微泡還含有與從腎細(xì)胞獲得的小RNA圖譜相似的小RNA 圖譜。如圖27所示，尿微泡(B)和腎組織(A)都含有小RNA(約25-200個堿基對)并共有相似的樣式。這些數(shù)據(jù)表明，利用本發(fā)明公開的新核酸提取方法時，可以利用尿微泡中的圖譜檢查該微泡起源的腎細(xì)胞中的圖譜。實施例11 尿微泡與全尿中的RNA圖譜不同我們發(fā)現(xiàn)，尿微泡中的RNA圖譜與全尿中的那些不同。我們將75ml —式兩份尿樣用于測試。首先于4°C在300g下預(yù)處理該尿10分鐘，于4°C在17，OOOg下離心上清液20分鐘，并通過0.8μπι過濾器(硝酸纖維素膜過濾裝置，Nalgene，NY)過濾上清液，接著進(jìn)行實施例5中詳細(xì)描述的步驟，如此從尿微泡中分離出RNA。根據(jù)制造商說明書利用觀尿?。磕鄯蛛x試劑盒(Zymo Research,CA)從全尿中分離出RNA。為了從經(jīng)Zymo加工的樣品中除去 DNA,將洗脫的RNA重懸在350 μ 1 RLT緩沖液中，通過利用DNA酶除去關(guān)聯(lián)DNA的RNeasy Plus Micro試劑盒進(jìn)行加工，并用16 μ 1無核酸酶的水洗脫。 如圖觀所示，在不使用DNA酶時利用觀尿RNA分離試劑盒可以分離出大量核酸 (A)。但該圖譜似乎寬廣，缺少18SrRNA峰。進(jìn)一步地，當(dāng)使用DNA酶時該圖
譜發(fā)生顯著地變化(B)，表明該提取物的大部分在性質(zhì)上為DNA。相比之下，如圖四所示， 來自相同尿樣品的微泡的RNA圖譜一般與來自全尿提取物的圖譜有著很大的不同。在該微泡圖譜中，存在18S rRNA和^S rRNA峰。另外，來自微泡的RNA比來自全尿的RNA豐富。 當(dāng)將未經(jīng)DNA酶處理的圖譜(A)與經(jīng)過DNA酶處理的圖譜(B)相比較時，可以看出來自微泡的提取物的DNA酶消化沒有顯著影響rRNA峰。來自300g顆粒(圖30)和17，OOOg顆粒 (圖31)的RNA圖譜類似于來自全尿提取物的RNA圖譜。在這兩種圖譜中，當(dāng)將未經(jīng)DNA 酶處理的圖譜(A)與經(jīng)過DNA酶處理的圖譜(B)相比較時，可以看出在DNA酶處理之后該峰顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明DNA是該提取物中的主要物質(zhì)，并且檢測不到18S rRNA和^S rRNA峰。因此，結(jié)合實施例10中的數(shù)據(jù)，可以看出來自尿微泡的RNA圖譜比來自全尿的圖譜更類似于腎細(xì)胞圖譜。進(jìn)一步地，來自微泡的RNA提取物的完整性比來自全尿的至少強 10倍。 實施例12 尿微泡含有RNA和DNA通過首先用RNA酶和DNA酶處理該顆粒從而除去游離的微泡外非細(xì)胞污染，接著在基于柱的核酸分離期間使微泡內(nèi)核酸經(jīng)受RNA酶和/或DNA酶消化，我們確定了尿微泡是否含有RNA、DNA或二者。與未經(jīng)RNA酶消化的核酸圖譜㈧相比，RNA酶消化⑶幾乎完全破壞了核酸圖譜(圖32)。這些數(shù)據(jù)表明，RNA是微泡內(nèi)最豐富的核酸。如圖33所示， 在用DNA酶對RNA酶處理的樣品進(jìn)行柱上消化之后(B)，與進(jìn)一步DNA酶消化之前的峰(A) 相比，在內(nèi)部進(jìn)一步DNA酶消化之后僅20s之后的峰減小。這種減小證明，微泡內(nèi)存在少量的DNA酶可消化物質(zhì)，優(yōu)選DNA。實施例13 尿微泡含有來自腎單位和集合導(dǎo)管各個區(qū)域的mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼特異基因如實施例10所示，通過Agilent BioAnalyzer測得，尿微泡和腎細(xì)胞中的核酸圖譜相似。這里我們進(jìn)一步證明，微泡含有來自腎單位和集合導(dǎo)管各個區(qū)域的mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼特異基因。從來自2個人受試者(年齡為23至32歲)的200ml尿中分離出尿微泡， 在外來體裂解和RNA提取之前用RNA酶和DNA酶對它進(jìn)行消化，如實施例5中詳細(xì)描述的。 利用RiboAmp (Molecular Devices, CA)對所提取的RNA進(jìn)行兩輪mRNA擴增。對于核糖擴增(riboamplification)，對于第一輪體外轉(zhuǎn)錄步驟，將樣品在42°C下溫育4小時，而對于第二輪體外轉(zhuǎn)錄步驟，將樣品在42°C下溫育6小時。在65°C下使擴增的RNA變性5分鐘， 并按Qiagen Omniscript方案Oliagen，CA)中描述的進(jìn)行第一鏈cDNA合成。在所有樣品中都識別到GAPDH和肌動蛋白基因(圖34Α)。我們檢查了腎單位和集合導(dǎo)管各個區(qū)域所特有的15個轉(zhuǎn)錄物(圖34Β)。這些包括與各種腎病有關(guān)的蛋白質(zhì)和受體，包括來自腎小球的podocin、來自近端小管的吞飲受體和來自集合導(dǎo)管的水通道蛋白2。對于人樣品，所使用的PCR引物為ACTB UTR,正向5，-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3，，
反向‘5-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3，；GAPDH EX，正向 5，-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3，，反向5，-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3，；NPHS2 UTR,正向 5，-AACTTGGTTCAGATGTCCCTTT-3，，反向5，-CAATGATAGGTGCTTGTAGGAAG-3，；LGALSl EX，正向 5，-GGAAGTGTTGCAGAGGTGTG-3，，反向5，-TTGATGGCCTCCAGGTTG-3，；HSPG2 UTR, 5，-AAGGCAGGACTCACGACTGA-3，，反向5，-ATGGCACTTGAGCTGGATCT-3，；CUBN EX，正向 5，-CAGCTCTCCATCCTCTGGAC-3，，反向5，-CCGTGCATAATCAGCATGAA-3，；LRP2 EX，正向 5，-CAAAATGGAATCTCTTCAAACG-3，，反向5，-GTCGCAGCAACACTTTCCTT-3，；AQP 1UTR,正向 5，-TTACGCAGGTATTTAGAAGCAGAG-3，，反向5，-AGGGAATGGAGAAGAGAGTGTG-3，；CA4 UTR,正向 5，-ATGATGGCTCACTTCTGCAC-3，，反向5，-TCATGCCTAAAGTCCCACCT-3，；CLCN5 EX，正向 5，-GTGCCTGGTTACACACAACG-3，，反向5，-AGGATCTTGGTTCGCCATCT-3，；BDKRB 1UTR,正向 5，-GTGGTTGCCTTCCTGGTCT-3，，反向5，-ATGAAGTCCTCCCAAAAGCA-3，；CALCR UTR,正向 5，-ATTTTGCCACTGCCTTTCAG-3，，反向5，-ATTTTCTCTGGGTGCGCTAA-3，；SCNNlD UTR,正向 5，-GCGGTGATGTACCCATGCT-3，，反向5，-CTGAGGTGGCTAGGCTTGA-3，；SLC12A3 EX，正向 5，-AGAACAGAGTCAAGTCCCTTCG-3，，反向5，-TATGGGCAAAGTGATGACGA-3，；AQP2 UTR,正向 5，-GCAGTTCCTGGCATCTCTTG-3，，反向5，-GCCTTTGTCCTTCCCTAACC-3，；ATP6V1B1 EX，正向 5，-AGGCAGTAGTTGGGGAGGAG-3，，反向5，-CGAGCGGTTCTCGTAGGG-3，；SLC12A1 EX，正向 5，-CAGATGCAGAACTGGAAGCA-3，，反向5，-GGAAGGCTCAGGACAATGAG-3，?！癠TR，，是指設(shè)計在 UTR 中的引物， “EX”是指跨外顯子設(shè)計的引物。該PCR方案為94 °C 5分鐘；94 °C 40s ； 55 °C 30s ； 65°C 1分鐘，30個循環(huán)；以及68°C 4分鐘。對于小鼠樣品，所用的引物為AQP2 正向 5，-GCCACCTCCTTGGGATCTATT-3，，反向 5’ -TCATCAAACTTGCCAGTGACAAC-3，；V-ATPase Bl 亞基正向 5，-CTGGCACTGACCACGGCTGAG-3，，反向5，-CCAGCCTGTGACTGAGCCCTG-3，。該 PCR 方案為 94°C 5 分鐘；94°C 40s, 55°C 30s, 65°C 1分鐘，30個循環(huán)；和68°C 4分鐘。
如圖34，組A所示，容易在BioAnalyzer產(chǎn)生的4個人受試者尿微泡的假凝膠中， 檢測到RiboAmp擴增的β-肌動蛋白和GAPDH的mRNA轉(zhuǎn)錄物。為了清楚起見，在圖34，組 B中示出腎單位和集合導(dǎo)管的六個區(qū)域。通過來自尿外來體的RiboAmped mRNA的RT-PCR 分析，還容易檢測該六個區(qū)域中的下列轉(zhuǎn)錄物區(qū)域1腎小球NPHS2-p0d0Cin、LGALSl-半乳糖凝集素-1、和HSPG2-硫酸乙酰肝素蛋白多糖(圖35)；區(qū)域2近端小管CUBN-吞飲受體、，LRP2-兆蛋白、AQPl-水通道蛋白1、CA4-碳酸酐酶4、和CLCN5-氯離子通道蛋白5 (圖35)；區(qū)域3細(xì)下降枝=BDKRBl-緩激肽Bl受體(圖36)；區(qū)域4髓質(zhì)粗上升枝 CALCR-降鈣素受體、和SCNNlD-阿米洛利敏感鈉通道δ亞基(圖36)；區(qū)域5遠(yuǎn)曲小管 SLC12A3-噻嗪類敏感性氯化鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(圖36)；區(qū)域6集合導(dǎo)管AQP2_水通道蛋白 2、ATP6VlBl-vATPase Bl 亞基、和 SLC12A1-腎特異 Na-K-Cl 同向轉(zhuǎn)運體(圖 36)。因此，可以識別到來自所檢查的所有腎區(qū)的mRNA轉(zhuǎn)錄物，表明腎單位和集合導(dǎo)管的所有區(qū)域都釋放含有mRNA的微泡，并且微泡可以是腎病的核酸生物標(biāo)記的新非侵入性來源。實施例14 尿微泡內(nèi)一些mRNA轉(zhuǎn)錄物對腎細(xì)胞有特異性如果利用微泡中的核酸非侵入性地檢查導(dǎo)致疾病的腎基因，則微泡中的轉(zhuǎn)錄物要對腎細(xì)胞有特異性。這里，我們證明mRNA轉(zhuǎn)錄物對腎細(xì)胞有特異性。我們使用缺乏V-ATP 酶Bl亞基的基因敲除小鼠。V-ATPase Bl的缺乏可以導(dǎo)致小鼠腎性酸中毒(Finberg KE, Wagner CA, Bailey MA, et al. , The Bl-subunit of the H(+) ATPase is required for maximal urinary acidification. Proc Natl Acad Sci USA 102:13616-13621.2005)。所有動物實驗都是根據(jù)Massachusetts General Hospital批準(zhǔn)的動物道德準(zhǔn)則執(zhí)行的。V-ATPase Bl亞基基因敲除動物已被描述(Finberg KE，Wagner CA, Bailey ΜΑ，等人.The Bl-subunit of the H(+) ATPase is required for maximal urinary acidification. Proc Natl Acad Sci USA 102 :13616-13621, 2005)。為了收集尿，將 2 個組(n = 4只動物，每組)中的動物關(guān)在代謝籠中72小時(也可以通過每個籠子關(guān)一只動物來獲得充足RNA)，收集尿用于上面針對人尿描述的微泡分離和分析。為了提取腎，使用戊巴比妥鈉(Nembutal) (Abbott Laboratories, IL) (65mg/kg體重，腹膜內(nèi)注射)使動物麻醉，立即取出腎臟并冷凍在液氮中。在液體氮氣浴中使用杵和研缽碾碎冷凍的腎臟，將其重懸在RNAlateHQiagen，CA)中，并以Iml等分試樣儲存在_80°C下。為了提取RNA，在冰上使該等分試樣解凍，在350 μ 1 RLT緩沖液(帶有10 μ 1 β -巰基乙醇/ml RLT)中使50 μ 裂解。通過包括DNA消化步驟的RNeasy Mini試劑盒^iagemCA)對小鼠腎臟樣品進(jìn)行加工。為了執(zhí)行實時PCR分析，使從小鼠尿微泡提取的RNA在65°C下變性5分鐘，并按Qiagen Sensiscript方案^liagen，MD)中描述的執(zhí)行第一鏈cDNA合成。為了執(zhí)行 knsiscript逆轉(zhuǎn)錄，使用最終濃度為lyM(Applied Biosystems, CA)的寡_dT引物。根據(jù)使用14個預(yù)擴增循環(huán)的制造指南(Applied Biosystems，CA)，在TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒中使用所得cDNA。然后用IX TE緩沖液(PromegajI)稀釋預(yù)擴增產(chǎn)物。然后根據(jù) Taqman Preamplification指南(Applied Biosystems, CA)將所得 cDNA用作實時 PCR模板。在SmartSpec 3000 (Bio-Rad, CA)上測量小鼠腎RNA濃度，并將所有樣品稀釋至90ng/ μ Io使小鼠腎RNA在65°C下變性5分鐘，并按Qiagen Omniscript方案(Qiagen5MD)中描述的執(zhí)行第一鏈cDNA合成。在執(zhí)行Omniscript逆轉(zhuǎn)錄時，使用最終濃度為1 μ M(Applied Biosystems,CA)的寡_dT引物，然后在隨后的實時PCR反應(yīng)中每孔使用1 μ 1所得cDNA。該實時 PCR 反應(yīng)利用 TaqMan Gene Expression Master Mix and Expression Assays (Mouse GAPD Part Number 4I352339E 和小鼠 iUp6vlb2 分析 id Mm00431996_mH)在 ABI 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, CA)上進(jìn)行。我們從基因敲除小鼠的腎組織和尿微泡中提取RNA。我們利用RT-PCR檢查了 V-ATP酶Bl亞基和水通道蛋白2(AQP2)mRNA的表達(dá)。如圖37，組A所示，在雙突變小鼠 (Bi-/")的腎臟和尿微泡樣品中都沒有檢測到V-ATPase Bl亞基轉(zhuǎn)錄物，這與這些小鼠中的V-ATPase Bl亞基基因被敲除的事實吻合。相反，野生型小鼠(Bi/+/+)的腎臟和微泡樣品中存在V-ATP酶Bl亞基轉(zhuǎn)錄物。在Bl基因敲除或野生型小鼠的腎和微泡樣品中容易檢測到AQP2mRNA，這是期望的，因為V-ATP酶Bl亞基缺失沒有影響AQP2的表達(dá)。進(jìn)一步地， 如圖37，組B所示，Bl基因敲除小鼠的微泡中V-ATPase B2亞基的表達(dá)水平與野生小鼠的微泡中的水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異?；蚯贸∈蟮哪I臟細(xì)胞中V-ATPase B2亞基的表達(dá)水平與野生型小鼠的腎臟細(xì)胞中的水平也是如此。因此，腎臟細(xì)胞中存在的轉(zhuǎn)錄物可以在該腎臟細(xì)胞分泌的尿微泡中檢測到，而腎臟細(xì)胞中不存在的轉(zhuǎn)錄物無法在該腎臟細(xì)胞分泌的尿微泡中檢測到。因此，尿微泡中的轉(zhuǎn)錄物對腎細(xì)胞具有特異性，并且是腎細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的非侵入性生物標(biāo)記。實施例15 尿微泡含有非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物分離尿微泡，根據(jù)實施例5中詳細(xì)描述的上面的方法提取核酸。我們對尿微泡RNA 進(jìn)行深度測序，發(fā)現(xiàn)在某些染色體上存在表現(xiàn)出極端轉(zhuǎn)錄(extreme transcription)的隨機區(qū)。當(dāng)對轉(zhuǎn)錄物數(shù)目與染色體上的位置進(jìn)行作圖時，這些轉(zhuǎn)錄物以“尖峰”形式出現(xiàn)。這些轉(zhuǎn)錄物比眾所周知的內(nèi)源性標(biāo)記如GAPDH或肌動蛋白更豐富地表達(dá)，一般位于染色體的非編碼區(qū)中。這些尖峰序列的相對高水平表達(dá)揭示，這些序列也可以在染色體激活和細(xì)胞調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。我們識別出存在500個以上的尖峰的四個區(qū)域。該四個區(qū)域在圖42中示出，對應(yīng)于SEQ ID N0. 1-四。所繪制的這四個區(qū)域中的尖峰在圖45-圖73中示出。最高度表達(dá)的尖峰轉(zhuǎn)錄物序列的PCR分析證明，它們確實存在于人尿微泡和人腎細(xì)胞中，表明這些序列不是深度測序的人工產(chǎn)物。用于擴增10個此種尖峰豐富區(qū)域的引物在圖43中示出。根據(jù)下面方案執(zhí)行PCR 起始在95°C下變性8分鐘；由95°C變性40秒、55°C退火30秒和65°C延伸1分鐘的三個步驟組成的30個循環(huán)；最終在68°C下延伸5分鐘；以及在用BioAnalyzer 分析該反應(yīng)之前保持在4°C下。如圖44所示，使用模板，在人尿微泡(A)和人腎細(xì)胞(B) 中，這10個區(qū)域中每個的擴增都給出陽性結(jié)果，表明這些尖峰轉(zhuǎn)錄物確實存在于微泡和人腎細(xì)胞中。這些豐富的尖峰轉(zhuǎn)錄物可以用于評估來自生物樣品的核酸提取物質(zhì)量。例如，該尖峰轉(zhuǎn)錄物中任一種的量都可以代替普通標(biāo)記如GAPDH或ACTIN多核苷酸分子，用于評估來自尿微泡的核酸質(zhì)量。尿微泡中GAPDH或ACTIN RNA的量非常低，以至于需要額外擴增步驟如RiboAMP來測量它們的量。相比之下，尖峰轉(zhuǎn)錄物中任一種的量非常高，以至于不需要額外擴增步驟。因此，這些尖峰轉(zhuǎn)錄物的使用可以使核酸提取物質(zhì)量的評估更高效且更簡單。因此，本文描述的本發(fā)明另一方面是評估來自生物樣品，如人尿樣品的核酸提取物質(zhì)量的新方法。該方法可以通過以下操作完成通過從生物樣品中提取核酸，測量尖峰轉(zhuǎn)錄物中任一種的量，和將該量與已針對特定生物樣品確定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。此種標(biāo)準(zhǔn)可以是，例如，從10個正常人尿樣中提取的此類尖峰轉(zhuǎn)錄物的平均量，可由經(jīng)驗豐富的生物技術(shù)專業(yè)人員確立。雖然本發(fā)明是參考某些實施例公幵的，但在不偏離由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍的情況下可以對所描述的實施例作出許多修改、更改和改變。因此，本發(fā)明不限于所描述的實施例，本發(fā)明覆蓋由權(quán)利要求及其等價形式的語言限定的全部范圍。參考文獻(xiàn)Abravaya, K.，J. 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權(quán)利要求
1.一種來自一個或多個分離自真核生物樣品的微泡的核酸提取物，其中，可在所述提取物中檢測到18S rRNA和^S rRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸提取物，其中，所述生物樣品是體液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸提取物，其中，所述體液是尿。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸提取物，其中，所述體液是血清或血漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的核酸提取物，其中，所述生物樣品來自哺乳動物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸提取物，其中，所述生物樣品來自人。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的核酸提取物，其中，可在所述提取物中檢測到的 18S rRNA與^S rRNA的定量比率在約1 1 約1 2的范圍內(nèi)；并且優(yōu)選約為1 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸提取物，其中，所述生物樣品是蛋白質(zhì)濃度低于10mg/ml 的體液，例如尿，并且所述提取物具有大于或等于5的RNA完整性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸提取物，其中，所述生物樣品是蛋白質(zhì)濃度高于10mg/ml 的體液，例如血清或血漿，并且所述提取物具有大于或等于3的RNA完整性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸提取物，其中，來自20ml生物樣品的核酸產(chǎn)量大于或等于 50pg/mlo
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸提取物，其中，來自Iml生物樣品的核酸產(chǎn)量大于或等于 50pg/mlo
12.—種來自一個或多個分離自真核生物樣品的微泡的核酸圖譜，其中可在所述圖譜中檢測到18S rRNA和^S rRNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的圖譜，其中，所述生物樣品是體液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的圖譜，其中，所述體液是尿。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的圖譜，其中，所述體液是血清或血漿。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的圖譜，其中，所述生物樣品來自哺乳動物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的圖譜，其中，所述生物樣品來自人。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項所述的圖譜，其中，18SrRNA與^S rRNA的定量比率在約1 1 約1 2的范圍內(nèi)；并且優(yōu)選約為1 2。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的圖譜，其中，所述生物樣品是蛋白質(zhì)濃度低于10mg/ml的體液，例如尿，并且所述核酸具有大于或等于5的RNA完整性。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的圖譜，其中，所述生物樣品是蛋白質(zhì)濃度高于10mg/ml的體液，例如血清或血漿，并且所述核酸具有RNA完整性大于或等于3的提取物。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的圖譜，其中，來自20ml生物樣品的核酸產(chǎn)量大于或等于 50pg/mlo
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的圖譜，其中，來自Iml生物樣品的核酸產(chǎn)量大于或等于 50pg/mlo
23.一種評價來自分離自真核生物樣品的微泡的核酸提取物質(zhì)量的方法，包括以下步驟(a)從微泡中提取RNA；和(b)通過測定所述提取物中的18SrRNA和^S rRNA量來測量RNA的質(zhì)量。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述生物樣品是體液。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述體液是尿。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述體液是血清或血漿。
27.根據(jù)權(quán)利要求23至沈中任一項所述的方法，其中，所述生物樣品來自哺乳動物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述生物樣品來自人。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項所述的方法，其中，18SrRNA與^S rRNA的定量比率在約1 1 約1 2的范圍內(nèi)；并且優(yōu)選約為1 2。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中，所述生物樣品是蛋白質(zhì)濃度低于10mg/ml的體液，例如尿，并且所述核酸具有大于或等于5的RNA完整性。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中，所述生物樣品是蛋白質(zhì)濃度高于10mg/ml的體液，例如血清或血漿，并且所述核酸具有RNA完整性大于或等于3的提取物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，來自20ml生物樣品的核酸產(chǎn)量大于或等于 50pg/mlo
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，來自Iml生物樣品的核酸產(chǎn)量大于或等于 50pg/mlo
34.一種從生物樣品中獲取核酸的方法，包括以下步驟(a)獲取生物樣品；(b)在所述生物樣品上執(zhí)行提取促進(jìn)操作；和(c)從所述生物樣品中提取核酸。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述提取促進(jìn)操作由以下步驟組成(a)向所述生物樣品中添加以下試劑中的一種或多種； (i) RNA酶抑制劑；( )蛋白酶；(iii)還原劑；(iv)誘餌底物，例如合成RNA; (ν)可溶性受體；(vi)小干擾RNA；(vii)RNA結(jié)合分子，例如抗-RNA抗體、伴侶蛋白、或RNA酶抑制蛋白； (ix)RNA酶變性物質(zhì)，例如高滲透壓溶液、去污劑；或(b)在提取核酸之前執(zhí)行以下步驟中的一個或多個； (χ)洗滌；(xi)對所述樣品中的RNA酶進(jìn)行尺寸分選；(xii)通過物理變化，如通過降低溫度、冷凍/解凍循環(huán)使RNA酶變性；或(c)前述試劑或前述步驟的任意組合。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中，所述生物樣品是體液。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述體液是尿。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述體液是血清或血漿。
39.根據(jù)權(quán)利要求34至38中任一項所述的方法，其中，從所述生物樣品獲取衍生物，并在提取核酸之前對所述衍生物執(zhí)行提取促進(jìn)操作。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述衍生物是來自生物樣品的微泡組分。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述微泡組分通過選自下組的技術(shù)獲得差速離心、親和純化、過濾濃縮、浮力密度梯度法、微流體分離、色譜、親和色譜、離子交換，和任何前述方法的任意組合。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述微泡組分通過過濾濃縮技術(shù)獲得。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，使所述生物樣品通過孔徑小于或等于0.8 μ m 的過濾器。
44.根據(jù)權(quán)利要求34-43中任一項所述的方法，其中，在執(zhí)行促進(jìn)提取操作之前，用核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、或它們的組合對所述生物樣品或所述衍生物進(jìn)行處理。
45.根據(jù)權(quán)利要求32-44中任一項所述的方法，其中，所述提取促進(jìn)操作包括在提取核酸之前向所述生物樣品中，或向所述衍生物中加入RNA酶抑制劑。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述RNA酶抑制劑的濃度大于[IX]濃度；可替換地，大于或等于[5X]濃度；可替換地，大于或等于[10X]濃度；可替換地，大于或等于 [25X]濃度；以及可替換地，大于或等于[50X]濃度。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中，所述RNA酶抑制劑是蛋白酶。
48.一種用于從微泡中獲取核酸的試劑盒，其在一個或多個容器中包含(a)核酸提取促進(jìn)劑；(b)DNA酶、RNA酶，或二者；和(c)裂解緩沖液。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，進(jìn)一步包含使用所述試劑盒的說明書。
50.根據(jù)權(quán)利要求48或49所述的試劑盒，其中，所述核酸提取促進(jìn)劑選自下組(a)RNA酶抑制劑；(b)蛋白酶；(c)還原劑；(d)誘餌底物；(e)可溶性受體；(f)小干擾RNA；(g)RNA結(jié)合分子；(h)RNA酶變性物質(zhì)；或(i)任何前述試劑的任意組合。
51.一種分析來自微泡的RNA的方法，包括以下步驟(a)獲取微泡樣品；(b)用DNA酶處理所述樣品以除去所有或基本上所有位于所述樣品中微泡的表面外或表面上的任何DNA ；(c)從所述樣品中提取RNA；和(d)分析所提取的RNA。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，從生物樣品中分離所述微泡。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述生物樣品是體液。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述體液是尿。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述體液是血清或血漿。
56.根據(jù)權(quán)利要求51至55中任一項所述的方法，其中，所述生物樣品來自哺乳動物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述生物樣品來自人。
58.一種用于診斷、監(jiān)測、或治療受試者的方法，包括以下步驟(a)從受試者的尿樣中分離出微泡組分；(b)檢測所述微泡組分中是否存在生物標(biāo)記；其中，所述生物標(biāo)記選自下組(i)核酸類物質(zhì)，(ii)核酸表達(dá)水平，(iii)核酸變體、 和(iv)前述中任何一種的任意組合；而且其中，所述生物標(biāo)記與疾病或其他醫(yī)學(xué)病況的存在與否、或治療選擇方案的可行性相關(guān)聯(lián)。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述生物標(biāo)記是mRNA轉(zhuǎn)錄物。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物選自下組NPHS2(podocin)、 LGALSl (半乳糖凝集素-1)、HSPG2(硫酸肝素蛋白多糖)、CUBN(吞飲受體)、LRP2(兆蛋白)、 AQPl (水通道蛋白1)、CA4(碳酸酐酶4)、CLCN5 (氯離子通道蛋白5) ,BDKRBl (緩激肽Bl受體)、CALCR (降鈣素受體)、SCNNlD (阿米洛利敏感鈉通道δ亞基)、SLC12A3 (噻嗪類敏感性氯化鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白)、AQP2 (水通道蛋白2、、ATP6V1B1 (V-ATP酶Bl亞基)、SLC12A1 (經(jīng)由RiboAmped mRNA的RT-PCR的腎特異Na-K-Cl同向轉(zhuǎn)運體)。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物是AQP2(水通道蛋白2)或 ATP6V1B1 (V-ATP 酶 Bl 亞基)。
62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述生物標(biāo)記和疾病或其他醫(yī)學(xué)病況選自下組(a)NPHS2 (podocin)和腎小球疾病，如激素耐藥型腎病綜合征；(b)如Lnerslund-Grasbeck綜合征中的CUBN(吞飲受體)和蛋白尿；和(c)AQP2(水通道蛋白2~)和尿崩癥。
63.一種包含與選自SEQ ID NO :1-29的第二核苷酸序列有至少90%同一性的第一核苷酸序列的分離多核苷酸分子。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的分離多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子是脫氧核糖核苷酸。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的分離多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子是核糖核苷酸。
66.一種包含根據(jù)權(quán)利要求63所述的分離核酸分子的載體。
67.一種包含根據(jù)權(quán)利要求63所述的分離核酸分子的宿主細(xì)胞。
68.一種包含選自SEQ ID NO :1-29的核苷酸序列片段的分離多核苷酸。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的分離多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子是脫氧核糖核苷酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求68所述的分離多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子是核糖核苷酸。
71.一種包含根據(jù)權(quán)利要求68所述的分離核酸分子的載體。
72.一種包含根據(jù)權(quán)利要求68所述的分離核酸分子的宿主細(xì)胞。
73.一種包含具有與SEQ ID NOS :1- 的任何一個中的任何13-核苷酸序列相同的至少13個核苷酸的序列的分離多核苷酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的分離多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子是脫氧核糖核苷酸。
75.根據(jù)權(quán)利要求79所述的分離多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子是核糖核苷酸。
76.一種包含根據(jù)權(quán)利要求73所述的分離核酸分子的載體。
77.一種包含根據(jù)權(quán)利要求73所述的分離核酸分子的宿主細(xì)胞。
78.—種評估來自生物樣品的核酸提取物質(zhì)量的方法，所述方法包括a.提供生物樣品；b.從所述生物樣品中獲取核酸提取物；c.測量所述提取物中包含具有選自SEQNOS 1-29的核苷酸序列的片段的多核苷酸分子的量；和d.將所述多核苷酸分子的量與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較從而評估所述核酸提取物的質(zhì)量。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述生物樣品是體液。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述體液是尿。
81.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述體液是血清或血漿。
82.根據(jù)權(quán)利要求78至81中任一項所述的方法，其中，所述生物樣品來自哺乳動物。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中，所述生物樣品來自人。
84.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述提取物是根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物。
85.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述提取物是利用權(quán)利要求34所述的方法獲得的。
86.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)物通過測量來自5個以上的生物樣品的核酸提取物中的包含具有選自SEQ NOS 1-29的核苷酸序列的片段的多核苷酸分子的量而獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了從生物樣品中提取高質(zhì)量核酸的方法。通過本文所述的方法獲得的提取物的特征是高產(chǎn)率和高完整性，使得所提取核酸對優(yōu)選高質(zhì)量核酸提取物的各種應(yīng)用有用，所述的應(yīng)用為，例如對醫(yī)學(xué)病況的診斷、預(yù)后或治療評價。
文檔編號G01N33/48GK102498397SQ201080041496
公開日2012年6月13日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日
發(fā)明者凱文·C·米蘭達(dá), 約翰·斯科格, 雷萊塔·M·魯索 申請人:總醫(yī)院有限公司