專利名稱：從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法及專用磁性分離器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法及專用磁性分離器。
背景技術(shù)：
在醫(yī)院或科研工作中經(jīng)常要在血清、血漿、全血或乳汁、唾液、分泌液、胸腔積液、尿 液、精液、月經(jīng)血、陰道分泌物、糞便、腦脊液等包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化 核酸的檢測。現(xiàn)有分離純化核酸的常規(guī)方法有(1)酚提取/沉淀法將細(xì)胞裂解后離心分離
含核酸的水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 :24 : i體積)混合液，兩相經(jīng)漩渦振 蕩混勻(適用于分離小分子量核酸)或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸)后離心分 離，再將核酸鹽用有機溶劑沉淀，通過沉淀濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除 某些雜質(zhì)分子。(2)層析法，層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析 方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法。(3)密度梯度離心法，采用氯化 銫作為密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)，梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶 經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化 銫而獲得純化的核酸。上述分離純化核酸的方法需要用到的試劑較多，步驟較繁瑣，且分離 純化后所得到的核酸純度不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法。以 實現(xiàn)操作步驟簡單快速、使用試劑少，所獲得的核酸純度更高。
本發(fā)明的目的還在于提供一種專用于本方法的磁性分離器。
從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法包括以下步驟
(1)裂解釋放核酸將待分離的樣品加入離心管中，按已有技術(shù)加入裂解液進(jìn)行裂解 用渦旋儀將裂解液與樣品溶液充分混勻，放置3-5分鐘；溫度為室溫,最好是高于2(TC;
3在室溫條件下，在上述裂解液與樣品溶液混合液中加入PH為7.0±0.5 的含固相載體的緩沖溶液中，核酸分子被固相載體吸附包被，混勾后置于磁性分離器上，放 置5-10分鐘，磁性顆粒被磁性底座內(nèi)的磁鐵吸引而聚集在離心管壁一側(cè)；
(4) 洗滌純化卜3次加入無機洗滌液和有機疏水物，充分混勻后再次置于磁性分離器 上，上層疏水環(huán)境中核酸更好地結(jié)合到磁性顆粒，而下層的無機物將雜質(zhì)溶解。將移液槍深 入離心管底，先逐步將雜質(zhì)及無機物吸到移液槍頭中，最后吸出有機物，剩下包被有核酸的 磁性顆粒；
所述固相載體是磁性顆粒、硅土、硅膠、玻璃基質(zhì)等； 所述磁性顆粒是包被有高交聯(lián)聚苯乙烯的鐵氧化物，直徑為lum。
所述無機洗滌液是lOOmM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH 7.5±0.5)和lmM EDTA乙二 胺四乙酸的混合液.所述有機疏水物為礦物油或石蠟油。
所述包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品包括血清、血漿、全血、乳汁、唾液、分泌液、胸腔 積液、尿液、精液、月經(jīng)血、陰道分泌物、糞便、腦脊液、細(xì)菌。
本發(fā)明專用磁性分離器是由磁性底座和離心管架二部分活動連接而成，所述磁性底座是 由一個長條形空座和二端的插孔組成，在長條形空座內(nèi)腔均勻分布有磁鐵，所述離心管架上 設(shè)有二排共10-30個離心管孔，在離心管架的二端設(shè)有可插入磁性底座二端插孔的插條。
本發(fā)明的優(yōu)點只需要加入簡單的兩種溶液，采用一個磁性分離器就可以完成對核酸的 分離和純化，簡化了設(shè)備，操作過程簡單快速、使用試劑少。使核酸分子的分離數(shù)量增加， 能夠通過一個流程同時有效地分離和純化雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA分子，所獲得的核酸純 度更高。


圖1和圖2是用無機相加有機相純化熒光定量PCR檢測定量結(jié)果圖； 圖3和圖4是用普通的無機相純化熒光定量PCR檢測定量結(jié)果圖； 圖5是磁性分離器組裝示意圖； 圖6為磁性分離器整體示意圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步說明
實施例1:血清中乙型肝炎病毒核酸的提取和分離純化。
取含乙肝病毒核酸的血清300 ul,加入250ul裂解液2%Chelex-100樹脂，其基質(zhì)為聚 苯乙烯二乙烯基苯)、2%SDS (十二烷基磺酸鈉)、1% Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚) 混合組成，混勻，簡單離心后加入100ul第二種溶液(PH為7.0±0.5的含固相載體的緩沖 溶液)，本實施例是用200rnM HEPES ,4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷 磺酸(pH7.0士0.5)、誦aCl (氯化鈉)、300ug/ml magnetic beads(磁性微球)混合組成， 這里的磁性微球即固相載體，是包被有高交聯(lián)聚苯乙烯的鐵氧化物，震蕩混勻，室溫放置10min 后簡單離心。將樣品試管置于磁性分離器，5min后待磁珠完全吸附于試管壁，從試管底部緩 慢將上清液吸出。
加入600ul第三種溶液(無機洗滌液)，100mM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽 (pH 7.5±0.5) 、 lraM EDTA乙二胺四乙酸混合組成)和200ul第四種溶液(有機疏水物) 礦物油，震蕩混勻使磁珠完全懸浮，簡單離心后將樣品管置于磁珠分離器，待磁珠完全吸附 于試管壁，上清液分為兩層(上層為有機相，下層為無機相)，從試管底部將液體(包括上 述有機相和無機相)完全吸出。用移液器吸取50ul核酸回收液反復(fù)幾次將吸附于管壁的磁 珠完全洗脫，轉(zhuǎn)移即可。
對此轉(zhuǎn)移的核酸回收液(50ul)運用熒光定量PCR擴增對起始濃度進(jìn)行定量檢測，與未 經(jīng)過此提取、分離純化步驟，直接進(jìn)行熒光定量PCR擴增檢測結(jié)果相比較。同樣的樣品，經(jīng) 過此純化步驟的定量結(jié)果比未經(jīng)過此純化步驟的定量值高約2倍。
實施例2 :乳汁(牛奶)中乙型肝炎病毒核酸的提取和分離純化。
因乳汁或牛奶中脂肪等雜質(zhì)較多，采用了兩組對比實驗來觀察本發(fā)明在核酸分離和純化 中的作用。
第一組加入250ul第一種溶液(裂解液)，隨后加入待分離的樣品(含乙肝病毒核酸 的乳汁或牛奶等)300 ul,加入200ul第四種溶液(有機相)，混勻，簡單離心。加入100ul第二種溶液(吸附包被核酸)的磁珠混合液，震蕩混勻，室溫放置10min后簡單離心。將樣 品試管置于磁性分離器，5min后待磁珠完全吸附于試管壁，溶液分為兩層(上層為有機相， 下層為無機相，第一次純化)，從試管底部緩慢將上清液吸出。
加入600ul第三種溶液(無機相)和200ul第四種溶液(有機相)，震蕩混勻使磁珠完 全懸浮，簡單離心后將樣品管置于磁珠分離器，待磁珠完全吸附于試管壁，上清液分為兩層 (上層為有機相，下層為無機相，第二次純化)，從試管底部將液體(包括上述有機相和無 機相)完全吸出。用移液器吸取50ul ，核酸回收液反復(fù)幾次將吸附于管壁的磁珠完全洗脫， 轉(zhuǎn)移即可。
第二組不加第四種溶液(有機相)，即僅用普通的無機相去除雜質(zhì)。
兩組實驗所要獲得的目的核酸均為己知的用牛奶稀釋的低濃度HBV-DNA。運用實時熒光 定量PCR檢測來觀察兩組各自的定量結(jié)果。
每組均選取了16個樣品，兩個濃度即10IU/ml和20IU/ml，第一組運用本發(fā)明的原理， 經(jīng)過兩次純化后10 IU/ml和20 IU/ml的樣品均得到了擴增，第二組未經(jīng)過此純化的10 IU/ml 樣品僅兩個擴增，且擴增曲線明顯劣于第一組。
由此可以得出結(jié)論，運用本發(fā)明對目的核酸進(jìn)行純化，可以提高試劑檢出的靈敏度，所 獲得的核酸純度更高。
實施例3:
結(jié)合附圖5和圖6:
磁性分離器是由磁性底座B和離心管架A 二部分活動連接而成。磁性底座是由一個長條 形空座1和二端上部的橢圓形插孔2組成，磁鐵3是將磁條通過長條形空座1的插孔9插入， 使長條形空座1內(nèi)腔均勻分布有磁鐵。在磁性底座的中部設(shè)有圓椎形固定插孔4。在離心管 架上設(shè)有16-28個離心管孔5，在離心管架的二端設(shè)有可插入磁性底座二端插孔的插條6，插 條6上端7是橢圓形。在離心管架中部設(shè)有可插入固定孔的圓椎形插條8。
權(quán)利要求
1. 一種從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)裂解釋放核酸將待分離的樣品加入離心管中，按已有技術(shù)加入裂解液進(jìn)行裂解用渦旋儀將裂解液與樣品溶液充分混勻，放置3-5分鐘；溫度為室溫，最好是高于20℃；(3)磁性分離在室溫條件下，在上述裂解液與樣品溶液混合液中加入PH為7.0±0.5的含固相載體的緩沖溶液中，核酸分子被固相載體吸附包被，混勻后置于磁性分離器上，放置5-10分鐘，磁性顆粒被磁性底座內(nèi)的磁鐵吸引而聚集在離心管壁一側(cè)；(4)洗滌純化1-3次加入無機洗滌液和有機疏水物，充分混勻后再次置于磁性分離器上，上層疏水環(huán)境中核酸更好地結(jié)合到磁性顆粒，而下層的無機物將雜質(zhì)溶解。將移液槍深入離心管底，先逐步將雜質(zhì)及無機物吸到移液槍頭中，最后吸出有機物，剩下包被有核酸的磁性顆粒；
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法,其特 征在于，所述固相載體是磁性顆粒、硅土、硅膠、玻璃基質(zhì)；所述磁性顆粒是包被有高交聯(lián) 聚苯乙烯的鐵氧化物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法,其特 征在于，所述禾機洗滌液是100 mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH 7. 5±0. 5)和lmM乙 二胺四乙酸的混合液.所述有機疏水物為礦物油或石蠟油。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法,其特 征在于，所述包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品包括血清、血漿、全血、乳汁、唾液、分泌液、 胸腔積液、尿液、精液、月經(jīng)血、陰道分泌物、糞便、腦脊液、細(xì)菌。
5. —種分離純化核酸的專用磁性分離器，其特征在于，是由磁性底座和離心管架二部分 活動連接而成，所述磁性底座是由一個長條形空座和二端的插孔組成，在長條形空座內(nèi)腔均 勻分布有磁鐵，所述離心管架上設(shè)有二排共10-30個離心管孔，在離心管架的二端設(shè)有可插 入磁性底座二端插孔的插條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從包含核酸的病毒或細(xì)胞的樣品中分離純化核酸的方法及專用磁性分離器。本發(fā)明的方法包括(1)按已有技術(shù)加入裂解液裂解釋放核酸；(2)核酸分子在磁性分離器上進(jìn)行磁性分離；(3)加入無機洗滌液和有機疏水物洗滌純化1-3次。本發(fā)明只需要加入簡單的兩種溶液，采用一個磁性分離器就可以完成對核酸的分離和純化，簡化了設(shè)備，操作過程簡單快速、使用試劑少。使核酸分子的分離數(shù)量增加，能夠通過一個流程同時有效地分離和純化雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA分子，所獲得的核酸純度更高。
文檔編號C07H21/00GK101481400SQ20091004243
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日
發(fā)明者戴立忠, 熊曉燕, 蔡鳴鏑 申請人:戴立忠