專利名稱：：一種特異性識別細胞表面整合素α3β1的小分子肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種肽，特別是含5-11個氨基酸的肽。
背景技術(shù)：
：整合素是細胞膜表面糖蛋白受體,族的成員之一，是介導(dǎo)細胞與細胞及細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)的粘附分子。整合素分子是由a和P二個亞單位通過非共價鍵連接構(gòu)成的異二聚體分子，參與細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對細胞的生存、增殖、分化、移動及癌細胞的侵襲、粘附和轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生重要調(diào)控作用。整合素分子的體內(nèi)分布很廣泛，不同類型的細胞表達整合素分子的種類是不同的，整合素分子的表達具有明顯的細胞類型特性，如整合素a3pi在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膠質(zhì)細胞瘤等中出現(xiàn)表達異常。因此，整合素可作為腫瘤分子診斷和耙向治療的重要靶點。本發(fā)明人曾利用"一個珠子一個化合物"的組合化學(xué)肽庫篩選得到一個氨基酸序列為cNGQGEQc的小分子肽，該小分子肽可通過識別整合素a3特異性結(jié)合肺癌細胞A549，并發(fā)現(xiàn)該肽中對特異性粘附A549作出主要貢獻的結(jié)構(gòu)是-NGXG-以及六肽長度(郭琳瑯等.一種特異性識別非小細胞肺癌A549細胞的小分子肽.生物化學(xué)與生物物理進展，2007，34(10):1080~1085)。但上述小分子肽粘附癌細胞A549的能力較弱，且不能作為熒光素的載體將熒光素運輸?shù)侥[瘤中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題是提供一種可將熒光素運輸?shù)秸纤豠3pl陽性表達的腫瘤中的小分子肽。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是一種特異性識別細胞表面整合素a3pl的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGLGHypNc;其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，L表示L型亮氨酸，Hyp表示L型4-羥脯氨酸，N表示L型天冬酰胺。本發(fā)明小分子肽可用常規(guī)的固相合成法(LamKS，SalmonSE，HershEM，HrubyVJ，KazmierskiWM，KnappRJ.Atow1991,35《82)制備，具體方法如下(1)取表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，先用二甲基酰胺洗滌，然后浸泡在二甲基酰胺中使所述樹脂珠子充分腫脹，接著按照所述小分子肽的氨基酸序列依次將相應(yīng)的氨基酸偶聯(lián)到所述樹脂珠子上并形成肽鏈；(2)用無水氟化氫將肽鏈從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側(cè)鏈保護基；(3)用30%乙酸稀釋后，用碘作氧化劑使分子內(nèi)2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵；(4)依次經(jīng)Sephadex-G-15柱層析、透析和高效液相層析分離純化。本發(fā)明所述小分子肽可特異性識別細胞表面整合素a3pi，不僅通過識別a3pl粘附到腫瘤細胞表面，還可以在攜帶熒光素的情況下粘附到腫瘤細胞表面，因此可作為影像造影劑如熒光素的靶向載體，將熒光素運輸?shù)礁弑磉_a3pi的癌細胞表面，通過熒光素掃描儀器，實現(xiàn)腫瘤的分子影像診斷。本發(fā)明所述小分子肽還有一個重要的潛在用途是作為抗腫瘤藥物載體，為實現(xiàn)靶向治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。圖l是4株肺癌細胞的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶AvalI消化后的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中M表示分子量標準物，A表示A549，C表示Calu-l，H表示H1650，D表示DMS-53，l表示a5片段(104bp)，2表示a3片段(69bp)，3表示a4片段(45bp)。圖2是4株肺癌細胞的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶Bsp1286I消化后的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中M表示分子量標準物，A表示A549，C表示Calu-l，H表示H1650，D表示DMS-53,l表示Pl片段(128bp)。圖3是不同濃度抗整合素ot3抗體阻斷A549細胞與小分子肽結(jié)合的阻斷率柱形圖。圖4是注入了連接了熒光素Alexa的小分子肽的荷瘤小鼠的熒光掃描圖，其中1所指部位是注射點，2所指部位是腎臟，3所指部位是A549腫瘤。圖5是注入了連接了熒光素Alexa的小分子肽的荷瘤小鼠各器官的熒光掃描圖。具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面將通過實施例以及效果實驗進一步闡明本發(fā)明所具有的技術(shù)效果。1、本發(fā)明小分子肽的制備(1)稱取lg表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，用二甲基酰胺洗滌3次，然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分腫脹；(2)加入半胱氨酸和N,N'-二異丙基碳二亞胺，室溫下反應(yīng)2小時后，用DMF洗滌珠子5次，接著加入20%的哌啶，在室溫下反應(yīng)5min，再加入20%的DMF，反應(yīng)15min，完全脫去Fmoc保護基；(3)按步驟(2)方法依次偶聯(lián)天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸；(4)將連接完最后一個氨基酸的珠子經(jīng)25%的三氟乙酸洗滌一次，蒸餾水洗滌3次；(5)用無水氟化氫將小分子肽從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側(cè)鏈保護基。還原產(chǎn)物在30%乙酸高度稀釋下用碘作氧化劑，使分子內(nèi)2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵。經(jīng)Sephadex-G-15柱層析，透析和高效液相層析分離純化，獲得在反相高效液相層析(分析柱)為單一峰的高純度產(chǎn)物。2、分析癌細胞表面整合素a3卩l(xiāng)的表達(1)基因表達限制性分析①RNA提取和RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA:培養(yǎng)細胞，收獲細胞3xl07，移入1.5ml離心管，加入lmlTrizol，混勻，室溫靜置5min;加入0.2ml氯仿，振蕩15sec,室溫靜置2min。4'C離心，12000gxl5min，取上清；加入0.5ml異丙醇，將管中的液體輕輕混勻，室溫靜置IOmin;4°C離心，12000gxi0min，棄上清；加入lml75。/o乙醇，輕輕洗滌后沉淀；4。C離心，7500gx5min，棄上清；晾干，加入適量DEPCH20溶解；260nm波長分光度測定總RNA濃度，并根據(jù)OD260/OD280的比值計算純度。將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，50(al的混合反應(yīng)液包含25嗎fRNA、1mMdNTP和10個單位的AMV(禽成髓性白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)條件為25。C，10min，然后42。C2hr，最后75。C5min。②引物設(shè)計根據(jù)整合素a和p亞單位基因序列，用MacVector公司ClustalW軟件設(shè)計引物，引物長度為25-26個堿基，整合素a的擴增片段約250-330堿基對，整合素(3的擴增片段約231-249堿基對。同時用MacVector公司的限制性酶切分析軟件預(yù)測不同限制性酶消化擴增片段后的長度(見表1和2)。表l限制性內(nèi)切酶消化整合素a預(yù)測得到不同長度的基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>ctL4451604433ctM7523/8473aV24612925037aX50752373'表2限制性內(nèi)切酶消化整合素p預(yù)測得到不同t〈度的基因片段RestrictionEnzymesIntrgeinsAluIHinflBap1286IBslIFragmentSize(Basepairs)pi61196128208P26687P363P46645P516182(36116mP7116.52140p823866112③PCR:PCR反應(yīng)體系總體積為5(HU，包括25nCi的Y"P標記的正向引物，400nM反向引物，200nMdNTP及25ngcDNA。cDNA變性，94°C，10min，PCR反應(yīng)條件:前5個循環(huán)，94°C，40sec;50°C，90sec;72°C，15sec;后19個循環(huán)94。C，45sec;58°C，90sec;72°C,20sec。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.4。/。的瓊脂糖純化，QIACEXII試劑盒抽提。限制性酶切分別用酶消化PCR產(chǎn)物，對整合素a各亞單位，采用的內(nèi)切酶有AccI、AvaII、Bsll、BstNI、Hinfl、TaqI及AluI,對整合素卩各亞單位采用的酶有AIuI、Hinfl、Bspl2861及BslI(NewEnglandBiolabs，Inc)。酶切產(chǎn)物用7。/。的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。結(jié)果經(jīng)AvaII酶切后，非小細胞肺癌細胞A549、Calu-l及H1650出現(xiàn)整合素oc3(69bp),而DMS-53缺少a3(見圖l)。經(jīng)Bspl2861酶切后，所有細胞均出現(xiàn)(31(128bp)(見圖2)。(2)流式細胞儀分析①將lxl(^的培養(yǎng)細胞用2.5g/L胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基終止消化，離心棄細胞培養(yǎng)基；②PBS洗滌3次，50mg/mL多聚甲醛固定15min，制成單細胞懸液5X106/ml。③每個樣本分別取lOOpl細胞懸液加入2個EP管中，實驗組加入第一抗體鼠抗人整合素a3、a4、a5及卩l(xiāng)單克隆抗體，稀釋度均為1:100，對照組加入PBS，室溫孵育1hr。④洗滌液洗滌2次，離心棄上清。⑤每個EP管加入FITC標記羊抗鼠IgG抗體，稀釋度為1:50，室溫避光孵育30min。⑥應(yīng)用美國BectonDickson公司的FAC-Sort型流式細胞儀分析蛋白表達陽性率，每種蛋白重復(fù)測定三次，分析結(jié)果。結(jié)果顯示非小細胞肺癌細胞A549、Calu-l及H1650出現(xiàn)整合素a3，四種細胞均有整合素Pl表達。3、確定本發(fā)明小分子肽與癌細胞表面整合素a3(31特異性結(jié)合①篩選小分子肽與A549細胞的結(jié)合位點利用特異性抗細胞表面粘附分子整合素的單克隆抗體，阻斷小分子肽cdGLGHypNc與A549細胞表面相關(guān)受體結(jié)合，確定小分子肽與A549細胞的結(jié)合位點。阻斷抗體有整合素al-6，v和(31-5(Chemicon公司，USA)，在96孔細胞培養(yǎng)板的A1-7孔中分別加入濃度為1.5mg/L的抗al、a2、a3、a4、a5、a6、av抗體，Bl-5孔中分別加入抗pl、(32、卩3、卩4、(35抗體，因此，在AlBl孔中含有抗al和pl兩種抗體，A1B2孔中含有抗al和p2兩種抗體，依次類推，不同孔中即含有抗a和p兩種抗體的不同組合。然后加入A549細胞懸液，搖動培養(yǎng)板，使兩者充分混合，置細胞培養(yǎng)箱中孵育IOmin，加入小分子肽珠子?；旌霞毎椭樽?，37QC,5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24hr和48hr后計數(shù)表面粘附A549細胞的陽性珠子數(shù)。②進一步確定小分子肽與A549細胞的結(jié)合位點根據(jù)上述(1)的實驗結(jié)果，在48孔細胞培養(yǎng)板中分別加入不同濃度的阻斷抗體(0，0.125，0.25，0.5，1，2，5mg/L)，其余歩驟同上，分別于24hr和48hr后記數(shù)有細胞粘附的珠子的百分率，以此判定抗體對細胞與小分子肽結(jié)合的阻斷百分率。結(jié)果用抗整合素(od-6，v.和pi-5)抗體(1.5yg/ml)阻斷A549細胞與小分子肽的結(jié)合實驗，結(jié)果顯示抗整合素a3抗體與抗p亞單位抗體的任何組合如a3pl、a鄧2、ct3(33、a鄧4、a3p5均可阻斷A549細胞與cdGLGHypNc的結(jié)合，而a其它亞單位與p亞單位的組合如od(31、a2pi、a4pi、a2pl、a2p2等對A549細胞與cdGLGHypNc的結(jié)合均無明顯的阻斷作用?？拐纤豠3抗體對A549細胞與小分子肽結(jié)合的阻斷作用隨其濃度增加而增強，當a3抗體的濃度為0.5pg/ml時，其抑制作用可達95%以上(見表3和圖3)表3抗整合素a3抗體阻斷A549細胞與小分子肽結(jié)合實驗結(jié)果integrina3(嗎/tnl)_%inhibitionofcellattachment000.12500.257.70.595.11.01002.01005.01004、本發(fā)明小分子肽作為特異性識別整合素a3pl的靶向載體(1)用熒光素Alexat示記試劑盒(invitrogen公司)標記小分子肽cdGLGHypNc;(2)于裸鼠背部皮下接種4~6乂106細胞(肺腺癌細胞A549)，3周后測量瘤體達lcm，成功建立高表達整合素a3pl的荷瘤小鼠模型；(3)從裸鼠尾靜脈將連接了熒光素Alexa的小分子肽(lOO)il)注入荷瘤小鼠模型體內(nèi)，2小時后在熒光掃描儀下7見察標記熒光素的小分子肽在荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤及肝臟、脾臟、肺臟等臟器的分布情況。圖中顯示在荷瘤小鼠的腎臟和瘤體中出現(xiàn)熒光素聚集，而肝臟、脾臟、肺臟等臟器中未見明顯熒光素聚集(見下圖4);取出瘤體和腎臟、肝臟等臟器，再次用熒光掃描儀掃描，成像結(jié)果與fls內(nèi)顯像一致(見下圖5)，瘤體良好成像表明小分子肽成功將熒光素Alexa運送到高表達整合素a3pl的癌組織，腎臟中出現(xiàn)熒光素聚集提示小分子肽能通過腎臟經(jīng)尿液排泄。5、本發(fā)明小分子肽與先期公開的小分子肽cNGQGEQc生物特性比較(1)本發(fā)明小分子月太與cNGQGEQc的體外粘附特性比較①吸取20pl(約1500個)的小分子肽珠子，PBS緩沖液和70M酒精各洗3次，然后細胞培養(yǎng)液洗2次。轉(zhuǎn)移小分子肽珠子至48孔細胞培養(yǎng)板(約150個珠子/L)。A549細胞株分別與小分子肽珠子cdGLGHypNc和cNGQGEQ混合培養(yǎng)(37°C，5%C02)，計算并比較培養(yǎng)24和48hr后兩種小分子肽與細胞的結(jié)合百分率，以此評價小分子肽與細胞粘附結(jié)合力的強弱。結(jié)果培養(yǎng)24hr后，cdGLGHypNc與A549細胞的結(jié)合百分率為71.3%，明顯高于cNGQGEQ與A549細胞的結(jié)合百分率55.8%;培養(yǎng)48hr后，兩種小分子肽與細胞的結(jié)合百分率大致相同，分別為96.1°/。和95.6%。②將100pl的avidin(抗生物素蛋白，20嗎/mlinPBS)滴加在玻璃片上，37GC孵育1hr，甩去avidin，PBS洗1次，除去未與玻片結(jié)合的avidin，在玻片上分別滴加100pl(0.1pM)聯(lián)接有生物素的游離小分子肽cdGLGHypNc和cNGQGEQc，僅包被avidin或小分子肽作為對照，無任何包被的玻片作為陰性對照。在玻片上加上lOOplA549細胞懸液，孵育1hr，Gimsa染色，觀察比較各玻片上的粘附細胞數(shù)量。結(jié)果顯示載有cdGLGHypNc的玻片上粘附的A549細胞數(shù)為53個，而載有cNGQGEQc的玻片上粘附的A549細胞為35個，僅載有avidin或無任何載物的玻片上見個別細胞或無任何細胞粘附。上述實驗①和②的結(jié)果表明小分子肽cdGLGHypNc與A549的結(jié)合力高于cNGQGEQc。(2)本發(fā)明小分子肽與cNGQGEQc的體內(nèi)靶向載體比較從裸鼠尾靜脈將連接了熒光素Alexa的小分子肽cdGLGHypNc和cNGQGEQc(lOOpil)注入荷瘤小鼠模型體內(nèi)，2小時后在熒光掃描儀下觀察標記熒光素的小分子肽在荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤及肝臟、脾臟、肺臟等臟器的分布情況。結(jié)果顯示熒光素AIexa-cdGLGHypNc在荷瘤小鼠的腎臟和瘤體中出現(xiàn)熒光素聚集(見圖4)，而肝臟、脾臟、肺臟等臟器中未見明顯熒光素聚集，取出瘤體和腎臟、肝臟等臟器，再次用熒光掃描儀掃描，熒光素Alexa-cdGLGHypNc在荷瘤小鼠的腎臟和瘤體成像結(jié)果與體內(nèi)顯像一致(見圖5);而熒光素Alexa-cNGQGEQc在荷瘤小鼠的瘤體中未見熒光素聚集。結(jié)果表明小分子肽cdGLGHypNc能成功將熒光素Alexa運送到A549細胞。9序列表<110>南方醫(yī)科大學(xué)<120>—種特異性識別細胞表面整合素a301的小分子肽<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<400>1CysAspGlyLeuGly4-HypAsnCys1權(quán)利要求1、一種特異性識別細胞表面整合素α3β1的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGLGHypNc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，L表示L型亮氨酸，Hyp表示L型4-羥脯氨酸，N表示L型天冬酰胺。2、權(quán)利要求1所述小分子肽的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)取表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，先用二甲基酰胺洗滌，然后浸泡在二甲基酰胺中使所述樹脂珠子充分腫脹，接著按照所述小分子肽的氨基酸序列依次將相應(yīng)的氨基酸偶聯(lián)到所述樹脂珠子上并形成肽鏈；(2)用無水氟化氫將肽鏈從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側(cè)鏈保護基；(3)用30%乙酸稀釋后，用碘作氧化劑使分子內(nèi)2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵；(4)依次經(jīng)Sephadex-G-15柱層析、透析和高效液相層析分離純化。全文摘要本發(fā)明提供了一種特異性識別細胞表面整合素α3β1的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGLGHypNc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，L表示L型亮氨酸，Hyp表示L型4-羥脯氨酸，N表示L型天冬酰胺。本發(fā)明所述小分子肽可通過常規(guī)的固相合成法合成得到，能特異性識別細胞表面整合素α3β1，因此可作為影像造影劑如熒光素的靶向載體，將熒光素運輸?shù)礁弑磉_α3β1的癌細胞表面，通過熒光素掃描儀器，實現(xiàn)腫瘤的分子影像診斷。文檔編號C07K7/00GK101638429SQ20091004228公開日2010年2月3日申請日期2009年8月28日優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日發(fā)明者帆張,李貴平,穎郭,郭琳瑯申請人:南方醫(yī)科大學(xué)