專利名稱：生物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合適載體系統(tǒng)上的皮膚黑素細(xì)胞遞送系統(tǒng)及其制備 方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及自體黑素細(xì)胞的移植物、其 制備方法、運輸至醫(yī)院和它們的治療(包括白癥風(fēng))應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚及黑素細(xì)胞的生理作用
皮膚是機(jī)體最大的器官，由被稱為表皮的外部上皮組成，通過 基底膜與下面的結(jié)締組織(真皮)分開。鄰近表皮的真皮部分被稱為網(wǎng) 狀真皮，主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原纖維、微血管和少數(shù)遷移白 細(xì)胞組成。網(wǎng)狀真皮為沒有血管的表皮提供所有的營養(yǎng)。表皮中的 絕大多數(shù)細(xì)胞是呈分層排列的角質(zhì)形成細(xì)胞。在真皮表皮交界處是 基底層，它是帶有少量分散黑素細(xì)胞的單層角質(zhì)形成細(xì)胞(每30個角 質(zhì)形成細(xì)胞有約1個黑素細(xì)胞)，這些黑素細(xì)胞通過其發(fā)出的樹突向 附近的角質(zhì)形成細(xì)胞提供黑色素。皮膚顏色決定于不同黑色素類型 的絕對量和相對量，其中兩種主要的黑色素形式是真黑素(eumelanin) 和褐黑素(pheomelanin)。它們受黑皮素(melanocortin) 1受體(MC1R) 的調(diào)節(jié)。不同MC1R序列與不同皮膚顏色相關(guān)聯(lián)。黑素細(xì)胞刺激激 素(MSH)與MC1R的結(jié)合導(dǎo)致真黑素的形成，而野灰蛋白(agouti protein)與MC1R結(jié)合則導(dǎo)致褐黑素的產(chǎn)生。因暴露于紫外線而造成的皮膚曬黑代表了表皮內(nèi)真黑素含量的增加，其主要目的是增加光 保護(hù)。這些可以由于黑素細(xì)胞數(shù)量或其活性的改變所致。
色素沉著癥
色素沉著過低和色素沉著過多疾病可因黑素細(xì)胞數(shù)量改變或者 黑素細(xì)胞活性減少或增加所致。最常見的色素沉著疾病之一是黃褐
斑(melasma)。接觸陽光對色素沉著的誘導(dǎo)和維持起著十分重要的作 用。如果沒有防護(hù)，紫外線輻射則可導(dǎo)致細(xì)胞的遺傳編碼或DNA突 變。這可以顯著改變細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致與紅斑痤瘡、皮膚老化、 免疫功能損害和癌癥相關(guān)聯(lián)的改變。
此外，由紅斑痤疾、、激光療法或紫外線暴露導(dǎo)致的炎癥可能會 影響黑素細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致黑色素或色素產(chǎn)量的不正常增加。 這可能在視覺上表現(xiàn)為雀斑、不均勻片狀著色或日光斑(通常稱為老 人斑)。醫(yī)學(xué)研究一直重點關(guān)注調(diào)節(jié)黑色素的方法，以控制黑色素的 異常產(chǎn)生并解決色素沉著過多病變的表現(xiàn)。
與色素沉著過^f氐相關(guān)^:的疾病包"^舌例如(a)白斑病，往往與皮 膚炎癥性疾病如特應(yīng)性皮炎相關(guān)聯(lián)；和(b)白癜風(fēng)。
白癜風(fēng)
白瘕風(fēng)(vit-ill-eye-go)，也被稱為白斑病，是一種色素沉著疾病， 其患者皮膚、嘴和鼻子及生殖器官和直腸區(qū)(粘膜)內(nèi)部的組織、以及 眼部視網(wǎng)膜中的黑素細(xì)胞都被摧毀。其結(jié)果是，在機(jī)體不同部位的 皮膚上出現(xiàn)白斑。生長在受白癜風(fēng)影響區(qū)域的毛發(fā)可能變白。
白瘕風(fēng)的影響，在印度為大約每100人中有1人，在美國為大 約2000人中有1人。約1%至2%的世界人口即4千萬至5千萬人 有白癜風(fēng)。全世界所有地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)。白癜風(fēng)影響所有種族 群體，但對深色皮膚的人群更為不利。這種疾病對男性和女性的影 響是同樣的。通常的發(fā)病年齡是10至30歲，但其病癥可以開始于任何年齡。百分之九十五的患有白癜風(fēng)的人在40周歲之前發(fā)病。由
白癜風(fēng)引起的外貌變化可以影響一個人的情感和心理福祉，并可能 造成獲得或維持工作的困難。有這種疾病的人可能經(jīng)歷情感壓力， 特別是當(dāng)白癜風(fēng)發(fā)生在機(jī)體的可見區(qū)域，如面部、手、手臂、腳或 生殖器時。青少年往往特別關(guān)注其外貌，他們可能被大范圍的白瘋 風(fēng)所摧殘。有些患有白癜風(fēng)的人會感覺窘迫、羞愧、沮喪或擔(dān)心別 人會作何反應(yīng)。
白癜風(fēng)的治療目標(biāo)是恢復(fù)皮膚的功能，并改善患者的外貌。目
前治療白瘋風(fēng)往往需要很長的時間，例如，6至18個月。治療法的 選擇取決于白斑的數(shù)目和它們?nèi)绾螖U(kuò)散，以及患者對治療的偏好。
白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理
到目前為止，已經(jīng)有三個重要的假說來解釋白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī) 理。自身免疫假說是源于白癜風(fēng)與某些自身免疫病相關(guān)聯(lián)這一觀察 結(jié)果。已證明細(xì)胞和體液因素二者均造成對黑素細(xì)胞的自身免疫破 壞。該自身細(xì)胞毒性或自我毀滅假說認(rèn)為，黑色素生物合成過程中 產(chǎn)生的某些毒性分子是造成易感個體黑素細(xì)胞損害的原因。神經(jīng)假 說假定，從神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)化學(xué)物對黑素細(xì)胞是有毒的。有些 人報告，曬傷或情緒困擾可能引發(fā)白癜風(fēng)?？赡苡卸喾N機(jī)制導(dǎo)致白 瘋風(fēng)。
可用的治療方法
對于白癜風(fēng)，沒有普遍有效的醫(yī)藥或手術(shù)治療方法；雖然已知 有一些辦法是有效的。除了在本文后面列出的這些醫(yī)藥和手術(shù)治療 方法，人們還必須始終牢記輔助療法，如用廣譜防曬霜以防止白瘋 風(fēng)皮膚的光損傷，和通過對白癜風(fēng)暴露區(qū)域的著色或化裝對被毀損 皮膚進(jìn)行美容掩飾。盡管有若干抑制黑色素合成的外用藥物，但研究人員關(guān)注于直 接控制酪氨酸酶產(chǎn)量的突破，以更好地控制色素的變化。協(xié)助提高
色素沉著區(qū)的外觀，因為新細(xì)胞似乎含有較少色素顆粒。然而，已
有初步調(diào)查才艮道，用含有異丙月幾苷(isoprinosine)、 左旋。米唑 (levamisole)、 曱石黃司特(suplatast tosilate)、 環(huán)孑包霉素(cyclosporine)的
外用皮膚護(hù)理制劑，可使白癜風(fēng)病變產(chǎn)生重新色素沉著，所有上述 藥物都是免疫抑制劑/免疫調(diào)節(jié)劑。
醫(yī)藥治療
外用類固醇治療對于皮膚的重新著色(將顏色重轉(zhuǎn)回白斑)是有幫 助的，特別是當(dāng)在疾病早期就開始使用時。在看到任何結(jié)果前，患 者需要在他們皮膚白斑上施用類固醇外用乳膏至少3個月。醫(yī)生還 不得不密切監(jiān)測副作用的危險，如皮膚萎縮和皮膚裂紋(皮膚上的條 斑或線條)。補(bǔ)骨脂素(psoralen) UVA光化學(xué)療法(PUVA)涉及口服或 外用補(bǔ)骨脂素，然后小心地定時接觸太陽光或由特殊燈發(fā)出的紫外 線A (UVA)光?；颊咄ǔＴ卺t(yī)生辦公室接受治療，以便能夠被仔細(xì) 觀察任何副作用?；颊咴谄渌鼤r間必須盡量減少接觸太陽光。然 而，該方法耗費時間而且必須注意避免副作用，副作用有時可能嚴(yán) 重。補(bǔ)骨脂素是含有能與紫外光反應(yīng)造成皮膚變黑的化學(xué)品的藥 物。外用PUVA療法主要有兩大潛在副作用(l)嚴(yán)重灼傷和起泡， 和(2)經(jīng)治療斑塊或白癜風(fēng)周圍正常皮膚重新色素沉著過度或變暗(過 色素沉著)。口服補(bǔ)骨脂素的其它已知副作用包括惡心和嘔吐、瘙 癢、毛發(fā)生長異常和皮膚癌風(fēng)險增加。
脫色涉及對機(jī)體的其余皮膚進(jìn)行褪色，以與已有的白區(qū)相匹 配，更常用于有大范圍白癜風(fēng)的人。患者在色素區(qū)一天兩次施用氫 醌的單千基醚藥物(莫諾苯宗(monobenzone)或Benoquin)，直到色素 區(qū)與脫色區(qū)相匹配。患者在施用藥物后至少2個小時，必須避免與其他人直接的皮膚對皮膚接觸。脫色療法的主要副作用是皮膚炎癥 (發(fā)紅和腫脹)?；颊咭部赡軙?jīng)歷發(fā)癢、皮膚干燥或覆蓋眼白的膜異 常變暗。脫色是永久性的，并且無法逆轉(zhuǎn)。此外，經(jīng)受脫色治療的 人總是對太陽光異常敏感。
手術(shù)治療
已報告了 一些治療脫色皮膚的外科手術(shù)對用醫(yī)藥治療難以取得 良好效果的患者有效。手術(shù)治療方法包括皮膚移植。在皮膚移植 時，醫(yī)生移除部分正常的、具色素皮膚(供體部位)，將它們放置到脫
色區(qū)(受體部位)。手術(shù)方法包括
1. 采用熱、負(fù)壓或冷凍處理在患者的正常色素皮膚處制作負(fù)壓 水泡移植物(Sunction Blister graft)。然后切出水泡頂部，移植到脫色 皮膚區(qū)。水泡移植的風(fēng)險包括發(fā)展為卵石外觀、瘢痕以及缺乏重新 色素沉著?？墒?，在瘢痕形成方面，該方法比其他類型的移植的風(fēng) 險更低。
2. 穿孔移植物(punch graft)已被用來取代脫色皮膚。穿孔移植物 是利用市售打孔機(jī)從患者移除的小塊正常皮膚。在磨去白癜風(fēng)皮膚 后，將這些移植物放置在該區(qū)域上以誘導(dǎo)色素沉著。該技術(shù)雖然有 效，但會導(dǎo)致卵石外觀和瘢痕形成。
3. 紋身(tattooing)很適合唇部，特別是皮膚黝黑的人；可是，醫(yī) 生很難使該區(qū)域與其周邊皮膚的顏色完全匹配。紋身往往隨著時間 的推移褪色。此外，唇部紋身可能導(dǎo)致單純皰疹病毒所引起的皰疹 疫情。
其它方法
已有若干專利和專利申請?zhí)岢隽酥委煱遵帮L(fēng)的其他方法，其中 包括美國專利號4,866,038 、 5,700,450 、 6,039,972 、 6,660,305和 6,673,603,美國公開專利申請?zhí)?001/0006813和2002/0106353，和PCT7/Hf說明書WO2004096981A2和WO2005011676Al。其中一些 文獻(xiàn)提出用于刺激黑色素和/或黑素細(xì)胞產(chǎn)生的組合物。另 一些文獻(xiàn) 提出直接注射黑色素到皮膚。其他文獻(xiàn)關(guān)注于運送細(xì)胞的工具。例 如，包含角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞糊劑；用載體基質(zhì)(如纖 維蛋白膠)運送的培養(yǎng)的黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞；或用專門的適配 器械運送細(xì)胞懸液。另一個描述了包含錨定在疏水性合成高分子薄 膜上哺乳動物細(xì)胞的傷口敷劑。和這些傷口敷劑一起，薄膜被施用 于皮膚，細(xì)胞需要穿過孔洞遷移。這類運送方式導(dǎo)致只有較少細(xì)胞 直接與皮膚接觸，薄膜多孔性的效率對于細(xì)胞遷移很重要。另一份 文獻(xiàn)提出了一種增加色素沉著的方法，包括將皮膚移植物植入在白 癜風(fēng)斑上，所述皮膚移植物包含通過與有效量甘油二酯接觸而被激 活的黑素細(xì)胞。在該方法中，待用于移植的供體皮膚面積取決于需 要被皮膚移植覆蓋的脫色皮膚面積，即，為了覆蓋大面積的脫色皮 膚，需要更大面積的供體皮膚。其它技術(shù)包括純黑素細(xì)胞培養(yǎng)物以 及黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)物。這些技術(shù)對局部病灶是有利 的。
現(xiàn)在，培養(yǎng)人黑素細(xì)胞的最新發(fā)展使得能夠?qū)恼Ｆつw顏色 區(qū)獲得的自體黑素細(xì)胞移植到脫色皮膚區(qū)。在直接移植黑素細(xì)胞程 序中，獲取患者正常色素皮膚的樣本并進(jìn)行酶促解離。然后，將所 得的既有角質(zhì)形成細(xì)胞又有黑素細(xì)胞的細(xì)胞懸液直接添加到已清創(chuàng) 的脫色區(qū)。
這些方法的缺點包括
(a) 細(xì)胞數(shù)量的確定:由于所產(chǎn)生的細(xì)胞懸液中包含所有類型的 表皮皮膚細(xì)胞，因而被施用到脫色部位的黑素細(xì)胞的確切數(shù)量是不 清楚的。
(b) 將細(xì)胞保留在脫色部位:因為細(xì)胞被噴涂或澆注在脫色區(qū) 上，所以在接下來施用敷劑后這些細(xì)胞可能會消失。因此，存留在 清創(chuàng)區(qū)的細(xì)胞數(shù)目是不清楚的。(c)覆蓋范圍:如果獲取的起始活組織切片小于脫色區(qū)，則施用
到脫色部位的黑素細(xì)胞數(shù)量將不足以產(chǎn)生令人滿意的色素沉著水 平。
通過開發(fā)體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞的方法可以克服上述的一些缺點。 在黑素細(xì)胞于培養(yǎng)皿中增殖后，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離并移植到患 者的清創(chuàng)脫色皮膚斑處。迄今，對黑素細(xì)胞移植的所有研究已經(jīng)在 醫(yī)院或者在附屬于研究中心的醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行，并包括將黑素細(xì)胞懸 浮液遞送到皮膚。這種遞送方法效率低，細(xì)胞不能被正確地遞送到
創(chuàng)面(wound bed)或被治療皮膚處施用的紗布所捕獲。雖然對發(fā)病機(jī) 理的理解和對白瘋風(fēng)的治療有了很大進(jìn)展，但許多市售制品都只是 或多或少地有效，并且很少能達(dá)到外觀均勻的肌膚色調(diào)。
基于對時間的要求，本發(fā)明提供了新的系統(tǒng)，其可以克服現(xiàn)有 細(xì)胞遞送系統(tǒng)的缺陷，遞送功能性黑素細(xì)胞到白癜風(fēng)區(qū)，誘導(dǎo)重新 色素沉著。本發(fā)明提供用于移植的功能性黑素細(xì)胞移植物，它可以 從集中式(centralized)生產(chǎn)或加工中心被運送給位于不同地方的醫(yī)生 或醫(yī)院。根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的黑素細(xì)胞意欲用于遞送到皮膚的白癜風(fēng) 部位以誘導(dǎo)重新色素沉著。以往的研究都是在附屬研究中心的醫(yī)院 進(jìn)行。
迄今為止，由于無法安全而可靠地跨距離運送黑素細(xì)胞培養(yǎng) 物，所以尚不能進(jìn)行遠(yuǎn)程的黑素細(xì)胞移植。本發(fā)明提供預(yù)先包裝的 "現(xiàn)成"組合物的優(yōu)勢，所述組合物可直接從制造機(jī)構(gòu)運送給醫(yī)院或醫(yī) 生，而不是依賴于醫(yī)院、附近的研究中心或醫(yī)生來組裝或制備組合 物，這可大大降低成本并提高效率和易用性。
因此，仍然需要有一個能夠使細(xì)胞在集中式機(jī)構(gòu)中加工并運送 給各醫(yī)院的系統(tǒng)。在運送過程中保存細(xì)胞的活力是成功移植的關(guān) 鍵。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出 一 種關(guān)注于活組織切片運送的系 統(tǒng)黑素細(xì)胞培養(yǎng)物，其在生物聚合物上運輸和遞送。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)以促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移并定植于皮膚的方式提供細(xì)胞到脫色皮 膚，導(dǎo)致重新色素沉著。
本發(fā)明成功地創(chuàng)造了這樣一種系統(tǒng)，其將大大降低成本和提高 治療的易用性，患者因此而受益。
并指出，采用由本發(fā)明開發(fā)的、附帶角質(zhì)形成細(xì)胞的自體體外 培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物，能夠?qū)崿F(xiàn)具有良好愈合的色素沉著，從而減
輕色素減退(hypopigmented)病癥，如白癜風(fēng)。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中角質(zhì)形 成細(xì)胞的存在有助于加快傷口閉合。
發(fā)明概述
本公開內(nèi)容涉及移植物，其包含在透明生物相容性膜上培養(yǎng)的 增殖性黑素細(xì)胞。通過將膜倒置，將這些細(xì)胞直接遞送到脫色部 位，使細(xì)胞與清創(chuàng)位點相對。在一個實施方案中，在移植前的運送 條件下，本發(fā)明移植物中黑素細(xì)胞的活力可以保持至少96小時。本 發(fā)明可用于治療色素減退(hypopigmention)疾病如白癥風(fēng)、白斑病， 也可用于高色素沉著(hype卬igmention)病癥，如痣。與色素減退部位 相似，可對高色素沉著區(qū)進(jìn)行清創(chuàng)。這將導(dǎo)致移除負(fù)責(zé)非常暗的色 素沉著的高活性黑素細(xì)胞。在該部位移植正常的黑素細(xì)胞將有助于 正常的色素沉著。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括能夠誘導(dǎo)皮膚中色素沉著的移 植組合物，其包含來源于自體表皮的黑素細(xì)胞和生物聚合物膜，其 中，在5-37。C的運送條件下，組合物中至少75%的細(xì)胞保持活力至 少72小時。在相關(guān)實施方案中，5-37t:的運送條件下，組合物中至 少80%的細(xì)力包l呆持活力至少96小時。
在另外的實施方案中，黑素細(xì)胞組合物進(jìn)一步含有角質(zhì)形成細(xì) 胞。在一些實施方案中，黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的比率為0.8:2到 1:1。在本發(fā)明的移植物中，細(xì)胞可以是單層的。在一些實施方案
中，單層是至少25%、至少50%、至少70% 、至少90%以及100% 融合的(即從半融合到融合)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的黑素細(xì)胞能夠進(jìn)一步增殖。在相 關(guān)實施方案中，移植物中至少卯％的黑素細(xì)胞是活躍增殖性黑素細(xì) 胞。
本發(fā)明的細(xì)胞生長于生物相容聚合物(生物聚合物)膜上。合適的 生物相容膜包括可生物降解的、天然生物相容性的和合成的生物相 容性膜。在一些實施方案中，該生物聚合物膜選自聚乳酸(PLA)、 聚乙醇酸(PGA)以及分子量至少為50,000 Da的聚乳酸聚乙醇酸共聚 物(PLGA)。
因此，在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明包括組合物，其包含亞融合
中，在5-37。C的運送條件下，組合物中至少75%細(xì)胞保持活力至少 72小時。
本發(fā)明的組合物適于治療色素減退的皮膚疾患。因此， 一方 面，有足夠數(shù)量的黑素細(xì)胞，以使所產(chǎn)生的組合物對皮膚色素減退 癥具有治療效果。
本發(fā)明還包括制備適用于治療色素減退癥的、生物聚合物膜上 的黑素細(xì)胞組合物的方法。 一方面，該方法包括
a) 從自體表皮中分離黑素細(xì)胞；
b) 制備含分離黑素細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液；
c) 擴(kuò)增黑素細(xì)胞；
d) 可選擇地，冷凍保存黑素細(xì)胞細(xì)胞；
e) 可選擇地，解凍黑素細(xì)胞；
f) 將黑素細(xì)胞接種到生物聚合物膜上；
g) 將生物聚合物膜上的細(xì)胞擴(kuò)增為亞融合單層；和
h) 用含運送培養(yǎng)基的運送設(shè)備運送該生物聚合物膜；其中，在運送條件下，組合物中至少75%細(xì)胞能保持活力至少72小時。
在相關(guān)實施方案中，生物聚合物膜包括聚乳酸(PLA)(以PLDA 形式)，黑素細(xì)胞以1 xlO"^至x 1()S細(xì)胞/cm2的細(xì)胞濃度接種到生物 聚合物膜上。在進(jìn)一步實施方案中，運送設(shè)備包括聚碳酸酯。在另 外的實施方案中，運送培養(yǎng)基包含二氧化碳富集的培養(yǎng)基。在一個 實施方案中，運送培養(yǎng)基是KSFN培養(yǎng)基。
本發(fā)明還提供了對需要皮膚色素沉著的個體的治療方法。在一 個實施方案中，該個體是人。在進(jìn)一步的實施方案中，該個體受到 色素減退癥(如白斑病或白癜風(fēng))侵襲。在相關(guān)實施方案中，該方法包 括施用移植組合物，所述組合物能夠誘導(dǎo)皮膚中色素沉著，并且包 含來源于自體表皮的黑素細(xì)胞和生物聚合物膜，其中，在5-37。C的 運送條件下，組合物中至少75%細(xì)胞能保持活力至少72小時。在相 關(guān)實施方案中，在5-37。C的運送條件下，組合物中至少80%細(xì)胞能 保持活力至少96小時；其中，組合物增強(qiáng)該個體皮膚中的表皮再生 率。因此，本發(fā)明提供了治療受治療者白癜風(fēng)的方法，包括使用生 物聚合物膜作為遞送系統(tǒng)，并將亞融合單層黑素細(xì)胞遞送到皮膚。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供用于治療白癜風(fēng)的藥盒，其 中，該藥盒包含(l)組合物，其包含(a)亞融合單層黑素細(xì)胞和(b)生 物聚合物膜，其中，單層黑素細(xì)胞位于生物聚合物膜上；和(2)運送 設(shè)備，
其中，在5-37。C的運送條件下，組合物中至少75。/。的黑素細(xì)胞能保 持活力至少72小時。
附圖簡述
下列附圖是本說明書的部分，包括這些附圖以進(jìn)一步證明本公 開內(nèi)容的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或多個，并結(jié)合本 文對具體實施方案的詳細(xì)說明，可更好地理解本發(fā)明。

圖1:圖解本發(fā)明的活性(interactive)生物聚合物移植物，其包含 PLA片層(sheet)上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞。
圖2:圖示說明本發(fā)明創(chuàng)面覆蓋物的運送容器。運送容器的設(shè)計 已注冊，印度設(shè)計專利號為198591,在此引作參考。
圖3:圖示說明細(xì)胞支原體檢驗的比較結(jié)果。如圖所示，3A: 支原體陽性對照；3B:培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，顯示沒有支原體。
圖4:圖示說明用MEL-5抗體染色法測試黑素細(xì)胞的細(xì)胞身 份，其中，黑素細(xì)胞被確定為綠色細(xì)胞。細(xì)胞核用DAPI染色。
圖5:圖示說明用PCR技術(shù)分析的黑素細(xì)胞中MART-1基因表達(dá)。
圖6:圖示說明通過DOPA染色檢測的培養(yǎng)黑素細(xì)胞的功能性。
圖7:圖示說明黑素細(xì)胞從PLA片層向創(chuàng)傷覆蓋面的遷移，通 過創(chuàng)傷面紅色焚光標(biāo)記細(xì)胞的存在來指示。
圖8:表1.體外致瘤性測定的結(jié)果，表明培養(yǎng)黑素細(xì)胞對于移 植的安全性。
圖9:圖示說明在運送條件下黑素細(xì)胞的活力。
圖10:在相差顯微鏡下黑素細(xì)胞加上角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
圖11:通過角蛋白染色法鑒定角質(zhì)形成細(xì)胞。
圖12:用PCR鑒定角質(zhì)形成細(xì)胞中MHC- II (HLA-DR)的表
達(dá)，以防使用異源性角質(zhì)形成細(xì)胞。
圖13:體外致瘤性測定的結(jié)果，表明培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞對于移 植的安全性。
本發(fā)明實施方案的詳細(xì)說明
本發(fā)明提供了組合物和遞送系統(tǒng)，其包含位于生物相容性支持 材料(如聚乳酸)上的活躍生長性表皮細(xì)胞(如黑素細(xì)胞，或黑素細(xì)胞-角質(zhì)形成細(xì)胞混合物)的培養(yǎng)移植物，，該組合物和遞送系統(tǒng)適于從 集中加工中心被運送到其它位于不同地點醫(yī)院進(jìn)行移植。
在 一個實施方案中，制備移植物的方法涉及對接種細(xì)胞用的支 架的優(yōu)化。支架可以選自天然材料(如膠原蛋白和纖維蛋白)或合成材 料(如用于外科縫合的可降解聚酯)。支架采取的形式可從海綿狀片 層和織物到凝膠到用新材料加工技術(shù)制造的帶有復(fù)雜孔和管道的高 度復(fù)合結(jié)構(gòu)。支架的空間和組成性質(zhì)、支架的孔隙度和孔的互連性 都要求能允許細(xì)胞滲透到支架中，以及允許養(yǎng)分和廢物產(chǎn)物轉(zhuǎn)運。
在另一實施方案中，構(gòu)成分化角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)方法一部分的 黑素細(xì)胞以4-5層厚的組織形式遞送，然后可以通過酶解脫離培養(yǎng) 亞，并在清創(chuàng)后被移植到脫色區(qū)。
在某些實施方案中，黑素細(xì)胞可以在培養(yǎng)容器中直接培養(yǎng)于送 送膜上，然后在需要使用時剝離。
在本發(fā)明的另 一 實施方案中，生物聚合物上的體外培養(yǎng)黑素細(xì) 胞移植物包括對移植細(xì)胞的基因修飾以改善色素沉著。
生物相容性聚合物可以是天然的或合成的。 一般情況下，合成 聚合物比天然材料具備更大優(yōu)勢，因為與天然來源的物質(zhì)比較，它 們能夠提供更廣泛的性能和更可預(yù)見的批量間均勻性。合成聚合物 還代表了更可靠的原料來源，沒有普遍關(guān)注的免疫原性和感染力。
聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚 氨酯是本發(fā)明優(yōu)選的 一些生物相容性聚合物。這些聚合物的優(yōu)點 是，在達(dá)到其預(yù)期目的后，不需要手術(shù)切除它們?；谄洫毺匦?能，包括通用降解動力學(xué)、非毒性和生物相容性，這些聚合物已經(jīng) 在藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)有廣泛的應(yīng)用。PGA是高度結(jié)晶聚合物，是它們 中親水性最強(qiáng)的。PGA有非常高的熔點(224。C至226°C),其降解率 比PLA高得多。由不同比率的乳酸(LA)和乙醇酸(GA)組成的隨機(jī) PLGA共聚物表現(xiàn)出不同的降解率，從而可以定制用于需要從數(shù)周到 數(shù)月的特殊降解動力學(xué)的具體應(yīng)用。它們通常比其均聚物更具無定形性，在兩種單體含量相同時最容易被水解。聚乳酸(PLA)和聚乙醇
酸(PGA)是已被核準(zhǔn)臨床使用的為數(shù)不多的合成可降解性聚合物，在 組織發(fā)育方面已一皮廣泛研究。
嵌段聚氨酯彈性體由于其優(yōu)異的機(jī)械性能和巨大的化學(xué)多功能 性，已被廣泛用作生物材料。致力于開發(fā)生物醫(yī)學(xué)聚氨酯的研究主 要側(cè)重于長期應(yīng)用，如血管移植物和起搏器電極絕緣體(pacemaker lead insulator)。聚氨酯聚合物以若干不同的形式并在大范圍被應(yīng)用， 無論是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和其它等等。該材料通過澆注或其他成型技術(shù) 制作而形成了基片(substrate),可與其它基片 一起或聯(lián)合應(yīng)用以形成 均質(zhì)的多層材料?？尚纬蛇@種多層均質(zhì)聚氨酯材料，各層有不同程 度的可降解性。
影響生物可降解性聚合物機(jī)械性能的因素包括單體的選擇、起 始物的選擇、工藝條件以及添加劑的存在。這些因素進(jìn)而又影響到 聚合物的親水性、結(jié)晶度、熔點和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、分子量、分子 量分布、端基、序列分布(隨機(jī)對塊狀)以及殘余單體或添加劑的存 在。此外，從事生物可降解材料的高分子科學(xué)家必須評估這些變量 中每一個對生物可降解性的影響。雖然對這些聚合物特性已有充分 理解，但它們僅用來提供細(xì)胞可附著于其上但不與細(xì)胞相互作用的 三維生物相容性結(jié)構(gòu)。在機(jī)體中，細(xì)胞位于胞外基質(zhì)(ECM)內(nèi)，后者 為組織提供適當(dāng)?shù)募軜?gòu)以及影響細(xì)胞關(guān)鍵功能(如遷移、增殖和分化) 的信號途徑。研究繼續(xù)關(guān)注于利用基質(zhì)分子與特定的生長因子以優(yōu) 化細(xì)胞對支架的附著和直接細(xì)胞活性。
本遞送系統(tǒng)上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞避免了現(xiàn)有的黑素細(xì)胞遞送系統(tǒng) 所面臨的缺陷。
其上培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移有皮膚細(xì)胞的本發(fā)明聚合物的應(yīng)用提高了在細(xì) 胞培養(yǎng)及其移植過程中移植物處理的容易性。用于本發(fā)明的聚合物 是透明的，允許在細(xì)胞培養(yǎng)過程中對細(xì)胞的顯^[敬觀察以及將其施用 于脫色皮膚后可顯現(xiàn)下面的皮膚。在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于治療脫色性皮膚的 人表皮黑素細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明目的是使用生物相容性聚合 物，這種使用代替了其已報告性能。設(shè)想用于本發(fā)明中的、用于傷 口愈合或傷口護(hù)理組合物的生物可降解性聚合物包括聚酯、聚(氨基
酸)、聚酯酰胺、聚氨酯或它們的共聚物。此外，選自PLA、 PGLA 和聚氨酯的聚合物片層具有以下優(yōu)點在培養(yǎng)和施用到傷口面上的 過程中易于處理，以及其能緊l占傷口輪廓。PLA、 PGA、 PGLA和聚 氨酯的片層是透明的，允許在培養(yǎng)過程中以及將其施用于傷口后色 素沉著過程中細(xì)胞的可視性。此外，它擁有的屏障性能，防止傷口 的微生物污染。
本發(fā)明提供由生物相容性、生物可降解性聚合物如PLA制造的 片層作為黑色素的遞送系統(tǒng)的應(yīng)用，以及使用該系統(tǒng)作為工具將增 殖性黑素細(xì)胞遞送給脫色皮膚的能力。
在一個實施方案中，本發(fā)明的傷口覆蓋物主要包含PLA片層上 的培養(yǎng)黑素細(xì)胞(圖i)，其在一個特別設(shè)計的容器中(圖2)。 PLA粗
品利用雙交酯(dilactide)通過催化反應(yīng)來制備，并通過重新溶解在溶 劑(如丙酮、氯仿)中然后再用水重新沉淀而純化。在這一過程中，未 轉(zhuǎn)化的雙交酯、其他單體和雜質(zhì)會連同一部分所用催化劑被移除。 聚合物薄膜用純化PLA來制備。
本公開內(nèi)容期望制造生物相容性和生物可降解性聚合物給設(shè)備 的設(shè)計者和醫(yī)生，這將有助于加速患者康復(fù)。本發(fā)明提供了黑素細(xì) 胞的組合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明可供用于培養(yǎng)與其他細(xì)胞如角質(zhì)形 成細(xì)胞一起的黑素細(xì)胞，及將其在生物相容性聚合物上的遞送。
本發(fā)明提供了共培養(yǎng)方法以及其在如白癜風(fēng)的皮膚病癥中移植 的應(yīng)用。將角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素細(xì)胞共同遞送的優(yōu)勢是，其可以提 高受影響皮膚的上皮形成速度。本發(fā)明的潛在優(yōu)勢或特點如下
1.黑素細(xì)胞移植物幫助色素沉著。2. 聚合物薄膜通過阻止微生物對創(chuàng)面的入侵而幫助愈合。
3. 聚合物薄膜粘附到創(chuàng)面并通過封閉神經(jīng)末梢來緩解疼痛。
4. 聚合物薄膜通過防止創(chuàng)面干燥而確保傷口環(huán)境潮濕。
5. 通過采取嚴(yán)格的工序間控制來最小化傳染性疾病的傳播。
6. 然后可以將遞送系統(tǒng)上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移至患者，從而盡 量減少由醫(yī)師處理細(xì)胞。由于細(xì)胞在薄膜上遞送，細(xì)胞受到最小的 醫(yī)師處理。
7. 用于遞送細(xì)胞的聚合物薄膜使細(xì)胞遷移到創(chuàng)面，從而阻止細(xì)胞 的損失。
8. 該聚合物薄膜在培養(yǎng)過程以及應(yīng)用中為移植物提供足夠強(qiáng) 度。不同于在細(xì)胞移植中使用的膠原片層和纖維片層，PLA薄膜不 脆弱，有足夠強(qiáng)度。該特性有利于制造過程即細(xì)胞培養(yǎng)時)以及在移 植過程中對移植物的處理。
以及在其被施用后對皮膚的可視性。
10. 大面積脫色皮膚可以用取自患者的少量活組織切片細(xì)胞所覆蓋。
11. 移植物的活力在運送條件下可以保持約96小時，從而便于
將其遞送至遠(yuǎn)離中央加工i殳施的各醫(yī)院。
用于制備本發(fā)明的生物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物的大部
分原材料是無菌產(chǎn)品。用于患者和/或供體皮膚運送的胎牛血清來源 被證明來自無瘋牛病(BSE)的國家。用于該生產(chǎn)方法中的所有塑料制 品是一次性的，從NUNCtm(美國)和Falcon (美國)獲得。在本發(fā)明 的生物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物中，PLA膜用作黑素細(xì)胞的 載體。將PLA澆注成薄膜，并用環(huán)氧乙烷(ETO)滅菌。本發(fā)明的生 物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物在特別設(shè)計的聚碳酸酯盤中運 送。使用硅氧烷O型圏(silicone O-ring)作為本發(fā)明傷口覆蓋物運送容器的部分。所有原材料都經(jīng)過測試，以進(jìn)一步確保材料無菌。制造 本發(fā)明傷口覆蓋物的過程是在按照CGMP規(guī)范的無塵室中進(jìn)行。
按照本發(fā)明，在培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物的組合物的制備中涉及
1. 分離黑素細(xì)胞
2. 培養(yǎng)黑素細(xì)胞
3. 制備生物聚合物薄膜
4. 安全性和有效性研究。
本發(fā)明的生物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物用于患者具脫色 或色素減退皮膚的病癥，如白瘕風(fēng)、白斑病等。
在一個實施方案中，鑒于PLA的生化特性，如生物相容性、受 控降解速度、已被證明的無毒性、高強(qiáng)度和受控降解速度，本發(fā)明 使用PLA作為基片來遞送黑素細(xì)胞。PLA薄膜是半滲透性的，這使 得它們對于液體和細(xì)菌是封閉的，但能滲透水汽、氧氣和二氧化 碳。滲透性很重要，因為發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，二氧化碳富集培養(yǎng)基，如 KSFM,出人意料地提高了在此基片上黑素細(xì)胞的活力。PLA對創(chuàng)面 的粘附有利于細(xì)胞向創(chuàng)面遷移。PLA薄膜是透明的，有助于在細(xì)胞
聚合物薄膜在其應(yīng)用中也易于移植物處理以及允許移植物被裁剪以 適應(yīng)白癜風(fēng)病變部位。在其過程中獲得的細(xì)胞活力反映了活組織切 片活力的維持。分離細(xì)胞的活力越高，黑素細(xì)胞存活和增殖的機(jī)會 就越高。本發(fā)明確保將活組織切片從醫(yī)院向中央加工設(shè)施運送過程 中活組織切片的活力。皮膚活組織切片在切取后，當(dāng)存放在5-37°C 時，在運送培養(yǎng)基中在96小時內(nèi)保持其活力的約80%。充填冷卻包 的保溫箱能在運送條件下維持5-25°C 96小時。因此，在72小時運 送中，可以從活組織切片分離出活細(xì)胞。移植物的活力在運送條件 下可以保持約96小時，從而使其能凈皮遞送到遠(yuǎn)離中央加工設(shè)施的各 醫(yī)院。同樣，本發(fā)明提供從培養(yǎng)-加工中心向移植醫(yī)院遞送時維持細(xì)胞 活力的運送條件。本發(fā)明提供了理想的存儲培養(yǎng)基、運送條件和期 限，以在運送中確保細(xì)胞的活力。在運送中，培養(yǎng)物被密封，以防 止污染和培養(yǎng)基泄漏。本發(fā)明提供了優(yōu)化的運送條件，其中，例
如，在8-25。C運送時，在二氧化碳富集培養(yǎng)基中，80%的細(xì)胞保持 其活力96小時。
二氧化碳富集培養(yǎng)基的一個實例是KSFM。[可由Gibco-BRL特 殊培養(yǎng)基獲得。參見Daley, J.P., Epstein, D.A.和Hawley-Nelson, P. (1990) Focus 12, 68; Donovan, J. (1998) Focus 20, 38]。 KSFM培養(yǎng)基 包括例如含L-谷氨酰胺的角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM (基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(500ml); 牛垂體提取物(25mg);和重組表皮生長因子(rEGF) (2.5嗎)。黑素細(xì) 胞培養(yǎng)于支持其增殖的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在溫度維持于37°C 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。但是在運送過程中，溫度于96小時期間中維持在 8-25。C。當(dāng)暴露于運送溫度時，黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基中的黑素細(xì)胞不 能夠保持其活力?？墒?，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)箱中于常規(guī)條件(37。C)培養(yǎng)于 KSFM培養(yǎng)基中時，細(xì)胞保持其活力，但其增殖情況與在生長培養(yǎng) 基中不同。 一個目標(biāo)是在運送中既保持活力又維持功能。已觀察 到，培養(yǎng)于二氧化碳不豐富的KSFM中的黑素細(xì)胞保持其活力不超 過24小時。但是，在富含二氧化碳的KSFM中運送的黑素細(xì)胞能保 持其活力96小時。
本發(fā)明提供了生物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物，該生物聚 合物為大約16平方厘米的圓形薄膜。然而，該尺寸并不限制本發(fā)明 的范圍，因為移植物可以是任何大小或形狀。此外，本發(fā)明以3x 10Vcm2的接種密度，用所述培養(yǎng)條件培養(yǎng)35-40天，提供了來自1 平方厘米皮膚活組織切片的64平方厘米移植物。因此，本發(fā)明能夠 使從小活組織切片獲得的黑素細(xì)胞繁殖，以覆蓋大面積的白癜風(fēng)病 變。臨床使用時，將移植物倒置在創(chuàng)面上，使細(xì)胞在經(jīng)磨削的皮膚 上與其緊密地相對。磨削是利用磨削器使表皮從皮膚上被移除的方法。在將片層倒置在經(jīng)磨削皮膚上時，黑素細(xì)胞會遷移并形成再生 表皮的一部分。再生上皮細(xì)胞中存在功能性黑素細(xì)胞，會導(dǎo)致皮膚 在接觸太陽光或PUVA后產(chǎn)生色素沉著。以共培養(yǎng)移植物存在的角 質(zhì)形成細(xì)胞也將遷移到創(chuàng)面上，定殖并重構(gòu)表皮。角質(zhì)形成細(xì)胞分 泌的生長因子幫助誘導(dǎo)接受者角質(zhì)形成細(xì)胞遷移、增殖和重建表 皮，從而導(dǎo)致早期創(chuàng)面閉合。
再生上皮細(xì)胞中存在功能性黑素細(xì)胞，會導(dǎo)致皮膚在接觸太陽
光或PUVA后產(chǎn)生色素沉著。以共培養(yǎng)移植物存在的角質(zhì)形成細(xì)胞
也將遷移到創(chuàng)面上，定殖并重構(gòu)表皮。由這些細(xì)胞分泌的生長因子
幫助誘導(dǎo)受體細(xì)胞遷移、增殖和重建表皮，從而導(dǎo)致傷口再生。PLA
薄膜上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞可本身被遞送，或作為與自體或異源性角質(zhì) 形成細(xì)胞 一 起的共培養(yǎng)物被遞送。以下是本發(fā)明的示例性實施方 案。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，在實施例中公開的技術(shù)代表了由本 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實踐中運作良好的技術(shù)。
然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，可在公開 的實施方案中作出改變，但仍然可獲得相同或相似的結(jié)果，而不偏 離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例1:制備生物聚合物上的培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植物
皮膚采集
從需要移植的人(此處被稱為患者)，采集穿孔活組織切片(punch biopsy)。采集患者的血樣(5ml)進(jìn)行傳染病檢驗，以確定患者的ID狀 況，以確保移植時操作者和患者的安全。將含有DMEM、 Iscove培 養(yǎng)基(Invirtrogen, USA)、 10。/。胎牛血清(FBS) (Hyclon， USA)、抗細(xì)菌-抗真菌溶液(Sigma， USA)和慶大霉素(Invitrogen, USA)的皮膚活組織 切片采集管形瓶在含水包的保溫箱中運送到醫(yī)院。保溫箱由EPS (發(fā) 泡聚苯乙烯)制造，并能保持8-25。C溫度72小時。該管形瓶在使用前可在水箱內(nèi)最多存放一周。將活組織切片采集到這些運送管形瓶 中，并在樣品采集48小時內(nèi)運回到保溫箱以作進(jìn)一步處理。
制備聚合物薄膜
利用溶劑澆注法制備聚合物薄膜。讓該薄膜在室溫下通過溶劑
蒸發(fā)來干燥，并用ETO消毒。生物聚合物片層的典型制備例如詳述 于印度申請?zhí)朓N 205/MUM/2006中，后者提交于2006年2月14 日。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明使用了 PLDA，其由DL-丙交酯和L-丙交 酯(重量/重量50/50)共聚合而制備，其特性粘度為0.85。利用旋轉(zhuǎn) 涂覆在不銹鋼板上澆注含PLDA約15 - 25°/。的丙酮溶液，在37。C放 置過夜以干燥。對于細(xì)胞培養(yǎng)，將該薄膜切成4.5cm直徑的環(huán)狀， 用環(huán)氧乙烷(ETO)滅菌。采用標(biāo)準(zhǔn)化方法(IS/ASTM)表征ETO消毒薄 膜的物理性能。根據(jù)薄膜防止下面的營養(yǎng)基質(zhì)污染的能力，評估薄 膜對微生物如細(xì)菌、酵母和真菌的阻隔性能。
細(xì)月包培養(yǎng)程序
黑素細(xì)胞的分離和擴(kuò)增包括下列步驟
1. 去除患者皮膚中多余的脂肪，依次在70%酒精、聚維酮碘 (Mundipharma, Switzerland)和抗細(xì)菌-抗真菌溶液中洗滌以去污染。
2. 根據(jù)真皮的厚度，將活組織切片在0.2-0.4。/。分散酶(Sigma， USA)中孵育1-18小時。經(jīng)過分散酶消化后，表皮脫離下面的真皮； 通過用0.0S。/o胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen， USA)酶消化，黑素細(xì)胞從 表皮釋放。
3. 在胰蛋白酶消化后，用大豆胰蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶活 性，并將釋放的細(xì)胞重懸浮于市售黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基254-CF (Cascade Biologies USA)。以4 x 104細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞接種于組 織瓶內(nèi)。每隔一天更換培養(yǎng)基，在細(xì)胞達(dá)到70-80%融合時傳代，測 定細(xì)胞活力。4, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合時，將細(xì)胞傳代。根據(jù)需覆蓋皮膚的面積，
將細(xì)胞傳代2-3次，以獲得足夠細(xì)胞數(shù)。在遞送移植物前，用胰蛋白
物聚合物薄膜(l x 104 - 1 x io5細(xì)胞/cm2移植物)。
5. ^t細(xì)胞粘附和增殖。
圖1表現(xiàn)了本發(fā)明的生物聚合物移植物，其中，可以看到培養(yǎng) 的黑素細(xì)胞分布在PLDA薄膜上。
工序間控制
通過在培養(yǎng)過程中不斷監(jiān)測細(xì)胞的無菌性和內(nèi)毒素水平，確保 細(xì)胞對接受者的安全性。
此外，為了排除此培養(yǎng)條件會在細(xì)胞中產(chǎn)生異常的可能性，對 幾個批次的黑素細(xì)胞進(jìn)行了體外致瘤性測試以及核型分析。所有實 驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)的細(xì)胞中沒有任何異常。
在接種后第2、 3和4天，在胰蛋白酶消化后用臺盼藍(lán)法，分析 PLDA薄膜上的黑素細(xì)胞生長。每個實驗進(jìn)行三次重復(fù)。臺盼藍(lán)是一 種活體染料，用來選擇地使死亡組織或細(xì)胞呈藍(lán)色。它是一種重氮 染料。帶完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞或組織不被著色。由于細(xì)胞對通過膜 的化合物是非常有選擇性的，在活細(xì)胞中，臺盼藍(lán)不被吸收；但它 可穿越死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜。因此，死亡細(xì)胞在顯微鏡下被顯示為獨 特的藍(lán)色。由于活細(xì)胞被排除在染色外，因而這種染色方法也被稱 為染料排除法。
在一個實驗中，分離和培養(yǎng)來自穿孔活細(xì)胞切片(8mm)的正常黑 素細(xì)胞，這些活細(xì)胞切片取自22個供體，年齡在25-63歲，均知情 同意。從每一活細(xì)胞切片的表皮分離平均1.6xl0Vcn^活細(xì)胞(用臺盼 藍(lán)排除法)。使用先前提到的培養(yǎng)條件，本發(fā)明人能夠使所有患者的 黑素細(xì)胞培養(yǎng)超過3代，不論這些患者的年齡、性別或是否存在白 癜風(fēng)。在某些情況下，能夠使細(xì)胞培養(yǎng)直至第七代而不改變細(xì)胞形態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)，對45歲及以上的供體，其細(xì)胞達(dá)到融合需較長的持 續(xù)時間。
在使用前至少一小時，將含有PLA底膜上的黑素細(xì)胞的小袋從 在室溫下穩(wěn)定的專門改裝的運送容器中取出。PLA底膜上的黑素細(xì) 胞和專門改裝的運送容器見本文別處的介紹。在使用時，在無菌條 件下打開密封的托盤，小心提起盤上的蓋子，通過上箭頭所指缺口 棄去運輸培養(yǎng)基。從盤中輕輕提起含有細(xì)胞的移植物，并用生理鹽 水沖洗。將移植物的帶細(xì)胞面向上放在戴無菌手套手掌上。將移植 物切成病灶大小，用一對鑷子將切好的移植物從邊上提起并面向下 置于病灶上，使細(xì)胞與創(chuàng)面部位相對。應(yīng)注意不要在創(chuàng)面上拖動片 層。然后，用第二層敷劑最終覆蓋移植物?；颊邞?yīng)該被保持固定至 少2-3天，創(chuàng)面區(qū)不應(yīng)受到任何機(jī)械力或摩擦力。在施用研究裝置后 3、 6和9個月，對患者進(jìn)行隨訪?？蓪颊唠S訪更長的時期，以收 集安全性和有效性數(shù)據(jù)。首要目標(biāo)是研究在施用產(chǎn)品后與對照組相 比治療部位獲得重新色素沉著的百分比。第二個目標(biāo)是報告接受部 位的感染和破裂告、在試驗部位色素沉著過度、在治療部位上白癜 風(fēng)斑治療后復(fù)發(fā)。
實施例2:共培養(yǎng)技術(shù)
將角質(zhì)形成細(xì)胞施用于皮膚，導(dǎo)致表皮形成速度提高和改善脫 色皮膚磨削后所產(chǎn)生傷口的愈合速度。
角質(zhì)形成細(xì)胞要么從進(jìn)行黑素細(xì)胞治療的患者獲得，要么由其 他供體獲得。圖10顯示了生物聚合物上的共培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)使用直接 取自患者的培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞時，角質(zhì)形成細(xì)胞將繼續(xù)存活更長時 間，并形成重建表皮的部分。但是，應(yīng)用異源培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞將 會通過刺激機(jī)體再生而提高愈合的速度，即使這些細(xì)胞只能短暫存 活。黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基選擇性地誘導(dǎo)黑素細(xì)胞增殖，但不支持角
質(zhì)形成細(xì)胞增殖。角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞都存在于表皮中。在酶消化后，表皮與真皮物理上分離(因此在表皮細(xì)胞中不會有任何成纖 維細(xì)胞的污染)。
實施例3:培養(yǎng)黑素細(xì)胞生物聚合物的移植物的運輸
在印度專利申請?zhí)?0/MUM/2006中呈示了運送容器的設(shè)計實 例、其組裝和在運輸培養(yǎng)細(xì)胞中的使用，在此納入作為參考。容器 的設(shè)計顯示于圖2。將無菌PLA薄膜放置在這些運送盤中，并在 PBS中浸泡1小時。每個盤中的薄膜用聚碳酸酯環(huán)保持適當(dāng)位置。 在運輸前，以3-5 x 104細(xì)胞/(:1112接種細(xì)胞并培養(yǎng)2天。在發(fā)送到醫(yī) 院前，用流量計將盤中的培養(yǎng)基置換為二氧化碳富集培養(yǎng)基。將盤 上的卡環(huán)(clasp)安全關(guān)閉，以確保在運輸過程中移植物的活力和無 菌。然后，將盤放置于維持8-25。C溫度96小時的保溫箱中，并運 送到各醫(yī)院用于移植。用Temprecord數(shù)據(jù)記錄儀(Temprecord International Ltd. USA)驗證過用于運輸模擬研究的保溫箱。進(jìn)行這項 研究是為了確定在EPS BOXES中96小時期間所維持的溫度。該數(shù) 據(jù)記錄器用來跟蹤盒內(nèi)96小時的溫度。
產(chǎn)品表征和測試 實施例4:安全性測試
為確保接受者的安全，在運輸模擬前對來自供體的細(xì)胞進(jìn)行以 下測試
1. 核型分析:對細(xì)胞進(jìn)行了核型分析，以確定染色體的數(shù)目， 并檢查是否存在異常。在染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常方面沒有發(fā)現(xiàn)具臨 床顯著性意義的證據(jù)。
2. 支原體測試:此測試通過Hoechst染色法進(jìn)行。4吏用支原體 染色試劑盒，在焚光染色條件下檢測細(xì)胞，其中，陽性細(xì)胞通過在 細(xì)胞核周圍的粒狀或絲狀熒光來鑒定(圖3A)，而陰性細(xì)胞根據(jù)僅有 細(xì)胞核被染色而鑒定，如本文所示(圖3B)。3. 傳染病測試:為了確?；颊叩陌踩肊LISA法對患者血樣 (在收集活組織切片時采集)進(jìn)行傳染性疾病檢測，以檢查HIV、 HBV、 CMV、 HBSAg和梅毒。在細(xì)胞被發(fā)送到醫(yī)院/接受者前，還 用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)檢測了傳染性疾病。
4. 無菌性:通過嚴(yán)格的工序間檢測如生物負(fù)荷量、采用LAL法 的內(nèi)毒素檢測和無菌性檢測，確保了產(chǎn)品的無菌性。無菌性檢測包 括對需氧微生物和厭氧微生物的檢測。該檢測通過將測試樣品接種 于兩個不同的無菌營養(yǎng)培養(yǎng)基來進(jìn)行，即液體巰基乙酸培養(yǎng)基(FTM) 和大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基(SCDM)。結(jié)果顯示，在14天的孵育期 內(nèi)在接種培養(yǎng)基中沒有任何生長，這表明樣品無菌。細(xì)菌內(nèi)毒素的 存在用凝膠塊技術(shù)，使用鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)試劑來測定。在 37。C細(xì)菌內(nèi)毒素存在下孵育一個小時時，LAL試劑形成堅實的凝膠 塊。進(jìn)行生物負(fù)荷量測試，以確定產(chǎn)品的微生物負(fù)荷，其依據(jù)呈現(xiàn) 在固體培養(yǎng)基平板上的菌落數(shù)來確定。測試使用的培養(yǎng)基是大豆酪 蛋白消化物瓊脂(SCDA)。
實施例5:細(xì)胞表征
1.鑒別:利用免疫組織化學(xué)分析法，對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了分析 和鑒別。
黑素細(xì)胞移植物
為確定黑素細(xì)胞培養(yǎng)物的純度，用MEL-5抗體對細(xì)胞進(jìn)行鑒 別。所有細(xì)胞對MEL-5抗體試驗呈陽性(圖4)。 MEL-5 (Ta99)單克隆 抗體檢測分化相關(guān)的、色素沉著相關(guān)的糖蛋白(gp75)(75kD),其由黑 色素瘤細(xì)胞、正常黑素細(xì)胞和痣表達(dá)。該gp75抗原現(xiàn)在被稱為酪氨 酸酶相關(guān)蛋白(TRP-1)。
共培養(yǎng)移植物
為確定移植物中的角質(zhì)形成細(xì)胞的身份和其數(shù)量，用特異性結(jié) 合角質(zhì)形成細(xì)胞的PAN-角蛋白抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫染色來檢測細(xì)胞。用FITC綴合抗小鼠第二抗體來檢測陽性細(xì)胞，并用DAPI來鑒
別細(xì)胞中的細(xì)胞核，參見圖.ll。
程序:將培養(yǎng)的黑素細(xì)胞以0.2><104細(xì)胞/孔接種于雙孔室載玻片 中。用4。/。低聚甲醛(Sigma, USA)固定細(xì)胞20分鐘，用磷酸緩沖鹽溶 液(PBS)洗兩次。在用0.2% Triton X-100 (Sigma, USA)透性處理1小 時后，用第一 Mel-5單克隆抗體(Sigma, USA)染色細(xì)胞1小時，用 PBS漂洗細(xì)胞，用Alexa Fluor 488綴合山羊抗小鼠第二抗體 (Molecular Probe, USA)檢測陽性細(xì)胞。用PBS漂洗細(xì)胞，并用DAPI (Sigma， USA)在室溫下孵育細(xì)胞10分鐘。-f見野中的所有細(xì)胞都具藍(lán) 色細(xì)胞核，而黑素細(xì)胞由綠色熒光鑒別。以僅用用作對照的第二抗 體檢測染色的特異性。
2. MART-1 PCR:如圖5所示，在所有傳代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中都 有MART-1的表達(dá)，表明培養(yǎng)的細(xì)胞能因產(chǎn)生MART-1蛋白而具備 誘導(dǎo)色素沉著的能力。GAPDH (3-磷酸甘油醛脫氫酶)用作內(nèi)參。 MART-1與Pmel17 (黑素體蛋白)形成復(fù)合物，并影響其表達(dá)、穩(wěn)定 性、轉(zhuǎn)運和加工，這對于第二階段黑素體形成很重要。因此，對 Pmel17的功能而言，MART-1是必不可少的，并在調(diào)節(jié)哺乳動物色 素沉著中發(fā)揮重要作用。RT-PCR技術(shù)包括以下步驟按照制造商的 方案，用Trizol試劑(Invitrogen, USA)從不同代黑素細(xì)胞中提取總 RNA。按照制造商的方案，用S叩erscriptTM RT-PCR第一鏈合成系統(tǒng) (Invitrogen， USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。基因擴(kuò)增在PCR Supermix (Invitrogen， USA)中進(jìn)行，每25pL反應(yīng)體積含1.5 pL c-DNA。所用PCR反應(yīng)條 件為95°C 5分鐘，然后為95°C 45秒、55°C 45秒和72°C 45秒， 最后在72。C延伸10分鐘。擴(kuò)增用依據(jù)從Genbank數(shù)據(jù)庫獲得的序列 設(shè)計的下列特異性引物在熱循環(huán)儀(Biometra, Germany)中進(jìn)行
MART-(2德p):
5'- GCTCATCGGCTGTTGGTATT -3'(有義)，(SEQ ID NO: 1) 5'- ATAAGCAGGTGGAGCATTGG -3'(反義)；(SEQ ID NO: 2)3 -磷酸甘油醛脫氫酶(0入？0印(75(^ ):5'-GGG-CTG-CTT-TTA-ACT-CTG-GT-3,(有義)，(SEQ ID NO: 3) 5'-GGG-CTG-CTT-TTA-ACT-CTG-GT-3'(反義)；(SEQ ID NO: 4) 在2。/。瓊脂糖凝膠上將PCR產(chǎn)物分離，并在紫外燈(Image master:Amersham Biosciences, USA)下觀察。MART-1表達(dá)水平在所有代培養(yǎng)黑素細(xì)胞中保持不變，表明所測試的所有代培養(yǎng)細(xì)胞都能誘導(dǎo)色素沉著。本發(fā)明還測試了直至第5代的表達(dá)水平。GAPDH (3-磷酸甘油醛脫氫酶)作為指示相等RNA負(fù)載量的內(nèi)參。3. 功能測驗:培養(yǎng)的黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化DOPA為黑色素的能力代表 了細(xì)胞的功能特征。功能性黑素細(xì)胞通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生黑色素，其 中酪氨酸酶催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為DOPA,后者再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為黑色 素。功能測驗如下進(jìn)行在培養(yǎng)的黑素細(xì)胞被接種到PLA薄膜前， 先將其在有室載玻片中培養(yǎng)，并用含10%福爾馬林的PBS在-4。C固 定3小時。用PBS漂洗細(xì)胞，并用含L-DOPA (0.05mg/ml)的PBS在 37。C孵育3小時。孵育后，用PBS漂洗這些細(xì)胞，并用10%福爾馬 林緩沖液固定1小時。在L-DOPA存在下，功能性黑素細(xì)胞被染色 為棕色。(圖6)。4. MHC-n (HLA-DR〕表達(dá):MHC-II在免疫應(yīng)答中有重要作用。 MHC標(biāo)志物的下調(diào)往往與癌癥相關(guān)。圖12說明了用PCR在共培養(yǎng) 物產(chǎn)品中鑒定角質(zhì)形成細(xì)胞中MHC-II類(HLA-DR)的表達(dá)。5. 在運輸條件下細(xì)胞的活力:運輸條件下黑素細(xì)胞的活力用 MTT法間接評價。簡單地說，將MTT (0.5mg/mL)添加到裝運后第 0、 1、 2、 3和4天的細(xì)胞中，每盤三個重復(fù)。通過細(xì)胞將可溶性 MTT轉(zhuǎn)換為不溶性曱臢晶體的能力，間接確定細(xì)胞活力。將該晶體 溶解，測定作為在測試波長570nm和參照波長650nm的光密度差的 吸光度值(Shimadzu UV-VIS Spectrophotometer, Japan) 。 4艮定在發(fā)送時 (也就是第0天)所有細(xì)胞都是活的，將發(fā)送時的吸光度值假定為100%。每個時間點的活力按照與第0天時吸光度值的百分比來計 算。在運輸條件下，約80%的細(xì)胞保持其活力約96小時。因此推 論，細(xì)胞可以在運輸條件下96小時內(nèi)被遞送到三級醫(yī)院而其活力沒 有多少損失。在96小時時觀察到活力略有增加，這可能歸因于保溫 箱內(nèi)的溫度在72小時達(dá)到約25°C。在此時間點，少數(shù)細(xì)胞可能已經(jīng) 開始增殖，從而增加了細(xì)胞數(shù)量。保溫箱在運輸模擬條件下96小時 周期中維持的溫度是11-24°C。移植物上的細(xì)胞在8-35。C溫度可 保持其活力至4天(圖9)。實施例6:通過臨床前研究測試效用1.毒性測試用小鼠和豚鼠測試時，PLA沒有表現(xiàn)出任何毒性。整個移植物 也沒有表現(xiàn)出在動物中有任何毒性效應(yīng)。毒性測試用Dulbeccp磷酸 緩沖鹽溶液(PBS)和PAL片層，在37°C進(jìn)行72小時(以下簡稱"測試 物質(zhì)，，)。所有毒性研究皆根據(jù)OECD于1998年公布的良好實驗室規(guī) 范(GLP)原則進(jìn)行。急性皮內(nèi)毒性研究在雄性和雌性新西蘭白兔中使用接觸溶液進(jìn) 行。該測試在每只兔一側(cè)的五個位點皮內(nèi)施用0.2ml測試物質(zhì)(接觸 溶液)來進(jìn)行。相似地，在每只兔另一側(cè)的五個位點注射0.2ml蒸餾 水(對照)。在注射后立刻以及注射后24、 48和72小時，觀察每個注 射部位的外觀。然后每天觀察單個動物的毒性跡象，持續(xù)14天。將 每個注射部位在每一個時間間隔產(chǎn)生的紅斑、水腫組織反應(yīng)進(jìn)行分 級。72小時后，將每一測試物質(zhì)和對照的所有紅斑等級和水腫等級 獨立地匯總。將每一總數(shù)除以36 (6只動物x 3個等級x 2個等級類 別)，以確定每一測試物質(zhì)相對對照的總體平均得分。如果平均得分 在測試物質(zhì)和對照間的差異為l.O或更低，則滿足測試要求。在經(jīng)過接觸溶液處理的兔中，沒有觀察到不良臨床體征或死亡。為了確保細(xì)胞沒有可能導(dǎo)致接受者形成腫瘤的任何異常/轉(zhuǎn)化， 在體外進(jìn)行了致瘤性檢驗。評價培養(yǎng)細(xì)胞在軟瓊脂中形成菌落的能 力，作為可能的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞在人體內(nèi)形成肺瘤的潛力的指標(biāo)。監(jiān)測培養(yǎng)物是否在28天內(nèi)形成超過10個細(xì)胞數(shù)的菌落。被檢驗的各批 次培養(yǎng)細(xì)胞沒有形成菌落。圖8圖示說明黑素細(xì)胞培養(yǎng)物，圖13圖 示說明與黑素細(xì)胞共同培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)果。3. 在動物中移植將黑素細(xì)胞接種在PLA薄膜上(4xl04細(xì)胞/cm2),培養(yǎng)3天。在 移植時，用HBSS漂洗細(xì)胞，將薄膜倒置在傷口上，如下文所述。用含80mg/kg氯胺酮、40mg/kg賽拉嗪和0.05mg/kg阿托品的混 合物腹膜內(nèi)麻醉SCID小鼠(4只)。剃光背側(cè)的毛，用70°/。乙醇清潔 皮膚。在無菌條件，在動物的背側(cè)制造lcn^局部厚度的傷口。用鹽 水沖洗傷口，將接種了黑素細(xì)胞的PLA薄膜倒置在傷口上，并用以 手術(shù)石膏立體支撐的石蠟包埋紗布覆蓋。動物被個別關(guān)養(yǎng)，并提供 食物和水，自由進(jìn)食。所有動物的處理均依據(jù)由印度政府規(guī)定的實 驗動物福利CPCSEA準(zhǔn)則。72小時后，處死動物，并切耳又他們的傷 口。將組織固定在福爾馬林中，并用石蠟包埋。使用IHC HRP檢測 試劑盒(Chemicon, USA)，對5微米厚切片進(jìn)行免疫組化染色以檢測 黑素細(xì)胞遷移。簡單地說，用試劑盒的封閉緩沖液封閉切片，然 后，要么用人類細(xì)胞核單克隆抗體1:50 (Chemicon, USA),要么用 MEL-5單克隆抗體1:50 (Signet， USA)進(jìn)行孵育。隨后，用試劑盒提 供的生物素標(biāo)記羊抗小鼠第二抗體和HRP鏈霉抗生物素先后孵育樣 本。以二氨基聯(lián)苯胺(Sigma, USA)作為底物獲得陽性細(xì)胞信號。此 外，僅用第二抗體對切片進(jìn)行染色，用作第二抗體非特異性結(jié)合的 對照。動物在72小時后^^皮處死。4.細(xì)胞從生物聚合物遷移分別在豚鼠和SCID小鼠的全深度穿孔傷口活4全才莫型中，測試了 角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞遷移到皮膚中的能力。在SCID小鼠中，評 價了黑素細(xì)胞從放置在創(chuàng)面上的PLDA薄膜遷移的證據(jù)，如第4點 4是到的。72小時后處死動物，切取傷口并加工進(jìn)行免疫組織化學(xué)抬r查。組織化學(xué)分析表明，細(xì)胞已經(jīng)遷移到創(chuàng)面，并構(gòu)成了再生上皮 的一部分(圖7)。通過MEL-5陽性染色的存在鑒別出黑素細(xì)胞(圖7 A 和圖7 B)。在創(chuàng)面觀察到了 MEL-5陽性細(xì)胞(圖7A和圖7B中箭 頭)。通過觀察到類似的抗人細(xì)胞核抗體染色模式，證實了遷移的人 黑素細(xì)胞的存在(圖7C和圖7D)。用人類細(xì)胞在動物身上進(jìn)行了體內(nèi)實驗。實驗的目的是證明細(xì) 胞從薄膜遷移至創(chuàng)面。本發(fā)明的目的還在于通過對移植后對自體患者的研究，解決 用傳統(tǒng)技術(shù)治療色素減退時觀察到的下述并發(fā)癥。1. 浸出2. I貞色不匹配3. 移植物排斥4. 供體部位的瘢痕形成5. 移植后炎癥6. 鵝卵石外》見雖然為了清楚理解上述發(fā)明，通過舉例說明和實施例較詳細(xì)地 描述了上述發(fā)明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不 偏離所附權(quán)利要求書的精神或范疇的前提下，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)， 可以作出某些變化和修改。根據(jù)本公開的內(nèi)容，本文所公開和要求 保護(hù)的所有組合物和方法無需過多的實驗即可以進(jìn)行和實施。雖然 本發(fā)明的組合物和方法已通過優(yōu)選實施方案加以描述，但對本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說顯而易見的是，對本文所述組合物和/或方法以及方法中的步驟或一系列步驟，都是可以有變化的，而不偏離本發(fā)明的理 念、精神和范疇。更具體地說，顯而易見的是，某些化學(xué)或生理相 關(guān)的試劑可替代本文所述的試劑，而能得到相同或相似的結(jié)果。對 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，所有這些類似的替代和修改顯然被認(rèn)為是屬 于本發(fā)明的精神、范疇和理念。
權(quán)利要求
1.能夠誘導(dǎo)皮膚色素沉著的移植組合物，其包含來源于自體表皮的黑素細(xì)胞和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的運送條件下，組合物中至少75％的細(xì)胞保持活力至少72小時。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中，在5-37"的運送條件下，組合 物中至少80%的細(xì)胞保持活力至少96小時。
3. 權(quán)利要求1的組合物，其中，組合物進(jìn)一步包含角質(zhì)形成細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求3的組合物，其中，組合物中黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成 細(xì)胞在生物聚合物膜上的比率是0.8:2 - 1:1。
5. 權(quán)利要求1的組合物，其中，細(xì)胞以單層存在于生物聚合物 膜上。
6. 權(quán)利要求5的組合物，其中，所述的單層是亞融合單層。
7. 權(quán)利要求l的組合物，其中，黑素細(xì)胞能夠進(jìn)一步增殖。
8. 權(quán)利要求1的組合物，其中，至少90%的細(xì)胞是活躍增殖性 黑素細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求1的組合物，其中，生物聚合物膜選自聚乳酸 (PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及分子量至少為50,000 Da的聚乳酸聚乙醇 酸共聚物(PLGA)。
10. 權(quán)利要求1的組合物，其中，生物聚合物膜是聚乳酸 (PLA)。
11.權(quán)利要求i的組合物，其中，有足夠數(shù)量的活黑素細(xì)胞，以 使所產(chǎn)生的組合物對皮膚色素減退癥具有治療效果。
12.制備權(quán)利要求1組合物的方法，包括以下步驟a) 從自體表皮中分離黑素細(xì)胞；b) 制備含分離黑素細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液；c) 擴(kuò)增黑素細(xì)胞；d) 可選擇地，冷凍保存黑素細(xì)胞細(xì)胞；e) 可選擇地，解凍黑素細(xì)胞；f) 將黑素細(xì)胞接種到生物聚合物膜上；g) 將生物聚合物膜上的細(xì)胞擴(kuò)增為亞融合單層；和h) 用含運送培養(yǎng)基的運送設(shè)備運送該生物聚合物膜；其中，在運送條件下，組合物中至少75%的細(xì)胞保持活力至少72小 時。
13. 權(quán)利要求1.2的方法，其中，生物聚合物膜包括聚乳酸 (PLA)，黑素細(xì)胞以1 x 104至1 x 1(^細(xì)胞/cm2的細(xì)胞濃度接種到生 物聚合物膜上。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中，運送設(shè)備包括聚碳酸酯。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中，運送培養(yǎng)基包括二氧化碳富集 培養(yǎng)基。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中，運送培養(yǎng)基是KSFN培養(yǎng)基。
17. 治療需要皮膚色素沉著個體的方法，包括向該個體施用權(quán)利 要求l的組合物，其中，該組合物增強(qiáng)該個體皮膚中表皮再生率。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中，該個體是人。
19. 權(quán)利要求17的方法，其中，需要皮膚色素沉著的該個體是 患有白瘋風(fēng)。
20. 組合物，其包含亞融合單層黑素細(xì)胞和生物聚合物膜，其 中，在5-37。C的運送條件下，組合物中至少75%的細(xì)胞保持活力至 少72小時。
21. 組合物，其包含與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)的亞融合單層黑素細(xì) 胞和生物聚合物膜，其中，在5-37。C的運送條件下，組合物中至少 75%的黑素細(xì)胞保持活力至少72小時。
22. 權(quán)利要求21的組合物，其中，黑素細(xì)胞以1:1的比率與角 質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)。
23. 組合物，其包含(l)包含未分化細(xì)胞的亞融合單層角質(zhì)形成 細(xì)胞，和(2)生物聚合物膜，其中，在5-37。C的運送條件下，組合物 中至少75%的細(xì)胞保持活力至少72小時。
24. 在受治療者中治療色素減退的方法，其包括用生物聚合物膜 作為遞送系統(tǒng)，將亞融合單層黑素細(xì)胞遞送至皮膚。
25. 在受治療者中治療高色素沉著的方法，其包括用生物聚合物 膜作為遞送系統(tǒng)，將亞融合單層黑素細(xì)胞遞送至皮膚。
26. 用于治療白瘕風(fēng)的藥盒，其中，該藥盒包含(l)組合物，包 含(a)亞融合單層黑素細(xì)胞和(b)生物聚合物膜，其中，單層黑素細(xì)胞 是位于生物聚合物膜上；和(2)運送設(shè)備，其中，在5-37"的運送條 件下，組合物中至少75%的黑素細(xì)胞保持活力至少72小時。
27. 能夠誘導(dǎo)皮膚色素沉著的移植組合物，其包含來源于自體表 皮的黑素細(xì)胞和生物聚合物膜，按照前述權(quán)利要求的其方法和藥 盒，其在本文有實質(zhì)性描述，實質(zhì)性體現(xiàn)在實施例和圖中。
全文摘要
本發(fā)明涉及移植物，其中，利用生物聚合物來遞送培養(yǎng)的自體黑素細(xì)胞。本發(fā)明描述了其組合物、制備方法及與安全性和功效相關(guān)的性能。本發(fā)明的移植物在皮膚重新色素沉著方面具有潛在的用途。
文檔編號A61L27/60GK101605566SQ200780046208
公開日2009年12月16日 申請日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者D·戈舒, P·庫徹羅, S·謝諾伊, V·沙爾 申請人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司