專利名稱：一種小麥矮腥黑粉菌的快速檢測方法及其特異性scar標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小麥矮腥黑粉菌的快速檢測方法及其特異性 SCAR標(biāo)記。
背景技術(shù)：
小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kilhn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害，也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一(王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國進(jìn)境植物檢疫有害生物選編，中華人民共和國動植物檢疫局和農(nóng)業(yè)部植物檢疫實驗所編，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1997，95 98)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產(chǎn)量損失一般為20 50%，嚴(yán)重時可達(dá)75 90%，甚至絕產(chǎn)。病菌抗逆性極強(qiáng)，其冬孢子在土中可存活3 7年，包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長達(dá)10年以上。此病害一旦發(fā)生，很難防治或根除，所以國際上有15個國家將其列為檢疫對象加以防范。我國從20世紀(jì)60年代開始一直將此病害列為一類對外檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在形態(tài)學(xué)上極為相似，難于區(qū)別。傳統(tǒng)的病害診斷、檢測方法主要是依據(jù)病原形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的特性， 不但過程繁瑣、時間周期長，而且準(zhǔn)確性差、精度不高。因此，利用分子生物學(xué)手段快速、準(zhǔn)確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實用價值。1996年i^erreira等 (Ferreira Μ. A.，Tooley P. W.，Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence for identification of Tilletia indica， the Karnal bunt of wheat fungus[J]. Application Environment Microbiology，1996，62 :87 93) 首次將PCR技術(shù)引進(jìn)到印度腥黑穗病(Tilletia indicaMitra)的鑒定中來，他們選擇了印度腥黑粉菌線粒體DNA的一個2. 3kb的EcoR I片段進(jìn)行了克隆和測序，設(shè)計的特異性引物Til/Ti4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另夕卜，Smith等(Snith 0. P.， Peterson G. L. Beck R. J. etc. Development of a PCR-based method for identification of Tilletia indica, causal agent of karnal bunt of wheat[J]. Phytopathology, 1996,86 115 122)通過克隆印度腥黑粉菌線粒體DNA的Dra I片段，進(jìn)行了序列分析， 設(shè)計了兩套寡核苷酸引物對Til7/Ml和Til7/M2，能分別從印度腥黑粉菌中擴(kuò)增出大小為 825bp和118bp特異性片段，也實現(xiàn)了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。2000年Frederic 等(Frederick R. D. , Snyder K. Ε. , Tooley P. W. Identification and Differentiation of Tilletia indica and T. walkeri using the Polymerase Chain Reaction [J].Phytopathology, 2000,90 :951-960.)根據(jù)線粒體的差異設(shè)計了 5對針對印度腥黑粉菌的特異性引物和3對針對黑麥草腥黑粉菌的特異性引物，分別能將印度腥黑粉菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。張競宇等(張競宇，張正光，鄭小波，等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測[J].高技術(shù)通訊，2004，1 31 36)利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個種中設(shè)計了一對特異性引物T1/T2,能將T. indica和T. walkeri 從其它種中區(qū)分開來，而后又根據(jù)T. indica和T. walkeri線粒體之間的差異設(shè)計了一對特異性引物M1/M2，可以將二者區(qū)分開來，為了使反應(yīng)更為靈敏，建立了套式PCR技術(shù)，以便于提供更簡單的鑒定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌 rDNA 2IGS區(qū)的擴(kuò)增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報，2006，36 (5) =407-412)依據(jù)核糖體的IGSl區(qū)特性，設(shè)計了一對特異性引物，可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣屬種中鑒別出來。2004年高強(qiáng)(高強(qiáng).小麥矮腥黑穗病的分子檢測[D].長沙，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004) 利用RAPD技術(shù)找到了一條可以將小麥網(wǎng)腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區(qū)別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條帶，沒能將二者分開。2006年周業(yè)琴，劉素萍等(周業(yè)琴，劉素萍，周國梁，等.水稻腥黑粉病菌的單孢檢測[J]。植物檢疫，2006，20 :38 41)應(yīng)用核糖體ITS序列的通用引物Till/Til4 和兩對特異性引物(Hor2/Hor9 ；Hml/Hm5)結(jié)合建立了套式PCR技術(shù)，可以將水稻腥黑粉菌標(biāo)定出來。本實驗室陳萬權(quán)、劉太國、劉建華利用AFLP技術(shù)，找到了小麥矮腥黑粉菌的特異性片段，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區(qū)分開來，該技術(shù)已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利，專利號為200510080073. 7，但未報道其檢測的靈敏度，尚未在海關(guān)檢疫中應(yīng)用。ISSR是指利用基于SSR而設(shè)計的寡核苷酸引物來檢測2個SSR之間的一段短DNA 序列差異，其優(yōu)點是可在沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下，進(jìn)行基因組指紋圖構(gòu)建； 可同時檢測多個SSR座位；DNA用量少；顯性或共顯性。ISSR標(biāo)記可以用來填充遺傳圖譜中一些RFLP標(biāo)記稀少間斷或空白區(qū)，因此，在QTL定位中也逐漸得到較多的應(yīng)用。目前國內(nèi)外尚未見基于ISSR方法獲得特異性引物檢測小麥矮腥黑粉菌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)目前分子生物學(xué)方法檢測小麥矮腥黑粉菌的方法單一、靈敏度不高、 檢測樣本范圍較窄的現(xiàn)狀，提供一種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記及其引物，用于檢測小麥腥黑粉菌，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優(yōu)點。一種小麥矮腥黑粉菌的特異性SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列如kq No. 6所示。一種小麥矮腥黑穗病的快速檢測方法，其特征在于根據(jù)kq No. 6所示的核苷酸序列設(shè)計引物來PCR擴(kuò)增待測模板。所述引物為正向引物TCKSF3 5，-CACACACACACAGGAAGCA-3，，反向引物TCKSR3 5，-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3，。本發(fā)明基于ISSR獲得的小麥矮腥黑粉菌的特異性基因序列，所采用的黑粉菌樣本來源廣泛，共計51個菌株14個小麥矮腥黑粉菌(T. controversa Kuhn, TCK)菌株；6個小麥光腥黑粉菌(T. foetidaLiro,TFL)菌株，其中1個來自于捷克(TFL 6)，其余5個來源國內(nèi)不同地區(qū)；對個小麥網(wǎng)腥黑粉菌(T. cariesTul.，TCT)菌株，大部分來自于美國，1個來自于捷克(TCT24)，以及另外5種不同種的真菌菌株。這51個樣本來源基本涵蓋了目前黑粉菌盛行的地域，用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100個ISSR引物對這些菌株進(jìn)行特異性引物篩選，其中引物ISSR859能在小麥矮腥黑粉菌中穩(wěn)定地擴(kuò)增出670bp的片段，ISSR818能在小麥矮腥黑粉菌中穩(wěn)定地擴(kuò)增出952bp以及867bp的片段，而在其余兩種近緣的腥黑粉菌的37個菌株和其它對照的病原真菌中中沒有發(fā)現(xiàn)該條帶。因此，確定其為小麥矮腥黑粉菌特有的核苷酸序列。通過回收測序上述3個特異性DNA片段，獲得這些片段的核苷酸序列信息，如No. 1，No. 2，No. 3所示。由于本發(fā)明獲得的kq No. 1，No. 2，No. 3所示的核苷酸序列是小麥矮腥黑粉菌所特有的基因片段，因此，根據(jù)該序列設(shè)計的特異性引物，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣種中區(qū)別開來。這些引物所擴(kuò)增出來的基因片段可用作小麥矮腥黑粉菌的SCAR標(biāo)記。本發(fā)明所設(shè)計的特異性引物TCKSF (1-3) /TCKSR (1-3)，其核苷酸序列如Seq No. (7-12)所示，能高靈敏度、高特異性地將小麥矮腥黑粉菌鑒別出來，該對引物所擴(kuò)增出來的基因片段具有Seq No. 4, No. 5, No. 6所示的核苷酸序列，其大小分別為372bp、496bp和 419bp，可作為小麥矮腥黑粉菌的優(yōu)選SCAR標(biāo)記。本發(fā)明檢測小麥矮腥黑粉菌的PCR方法中，由于檢測潛伏期的種子或者幼苗時， 其攜帶的菌量非常少，與種子或者幼苗共同提取的DNA中，病菌的DNA比例極低，對引物的特異性、靈敏性要求非常高。因此，PCR反應(yīng)體系采用高特異性SCAR標(biāo)記如kq No. 4, No. 5， No. 6所示的核苷酸序列設(shè)計高特異性、高靈敏度識別的引物，這些引物擴(kuò)增出來的基因片段只要方便于瓊脂糖凝膠檢測即可。本發(fā)明優(yōu)選TCKSF(l-2)/TCKSR(l-2)作為檢測引物， 其檢測靈敏度均可達(dá)到lng/25l·! 1。本發(fā)明提供的小麥矮腥黑粉菌特異性DNA片段kq No. 1，No. 2, No. 3以及根據(jù)這些特異性片段的核苷酸序列獲得的高特異性和高靈敏度的SCAR標(biāo)記如kq No. 4， No. 5，No. 6所示的核苷酸序列，可為PCR技術(shù)檢測小麥矮腥黑穗病提供多種引物選擇。根據(jù)SCAR標(biāo)記序列設(shè)計的一對高特異性引物TCKSF(1-2)/TCKSR(1-2)的檢測靈敏度可達(dá)到 lng/25uL·因此，本發(fā)明提供的PCR方法用于檢測小麥腥黑粉菌具有省時、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點，相對于本實驗室以前利用AFLP技術(shù)研發(fā)的“一種小麥矮腥黑粉菌檢測的PCR方法”(專利號200510080073. 7 ；發(fā)明人陳萬權(quán)等，2007)，具有更高的檢測靈敏度和可靠性。該方法可應(yīng)用于對小麥矮腥黑粉菌帶菌麥種樣品的檢測以及小麥矮腥黑穗病的診斷，具有更高的實際應(yīng)用價值。


圖1 JSSR859引物篩選其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL2000) ；1_8分別為小麥矮腥黑粉菌 (編碼為 TCK1，TCK2，TCK3，TCK4，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8)，9-12 分別為小麥光腥黑粉菌(編碼為TFLl, TFL2, TFL3, TFL4)，13-16分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌(編碼為TCT1, TCT2, TCT3, TCT4)。圖2 特異性SCAR標(biāo)記的驗證其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2000) ； 1-14分別為小麥矮腥黑粉菌 14 個菌株(編碼為 TCK1，TCK2, TCK3, TCK4, TCK5, TCK6, TCK7, TCK8, TCK9, TCK10, TCKl 1,TCK12, TCK13, TCK14)，15-38分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌M個菌株(編碼為TCT1，TCT2，TCT3, TCT4, TCT5, TCT6, TCT7, TCT8, TCT9, TCT10, TCTl1, TCT12, TCT13, TCT14, TCT15, TCT16, TCT17, TCT18, TCT19, TCT20, TCT21，TCT22，TCT23, TCT24)，39-44 別為小麥光腥黑粉菌(編碼為TFL1，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，45為小麥散黑黑粉菌，46為稻粒黑粉菌，47為甘蔗黑粉菌，48為高粱黑粉菌，49，50為玉米絲黑穗病菌，51為小麥條銹菌，52為雙蒸水。圖3 特異性引物TCKSF1/TCKSR1的靈敏度檢測其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL 2，000) ； 1-10分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK9)不同濃度梯度，分別為 100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、lng、100pg、10pg、lpg、 0. Ipg (25 μ 1)。圖4 :ISSR818引物篩選其中1為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarker DL2000) ；2-5分別為小麥矮腥黑粉菌 (編碼為TCK2，TCK6，TCK7，TCK10)，6_9分別為小麥光腥黑粉菌(編碼為TFL1,TFL2, TFL3， TFL4)，10-12分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌(編碼為TCT1, TCT2，TCT3)。圖5 特異性SCAR標(biāo)記的驗證其中1、25、26、50為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL2000) ；2-9分別為小麥矮腥黑粉菌 8 個菌株(編碼為 TCK1，TCK2, TCK5, TCK6, TCK7, TCK8, TCK9, TCK10)，10-17 分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌 8 個菌株(編碼為 TCT1，TCT2, TCT3, TCT4, TCT5, TCT6, TCT7, TCT8)，18-23 別為小麥光腥黑粉菌6個菌株(編碼為TFLl，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，24，27-28為小麥散黑粉菌，29-33 為甘蔗黑粉菌，34-36為高粱黑粉菌，37-40為玉米絲黑穗病菌，41-42為小麥條銹菌，43-44為小麥葉銹菌，45-46為小麥稈銹菌，47為小麥白粉菌，48為小麥赤霉菌，49為雙蒸水。圖6 特異性引物TCKSF2/TCKSR2的靈敏度檢測其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2, 000) ；2-12分別為小麥矮腥黑粉菌 (TCK6)不同濃度的梯度，分別為 60ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、 Opg (25 μ 1)。圖7 :特異性SCAR標(biāo)記的驗證其中1、25、26、50為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2000) ；2-9分別為小麥矮腥黑粉菌 8 個菌株(編碼為 TCK1，TCK2，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8，TCK9，TCK10)，10-17 分別為小麥網(wǎng)腥黑粉菌 8 個菌株(編碼為 TCT1，TCT2，TCT3, TCT4, TCT5, TCT6, TCT7, TCT8)，18-23 別為小麥光腥黑粉菌6個菌株(編碼為TFLl，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，24，27-28為小麥散黑粉菌，29-33為甘蔗黑粉菌，34-36為高粱黑粉菌，37-40為玉米絲黑穗病菌，41-42 為小麥條銹菌，43-44為小麥葉銹菌，45-46為小麥稈銹菌，47為小麥白粉菌，48為小麥赤霉菌，49為雙蒸水。圖8 特異性引物TCKSF3/TCKSR3的靈敏度檢測其中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNAmarkerDL 2，000) ；1-10分別為小麥矮腥黑粉菌(TCK7)不同濃度的梯度，分別為 100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、 10ng、5ng、lng、lOOpg、IOpg(25 μ 1)。
具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
本發(fā)明的實驗材料小麥矮腥黑粉菌(T. controversa Kuhn, TCK)共14個菌株，其中12個菌株來源于美國，2個菌株由重慶大學(xué)王中康教授提供；小麥光腥黑粉菌(T.foetida Liro, TFL)共 6個菌株，其中1個來源自捷克，其余5個來源國內(nèi)不同地區(qū)，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存；小麥網(wǎng)腥黑粉菌(T. caries Tul. , TCT)共M個菌株，除1個來自捷克外，其余均由重慶大學(xué)王中康教授提供；小麥散黑粉菌(Ustilago tritici)、稻粒黑粉菌(Neovossia horrida)、甘蔗黑粉菌(U. scitaminea)、高粱軸黑粉菌(Sphacelotheca crueuta)、玉米絲黑穗病菌(S. reiliana)、小麥條銹菌(Puccnia striiformis)、小麥葉銹菌(P. triticina)、小麥稈銹菌(P. graminis)、小麥白粉菌(Erysiphe graminis)、小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)等由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組收存，可向公眾發(fā)放作為非商業(yè)性實驗用(見表1)。表1本實驗所使用的菌株材料
權(quán)利要求
1.一種小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kuhn)的特異性SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列如kq No. 6所示。
2.一種小麥矮腥黑穗病的快速檢測方法，其特征在于根據(jù)Sep No. 6所示的核苷酸序列設(shè)計引物來PCR擴(kuò)增待測模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測方法，所述引物為 正向引物 TCKSF3 :5，-CACACACACACAGGAAGCA-3，，反向引物 TCKSR3 :5，-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種小麥矮腥黑粉菌的快速檢測方法及其特異性SCAR標(biāo)記”，該SCAR標(biāo)記如Seq No.6所示，可為PCR技術(shù)檢測小麥矮腥黑穗病提供多種引物選擇。根據(jù)SCAR標(biāo)記序列設(shè)計的高特異性引物TCKSF3/TCKSR3的檢測靈敏度可達(dá)到1ng/25μl，可將小麥矮腥黑粉菌從眾多相似菌株鑒別出來。
文檔編號C12Q1/68GK102154278SQ20111005140
公開日2011年8月17日 申請日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者劉太國, 陳萬權(quán), 高利 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所