專(zhuān)利名稱：重組微生物和利用其生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已經(jīng)通過(guò)將預(yù)定基因引入宿主微生物中而賦予期望功能的重組微生物和利用其生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法。
背景技術(shù)：
作為能在自然界中容易地降解的生物可降解塑料或作為能從可再生碳資源(如糖或植物油)中合成的“綠色塑料”，脂肪族聚酯已獲得日益增多的關(guān)注。目前，具有乳酸骨架(lactic acid skeleton)的脂肪族聚酯(例如聚乳酸酯，polylactate)已在實(shí)踐中使用。在例如專(zhuān)利文獻(xiàn)1 (WO 2006/U6796)中公開(kāi)的技術(shù)已知是使用重組微生物生產(chǎn)脂肪族聚酯(如聚乳酸酯)的技術(shù)。專(zhuān)利文獻(xiàn)1公開(kāi)了重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，其是通過(guò)將編碼使乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA之酶的基因和編碼利用乳酸CoA作為底物合成聚羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)之酶的基因引入作為宿主的大腸埃希氏菌而獲得的。在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)的技術(shù)中，源自丙酸梭菌(Clostridium propionic·)的pet 基因被用作編碼將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA之酶的基因。此外，在這種情況下，源自假單胞菌屬 61-3菌株的phaC2基因被用作編碼利用乳酸CoA為底物合成聚羥基烷酸酯之酶的基因。然而，在專(zhuān)利文獻(xiàn)1的情況中，不能說(shuō)達(dá)到了足夠水平的脂肪族聚酯(例如聚乳酸酯)生產(chǎn)力。此外，尚未針對(duì)提高該生產(chǎn)力進(jìn)行充分討論。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)2(W0 2008/062999)公開(kāi)了這樣的嘗試，即通過(guò)向源自假單胞菌屬6_19菌株的phaCl基因中引入特定突變，來(lái)提高利用乳酸CoA為底物合成乳酸均聚物或聚乳酸酯共聚物的能力。同時(shí)，在例如專(zhuān)利文獻(xiàn)3(US 7，186J41)中已經(jīng)公開(kāi)，源自埃氏巨球形菌 (Megasphaera elsdenii)的—因(T^llil: -CoA(propionyl-CoA transferase gene，pct基因))是編碼將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA之酶的基因。然而，在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中，沒(méi)有考查或比較各種丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因的活性水平。此外，專(zhuān)利文獻(xiàn)3沒(méi)有像專(zhuān)利文獻(xiàn)1中那樣公開(kāi)涉及使用上述基因生產(chǎn)脂肪族聚酯的技術(shù)。引文列表專(zhuān)利文獻(xiàn)PTL 1 專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 :W0 2006/126796PTL 2 專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :W0 2008/062999PTL 3 專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 =US 7，186，54
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題如上文所述，使用重組微生物生產(chǎn)脂肪族聚酯(如聚乳酸酯)的技術(shù)存在脂肪族聚酯生產(chǎn)力低的問(wèn)題。此外，就生產(chǎn)力提高而言，不能說(shuō)該技術(shù)已被充分地研究。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供表現(xiàn)出優(yōu)秀脂肪族聚酯生產(chǎn)力的重組微生物和使用該重組微生物
3生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法。問(wèn)題的解決方案由于為實(shí)現(xiàn)上述目的而進(jìn)行了深入研究，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，向其中引入了預(yù)定的微生物來(lái)源的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因和預(yù)定的微生物來(lái)源的聚羥基烷酸酯合酶基因的重組微生物具有極其優(yōu)秀的脂肪族聚酯(如聚乳酸酯)生產(chǎn)力。這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。本發(fā)明的重組微生物是通過(guò)將下文中所示選自基因(a)至(C)的基因和選自基因 (d)至(f)的基因引入宿主微生物中而獲得的(a)編碼具有SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因；(b)編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過(guò)替換、缺失或添加1或更多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性；(c)在嚴(yán)格條件下與具有與SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列互補(bǔ)之核苷酸序列的多核苷酸雜交的基因，并且所述基因編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)化成乳酸CoA之活性的蛋白質(zhì)；(d)編碼具有SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因；(e)編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過(guò)替換、缺失或添加1或更多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有用乳酸CoA為底物合成聚乳酸酯的活性；和(f)在嚴(yán)格條件下與具有與SEQ ID NO :5或7所示核苷酸序列互補(bǔ)之核苷酸序列的多核苷酸雜交的基因，并且所述基因編碼具有用乳酸CoA為底物合成聚乳酸酯之活性的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的重組微生物是用大腸埃希氏菌作為宿主微生物而獲得的。 此外，本發(fā)明的重組微生物可以是這樣的微生物，其中不僅引入了上述兩種基因，而且引入了編碼參與脂肪族聚酯合成系統(tǒng)之酶的基因。其中已經(jīng)引入上述兩種基因的重組微生物能使用培養(yǎng)基中的碳源合成聚乳酸酯均聚物。其中不僅引入上述兩種基因而且引入了編碼參與脂肪族聚酯合成系統(tǒng)之酶的基因的重組微生物能使用培養(yǎng)基中的碳源合成乳酸共聚物。 在本文中，術(shù)語(yǔ)“乳酸共聚物，，是指具有如下聚合物骨架的聚合物，所述聚合物骨架包含乳酸骨架和非乳酸的羥基烷酸酯(hydroxyalkanoate)骨架。此外，根據(jù)本發(fā)明，可提供使用本發(fā)明的重組微生物生產(chǎn)脂肪族聚酯的上述方法。 具體地說(shuō)，本發(fā)明的用于生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法包括培養(yǎng)微生物和從培養(yǎng)基中收集脂肪族聚酯的步驟。發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明，可提供具有優(yōu)秀脂肪族聚酯生產(chǎn)能力的重組微生物。具體地說(shuō)，與常規(guī)重組微生物相比，本發(fā)明的重組微生物具有極其優(yōu)秀的脂肪族聚酯生產(chǎn)能力。通過(guò)使用本發(fā)明的重組微生物，可提供具有優(yōu)秀生產(chǎn)力的用于生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法。附圖簡(jiǎn)述[

圖1]圖1是特征圖，其顯示對(duì)于源自丙酸梭菌的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因、源自埃氏巨球形菌的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因和源自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因?qū)⑷樗徂D(zhuǎn)化成為乳酸CoA之活性的評(píng)價(jià)結(jié)果。
[圖2]圖2是特征圖，其顯示對(duì)于與源自埃氏巨球形菌的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因一起表達(dá)的多種聚羥基烷酸酯合酶基因之聚乳酸酯生產(chǎn)力的評(píng)價(jià)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下文中詳細(xì)地描述了本發(fā)明的重組微生物和使用所述重組微生物生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法。本發(fā)明的重組微生物是通過(guò)將預(yù)定的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因(pet基因)和預(yù)定的聚羥基烷酸酯合酶基因引入宿主微生物中而獲得的。丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因在本發(fā)明中，丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因(下文中稱為pet基因)的實(shí)例包括源自埃氏巨球形菌的基因和源自金黃色葡萄球菌的基因。SEQ ID NO :1顯示源自埃氏巨球形菌的 pet基因之編碼區(qū)的核苷酸序列。SEQ ID NO :2顯示由所述pet基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO :3顯示源自金黃色葡萄球菌的pet基因之編碼區(qū)的核苷酸序列。 SEQ ID NO :4顯示由所述pet基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。具有SEQ ID N0:2或4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶活性，尤其是利用乳酸作為底物合成乳酸CoA 的活性。此外，本發(fā)明的pet基因的實(shí)例不限于具有編碼SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因，并且可包括編碼如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過(guò)缺失、替換或添加1或更多個(gè)氨基酸而衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列并且具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性。在本文中，術(shù)語(yǔ)“1或更多個(gè)氨基酸”是指例如1至20，優(yōu)選1至10，更優(yōu)選1至7，更優(yōu)選1至5，尤其優(yōu)選1至3個(gè)氨基酸。此外，本發(fā)明的pet基因可以是編碼具有如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有與 SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列有例如70%或更高、優(yōu)選80%或更高、更優(yōu)選90%或更高以及最優(yōu)選95%或更高的序列相似性的氨基酸序列，并且具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性。在本文中，所述序列相似性值是指按默認(rèn)設(shè)置使用執(zhí)行BLAST算法的計(jì)算機(jī)程序和含有基因序列信息的數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的值。此外，本發(fā)明的pet基因可以是具有以下多核苷酸的基因，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列之基因的至少一部分雜交，并且編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA之活性的蛋白質(zhì)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下”是指被稱為引起特異性雜交體形成而不引起非特異性雜交體形成的條件。例如，在45°C下用6XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)雜交并隨后在50°C至65°C下用0. 2至IXSSC和0. 1 % SDS清洗的條件可稱為這樣的條件。或者，在65°C至70°C下用IXSSC雜交并隨后在65°C至70°C 下用0.3XSSC清洗的條件可稱為這樣的條件。可通過(guò)常規(guī)的已知方法進(jìn)行雜交，例如， J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中描述的方法。此外，可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，如上文所述通過(guò)修飾編碼轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列來(lái)進(jìn)行氨基酸的缺失、替換或添加?？赏ㄟ^(guò)已知的方法引起核苷酸序列中的誘變，例如 Kimkel法、缺口雙鏈體法或與這類(lèi)已知方法相似的方法。例如，可通過(guò)使用基于定點(diǎn)誘變方法的誘變?cè)噭┖?例如，Mutant-K或Mutant-G (產(chǎn)品名稱，TAKARA Bio)),LA PCR體外誘變系列試劑盒(產(chǎn)品名稱，TAKARA Bio)等來(lái)引起誘變?；蛘?，誘變方法可以是使用化學(xué)誘變
5劑(以EMS(甲磺酸乙酯，ethyl methanesulfonate)、5_溴尿嘧啶、2_氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍或不同的致癌化合物為代表)的方法、包括使用放射線(X-射線、α-射線、β-射線、Y-射線或離子束)進(jìn)行放射處理的方法或包括紫外處理的方法。聚羥基烷酸酯合酶基因如專(zhuān)利文獻(xiàn)1 (W0 2006/126796)中所公開(kāi)，已知聚羥基烷酸酯合酶基因(也稱為 PHA合酶基因)存在于很多微生物中。尤其是在本發(fā)明中，特定的聚羥基烷酸酯合酶基因與上述pet基因一起在宿主微生物中表達(dá)。具體地說(shuō)，可使用源自假單胞菌屬61-3菌株的聚羥基烷酸酯合酶基因(phaC2基因)和/或源自泊庫(kù)島食烷菌(Alcanivorax borkumensis) SK2菌株的聚羥基烷酸酯合酶基因作為本發(fā)明所用的聚羥基烷酸酯合酶基因。SEQ ID NO 5顯示源自假單胞菌屬61-3菌株的聚羥基烷酸酯合酶基因(phaC2基因)之編碼區(qū)的核苷酸序列。SEQ ID NO :6顯示由所述phaC2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO 7顯示源自泊庫(kù)島食烷菌SK2菌株的聚羥基烷酸酯合酶基因之編碼區(qū)的核苷酸序列。 SEQID NO :8顯示由所述聚羥基烷酸酯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。具有SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有合成聚羥基烷酸酯的活性，尤其是用乳酸CoA為底物合成聚乳酸酯的活性或利用乳酸CoA和不同的羥基烷酸酯為底物合成基于聚乳酸酯的共聚物的活性。此外，本發(fā)明的PHA合酶基因的實(shí)例不限于具有編碼SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因，還可包括編碼以下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過(guò)缺失、替換或添加1或更多個(gè)氨基酸而衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有用乳酸CoA 為底物合成聚乳酸酯的活性。在本文中，術(shù)語(yǔ)“1或更多個(gè)氨基酸”是指例如1至20，優(yōu)選 1至10，更優(yōu)選1至7，更優(yōu)選1至5，尤其優(yōu)選1至3個(gè)氨基酸。此外，本發(fā)明的PHA合酶基因可以是編碼以下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列具有例如70%或更高、優(yōu)選80%或更高、更優(yōu)選90%或更高以及最優(yōu)選95%或更高的序列相似性的氨基酸序列，并且具有利用乳酸CoA為底物合成聚乳酸酯的活性。在本文中，所述序列相似性值是指按默認(rèn)設(shè)置使用執(zhí)行BLAST算法的計(jì)算機(jī)程序和含有基因序列信息的數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的值。此外，本發(fā)明的PHA合酶基因可以是具有以下多核苷酸的基因，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO :5或7所示核苷酸序列之基因的至少一部分雜交，并且編碼具有用乳酸CoA作為底物合成聚乳酸酯之活性的蛋白質(zhì)。此外，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指與描述“丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因”的段落中相同的定義。此外，在描述“丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因”的段落中舉例說(shuō)明的技術(shù)可用于氨基酸的缺失、替換或添加。宿主微生物本發(fā)明的宿主微生物的實(shí)例包括屬于假單孢菌屬(I^eudomonas)的細(xì)菌，如假單孢菌屬61-3菌株；屬于雷氏菌屬(Ralstonia)的細(xì)菌，如真養(yǎng)雷氏菌(R. eutropha)； 屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌，如大腸埃希氏菌(Escherichia coll)；屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的細(xì)菌；屬于酵母屬(Saccharomyces)的酵母，如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；和屬于假絲酵母屬(genus Candida)的酵母，如麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)。尤其優(yōu)選使用大腸埃希氏菌作為宿主微生物。用于將上述基因引入宿主細(xì)胞的載體可以是能夠在宿主中自主復(fù)制的載體，其優(yōu)選為質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA的形式。要引入大腸埃希氏菌的載體的實(shí)例包括質(zhì)粒DNA，如 pBR322、pUC18 和 pBLuescript II ；和噬菌體 DNA，如 EMBL3、M13 和 λ-gtll。要引入酵母的載體的實(shí)例包括YEp 13和YCp50。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因重組技術(shù)來(lái)將上述兩個(gè)基因或其中之一插入載體。此外，重組時(shí)，優(yōu)選將所述基因連接至能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的下游?？墒褂萌魏螁?dòng)子，只要其可在宿主中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄即可。例如，在使用大腸埃希氏菌作為宿主的情況下，可使用trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、I3R啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子等。在使用酵母作為宿主的情況下，可使用gall啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子等。此外，可在微生物中用于基因引入的終止子序列、增強(qiáng)子序列、剪接信號(hào)序列、 poly-Α添加信號(hào)序列、核糖體結(jié)合序列(SD序列)、選擇標(biāo)記基因等可根據(jù)需要連接至載體。除了藥物抗性基因(例如，氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因)之外，選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括參與營(yíng)養(yǎng)物(如氨基酸或核酸)的細(xì)胞內(nèi)生物合成的基因和編碼熒光蛋白(如螢光素酶)的基因。可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法將上述載體引入微生物。用于將載體引入微生物的方法的實(shí)例包括磷酸鈣法、電穿孔法、原生質(zhì)球法、醋酸鋰法、接合轉(zhuǎn)移法和使用鈣離子的方法。脂肪族聚酯的生產(chǎn)可如下生產(chǎn)目標(biāo)脂肪族聚酯在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物(所述微生物是通過(guò)如上文所述將pet基因和PHA合酶基因引入宿主微生物中而獲得的)，以在培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞或培養(yǎng)物中引起脂肪族聚酯的產(chǎn)生和積累，之后從所述培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞或所述培養(yǎng)物中收集脂肪族聚酯。上述重組微生物在糖代謝途徑中由糖合成乳酸，pet基因編碼的丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶隨后將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA。此外，在所述重組微生物中，由PHA合酶基因編碼的PHA合酶利用乳酸CoA為底物合成脂肪族聚酯，所述脂肪族聚酯包含乳酸作為構(gòu)建塊(building block)。在本文中，脂肪族聚酯可以是聚乳酸酯(均聚物)(其包含由乳酸組成的構(gòu)建塊)或者是基于乳酸的共聚物(其包含由乳酸和非乳酸的羥基烷酸組成的構(gòu)建塊)。當(dāng)合成聚乳酸酯(均聚物)時(shí)，不將非乳酸的羥基烷酸添加至培養(yǎng)基，或者使得宿主微生物缺乏非乳酸羥基烷酸生物合成途徑。相對(duì)而言，當(dāng)合成基于乳酸的共聚物(其包含由乳酸和非乳酸羥基烷酸組成的構(gòu)建塊)時(shí)，可將非乳酸羥基烷酸添加至培養(yǎng)基，或者使得宿主微生物具有非乳酸羥基烷酸生物合成途徑。碳源的實(shí)例包括碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖。此外，可使用具有4或更高碳數(shù)的油脂相關(guān)物質(zhì)(fat-and-oil-related substance)作為碳源。具有4或更高碳數(shù)的油脂相關(guān)物質(zhì)的實(shí)例包括天然油脂，例如玉米油、大豆油、紅花油、葵花籽油、 橄欖油、椰子油、棕櫚油、菜籽油、魚(yú)油、全油(whole oil)、豬油或牛油；脂肪酸，例如丁酸、 戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸、肉豆蔻酸，或其脂肪酸酯；和醇，例如辛醇、月桂醇、油醇、棕櫚醇，或其酯。除了銨鹽(例如，氨、氯化銨、硫酸銨和磷酸銨)之外，氮源的實(shí)例包括蛋白胨、肉提取物、酵母提取物和玉米漿。無(wú)機(jī)物質(zhì)的實(shí)例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸
7鎂和氯化鈉。一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在pet基因和PHA合酶基因的表達(dá)開(kāi)始之后，在25°C至37°C下振搖培養(yǎng)或類(lèi)似地培養(yǎng)至少M(fèi)小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中可以向培養(yǎng)基中添加抗生素(例如，卡那霉素、氨芐青霉素或四環(huán)素)。對(duì)于在誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下已引入pet 基因和PHA合酶基因中一種或兩種的情況，優(yōu)選在將誘導(dǎo)從啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的因子添加至培養(yǎng)基之后進(jìn)行至少M(fèi)小時(shí)的培養(yǎng)。尤其優(yōu)選培養(yǎng)已經(jīng)弓I入上述pet基因和PHA合酶基因的重組大腸埃希氏菌來(lái)生產(chǎn)聚乳酸酯。在該方法中，可生產(chǎn)聚乳酸酯，而無(wú)需將構(gòu)成目標(biāo)聚合物的單體組分(如乳酸) 添加至培養(yǎng)基，這在生產(chǎn)成本方面是有利的。此外，可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)收集脂肪族聚酯(如乳酸)。例如，通過(guò)進(jìn)行離心和清洗，繼之以干燥，而從培養(yǎng)溶液中收獲。隨后，將干燥的細(xì)菌細(xì)胞懸浮于氯仿中并加熱。從而用氯仿級(jí)分提取目標(biāo)聚酯。進(jìn)而，向所述氯仿溶液中添加甲醇以沉淀所述聚酯， 隨后通過(guò)過(guò)濾或離心去除上清液，隨后干燥。由此可獲得純化的聚酯?？赏ㄟ^(guò)一般方法如氣相色譜法或核磁共振法來(lái)證實(shí)所收集的聚酯為聚乳酸酯。實(shí)施例下文中參照以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于此。(實(shí)施例1)多種pet基因的評(píng)價(jià)在本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了源自丙酸梭菌的pet基因、源自埃氏巨球形菌的pet基因和源自金黃色葡萄球菌的pet基因?qū)⑷樗徂D(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性。制備了 pTV118N-C.P PCT 載體、pTV118N-M.E PCT載體和pTV118N-S.A PCT載體，分別用于引入源自丙酸梭菌的pet 基因、源自埃氏巨球形菌的pet基因和源自金黃色葡萄球菌的pet基因。首先，通過(guò)一般方法獲得埃氏巨球形菌(ATCC17753)、金黃色葡萄球菌 (ATCC10832)和丙酸梭菌(ATCC25522)的基因組。通過(guò)PCR法獲得每個(gè)pet基因。使用以下引物用于擴(kuò)增含有源自埃氏巨球形菌的Pct基因的DNA片段=MePCTN 5' -atgagaaaag tagaaatcattac-3‘ (SEQ ID NO 9)；和MePCTC -ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3 ‘(SEQ ID NO 10)。使用以下引物用于擴(kuò)增含有源自金黃色葡萄球菌(ATCC10832)的pet 基因的 DNA 片段SpctN :5' -gtgccatggaacaaatcacatggcacgac-3' (SEQ ID NO :11);禾口 SpctC 5' -cacgaattcatactttatgaattgattg-3' (SEQ ID NO : 12)。使用以下引物用于擴(kuò)增含有源自丙酸梭菌(ATCC25522)的pet基因的DNA片段=CpPCTN 5' -gggggccatgggaaa ggttcccattattaccgcagatgag-3‘ (SEQ ID NO 13)；禾口CpPCTC :5' -ggggggctcgagtcaggac ttcatttccttcagacccat-3‘ (SEQ ID NO: 14)。此外，將在NCBI注冊(cè)的信息作為引物核苷酸序列的參照。但對(duì)于埃氏巨球形菌， 參照W002/4M18中描述的序列。在以下條件下從相關(guān)的基因組中擴(kuò)增每種基因PCR(酶KOD plus) (94°C 1分鐘)X 1，(940C 0. 5分鐘，50°C 0. 5分鐘，72°C 2分鐘)X 30，(94°C 2分鐘)。將所擴(kuò)增的片段分別引入TOPO BlimtII載體，隨后測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)源自丙酸梭菌的pet和源自金黃色葡萄球菌的pet分別與AJ276553和MW0211(其為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的序列)完全相同。源
8自埃氏巨球形菌的pet的核苷酸序列與以前報(bào)道的序列具有97. 8%的同源性。然而，在其氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了單位點(diǎn)差異。通過(guò)PCR獲得的來(lái)自丙酸梭菌、埃氏巨球形菌和金黃色葡萄球菌的上述pet基因被分別插入 PTV118N 載體(Takara Bio Inc.)的 NcoI-BamHI、EcoRl-PstI 和 NcoI-EcoRI 位點(diǎn)。從而產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒(pTV118N-C. P PCT、pTV118N-M. E PCT 和 pTV118N_S. A PCT)。隨后，將這些表達(dá)質(zhì)粒分別弓I入大腸埃希氏菌W3110。預(yù)培養(yǎng)所獲得的已轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌，隨后以2%接種于200_mlLB/2L燒瓶中，并在37°C和180rpm下培養(yǎng)3小時(shí)。在大約OD6tltl = 0. 5時(shí)，使用IOmM IPTG進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)，隨后在30°C和80rpm下培養(yǎng)6小時(shí)。隨后，通過(guò)離心收集細(xì)菌細(xì)胞，并在37°C下用M9 (+1. 5% 葡萄糖，IOmM MgSO4, IOmM泛酸鈣)(0D = 20,3ml)培養(yǎng)。以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行取樣。測(cè)定所合成的乳酸CoA的量，用于比較源自丙酸梭菌、埃氏巨球形菌和金黃色葡萄球菌的pet基因?qū)⑷樗徂D(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性。首先，收集細(xì)菌細(xì)胞(IX IO5細(xì)胞)用于制備樣品(η = 3)。將樣品應(yīng)用于吸濾器系統(tǒng)(suction filter system)，并用Milli Q 水清洗兩次。將濾器(顛倒)置于含有MeOH溶液Qml)的培養(yǎng)皿中，并使其在室溫下靜置10分鐘。將一部分MeOH溶液(1. 6ml)轉(zhuǎn)移進(jìn)離心管，并與氯仿(1. 6ml)和MilliQ水 (640ul)混合，隨后混懸。以4600g和4°C離心5分鐘以后，將水+MeOH層(1. 5ml)用5k超濾膜(Millopore)離心過(guò)濾大約2小時(shí)。收集濾液并冷凍干燥。將產(chǎn)物濃縮200倍并用含有二級(jí)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(a secondary internal standard substance)的 Milli Q 7jC溶角軍，隨后用 CE-MS 分析。CE-MS 分析條件參照〃 Pressure-Assisted Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Analysis of Multivalent Anions“ (Anal. Chem 2002，74，6224-6229)。結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1所示，其揭示源自埃氏巨球形菌的pet基因和源自金黃色葡萄球菌的Pct基因具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性，其活性水平顯著高于源自丙酸梭菌的 pet基因。該結(jié)果揭示，使用源自埃氏巨球形菌的pet基因和/或源自金黃色葡萄球菌的 pet基因，可充足地供應(yīng)用于合成具有基本骨架的脂肪族聚酯的反應(yīng)的底物，所述骨架部分地包含乳酸或由其構(gòu)成。(實(shí)施例2)評(píng)價(jià)多種PHA合酶基因在本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了多種PHA合酶基因的聚乳酸酯生產(chǎn)力，這在允許與源自埃氏巨球形菌的pet基因一起表達(dá)所述基因的情況下進(jìn)行，所述源自埃氏巨球形菌的pet基因已在實(shí)施例1中被評(píng)價(jià)為具有顯著高的將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性。表1列出了在本實(shí)施例中檢測(cè)的PHA合酶基因。在表1中，對(duì)于類(lèi)球紅細(xì)菌(Iihodobacter sphaeroides) (No. 1)和深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum) (No. 4)，由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了以不同登錄號(hào)注冊(cè)的多個(gè)基因，因此檢測(cè)了這些多個(gè)基因。[表 1]
權(quán)利要求
1.一種重組微生物，其是通過(guò)將如下所示選自基因(a)至(c)的基因和選自基因(d) 至(f)的基因引入宿主微生物中而獲得的(a)編碼如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有SEQID NO :2或4所示氨基酸序列；(b)編碼如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過(guò)替換、缺失或添加1或更多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA的活性；(c)在嚴(yán)格條件下與如下多核苷酸雜交的基因，所述多核苷酸具有與SEQIDNO :1或3 所示核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述基因編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸CoA之活性的蛋白質(zhì)；(d)編碼如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有SEQID NO :6或8所示氨基酸序列；(e)編碼如下蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有通過(guò)替換、缺失或添加1或更多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有用乳酸CoA為底物合成聚乳酸酯的活性；和(f)在嚴(yán)格條件下與如下多核苷酸雜交的基因，所述多核苷酸具有與SEQIDN0:5或7 所示核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述基因編碼具有用乳酸CoA為底物合成聚乳酸酯之活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述宿主微生物為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)0
3.一種用于生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組微生物，和收集脂肪族聚酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法，其中要收集的所述脂肪族聚酯是具有乳酸骨架的脂肪族聚酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法，其中要收集的所述脂肪族聚酯是聚乳酸酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法，其中在培養(yǎng)所述重組微生物時(shí)不向培養(yǎng)基中添加乳酸。
全文摘要
本發(fā)明提供表現(xiàn)出優(yōu)秀脂肪族聚酯生產(chǎn)力的重組微生物和利用所述重組微生物生產(chǎn)脂肪族聚酯的方法。在本發(fā)明中，源自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的pct基因(和/或源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的pct基因)和源自假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)61-3菌株的PHA合酶基因(phaC2基因)(和/或源自泊庫(kù)島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2菌株的PHA合酶基因)被引入宿主微生物。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102482651SQ201080040029
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者伊藤正和, 小畑充生, 嶋村隆, 幸田勝典, 村松正善, 神戶浩美 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車(chē)株式會(huì)社