用于生產(chǎn)c4-二羧酸的重組微生物的制作方法【專利摘要】本文中提供了包含碳酸酐酶活性的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠產(chǎn)生C4二羧酸。亦提供了產(chǎn)生C4二羧酸的方法，其包括(a)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有碳酸酐酶活性的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。【專利說(shuō)明】用于生產(chǎn)C4-二羧酸的重組微生物[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用[0002]本申請(qǐng)要求2011年8月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/525，345的優(yōu)先權(quán)，其通過全文提述并入本文。[0003]涉及序列表[0004]本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其通過提述并入本文。[0005]發(fā)明背景[0006]有機(jī)酸在多種工業(yè)中具有悠久歷史的商業(yè)使用。舉例而言，有機(jī)酸用于食品和飼料工業(yè)(檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸)，作為用于產(chǎn)生多種聚合物的單體(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸)，作為金屬螯合劑(葡糖酸)和作為“綠色”溶劑(乙酸)(Sauer等，2008，TrendsinBiotechnology26:100-108)。有機(jī)酸可以自身是商業(yè)產(chǎn)品，也可以是用于制造其他化學(xué)品的化學(xué)構(gòu)件(buildingblock)。除了專門用途之外，長(zhǎng)久以來(lái)公認(rèn)C4-二羧酸亦可充當(dāng)構(gòu)件化合物以供產(chǎn)生大量的工業(yè)化學(xué)品，如1，4-丁二醇，四氫呋喃和Y-丁內(nèi)酯。[0007]有機(jī)酸在產(chǎn)業(yè)上可通過從石油衍生原料的化學(xué)合成(例如，延胡索酸、蘋果酸、丙烯酸和己二酸)或通過微生物發(fā)酵(例如檸檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)產(chǎn)生。一些有機(jī)酸如延胡索酸和蘋果酸亦可通過微生物發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生，但由于更低的生產(chǎn)成本，目前在商業(yè)上仍通過化學(xué)合成從石油化學(xué)原料產(chǎn)生。然而，石油衍生構(gòu)件化學(xué)品的成本的日益升高，地緣政治的不穩(wěn)定性對(duì)原油價(jià)格的影響，以及對(duì)實(shí)施利用來(lái)源于可再生資源的原料的制造工藝的期望，再次激發(fā)了人們通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸和其他化學(xué)品的興趣。[0008]雖然現(xiàn)在C4-二羧酸如蘋果酸通過化學(xué)合成從石油化學(xué)來(lái)源來(lái)工業(yè)生產(chǎn)，其亦可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)。蘋果酸已在基因工程改造的酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))(Zelle等,2008,Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的絲狀真菌如曲霉屬菌種(Aspergillusspp.)(美國(guó)專利號(hào)3，063，910;Bercovitz等，1990，Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中獲得了高水平生產(chǎn)。Abe等(美國(guó)專利號(hào)3,063,910)和Bercovitz等(1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)報(bào)道了在幾種曲霉屬菌種中高水平的蘋果酸生產(chǎn)。而且，Battat等(1991，Biotechnol.Bioengineering,37:1108-1116)報(bào)道了在優(yōu)化條件下在攪拌的發(fā)酵罐中由黃曲霉(Aspergillusflavus)產(chǎn)生了高至113g/L的蘋果酸。在W02010/003728中描述了在酵母中通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生二羧酸。亦在W02009/011974，W02009/155382和W02010/111344中描述了通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生蘋果酸。通過遺傳工程C4-二羧酸如蘋果酸的產(chǎn)生的改善可使得能夠通過發(fā)酵經(jīng)濟(jì)地商業(yè)性生產(chǎn)蘋果酸。[0009]在宿主如曲霉屬菌種(Aspergillusspp.)中的蘋果酸過量產(chǎn)生在特定的培養(yǎng)條件(有氧條件和高C:N比；碳酸鈣亦可作為中和劑和作為用于蘋果酸生物合成的CO2源添加)下發(fā)生。在這些條件下，通過胞質(zhì)溶膠中發(fā)生的還原性三羧酸(TCA)循環(huán)的溢出代謝(overflowmetabolism)導(dǎo)致的蘋果酸生物合成和培養(yǎng)基分泌量增加。已報(bào)道了釀酒酵母中通過使用遺傳工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等，1999，F(xiàn)EMSMicrobiolLett.179:107-113)或蘋果酸脫氫酶(Pines等,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)(Zelle等，2008，見上)可增加蘋果酸產(chǎn)生?；谏锘瘜W(xué)證據(jù)，提出了在黃曲霉菌株ATCC13697中，蘋果酸脫氫!酶活性限制蘋果酸產(chǎn)生(Peleg等,1988,Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。W02011/028643,PCT/US11/38881,PCT/US11/38881,美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/165，696和13/165，719，和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/447，286(其內(nèi)容通過全文提述并入本文)描述了C4二羧酸產(chǎn)生。[0010]在本領(lǐng)域中，作為使用重組DNA技術(shù)的遺傳工程改造的結(jié)果而改善C4-二羧酸產(chǎn)生如蘋果酸產(chǎn)生會(huì)是有益的。本發(fā)明提供了用于改善C4-二羧酸產(chǎn)生(例如蘋果酸產(chǎn)生)的方法等。【
發(fā)明內(nèi)容】[0011]本文中描述了包含碳酸酐酶活性的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生(或能夠產(chǎn)生)增加量的C4-二羧酸(例如蘋果酸)。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞與沒有所述異源核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生(或能夠產(chǎn)生)和/或分泌(或能夠分泌)更大量的C4-二羧酸。在一些方面，所述碳酸酐酶是胞質(zhì)溶膠碳酸酐酶。在一些方面，所述宿主細(xì)胞還包含編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)移酶的異源多核苷酸，編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和/或編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在一些方面，所述宿主細(xì)胞是曲霉屬(Aspergillus)宿主細(xì)胞,如米曲霉(Aspergillusoryzae)宿主細(xì)胞。[0012]亦描述了使用重組宿主細(xì)胞用于產(chǎn)生C4-二羧酸的方法。在一個(gè)方面，為產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋果酸)的方法，其包括:(a)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有碳酸酐酶活性的重組宿主細(xì)胞(例如曲霉屬宿主細(xì)胞)以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。在一些方面，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸。在另一個(gè)方面，為產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋果酸)的方法，其包括:(a)將本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞(例如曲霉屬宿主細(xì)胞)；(b)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的生物以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(c)回收所述C4-二羧酸。在所述方法的一些方面，所述碳酸酐酶是胞質(zhì)溶膠碳酸酐酶。在所述方法的一些方面，所述重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)移酶的異源多核苷酸，C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和/或編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在所述方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞，如米曲霉宿主細(xì)胞?！緦＠綀D】【附圖說(shuō)明】[0013]圖1顯示pShTh60的限制圖譜。[0014]圖2顯示pAmFs69的限制圖譜。[0015]圖3A和3B顯示米曲霉NRRL3488碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(btl)的基因組核苷酸構(gòu)建體序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:1和2)。[0016]圖4A和4B顯示米曲霉NRRL3488碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因組核苷酸構(gòu)建體序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:3和4)。[0017]圖5顯示pSaMF36的限制圖譜。[0018]圖6顯不棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(c4t521)的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:5和6)。[0019]圖7顯示米曲霉NRRL3488蘋果酸脫氫酶基因(mdh3)的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:7和8)。[0020]圖8顯示pSaMF21的限制圖譜。[0021]圖9A和9B—同顯示米曲霉NRRL3488丙酮酸羧化酶基因(pyc)的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:9和10)。[0022]圖10顯示pRYANl的限制圖譜。[0023]圖11顯示pShTh76的限制圖譜。[0024]圖12顯示pSaMF48的限制圖譜。[0025]圖13顯示pSaMF58的限制圖譜。[0026]圖14顯不棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)碳酸酐酶基因(ACLA_007930)的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:54和55)。[0027]圖15顯示pShTh66的限制圖譜。[0028]圖16顯示pShTh77的限制圖譜。[0029]圖17顯示pShThl47的限制圖譜。[0030]定義[0031]碳酸酐酶:術(shù)語(yǔ)“碳酸酐酶”在本文中定義為催化二氧化碳(CO2)和水反應(yīng)生成碳酸氫根(HC03_)的鋅金屬酶(EC4.2.1.1)。碳酸酐酶蛋白的非限定性實(shí)例包括α，β，Y，δ和ε家族。碳酸酐酶活性可通過不含細(xì)胞的提取物如本領(lǐng)域中所述，例如如本領(lǐng)域中在例如Khalifah,1970，J.Biol.Chem.，246:2561-2573中所述進(jìn)行確定。[0032]胞質(zhì)溶膠碳酸酐酶:術(shù)語(yǔ)“胞質(zhì)溶膠碳酸酐酶”意指不含有功能性N端線粒體靶向序列(MTS)的碳酸酐酶。非限定性實(shí)例包括缺乏MTS的碳酸酐酶，或含有經(jīng)修飾但非功能性的MTS(例如通過截短和/或序列改變)的碳酸酐酶。對(duì)于N端MTS序列，其相應(yīng)的切割位點(diǎn)可使用程序MitoProtII一vl.101和TargetPl.1如Elleuche,2009,CurrGenet,55，211-222中所述進(jìn)行預(yù)測(cè)。[0033]碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:術(shù)語(yǔ)“碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”(bicarbonatetranporters)在本文中定義為能夠協(xié)助hco3_跨生物膜(如細(xì)胞膜和/或細(xì)胞器的膜)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，如膜整合蛋白(membraneintegratedprotein)。碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的非限定性類型包括陰離子交換蛋白(anionexchanger,AE)家族的C1-/HC03_交換蛋白，NBC家族的Na7HC03_共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，和Na+-依存性C1_/HC03_交換蛋白。在本文中所述的一些方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是硫酸根-碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠協(xié)助HC03_和S042_陰離子二者跨生物膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。碳酸氫根交換活性可通過不含細(xì)胞的提取物如本領(lǐng)域技術(shù)中所述來(lái)確定，例如如Sterling等，2002，AmJPhysiolCellPhysiol283:C1522-1529中所述確定。[0034]C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:術(shù)語(yǔ)“C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”在本文中定義為可將蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的二羧酸通透酶(Grobler等，1995，Yeastl1:1485-1491;Camarasa等,2001,AppliedandEnvironmentalMicrobiology67:4144-4151)。用于預(yù)測(cè)線粒體輸入的蛋白及其祀向序列的計(jì)算方法由Claros和Vincens,1996，Eur.J.Biochem.241:779-786描述。[0035]蘋果酸脫氫酶:術(shù)語(yǔ)“蘋果酸脫氫酶”在本文中定義為在NADH+H+的存在下催化將草酰乙酸還原為蘋果酸和NAD+的蘋果酸:NAD+氧還酶(EC1.1.1.37)。就本發(fā)明而言，蘋果酸脫氫酶活性可通過不含細(xì)胞的提取物根據(jù)下述步驟確定。測(cè)定溶液由ImM草酰乙酸，IOOmMTrisρΗ8.0,IOmMNaHCO3,5mMMgCl2，和0.1mMNADH(SigmaChemicalC0.，St.Louis,MO,USA)組成。將不含草酰乙酸作為底物的測(cè)定溶液作為對(duì)照運(yùn)行以測(cè)量背景NADH降解率。用雙蒸水制備每種上清的1/100，1/500，1/2500和1/12500的稀釋。將測(cè)定溶液的270μI的等分試樣分配入96孔聚苯乙烯平底板。添加每種稀釋的上清的30μI樣品以起始測(cè)定。使用SPECTRAMAX?340PC讀板器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)以下述設(shè)定監(jiān)測(cè)反應(yīng):340nm,動(dòng)力學(xué)讀取(kineticreading)。使用NADH的濃度系列以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用純化的蘋果酸脫氫酶(SigmaChemicalC0.，St.Louis,MO,USA)的稀釋系列作為陽(yáng)性對(duì)照。一個(gè)單位的蘋果酸脫氫酶活性等于能夠在pH8.0，25°C每分鐘將I微摩爾草酰乙酸和NADH+H+轉(zhuǎn)化為蘋果酸和NAD+的酶量。[0036]丙酮酸羧化酶:術(shù)語(yǔ)“丙酮酸羧化酶”在本文中定義為在ATP和HC03_存在下催化將丙酮酸羧化為草酰乙酸、ADP和磷酸的丙酮酸:二氧化碳連接酶(形成ADP的)(EC6.4.1.1)。就本發(fā)明而言，丙酮酸羧化酶活性可由不含細(xì)胞的提取物根據(jù)針對(duì)丙酮酸羧化酶的SIGMA?質(zhì)量控制測(cè)試方法(SigmaChemicalC0.,St.Louis,MO,USA)的步驟確定，該測(cè)定使用PH8.0的Tris緩沖液替代。一個(gè)單位的丙酮酸羧化酶活性等于能夠在pH7.8，30°C每分鐘將I微摩爾的丙酮酸和CO2轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶量。[0037]異源多核苷酸:術(shù)語(yǔ)“異源多核苷酸”在本文中定義為對(duì)于宿主細(xì)胞并非天然的多核苷酸；其中已對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))結(jié)構(gòu)修飾的天然多核苷酸；作為通過重組DNA技術(shù)(例如，連接于所述多核苷酸的不同的(外來(lái))啟動(dòng)子)操縱DNA的結(jié)果其表達(dá)定量改變的天然多核苷酸；或其表達(dá)通過將一個(gè)或多個(gè)額外拷貝的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞而定量改變的天然多核苷酸。[0038]編碼序列:術(shù)語(yǔ)“編碼序列”的意思是指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重組多核苷酸。[0039]cDNA序列:術(shù)語(yǔ)“cDNA序列”意指從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子在反轉(zhuǎn)錄之后所得的DNA。來(lái)自基因組DNA起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。cDNA序列缺乏可存在于相應(yīng)基因組DNA序列中的插入的內(nèi)含子。相應(yīng)地，短語(yǔ)“SEQIDΝ0:Χ的cDNA序列”意指將SEQIDΝ0:Χ中插入的內(nèi)含子序列(若存在)去除之后所得的序列。在一些情況下一當(dāng)參照的基因組DNA序列缺乏插入的內(nèi)含子序列時(shí)一cDNA序列可與相應(yīng)的基因組DNA序列完全相同。[0040]基因組DNA序列:術(shù)語(yǔ)“基因組DNA序列”意指見于來(lái)源生物的基因組(例如真核或原核基因組)的DNA序列。在一些情況下，來(lái)自真核基因組的基因組DNA序列含有一個(gè)或多個(gè)插入的內(nèi)含子序列，其作為RNA剪接的結(jié)果從初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物去除。相應(yīng)地，短語(yǔ)“SEQIDNO:Y的基因組DNA序列”意指來(lái)自來(lái)源生物的相應(yīng)DNA序列，其含有在RNA剪接之前存在的插入的內(nèi)含子序列(若存在)。[0041]成熟多肽序列:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽序列”意指參照的多核苷酸序列在任何翻譯后序列修飾(如N端加工和/或C端截短)之后的部分。所述成熟多肽編碼序列可基于SignalP程序(Nielsen等，1997,ProteinEngineeringlO:1-6)或InterProScan程序(TheEuropeanBioinformaticsInstitute)預(yù)測(cè)。在一些情況下,所述成熟多肽序列可以與整個(gè)參照的多肽序列完全相同。本領(lǐng)域中已知宿主細(xì)胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽序列(即具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。[0042]片段:術(shù)語(yǔ)“片段”意指從參照的多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))氨基酸的多肽。在一個(gè)方面，所述片段具有碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，或丙酮酸羧化酶活性。在另一個(gè)方面，片段中的氨基酸殘基數(shù)為本文中所述的任何碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，或丙酮酸羧化酶的至少75%，例如至少80%，85%，90%,或95%，例如SEQIDNO:2，4，6，8，10，27，29，32，34，36，39，41，43，45，或55中的氨基酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%,90%,或95%。[0043]亞序列:術(shù)語(yǔ)“亞序列(subsequence)”意指從參照的核苷酸序列的5’和/或3’端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的多核苷酸。在一個(gè)方面，所述亞序列編碼具有碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，或丙酮酸羧化酶活性的片段。在另一個(gè)方面，亞序列中的核苷酸殘基數(shù)為本文中所述的任何編碼碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，或丙酮酸羧化酶的序列中的核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%，例如SEQIDNO:1，3，5，7，9，26，28，30，31，33，35，37，38，40，42，44，或54中的核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。[0044]等位變體(allelicvariant):術(shù)語(yǔ)“等位變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種以上可選形式中的任何種。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。[0045]序列同一性:兩個(gè)氨基酸序列間或兩個(gè)核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)“序列同一性”所描述。[0046]就本文中所述而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度是使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(優(yōu)選為3.0.0版或之后的版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)確定的。所用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用“-nobrief”選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并如下計(jì)算:[0047](相同的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口總數(shù))[0048]就本文中所述而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度是使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,見上)的Needle程序(優(yōu)選為3.0.0版或之后的版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定的。所用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用標(biāo)記為”最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并如下計(jì)算:[0049](相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口總數(shù))。[0050]表達(dá):術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，如測(cè)量mRNA和/或翻譯的多肽的水平來(lái)測(cè)量表達(dá)(例如，以檢測(cè)增加的表達(dá))。[0051]核酸構(gòu)建體:術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))調(diào)控序列的多核苷酸，所述多核苷酸可為單鏈或雙鏈的，并可分離自天然存在的基因，或經(jīng)修飾以本來(lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段,或?yàn)楹铣傻?。[0052]調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”意指對(duì)于多肽表達(dá)必需的核酸序列。調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，以及對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子序列、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。[0053]可操作地連接:術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。[0054]表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并與調(diào)控序列可操作地連接，其中所述調(diào)控序列提供編碼所述多肽的多核苷酸的表達(dá)。最少的情況，所述表達(dá)載體包含啟動(dòng)子序列，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)序列。[0055]宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指任何對(duì)于用包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))本文中所述的多核苷酸(例如編碼碳酸酐酶的多核苷酸)的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感(susceptible)的細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞的后代。[0056]破壞:術(shù)語(yǔ)“破壞”意指在宿主細(xì)胞內(nèi)編碼具有酶活性的多核苷酸的啟動(dòng)子、編碼區(qū)、和/或終止子受部分或完全修飾(例如修飾、缺失、插入、和/或取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的所述酶活性的缺失或減少。酶活性的缺失或減少可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)(例如本文中參照的不含細(xì)胞的提取物測(cè)量)直接測(cè)量，或若存在，通過相應(yīng)的mRNA的缺失或減少(例如至少50%減少，至少60%減少，至少70%減少，至少80%減少，或至少90%減少);相應(yīng)的具有酶活性的多肽的量的缺失或減少(例如至少50%減少，至少60%減少，至少70%減少，至少80%減少，或至少90%減少)；或相應(yīng)的具有酶活性的多肽的比活性的缺失或減少(例如至少50%減少，至少60%減少，至少70%減少，至少80%減少，或至少90%減少)來(lái)測(cè)量。對(duì)特定的感興趣基因的破壞可通過本領(lǐng)域中已知方法，例如通過靶向同源重組(參見MethodsinYeastGenetics(1997edition),Adams,Gottschling,Kaiser,andStems,ColdSpringHarborPress(1998));或通過RNAi或反義技術(shù)來(lái)生成。[0057]體積生產(chǎn)力(volumetricproductivity):術(shù)語(yǔ)“體積生產(chǎn)力”指每單位時(shí)間每體積(例如，培養(yǎng)基及其中內(nèi)含物的總體積)使用的系統(tǒng)所產(chǎn)生的參照的產(chǎn)物的量(例如，產(chǎn)生的C4-二羧酸的量)。[0058]發(fā)酵培養(yǎng)基:術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”指包含一種或多種(例如兩個(gè),幾種)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基能夠部分地通過宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化(發(fā)酵)為所需產(chǎn)物，如C4-二羧酸。在一些情況下，所述發(fā)酵培養(yǎng)基源自天然來(lái)源，如甘蔗，淀粉，或纖維素，并可為通過酶水解(糖化)而預(yù)處理所述來(lái)源的結(jié)果。[0059]在本文中，提及“約”某值或參數(shù)包括了涉及該值或參數(shù)本身的方面。舉例而言，提及“約V,的描述包括了“X”的方面。當(dāng)與測(cè)量值一同使用時(shí)，“約”包括范圍，所述范圍至少涵蓋與測(cè)量特定值的方法相關(guān)的不確定性，并可包括在所指定的值周圍加減兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍。[0060]如用于本文中和所附權(quán)利要求中，除非上下文明確地表示相反，單數(shù)形式“一(個(gè)/種…)(a)”或“所述/該(the)”包括了對(duì)復(fù)數(shù)的提及。應(yīng)理解本文中所述的各方面包括了“由…組成(consisting)”和/或“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”的方面。[0061]除非另行定義或上下文明確指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的相同的含意。[0062]發(fā)明詳述[0063]本文中描述了特定基因在重組宿主細(xì)胞如絲狀真菌(例如曲霉屬)中增加的表達(dá)以增強(qiáng)C4二羧酸(例如蘋果酸)的產(chǎn)生等。在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含用于表達(dá)碳酸酐酶的異源多核苷酸。在一些方面，所述重組宿主細(xì)胞在以高效價(jià)產(chǎn)生C4二羧酸的培養(yǎng)條件下過表達(dá)。所述重組宿主細(xì)胞可進(jìn)一步包含編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和/或編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。[0064]碳酸酐酶和編碼碳酸酐酶的多核苷酸[0065]自本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有碳酸酐酶活性。所述碳酸酐酶可為任何適用于本文中所述宿主細(xì)胞及其使用方法的碳酸酐酶，如天然存在的碳酸酐酶或其保留碳酸酐酶活性的變體。在一個(gè)方面，所述碳酸酐酶存在于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。在一些方面，所述碳酸酐酶是胞質(zhì)溶膠碳酸酐酶，如本文中所定義。在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸。[0066]在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有增加水平的碳酸酐酶活性。在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的碳酸酐酶活性。[0067]在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶與SEQIDNO:55具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:54,(ii)SEQIDNO:54的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDN0:54，或SEQIDNO:54的cDNA序列具有至少65%序列同一性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在一些情況下，編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸可滿足上述標(biāo)示的(a)、(b)和(c)選擇中的多于一種。[0068]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶與SEQIDN0:55具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述碳酸酐酶序列與SEQIDN0:55相差不多于十個(gè)氨基酸,例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或不多于一個(gè)氨基酸。[0069]在一個(gè)方面，所述碳酸酐酶包含或組成為(consistof)SEQIDN0:55的氨基酸序列，或其等位變體，或前述具有碳酸酐酶活性的片段。在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶包含或組成為SEQIDN0:55的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶包含或組成為SEQIDNO:55的氨基酸I至225。[0070]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶具有SEQIDNO:55的一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。氨基酸取代意指對(duì)應(yīng)于參照序列的某位置的氨基酸是不同的；氨基酸缺失意指對(duì)應(yīng)于參照序列的某位置的氨基酸不存在；和氨基酸插入意指不存在于參照序列的對(duì)應(yīng)位置的氨基酸的存在。在這些方面的一些中，SEQIDN0:55的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于9,8，7，6，5，4，3，2，或I。[0071]氨基酸改變的性質(zhì)一般是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。[0072]保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi):堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。[0073]或者，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì):使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改善碳酸酐酶的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。[0074]能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989，Science244:1081-1085)來(lái)鑒定碳酸酐酶中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的碳酸酐酶活性以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。碳酸酐酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過以下這些技術(shù):如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)確定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與其它碳酸酐酶的同一性分析來(lái)推斷，所述多肽與參照的碳酸酐酶相關(guān)。[0075]能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffIing)方法接著進(jìn)行有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156；W095/17413;或W095/22625公開的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、卩遼菌體展不(例如，Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837;美國(guó)專利N0.5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。[0076]誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnologyl7:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性碳酸酐酶的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。[0077]在一個(gè)方面，所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:54,(ii)SEQIDNO:54的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。在一個(gè)方面，所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:54或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。在另一個(gè)方面所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:54的cDNA序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。[0078]在一個(gè)方面，所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸與SEQIDNO:54或SEQIDNO:54的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一'丨生。在一個(gè)方面,所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸與SEQIDN0:54具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一個(gè)方面，所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸與SEQIDN0:54的cDNA序列具有至少65%,例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。[0079]在一個(gè)方面，所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸包含SEQIDNO:54。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:54的核苷酸I至750。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:54的亞序列，其中所述亞序列編碼具有碳酸酐酶活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列中的核苷酸殘基數(shù)是SEQIDNO:54中核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%，90%，或95%。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼SEQIDNO:55的片段，其中所述片段具有碳酸酐酶活性。在一個(gè)方面，所述片段中的氨基酸殘基數(shù)是SEQIDNO:55中氨基酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%,90%,或95%。[0080]所述碳酸酐酶可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于所述碳酸酐酶的N端或C端?？赏ㄟ^將編碼另一個(gè)多肽的多核苷酸融合于編碼碳酸酐酶的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術(shù)構(gòu)建,其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993,EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。[0081]融合多肽還可以包含在兩個(gè)多肽之間的切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，釋放所述兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，公開于Martin等，2003，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-WiIson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnologyl3:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381;Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等，1995,Biotechnologyl3:982-987;Carter等，1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點(diǎn)。[0082]用于分離或克隆編碼用于本文中提及的任何方面的多核苷酸一例如編碼碳酸酐酶的多核苷酸一以及其它多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮那箤?Aspergillus)菌株，或其他或相關(guān)生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可為例如核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種間變體(speciesvariant)。[0083]SEQIDNO:54的多核苷酸，或亞序列，以及SEQIDNO:55的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆碳酸酐酶。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，例如長(zhǎng)度上為至少14個(gè)核苷酸，至少25個(gè)核苷酸，至少35個(gè)核苷酸，或至少70個(gè)核苷酸。所述核酸探針可以更長(zhǎng)，例如至少100個(gè)核苷酸，至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，或至少500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，可使用甚至更長(zhǎng)的探針，如至少600個(gè)核苷酸，例如至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸，或至少900個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以供檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。[0084]可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有碳酸酐酶活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它株的基因組或其它DNA。可以將來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDN0:54的成熟多肽編碼序列，或它們的亞序列同源的克隆或DNA，所述載體材料可用于Sounthern印跡。[0085]就上述探針而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:54，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或前述序列的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。[0086]在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:54。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:55的多肽或其片段的多核苷酸。[0087]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在45。。(非常低嚴(yán)格性)，在50°C(低嚴(yán)格性)，在55°C(中嚴(yán)格性)，在60°C(中-高嚴(yán)格性)，在65°C(高嚴(yán)格性)，和在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0088]對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA48:1390)計(jì)算的T111低大約5°C至大約10。。，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5%NP_40，IXDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM憐酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算的Tm低5°C至I(TC的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。[0089]編碼本文中所述的碳酸酐酶的多核苷酸可以獲得自任何屬的微生物。如用于本文，與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，意思應(yīng)為由多核苷酸編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的多核苷酸的細(xì)胞產(chǎn)生。[0090]所述碳酸酐酶可以是細(xì)菌碳酸酐酶。例如，所述碳酸酐酶可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)碳酸酐酶；或革蘭氏陰性細(xì)菌碳酸酐酶,如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)碳酸酐酶。[0091]在一個(gè)方面，所述碳酸酐酶是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)碳酸酐酶。[0092]在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)碳酸酐酶。在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)碳酸酐酶。[0093]所述碳酸酐酶可為真菌碳酸酐酶。在一個(gè)方面，所述真菌碳酸酐酶為酵母碳酸酐酶，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)碳酸酐酶。[0094]在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶是絲狀真菌碳酸酐酶，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二抱屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)^If菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)碳酸酐酶。[0095]在另一個(gè)方面，所述碳酸圈1酶是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)碳酸酐酶。[0096]在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、黃曲霉、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Asperigullusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、醬油曲霉(Aspergillussojae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫(kù)威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白把齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimet1、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)碳酸酐酶。[0097]在一個(gè)方面，所述碳酸酐酶是曲霉屬碳酸酐酶，如SEQIDN0:55的棒曲霉碳酸酐酶。[0098]可理解的是對(duì)于前述的種，涵蓋了完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無(wú)性型(anamorph)，而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識(shí)別適合的等同物的身份。[0099]這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。[0100]在一些方面，在相同條件下，所述碳酸酐酶具有SEQIDN0:55的成熟多肽的碳酸酐酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。[0101]亦可使用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述碳酸酐酶。用于從天然生境(habitat)分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。然后可通過相似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品來(lái)獲得編碼碳酸酐酶的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合適探針檢測(cè)到編碼碳酸酐酶的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)將所述序列分離或克隆(參見，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)0[0102]碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸[0103]自本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可為任何適用于本文中所述宿主細(xì)胞及其使用方法的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如天然存在的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其保留碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的變體。在一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。[0104]在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有增加水平的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。[0105]在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDN0:2或4具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:1或3，(ii)SEQIDN0:1或3的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:1或3，或SEQIDN0:1或3的cDNA序列具有至少65%序列同一性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在一些情況下，編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可滿足上述標(biāo)示的(a)、(b)和(c)選擇中的多于一種。[0106]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:2或4具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列與SEQIDN0:2或4相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或不多于一個(gè)氨基酸。[0107]在一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為(consistof)SEQIDN0:2或4的氨基酸序列，或其等位變體，或前述具有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段。在另一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:2或4的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸I至770或SEQIDNO:4的氨基酸I至843。[0108]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有如上所述的SEQIDN0:2或4的一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些方面中，SEQIDN0:2或4的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于9，8，7，6，5，4，3，2，或1。[0109]在一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:1或3，(ii)SEQIDN0:1或3的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,見上文)。在一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與SEQIDN0:1或3或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。在一個(gè)方面所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與SEQIDN0:1或3的cDNA序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。[0110]在一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸與SEQIDN0:1或3或SEQIDNO:1或3的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸與SEQIDNO:1或3具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在另一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸與SEQIDNO:1或3的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%,至少98%，至少99%，或100%序列同一性。[0111]在一個(gè)方面，所述編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸包含SEQIDNO:1或3。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸I至2503，或SEQIDNO:3的核苷酸I至2657。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:1或3的亞序列，其中所述亞序列編碼具有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列中的核苷酸殘基數(shù)是SEQIDNO:1或3中核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%，90%,或95%。[0112]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼SEQIDN0:2或4的片段，其中所述片段具有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一個(gè)方面，所述片段中的氨基酸殘基數(shù)是SEQIDN0:2或4中氨基酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%，90%,或95%。在一個(gè)方面，所述片段含有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域，例如SEQIDNO:2的氨基酸280至556或SEQIDNO:4的192至480的推定的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域。[0113]所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亦可為碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的等位變體或人工變體。[0114]所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亦可含有融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。[0115]用于分離或克隆編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸的技術(shù)如上文所述。[0116]SEQIDNO:1，3的多核苷酸，或亞序列，以及SEQIDNO:2，4的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以如上文所述根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?？扇缟衔乃鰪挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽的DNA。[0117]在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:1或3。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2或4或其片段的多核苷酸序列。[0118]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。[0119]編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸可以獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是從本文中所述的微生物獲得的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是曲霉屬碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如SEQIDN0:2或4的米曲霉碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。[0120]其它可用于本文中所述的宿主細(xì)胞和使用方法的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括但不限于智人(H.sapiens)SLC4A1碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(W02010/111344的SEQIDN0:53，其中所述序列通過提述并入本文)，穴兔(0.cuniculus)SLC4A8碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(W02010/111344的SEQIDNO:54，其中所述序列通過提述并入本文)，和釀酒酵母(S.cerevisiae)YNL275w碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白W02010/111344的SEQIDNO:55，其中所述序列通過提述并入本文)。本文中所述的任何涉及其序列同一性、雜交、氨基酸修飾(例如取代、缺失和/或插入)、片段或亞序列的方面適用于上述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。[0121]在一些方面，在相同條件下，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有SEQIDNO:2或4的成熟多肽的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%,至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。[0122]亦可如上文所述從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。[0123]C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸[0124]自本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可為任何適用于本文中所述宿主細(xì)胞及其使用方法的C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如天然存在的C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其保留C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的變體。在一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。[0125]在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有增加水平的C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。[0126]在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:6具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:5，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:5具有至少65%序列同一'丨生。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解,在一些情況下,編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸可滿足上述標(biāo)示的(a)、(b)和(c)選擇中的多于一種。[0127]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:6具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。在一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列與SEQIDN0:6相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或不多于一個(gè)氨基酸。[0128]在一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為(consistof)SEQIDN0:6的氨基酸序列，或其等位變體，或前述具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的片段。在另一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:6的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:6的氨基酸I至418。在另一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含或組成為SEQIDN0:6的氨基酸18至418。[0129]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有如上所述的SEQIDN0:6的一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些方面中，SEQIDN0:6的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于9，8，7，6，5，4，3，2，或I。[0130]在一個(gè)方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:SEQIDNO:5,或前述的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,見上文)。[0131]在一個(gè)方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸與SEQIDNO:5具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性。[0132]在一個(gè)方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸包含SEQIDNO:5。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:5的核苷酸I至1257。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:5的核苷酸52至1257。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDN0:5的亞序列，其中所述亞序列編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列中的核苷酸殘基數(shù)是SEQIDNO:5中核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%,90%,或95%。[0133]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼SEQIDNO:6的片段，其中所述片段具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在一個(gè)方面，所述片段中的氨基酸殘基數(shù)是SEQIDN0:6中氨基酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%,90%,或95%。[0134]所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亦可為C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的等位變體或人工變體。[0135]所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亦可含有融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。[0136]用于分離或克隆編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸的技術(shù)如上文所述。[0137]SEQIDNO:5的多核苷酸，或亞序列，以及SEQIDNO:6的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以如上文所述根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?？扇缟衔乃鰪挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的多肽的DNA。[0138]在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:5。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:6或其片段的多核苷酸序列。[0139]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。[0140]編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸可以獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是從本文中所述的微生物獲得的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個(gè)方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是曲霉屬C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如SEQIDNO:6的棘孢曲霉C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。[0141]其它可與本發(fā)明中所述的宿主細(xì)胞和使用方法使用的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括但不限于，黃曲霉(Aspergillusflavus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AFLA_107340),SEQIDN0:27的米曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDNO:26的多核苷酸序列編碼；參見US2011/0053233),SEQIDNO:29的土曲霉(Aspergillusterreus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDN0:28的多核苷酸序列編碼，參見US2011/0053233)，SEQIDN0:32的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)O1-二竣酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDN0:30或31的多核昔酸序列編碼，參見US2011/0053233)，SEQIDN0:34的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDN0:33的多核苷酸序列編碼，參見2011年6月21日提交的，標(biāo)題為“PolypeptidesHavingC4_dicarboxylicacidTransporterActivityandPolynucleotidesEncodingSame”的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/165，696),SEQIDN0:36的棘抱曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDN0:35的多核苷酸序列編碼，參見美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/165，696，見上文)，SEQIDNO:39的日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicus)C4_二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDN0:37或38的多核苷酸序列編碼，參見2011年6月2日提交的，標(biāo)題為“C4_dicarboxylicacidProductioninFilamentousFungi，，的PCT/US11/38881),SEQIDN0:41的棒曲霉(Aspergillusclavatus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDNO:40的多核苷酸序列編碼；參見2011年6月21提交的，標(biāo)題為“MethodsforImprovingC4-dicarboxylicacidProductioninFilamentousFungi，，的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/165，719),SEQIDN0:43的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由SEQIDNO:42的多核苷酸編碼，參見美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/165，719，見上文)，或任何相應(yīng)的參考文獻(xiàn)中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的任何方面。本文中所述的任何涉及其序列同一性，雜交，氨基酸修飾(例如取代、缺失和/或插入)，片段，或亞序列的方面也涵蓋上述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。[0142]在一些方面，在相同條件下，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有SEQIDN0:6的成熟多肽的C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%,至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。[0143]亦可如上文所述從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。[0144]蘋果酸脫氫酶和編碼蘋果酸脫氫酶的多核苷酸[0145]自本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有蘋果酸脫氫酶活性。所述蘋果酸脫氫酶可為任何適用于本文中所述宿主細(xì)胞及其使用方法的蘋果酸脫氫酶，如天然存在的蘋果酸脫氫酶或其保留蘋果酸脫氫酶活性的變體。在一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶存在于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。[0146]在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有增加水平的蘋果酸脫氫酶活性。在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的蘋果酸脫氫酶活性。[0147]在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼蘋果酸脫氫酶，所述蘋果酸脫氫酶與SEQIDN0:8具有至少65%序列同一'丨生；(b)多核苷酸,其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:7，(ii)SEQIDNO:7的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:7或SEQIDNO:7的cDNA序列具有至少65%序列同一性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在一些情況下，編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸可滿足上述標(biāo)不的(a)、(b)和(C)選擇中的多于一種。[0148]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼蘋果酸脫氫酶，所述蘋果酸脫氫酶與SEQIDNO:8具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%,至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一'I"生。在一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶序列與SEQIDN0:8相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或不多于一個(gè)氨基酸。[0149]在一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶包含或組成為(consistof)SEQIDNO:8的氨基酸序列，或其等位變體，或前述具有蘋果酸脫氫酶活性的片段。在另一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶包含或組成為SEQIDN0:8的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶包含或組成為SEQIDNO:8的氨基酸I至330。[0150]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼蘋果酸脫氫酶，所述蘋果酸脫氫酶具有如上所述的SEQIDNO:8的一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些方面中，SEQIDN0:8的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于9，8，7，6，5，4，3，2，或I。[0151]在一個(gè)方面，所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:7，(ii)SEQIDNO:7的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,見上文)。在一個(gè)方面，所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:SEQIDN0:7，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。在另一個(gè)方面，所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交=SEQIDN0:7的cDNA序列，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[0152]在一個(gè)方面，所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸與SEQIDN0:7或SEQIDNO:7的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一'丨生。在一個(gè)方面,所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸與SEQIDNO:7具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一'丨生。在一個(gè)方面,所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸與SEQIDN0:7的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一1丨生。[0153]在一個(gè)方面，所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸包含SEQIDNO:7。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:7的核苷酸I至1430。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:7的亞序列，其中所述亞序列編碼具有蘋果酸脫氫酶活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列中的核苷酸殘基數(shù)是SEQIDNO:7中核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%,85%,90%,或95%。[0154]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼SEQIDNO:8的片段，其中所述片段具有蘋果酸脫氫酶活性。在一個(gè)方面，所述片段中的氨基酸殘基數(shù)是SEQIDN0:8中氨基酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%,90%,或95%。[0155]所述蘋果酸脫氫酶亦可為蘋果酸脫氫酶的等位變體或人工變體。[0156]所述蘋果酸脫氫酶亦可含有融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。[0157]用于分離或克隆編碼蘋果酸脫氫酶的多核苷酸的技術(shù)如上文所述。[0158]SEQIDNO:7的多核苷酸，或亞序列，以及SEQIDNO:8的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以如上文所述根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆蘋果酸脫氫酶?？扇缟衔乃鰪挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有蘋果酸脫氫酶活性的多肽的DNA。[0159]在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:7。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:8或其片段的多核苷酸序列。[0160]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。[0161]編碼蘋果酸脫氫酶的多核苷酸可以獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶可以是從本文中所述的微生物獲得的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌蘋果酸脫氫酶。在另一個(gè)方面，所述蘋果酸脫氫酶是曲霉屬蘋果酸脫氫酶，如SEQIDN0:8的米曲霉蘋果酸脫氫酶。[0162]其它可用于本申請(qǐng)所述用途的宿主細(xì)胞和方法的蘋果酸脫氫酶包括但不限于:構(gòu)巢曲霉蘋果酸脫氫酶(AN6717.1；SIMS等,2004,Mycol.Res.108:853-857)；黑曲霉蘋果酸脫氫酶(Anl6g00120；Pel等，2007，NatureBiotechnology25:221-231)；Phytophthorainfestans蘋果酸脫氫酶(PITG13614.1；Calcagno等，2009,MycologicalResearchll3:771-781);釀酒酵母蘋果酸脫氫酶(YKL085W;McAlister_Henn和Thompson,1987,JBacteriol.169:5157-5166);埃默森踝節(jié)菌蘋果酸脫氫酶(AF439996,AF487682；Maloney等，2004，Eur.J.Biochem.271:3115-3126)；以及玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)蘋果酸脫氫酶(um00403,umlll61；McCann和Snetselaar,2008,FungalGeneticsandBiology45:S77-S87),SEQIDN0:45的米曲霉蘋果酸脫氫酶(其由SEQIDNO:44的核苷酸序列所編碼；參見美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?2/870，523，標(biāo)題為“MethodsforImprovingMalicAcidProductioninFilamentousFungi”,2010年8月27日提交)，或任何相應(yīng)的參考文獻(xiàn)中所述的蘋果酸脫氫酶的任何方面。本文中所述的任何涉及其序列同一性，雜交，氨基酸修飾(例如取代、缺失和/或插入)，片段，或亞序列的方面也涵蓋上述的蘋果酸脫氫酶。[0163]在一些方面，在相同條件下，所述蘋果酸脫氫酶具有SEQIDN0:8的成熟多肽的蘋果酸脫氫酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。[0164]亦可如上文所述從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述蘋果酸脫氫酶。[0165]丙酮酸羧化酶和編碼丙酮酸羧化酶的多核苷酸[0166]自本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的一些方面，所述宿主細(xì)胞具有丙酮酸羧化酶活性。所述丙酮酸羧化酶可為任何適用于本文中所述宿主細(xì)胞及其使用方法的丙酮酸羧化酶，如天然存在的丙酮酸羧化酶或其保留丙酮酸羧化酶活性的變體。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶存在于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。[0167]在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有增加水平的丙酮酸羧化酶活性。在一些方面，包含所述一個(gè)或多個(gè)編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞與不具有所述一個(gè)或多個(gè)編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，具有至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的丙酮酸羧化酶活性。[0168]在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼丙酮酸羧化酶，所述丙酮酸羧化酶與SEQIDNO:10具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDN0:9,(ii)SEQIDNO:9的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDN0:9或SEQIDNO:9的cDNA序列具有至少65%序列同一性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在一些情況下，編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸可滿足上述標(biāo)示的(a)、(b)和(c)選擇中的多于一種。[0169]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼丙酮酸羧化酶，所述丙酮酸羧化酶與SEQIDNO:10具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%,至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一'I"生。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶序列與SEQIDNO:10相差不多于十個(gè)氨基酸，例如不多于五個(gè)氨基酸，不多于四個(gè)氨基酸，不多于三個(gè)氨基酸，不多于兩個(gè)氨基酸，或不多于一個(gè)氨基酸。[0170]在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為(consistof)SEQIDN0:10的氨基酸序列，或其等位變體，或前述具有丙酮酸羧化酶活性的片段。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶包含或組成為SEQIDNO:10的氨基酸I至1193。[0171]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼丙酮酸羧化酶，所述丙酮酸羧化酶具有如上所述的SEQIDNO:10的一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些方面中，SEQIDNO:10的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于9，8，7，6，5，4，3，2，或I。[0172]在一個(gè)方面，所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDN0:9,(ii)SEQIDN0:9的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(參見，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,見上文)。在一個(gè)方面，所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:SEQIDN0:9，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。在一個(gè)方面，所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下，例如中等嚴(yán)格條件、中等-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交=SEQIDN0:9的cDNA序列，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[0173]在一個(gè)方面，所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸與SEQIDN0:9或SEQIDNO:9的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%,或100%序列同一'丨生。在一個(gè)方面,所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸與SEQIDNO:9具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一'丨生。在一個(gè)方面,所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸與SEQIDN0:9的cDNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一1丨生。[0174]在一個(gè)方面，所述編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸包含SEQIDNO:9。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDN0:9的核苷酸I至3643。在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸包含SEQIDN0:9的亞序列，其中所述亞序列編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽。在一個(gè)方面，所述亞序列中的核苷酸殘基數(shù)是SEQIDN0:9中核苷酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%,85%,90%,或95%。[0175]在一個(gè)方面，所述異源多核苷酸編碼SEQIDNO:10的片段，其中所述片段具有丙酮酸羧化酶活性。在一個(gè)方面，所述片段中的氨基酸殘基數(shù)是SEQIDN0:10中氨基酸殘基數(shù)的至少75%，例如至少80%，85%,90%,或95%。[0176]所述丙酮酸羧化酶亦可為丙酮酸羧化酶的等位變體或人工變體。[0177]所述丙酮酸羧化酶亦可含有融合的多肽或可切割的融合多肽，如上文所述。[0178]用于分離或克隆編碼丙酮酸羧化酶的多核苷酸的技術(shù)如上文所述。[0179]SEQIDN0:9的多核苷酸，或亞序列，以及SEQIDNO:10的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以如上文所述根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆丙酮酸羧化酶?？扇缟衔乃鰪挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針雜交并且編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的DNA。[0180]在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDN0:9。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:10或其片段的多核苷酸序列。[0181]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格和洗滌條件如上文定義。[0182]編碼丙酮酸羧化酶的多核苷酸可以獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶可以是從本文中所述的微生物獲得的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌丙酮酸羧化酶。在另一個(gè)方面，所述丙酮酸羧化酶是曲霉屬丙酮酸羧化酶，如SEQIDN0:10的米曲霉丙酮酸羧化酶。[0183]其它可用于本申請(qǐng)所述用途的宿主細(xì)胞和方法的丙酮酸羧化酶包括但不限于:棒曲霉(Aspergillusclavatus)NRRLl丙酮酸羧化酶(XP_001271664;DirectSubmission,Submitted(26-0CT-2006)，TheInstituteforGenomicResearch,9712MedicalCenterDrive,Rockville,MD20850,USA);煙曲霉Af293丙酮酸羧化酶(XP_752054;Nierman等，2005，Nature438:1151-1156);構(gòu)巢曲霉FGSCA4丙酮酸羧化酶(XP_662066;Galagan等，2005，Nature438:1105-1115);黑曲霉丙酮酸羧化酶(Anl5g02820;Pel等，2007，NatureBiotechnology25:221-231;ASPNG5061;Panneman等，(JUL-1998)提交至EMBL/GenBank/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù))；土曲霉丙酮酸羧化酶(093918;DirectSubmission,Submitted(OCT-1998)TheInstituteforGenomicResearch,9712MedicalCenterDrive,Rockville,MD20850,USA);Magnaporthegrisea70_15丙酮酸羧化酶(XP_367852;DirectSubmission,Submitted(26-SEP-2005)BroadInstituteofMITandHarvard,320CharlesStreet,Cambridge,MA02142,USA)；粗糖脈抱菌0R74A丙酮酸羧化酶(XP_965636;Galagan等，2003，Nature422:859-868);米根霉(Rhizopusoryzae)丙酮酸羧化酶(R03G_06931.1);釀酒酵母丙酮酸羧化酶(NP_009777;Gaffeau等，1996，Science274:546-547);粟酒裂殖酵母丙酮酸羧化酶(NP_595900;DirectSubmission,Submitted(29-JUN-2007)EuropeanSchizosaccharomycesgenomesequencingproject,SangerInstitute,TheWellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SA);和玉蜀黍黑粉菌丙酮酸羧化酶(um01054;McCann和Snetselaar,2008，F(xiàn)ungalGeneticsandBiology45:S77-S87)。本文中所述的任何涉及其序列同一'I"生，雜交，氨基酸修飾(例如取代、缺失和/或插入)，片段，或亞序列的方面也涵蓋上述的蘋果酸脫氫酶/丙酮酸羧化酶。[0184]在一些方面，在相同條件下，所述丙酮酸羧化酶具有SEQIDNO:10的成熟多肽的丙酮酸羧化酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%。[0185]亦可如上文所述從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水、青貯飼料等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述丙酮酸羧化酶。[0186]表達(dá)載體和核酸構(gòu)建體[0187]所述重組宿主細(xì)胞和方法使用表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列連接，所述調(diào)控序列指導(dǎo)在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下表達(dá)。此類表達(dá)載體可用于本文中所述的任何宿主細(xì)胞和方法。本文中所述的多核苷酸可以通過多種方式加以操縱，來(lái)為所需多肽的表達(dá)提供條件。取決于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。[0188]多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸?；蛘?，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)所述多核苷酸。在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。[0189]重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。[0190]在一個(gè)方面，每個(gè)編碼本文中所述的碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸包含于獨(dú)立的載體上。在一個(gè)方面，至少兩個(gè)所述多核苷酸包含于一個(gè)載體上。在一個(gè)方面，至少三個(gè)所述多核苷酸包含于一個(gè)載體上。在一個(gè)方面，至少四個(gè)所述多核苷酸包含于一個(gè)載體上。在一個(gè)方面，所有編碼碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸包含于一個(gè)載體上。[0191]載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外,可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。[0192]所述表達(dá)載體可含有任何合適的啟動(dòng)子序列，其被用于表達(dá)本文中所述的任何多肽(例如碳酸酐酶，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，蘋果酸脫氫酶，或丙酮酸羧化酶)的多核苷酸的宿主細(xì)胞所識(shí)別。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。[0193]本文中所述的每個(gè)多核苷酸都可以可操作地連接于對(duì)于所述多核苷酸而言是外來(lái)的啟動(dòng)子。例如，在一個(gè)方面，所述碳酸酐酶或其亞基的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)于所述多核苷酸而言是外來(lái)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)方面，編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其亞基的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)于所述多核苷酸而言是外來(lái)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)方面，編碼C4-二羧酸的異源多核苷酸或其亞基可操作地連接于對(duì)于所述多核苷酸而言是外來(lái)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)方面，編碼蘋果酸脫氫酶或其亞基的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)于所述多核苷酸而言是外來(lái)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)方面，編碼丙酮酸羧化酶或其亞基的異源多核苷酸可操作地連接于對(duì)于所述多核苷酸而言是外來(lái)的啟動(dòng)子。[0194]用于指導(dǎo)核酸構(gòu)建體在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子:解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖鹿糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子(Egon等，1988，Gene69:301-315)、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核β_內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)。另外的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria〃于Gilbert等，1980，ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上文描述。[0195]用于指導(dǎo)核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子:構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β_葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列已由曲霉屬(Aspergilli)中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列已由構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。[0196]在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。[0197]調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接?？梢允褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子。[0198]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。[0199]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。[0200]調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)其為對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。[0201]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。[0202]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。[0203]調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。[0204]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。[0205]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。[0206]調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號(hào)肽，并且指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列外源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的?；蛘?，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。[0207]對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列:芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。[0208]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。[0209]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。[0210]調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子的基因獲得前肽編碼序列。[0211]當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的N端。[0212]同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。[0213]載體可含有一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。[0214]細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0215]載體可含有一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制的元件。[0216]為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列、[0217]或任何其它載體元件，來(lái)通過同源或非同源重組整合入基因組?；蛘?，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10，000個(gè)堿基對(duì)，400至10，000個(gè)堿基對(duì)，800至10，000個(gè)堿基對(duì)，以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何，其宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。[0218]為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中發(fā)揮功能，介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator)。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體發(fā)生體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。[0219]細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例有:允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點(diǎn)。[0220]用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例有2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1，ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。[0221]在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例有AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。AMAl基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)公開于W000/24883中的方法完成。[0222]可以將多于一個(gè)拷貝的本文中所述的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法實(shí)現(xiàn):使至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或使多核苷酸包含可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選出含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此選出含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。[0223]用于連接上述元件以構(gòu)建本文中所述的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見,例如，Sambrook等，1989，見上文)。[0224]宿主細(xì)胞[0225]重組宿主細(xì)胞可包含本文中所述的一種或幾種(例如兩種，幾種)多核苷酸，所述多核苷酸可以可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)一種或多種所述的多肽的表達(dá)，用于重組產(chǎn)生C4-二羧酸。所述宿主細(xì)胞可包含本文中所述的任何編碼碳酸酐酶的多核苷酸，并任選地包含本文中所述多種其他多核苷酸之任一或組合。舉例而言，在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，并任選地包含本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多肽，編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和/或編碼丙酮酸脫羧酶的異源多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)；其中所述宿主細(xì)胞與不含有所述異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生(或能夠產(chǎn)生)更多量的C4-二羧酸。[0226]在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。[0227]在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。[0228]在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。[0229]在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))本文中所述的編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)本文中所述的編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。[0230]在這些方面中的一些，所述重組宿主細(xì)胞缺乏內(nèi)源碳酸酐酶，缺乏內(nèi)源碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，缺乏內(nèi)源C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，缺乏內(nèi)源蘋果酸脫氫酶，和/或缺乏內(nèi)源丙酮酸羧化酶。[0231]在一個(gè)方面，所述重組宿主細(xì)胞包含:[0232](I)編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶與SEQIDNO:55具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:54,(ii)SEQIDNO:54的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDN0:54，或SEQIDN0:54的cDNA序列具有至少65%序列同一性；[0233]和任選地包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))選自下組的異源多核苷酸:[0234](2)編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDN0:2或4具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:1或3，(ii)SEQIDN0:1或3的cDNA序列，或或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:1或3，或SEQIDNO:1或3的cDNA序列具有至少65%序列同一性；[0235](3)編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與SEQIDNO:6具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:SEQIDNO:5，或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:5具有至少65%序列同一性；[0236](4)編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼蘋果酸脫氫酶，所述蘋果酸脫氫酶與SEQIDNO:8具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDN0:7,(ii)SEQIDN0:7的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:7，或SEQIDNO:7的cDNA序列具有至少65%序列同一丨丨生；和[0237](5)編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸，其中所述多核苷酸選自:(a)多核苷酸，其編碼丙酮酸羧化酶，所述丙酮酸羧化酶與SEQIDNO:10具有至少65%序列同一性；(b)多核苷酸，其在低嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDN0:9,(ii)SEQIDN0:9的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)多核苷酸，其與SEQIDNO:9，或SEQIDNO:9的cDNA序列具有至少65%序列同一1丨生；[0238]其中所述宿主細(xì)胞與沒有編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生(或能夠產(chǎn)生)更多量的C4二羧酸。[0239]如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在一些情況下，上述標(biāo)示的編碼多肽的異源多核苷酸可滿足相應(yīng)的(a)、(b)和(C)選擇中的多于一種。[0240]將包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))多核苷酸的構(gòu)建體或載體(或多個(gè)構(gòu)建體或載體)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使所述構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋任何親本細(xì)胞的后代，其由于在復(fù)制中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同。在一些情況下，宿主細(xì)胞的選擇會(huì)很依賴于編碼多肽的基因及其來(lái)源。下文中所述的方面適用于宿主細(xì)胞本身，以及使用宿主細(xì)胞的方法。[0241]所述宿主細(xì)胞可為任何能夠重組產(chǎn)生本文中所述的多肽的細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，和/或任何能夠重組產(chǎn)生C4-二羧酸的細(xì)胞。[0242]原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和脲原體屬。[0243]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。[0244]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。[0245]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。[0246]可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞:例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞:例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞:例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見,例如,Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585),或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞:例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391_397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞:例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見,例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tmmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。[0247]宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。[0248]所述宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T:子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁(yè)中所引用)和所有有絲分裂抱子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見上)。[0249]所述真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，就本文中所述而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9,1980)中所述。[0250]所述酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、西洋蓍霉屬或伊薩酵母屬(Issatchenkia)細(xì)胞，如Candidasonorensis,Candidamethanosorbosa,Candidaethanolica,乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus),發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans),Pichiagaleiformis,膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens),Pichiadeserticola,卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomycesbulder1、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)或東方伊薩酵母細(xì)胞。[0251]所述真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文,所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵性的。[0252]所述絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、FiIibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。[0253]所述絲狀真菌宿主細(xì)胞可為棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa>Ceriporiopsissubrufa、蟲擬臘菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium>|lf>Chrysosporiumqueenslandicum>熱帶金孢子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺療側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。[0254]在一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。在另一個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞是米曲霉。[0255]可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.1.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,J.Bacteriol.153:163JPHinnen等，1978,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920。[0256]在一些方面，所述宿主細(xì)胞包含一種或多種(例如兩種，幾種)本文中所述的多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞與沒有所述一種或多種多核苷酸的宿主細(xì)胞相比在相同條件下培養(yǎng)時(shí)分泌(或能夠分泌)增加水平的C4-二羧酸。在一些方面，所述宿主細(xì)胞與沒有所述一種或多種多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，分泌(或能夠分泌)的C4-二羧酸(例如蘋果酸)增加至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或500%水平。合適的培養(yǎng)條件的實(shí)例如下所述，并對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文中的教導(dǎo)會(huì)是顯而易見的。[0257]在本文中所述的重組宿主細(xì)胞和方法的任何方面中，所述C4-二羧酸可為蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸或延胡索酸，或其組合。在一些方面中，所述C4-二羧酸是蘋果酸、琥珀酸或延胡索酸，或其組合。在一些方面中，所述C4-二羧酸是蘋果酸或延胡索酸，或蘋果酸和延胡索酸的組合。在一些方面中，所述C4-二羧酸是蘋果酸。[0258]在任何這些方面，所述宿主細(xì)胞以高于理論值至少10%，例如至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%或至少90%的產(chǎn)率產(chǎn)生(和/或能夠產(chǎn)生)C4-二羧酸。[0259]在任何這些方面，所述重組宿主具有大于約0.lg/L每小時(shí)，例如，大于約0.2g/L每小時(shí),0.5g/L每小時(shí),0.6g/L每小時(shí),0.7g/L每小時(shí),0.8g/L每小時(shí),0.9g/L每小時(shí)，1.0g/L每小時(shí)，1.lg/L每小時(shí)，1.2g/L每小時(shí)，1.3g/L每小時(shí)，1.5g/L每小時(shí)，1.75g/L每小時(shí)，2.0g/L每小時(shí)，2.25g/L每小時(shí)，2.5g/L每小時(shí)，或3.0g/L每小時(shí)；或約0.lg/L每小時(shí)至約2.0g/L每小時(shí)，例如，約0.3g/L每小時(shí)至約1.7g/L每小時(shí)，約0.5g/L每小時(shí)至約1.5g/L每小時(shí)，約0.7g/L每小時(shí)至約1.3g/L每小時(shí)，約0.8g/L每小時(shí)至約1.2g/L每小時(shí)，或約0.9g/L每小時(shí)至約1.lg/L每小時(shí)的C4-二羧酸體積生產(chǎn)力(volumetricproductivity)。[0260]可將所述重組宿主細(xì)胞在適于產(chǎn)生碳酸酐酶、碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域中公知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中在允許表達(dá)和/或分離合意的多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。如本文中所述使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)，或可從商業(yè)上可獲得的成分制備。[0261]所述碳酸酐酶、碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶，及其活性，可使用本領(lǐng)域中公知的方法檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可包括使用特異性抗體，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。參見，例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999)；及Hanai等,Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007))。[0262]方法[0263]本文中所述的重組宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生C4_二羧酸。在一個(gè)方面，為產(chǎn)生C4-二羧酸(例如蘋果酸)的方法，其包括:(a)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任一種本文中所述的重組宿主細(xì)胞(例如任何具有碳酸酐酶活性，和任選地，碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，蘋果酸脫氫酶活性，和/或丙酮酸羧化酶活性的宿主細(xì)胞)以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。在一個(gè)方面，為產(chǎn)生C4-二羧酸的方法，其包括:(a)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任一種本文中所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)(例如兩個(gè)，幾個(gè))編碼本文中所述的碳酸酐酶的異源多核苷酸，和任選地，一個(gè)或多個(gè)編碼本文中所述的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、本文中所述的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、本文中所述的蘋果酸脫氫酶、和/或本文中所述的丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸，以產(chǎn)生C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。[0264]可在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行用于產(chǎn)生C4二羧酸的方法,所述培養(yǎng)基包含任何一種或多種(例如兩種，幾種)糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。在一些情況中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)源于自然來(lái)源，如甘蔗、淀粉或纖維素，且可為通過酶水解(糖化)預(yù)處理所述來(lái)源的結(jié)果。[0265]除了來(lái)自一種或多種(例如兩種，幾種)糖的合適碳源之外，可發(fā)酵的培養(yǎng)基可含有其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的營(yíng)養(yǎng)物和刺激物，如常量營(yíng)養(yǎng)物(例如氮源)和微量營(yíng)養(yǎng)物(例如維生素、礦物鹽、和金屬輔因子)。在一些方面，所述碳源可優(yōu)選地與至少一種氮源供應(yīng)，所述氮源如酵母提取物、N2、蛋白胨(例如Bacto?Peptone),或Soytone(大豆蛋白胨)(例如Bacto?Soytone)。微生物的非限定性實(shí)例都包括多種維生素(multivitamin),生物素，泛酸，煙酸，煙酸肌醇，硫胺素，吡哆醇，對(duì)氨基苯甲酸，葉酸，核黃素，和維生素A、B、C、D和E。礦物鹽和金屬輔因子的實(shí)例包括但不限于Na，P，K，Mg，S，Ca，F(xiàn)e，Zn，Mn，和Cu。[0266]用于C4二羧酸產(chǎn)生的方法的合適條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文中的教導(dǎo)來(lái)確定。在所述方法的一些方面，將宿主細(xì)胞培養(yǎng)約12小時(shí)至約216小時(shí)，如約24小時(shí)至約144小時(shí)，或約36小時(shí)至約96小時(shí)。溫度通常為約26°C至約60°C，例如，約34°C至約50°C，而pH為約3.0至約8.0,如約3.0至約7.0，約3.0至約6.0，約3.0至約5.0，約3.5至約4.5，約4.0至約8.0,約4.0至約7.0,約4.0至約6.0,約4.0至約5.0,約5.0至約8.0，約5.0至約7.0，或約5.0至約6.0。在所述方法的一些方面，宿主細(xì)胞所得的胞內(nèi)pH為約3.0至約8.0,如約3.0至約7.0，約3.0至約6.0，約3.0至約5.0，約3.5至約4.5，約4.0至約8.0，約4.0至約7.0，約4.0至約6.0，約4.0至約5.0，約5.0至約8.0，約5.0至約7.0，或約5.0至約6.0。培養(yǎng)視需要可在厭氧、微氧、或有氧條件下進(jìn)行。在一些方面，培養(yǎng)在厭氧條件下進(jìn)行。合適的緩沖劑在本領(lǐng)域是已知的。[0267]視需要，培養(yǎng)可在厭氧、基本上厭氧(微氧)或有氧條件下進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，厭氧指缺乏氧的條件，基本上厭氧(微氧)指氧氣的濃度低于空氣的環(huán)境，而有氧指其中氧濃度大約等于或大于空氣濃度的環(huán)境?；旧蠀捬醯臈l件包括，例如培養(yǎng)、分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，使得培養(yǎng)基中溶解氧濃度維持在少于10%飽和?；旧蠀捬醯臈l件亦包括在維持有少于1%氧的空氣的密封腔室內(nèi)的液體培養(yǎng)基中或固體瓊脂上生長(zhǎng)或靜息細(xì)胞。氧氣的百分比可通過，例如用隊(duì)/0)2混合物或其他合適的非氧氣體對(duì)培養(yǎng)物鼓泡來(lái)維持。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)在厭氧條件或基本上厭氧條件下進(jìn)行。[0268]本文中所述的方法可采用任何合適的發(fā)酵操作模式。例如，可使用分批模式發(fā)酵，其用封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基和宿主微生物在發(fā)酵開始時(shí)設(shè)定好，除了某些例如用于PH控制、泡沫控制或其他工藝維持所需的試劑之外不具有任何其他輸入。本文中所述的工藝可以以分批補(bǔ)料或連續(xù)模式進(jìn)行。[0269]本文中所述的方法可以數(shù)種生物反應(yīng)器設(shè)置，如攪拌釜、鼓泡塔、氣升式反應(yīng)器和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的設(shè)置中進(jìn)行。[0270]所述方法可以視需要在不含細(xì)胞的培養(yǎng)物中或在固定化的細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行?？墒褂萌魏斡糜诠潭ɑ募?xì)胞培養(yǎng)的支持材料，如藻酸鹽，纖維床(fibrousbed)或Argyle(阿蓋爾)材料如纖蛇紋石、蒙脫石KSF和蒙脫石K-1O。[0271]在所述方法的一個(gè)方面，以大于約10g/L，例如，大于約25g/L，50g/L，75g/L，100g/L,125g/L,150g/L,160g/L,170g/L,180g/L,190g/L,200g/L,210g/L,225g/L,250g/L,275g/L，300g/L,325g/L，350g/L,400g/L,或500g/L;或約lOg/L至約500g/L,例如，約50g/L至約350g/L，約lOOg/L至約300g/L，約150g/L至約250g/L，約175g/L至約225g/L，或約190g/L至約210g/L的效價(jià)產(chǎn)生所述C4-二羧酸(例如蘋果酸)。在所述方法的一個(gè)方面，所述C4二羧酸以大于約0.01克每克糖，例如大于約0.02,0.05,0.75,0.1,0.2,0.3,0.4，.0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，或1.0克每克糖的效價(jià)產(chǎn)生。[0272]在所述方法的一個(gè)方面，產(chǎn)生的C4-二羧酸(例如蘋果酸)的量在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與沒有一種或多種(例如兩種，幾種)編碼碳酸酐酶的多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，高至少5%，例如至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少50%，或至少100%。[0273]所述重組的C4-二羧酸(例如蘋果酸)可任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基使用任何本領(lǐng)域中已知的方法回收和純化(參見例如，W01998/022611和U.S.7，601，865)，所述方法包括但不限于層析(例如大小排阻層析，吸附層析，離子交換層析)，電泳方法，差示溶解度，滲透，蒸懼，提取(例如液液萃取)，滲透蒸發(fā)，萃取性過濾(extractivefiltration),膜過濾,膜分離，反滲透，超濾，或結(jié)晶。在一個(gè)實(shí)例中，所述C4-二羧酸從發(fā)酵培養(yǎng)基中的其它材料通過過濾來(lái)回收。[0274]在所述方法的一些方面，在任選地純化之前和/或之后的重組C4-二羧酸是基本上純的。對(duì)于產(chǎn)生C4-二羧酸(或其具體C4-二羧酸，如蘋果酸)的方法，“基本上純的”意指含有不超過15%雜質(zhì)的回收的C4-二羧酸制備物，其中雜質(zhì)意指除了C4-二羧酸以外的化合物。在一種變型中，提供基本上純的C4-二羧酸制備物，其中所述制備物含有不超過25%雜質(zhì),或不超過20%雜質(zhì),或不超過10%雜質(zhì),或不超過5%雜質(zhì),或不超過3%雜質(zhì),或不超過1%雜質(zhì)，或不超過0.5%雜質(zhì)。[0275]可使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行對(duì)本文中所述的產(chǎn)生方法和宿主細(xì)胞合適的測(cè)試C4-二羧酸的產(chǎn)生的測(cè)定法。舉例而言，最終C4-二羧酸和其它有機(jī)化合物，可通過如HPLC(高效液相色譜)，GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜)，和LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜)的方法或其它合適的分析方法，用本領(lǐng)域中公知的常規(guī)步驟進(jìn)行分析。發(fā)酵液中C4-二羧酸的釋放亦可用培養(yǎng)上清進(jìn)行測(cè)試。發(fā)酵培養(yǎng)基中的副產(chǎn)物和殘余糖(例如葡萄糖)可通過HPLC，例如使用供葡萄糖和醇類用的折射率檢測(cè)器，和供有機(jī)酸用的UV檢測(cè)器(Lin等，Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))的HPLC，或其它本領(lǐng)域中公知的合適的測(cè)定和檢測(cè)方法來(lái)定量。[0276]下述實(shí)施例以說(shuō)明方式提供，但并不意在限制本發(fā)明。實(shí)施例[0277]用作緩沖液和底物是至少試劑級(jí)的商品。[0278]真菌菌株[0279]使用棒曲霉作為碳酸酐酶基因(ACLA_007930)的來(lái)源。使用米曲霉NRRL3488(或ATCC56747)作為碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(btl)、丙酮酸羧化酶基因(pyc)、蘋果酸脫氫酶基因(mdh3)的來(lái)源，并用于產(chǎn)生C4-二羧酸。棘孢曲霉用作C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(c4t521)的來(lái)源。[0280]培養(yǎng)基和溶液[0281]YEG培養(yǎng)基組成為:20g葡萄糖，5g酵母提取物，和去離子水加至I升。[0282]COVE平板纟目成為:1M蔗糖，2%C0VE鹽溶液，IOmM乙酰胺，15mMCsCl，和25g/l高貴級(jí)瓊脂(AgarNoble)。[0283]COVE鹽溶液纟目成為:26gKC1，26gMgSO4.7H20，76gKH2PO4,50mlCOVE痕量元素溶液，和去離子水加至I升。[0284]COVE痕量元素溶液組成為:0.04gNa2B4O7.IOH2O,0.04gCuSO4.5H20，1.2gFeSO4.7Η20，0.7gMnSO4.H20,0.8gNa2MoO2.2H20,IOgZnSO4.7H20和去離子水加至I升。[0285]種子培養(yǎng)基組成為:40r葡萄糖，6r細(xì)菌蛋白胨(Bactopeptone),750mgKH2PO4,750mgK2HPO4,IOOmgMgSO4.7H20,IOOmgCaCl2.H2O,5mgFeSO4.7H20，5mgNaCl，和去離子水加至I升。[0286]種子培養(yǎng)基B組成為:30r葡萄糖，3r細(xì)菌蛋白胨，560mRKH2PO4,560mgK2HPO4,925mgNaH2PO4.H20，820mgNa2HPO4,75mgMgSO4.7H20，75mgCaCl2.Η20，0.75ml的1000X微量營(yíng)養(yǎng)物溶液(MicronutrientSolution),和去離子水加至I升。[0287]產(chǎn)酸培養(yǎng)基C組成為:100g葡萄糖，80gCaCO3,6g細(xì)菌蛋白胨，150mgKH2PO4,150mgK2HPO4,IOOmgMgSO4.7H20,IOOmgCaCl2.H2O,ImllOOOX微量營(yíng)養(yǎng)物溶液，和去離子水加至I升°[0288]發(fā)酵罐分批培養(yǎng)基組成為:14(^葡萄糖，120gCaCO3,9g細(xì)菌蛋白胨，150mgKH2PO4,150mgK2HPO4,IOOmgMgSO4.7Η20，IOOmgCaCl2_2H20，5mgFeSO4.7Η20，5mgNaCl，5mlPluronicL61,和去離子水加至I升。[0289]1000X微量營(yíng)養(yǎng)物溶液組成為:5gNaCl，5gFeSO4.7Η20，Ig檸檬酸，和去離子水加至I升。[0290]PDA平板組成為:39g/l馬鈴薯右旋糖瓊脂。[0291]2XYT+amp平板組成為16r胰蛋白胨，IOr酵母提取物，5rNaCl,IOOmg氨節(jié)青霉素，15g細(xì)菌瓊脂(Bactoagar),和去離子水加至I升。[0292]MM平板纟目成為50ml20XMM鹽溶液，ImLCOVE痕量元素溶液，IOg葡萄糖，20ml生物素儲(chǔ)液，500mgMgS04-7H20,20gNoble瓊脂，用NaOH調(diào)至pH6.5，和去離子水加至I升。[0293]2MM+1M蔗糖平板纟目成為50ml20XMM鹽溶液，ImlCOVE微量元素溶液，342.3g蔗糖，IOg葡萄糖，20ml生物素儲(chǔ)液,500mgMgS04_7H20,20gNoble瓊脂,用NaOH調(diào)至pH6.5,和去離子水加至I升。[0294]20XMM鹽溶液纟目成為120gNaNO3,10.4gKC1，30.4gKH2PO4,和去離子水加至I升。[0295]生物素儲(chǔ)液組成為IOOmMTris緩沖液(pH8.0)中的5mM生物素。[0296]實(shí)施例1:米曲霉碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(btl)的克隆和表達(dá)載體pAmFs69的構(gòu)建[0297]通過PCR擴(kuò)增從米曲霉NRRL3488基因組DNA克隆碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因1^1(40090012000782)沖0?擴(kuò)增使用與在已公開的米曲霉4了0:42149基因組序列(Galagan等，2005,Nature438:1105-1115)中發(fā)現(xiàn)的預(yù)測(cè)的米曲霉碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因模型號(hào)A0090012000782同源的引物。[0298]來(lái)自米曲霉NRRL3488的基因組DNA的分離通過下述進(jìn)行:用2X106個(gè)孢子接種搖瓶中的100mlYEG培養(yǎng)基，并在37°C200rpm振蕩下將燒瓶溫育過夜。將菌絲體收集在襯有MIRACLOTH?(Calbiochem,SanDiego,CA,USA)的漏斗中，并將大約2克的組織凍結(jié)于液氮。在冷的件和研缽中研磨來(lái)破壞菌絲體。使用DNeasy?植物大提試劑盒(PlantMaxiKit)(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的指示從粉末化的菌絲體分離基因組DNA。使用下示的正向引物069824和反向引物069825擴(kuò)增米曲霉btl基因:[0299]引物069824:[0300]5’-GTGATAGAACATCGTCCATAATGGAATCCAGCGCTGTACA-3’(SEQIDNO:11)[0301]引物069825:[0302]5，-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCAGATTTCAATCTCGTCTT-3’(SEQIDNO:12)[0303]擴(kuò)增反應(yīng)使用Phusion?HotStart高保真DNA聚合酶(HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase)(FinnzymesInc.,Massachusetts,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示進(jìn)行。每個(gè)PCR反應(yīng)體系包含47ng米曲霉NRRL3488基因組DNA，dNTPs各20(^]?，5(^]\1正向引物，5(^]\1反向引物，以？丨11^011?GCBuffer反應(yīng)緩沖液(FinnzymesInc.)，和50個(gè)單位的Phusion?熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶，終體積為50μI。將擴(kuò)增反應(yīng)體系在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.,ffestbury,NY,USA)中溫育，其編程如下:1個(gè)循環(huán)，在98°C進(jìn)行30秒；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)在98°C進(jìn)行10秒，66°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行2.5分鐘；和I個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行10分鐘。PCR產(chǎn)物通過50mMTris堿_50mM乙酸-0.1mMEDTA二鈉鹽(TAE)中的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化。從凝膠切出大約2.5kb的片段，并使用QIAQUICK?.凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.)從瓊脂糖提取出來(lái)。[0304]將質(zhì)粒pShTh60(圖1，亦參見2010年8月27日提交的PCR申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002)用SexAl和PacI消化，通過在TBE緩沖液(10.8g/LTris堿，5.5g/L硼酸，2mMEDTA,pH8.0)中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.)純化。然后使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)試劑盒(Clontech,MountainView,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示將上述純化的PCR產(chǎn)物插入經(jīng)消化的pShTh60片段，得到質(zhì)粒pAmFs69(圖2)。[0305]將2.5μI等份的連接反應(yīng)體系根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化至ONESHOT?T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen,SanDiego,CA,USA)。將轉(zhuǎn)化體鋪板于2XYT+amp平板上并在37°C溫育過夜。[0306]對(duì)所得的轉(zhuǎn)化體使用DNA序列分析以確認(rèn)btl編碼序列的完整性。使用下示的引物610849，610851，610853，610855，610857，610859，和610861，以及ABI3130XLDNA分析儀(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)和帶染料終止物化學(xué)的引物步移技術(shù)(Giesecke等,1992,J.Virol.Methods38:47-60)。[0307]引物610849:5’-GAACAGGAAGAAATCCAAAA-3，(SEQIDNO:13)[0308]引物610851:5，-GTCGGCATAGCCACTGCAAT-3，(SEQIDNO:14)[0309]引物610853:5’-TGTTGCCGCCAAGGGACTTA-3，(SEQIDNO:15)[0310]引物610855:5’-CCGAGAGCGTTGAGTTAATC-3’(SEQIDNO:16)[0311]引物610857:5’-AGCATTAGGGCTAGCTCCGT-3’(SEQIDNO:17)[0312]引物610859:5’-CCAAGATGCCATGTCAGGAC-3’(SEQIDNO:18)[0313]引物610861:5’-TCACAAAAGAGTAGAGGCCA-3’(SEQIDNO:19)[0314]棘孢曲霉btl基因的基因組DNA序列的核苷酸構(gòu)建體(SEQIDNO:1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)示于圖3A和3B。2503bp的基因組編碼序列(包含一個(gè)終止密碼子)由三個(gè)78bp(465-542)，51bp(1173-1223)，和61bp(1747-1807)的內(nèi)含子分隔。相應(yīng)的cDNA序列(圖3A和3B中所示的粗體核苷酸序列)為2313bp，包含一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)的編碼蛋白為770個(gè)氨基酸，具有83.9kDa的預(yù)測(cè)的分子量和6.9的等電點(diǎn)pH。[0315]實(shí)施例2:米曲霉碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因A0090003000798的克隆和相應(yīng)的表達(dá)載體的構(gòu)建[0316]通過PCR擴(kuò)增從米曲霉NRRL3488基因組DNA克隆碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因bt2(A0090003000798)，PCR擴(kuò)增使用與在已公布的米曲霉ATCC42149基因組序列(Galagan等，2005，見上)中發(fā)現(xiàn)的米預(yù)測(cè)的曲霉碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因模型號(hào)A0090003000798同源的引物。[0317]來(lái)自米曲霉NRRL3488的基因組DNA的分離和菌絲體的收獲和處理如實(shí)施例1中所述。使用下示的正向引物0614058和反向引物0614057擴(kuò)增米曲霉bt2基因:[0318]引物0614058:[0319]5’-GTGATAGAACATCGTCCATAATGCCGGGCGATCTCAAAACC-3’(SEQIDNO:63)[0320]引物0614057:[0321]5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTACTATGCATCAAGGACATTC-3’(SEQIDNO:64)[0322]擴(kuò)增反應(yīng)使用Phusion?HotStart高保真DNA聚合酶(Finnzymes)根據(jù)生產(chǎn)商的指示進(jìn)行。每個(gè)PCR反應(yīng)體系包含47ng米曲霉NRRL3488基因組DNA，dNTPs各200μΜ，50ρΜ正向引物，50ρΜ反向引物，IXPhusion?GCBuffer反應(yīng)緩沖液(Finnzymes)，和50個(gè)單位的Phusion?ItotStart高保真DNA聚合酶,終體積為50μI。將擴(kuò)增反應(yīng)體系在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其編程如下:1個(gè)循環(huán)，在98°C進(jìn)行2分鐘；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)在98°C進(jìn)行15秒，65°C進(jìn)行15秒，和74°C進(jìn)行I分鐘；和I個(gè)循環(huán)，在74°C進(jìn)行I分鐘。將PCR產(chǎn)物通過50mMTris堿_50mM乙酸-0.1mMEDTA二鈉鹽(TAE)中的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化。將大約2.7kb的片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.)從瓊脂糖提取出來(lái)。[0323]將質(zhì)粒pShTh77(圖16)用SexAl和PacI消化，通過在TBE緩沖液(10.8g/LTris堿，5.5g/L硼酸，2mMEDTA,pH8.0)中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)純化。然后將上述純化的PCR產(chǎn)物使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)試劑盒(Clontech)根據(jù)生產(chǎn)商的指示插入消化的pShTh77片段，得到質(zhì)粒pShThl47(圖17)。[0324]將2.5μI等份的連接反應(yīng)體系根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化至ONESHOT?TOPlO化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體鋪板于2XYT+amp平板上并在37°C溫育過夜。[0325]對(duì)所得的轉(zhuǎn)化體使用DNA序列分析以確認(rèn)bt2編碼序列的完整性。使用下示的引物0614313，0614314，996270，和0611428，以及ABI3130XLDNA分析儀(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)和帶染料終止子化學(xué)的引物步移技術(shù)(Giesecke等，1992，J.Virol.Methods38:47-60)。[0326]引物0614313:5，-GATTGAGATCGGCATTTACT-3，(SEQIDNO:65)[0327]引物0614314:5，-ACGCGGAACAGCAGAATGGC-3，(SEQIDNO:66)[0328]引物996270:5’-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT_3’(SEQIDNO:67)引物0611428:5’-TTCACCGTGAAACGTATTGA-3’(SEQIDNO:68)[0329]米曲霉btl基因的基因組DNA序列的核苷酸構(gòu)建體(SEQIDNO:3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:4)示于圖4A和4B。2657bp的基因組編碼序列(包含終止密碼子)由兩個(gè)64bp(302-365)和61bp(512-572)的內(nèi)含子分隔。相應(yīng)的cDNA序列(圖4A和4B中所示的粗體核苷酸序列)為2532bp，包含一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)的編碼蛋白為843個(gè)氨基酸，具有92.5kDa的預(yù)測(cè)的分子量和8.4的等電點(diǎn)pH。[0330]實(shí)施例3:棘孢曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和載體pSaMF36的構(gòu)建[0331]通過用2X106個(gè)孢子接種搖瓶中的100mlYEG培養(yǎng)基，并在34°C在160rpm振蕩下將燒瓶溫育過夜來(lái)分離來(lái)自棘孢曲霉的基因組DNA。通過使用襯有MIRACLOTH?(Calbiochem)的漏斗過濾來(lái)收獲菌絲體，并回收大約2克的菌絲體并凍結(jié)于液氮。在凍結(jié)的菌絲體包裹在MIRACLOTH?內(nèi)時(shí)，通過用錘子迅速敲碎來(lái)將其破壞。然后將破壞的菌絲體轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯錐形離心管中，離心管裝有IOml的IX裂解緩沖液(IOOmMEDTA,IOmMTrisρΗ8.0,1%TritonR'\-100,0.5M鹽酸胍，200mMNaCl)和3μI的RNaseA(QIAGENInc.,100mg/ml)。通過輕柔地潤(rùn)旋來(lái)混合管,然后在室溫溫育5分鐘,接著添加150μI蛋白酶K(QIAGENInc.;20mg/ml)。將管通過倒置來(lái)混合并在50°C溫育I小時(shí)。然后將管在7240xg離心20分鐘。然后將上清加到經(jīng)預(yù)平衡的QIAGEN-tiplOO(QIAGENInc.，USA)上，根據(jù)生產(chǎn)商的指示來(lái)進(jìn)行其余的DNA提取步驟。將DNA重懸于100μ1TE緩沖液(IOmMTris堿，ImMEDTA,ρΗ8.0)。[0332]使用下示的引物069700和069701從分離的棘孢曲霉基因組DNA擴(kuò)增了1257bp的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因c4t521。[0333]引物069700:[0334]5，-TGTGATAGAACATCGTCCATAATGCACGACCACAGC-3，(SEQIDNO:20)[0335]引物069701:[0336]5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCATTCGAACAACTCGGACA-3’(SEQIDNO:21)[0337]PCR反應(yīng)體系由10μ15X反應(yīng)緩沖液，1μI棘孢曲霉基因組DNA模板(105ng/μI),IμI引物069700(lOOng/μI)，IμI引物069701(lOOng/μI)，IμIdNTP混合物(IOmM),35.5μI去離子水,和0.5μIPhusion?熱啟動(dòng)高保真聚合酶(Finnzymes,Inc,)構(gòu)成。將擴(kuò)增反應(yīng)體系在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其編程如下:1個(gè)循環(huán)，在98°C進(jìn)行30秒；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)在98°C進(jìn)行10秒，60°C進(jìn)行30秒，72°C進(jìn)行I分鐘，和I個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行10分鐘。將PCR產(chǎn)物用DpnI消化I小時(shí)以降解任何質(zhì)粒DNA模板。[0338]將質(zhì)粒pShTh60(圖1)用SexAl和PacI消化，通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQUICK?.凝膠提取試劑盒純化。然后使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)試劑盒將上述純化的PCR產(chǎn)物插入該經(jīng)消化的pShTh60片段，組成為:2μ15Χ緩沖液、3μI純化的PCR產(chǎn)物(26ng/μI)、1.5μI凝膠純化的SexAl和PacI消化的和凝膠純化的pShTh60(132ng/μI)、IμIIn-Fusion?酶和2.5μI去離子水。將反應(yīng)體系在37°C溫育15分鐘，50°C溫育15分鐘，置于冰上5分鐘，并用40μITE緩沖液稀釋，得到pSaMF36(圖5)。[0339]將2.5μI等份的連接反應(yīng)體系根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化至ONESHOT?T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體鋪板于2XYT+amp平板上并在37°C溫育過夜。挑取所得的轉(zhuǎn)化體對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序以確認(rèn)mat521基因成功地整合入載體。[0340]棘孢曲霉c4t521基因的基因組DNA序列的核苷酸構(gòu)建體(SEQIDN0:5)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:6)示于圖6。1257bp的基因組編碼序列(包括終止密碼子)不含內(nèi)含子。預(yù)測(cè)的編碼蛋白為418個(gè)氨基酸，具有46.8kDa的預(yù)測(cè)的分子量和6.36的等電點(diǎn)pH。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6),預(yù)測(cè)了一條17個(gè)殘基的信號(hào)肽。基于該程序，預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有401個(gè)氨基酸，具有44.9kDa的預(yù)測(cè)的分子量和6.89的等電點(diǎn)pH。[0341]實(shí)施例4:米曲霉蘋果酸脫氫酶基因的克隆和表達(dá)載體pSaMF21的構(gòu)建[0342]構(gòu)建了質(zhì)粒pSaMF21，該質(zhì)粒含有NAD依存性蘋果酸脫氫酶(mdh3)基因序列(D0GAN:A0090701000013)，其是來(lái)自米曲霉的一個(gè)1430bp片段，如2010年8月27日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002中所述。米曲霉NRRL3488蘋果酸脫氫酶mdh3基因的基因組DNA序列的核苷酸構(gòu)建體(SEQIDNO:7)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:8)示于圖7。1430bp的基因組編碼序列(包括終止密碼子)被57bp(14-70bp)，70bp(103-172bp)，74bp(284-357bp)，68bp(446_513bp)，58bp(892_949bp)，48bp(1035-1082bp)，和62bp(1228-1289bp)的7個(gè)內(nèi)含子分隔開來(lái)。mdh3基因的編碼區(qū)的G+C含量為50.3%。對(duì)應(yīng)的cDNA序列(圖7中所示的粗體核苷酸序列)為993個(gè)bp，包含一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)的編碼蛋白為330個(gè)氨基酸，具有34.5kDa的預(yù)測(cè)的分子量，和6.79的等電點(diǎn)pH。[0343]簡(jiǎn)言之，該質(zhì)粒是通過用SexAl和PacI進(jìn)行的限制性消化使pShTh60直鏈化(圖1)而構(gòu)建的。將經(jīng)消化的載體通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒純化。使用引物067522和067525從PShTh71(2010年8月27日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002)擴(kuò)增mdh3基因。[0344]引物067522:[0345]5，-AGAACATCGTCCATAATGGTCAAAGCTGGTGAGTTA-3’(SEQIDNO:22)[0346]引物067525:[0347]5，-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTTTGGTGGTGGGTTCT-3’(SEQIDNO:23)[0348]PCR反應(yīng)體系由5μIlOX反應(yīng)緩沖液，1μIpShTh71模板(87ng/μI)，IμI引物067522(lOOng/μI)，IμI引物067525(lOOng/μI)，IμIdNTP混合物(IOmM),45.5μI去離子水,和0.5μIHerculase?I1lStartDNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA,USA)構(gòu)成。將擴(kuò)增反應(yīng)體系/1:EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其編程為:1個(gè)循環(huán)，在95°C進(jìn)行2分鐘；10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在95°C進(jìn)行10秒，58°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1.5分鐘；20個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在95°C進(jìn)行10秒，50°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行1.5分鐘且每個(gè)循環(huán)增加10秒。對(duì)PCR反應(yīng)體系用DpnI進(jìn)行限制性消化I小時(shí)，以降解任何質(zhì)粒DNA模板。然后使用MinE丨ute?PCR純化試劑盒(QIAGENInc.)純化PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)插入載體，其中所述反應(yīng)體系由2μ15X緩沖液，0.5μI純化的PCR產(chǎn)物(IIOng/μI)，1.7μI凝膠純化的經(jīng)SexAl和PacI限制性消化的pShTh60(圖1;78ng/μI)，IμIIn-Fusion?酶和4.8μI去離子水構(gòu)成。將反應(yīng)體系在37°C溫育15分鐘，接著在50°C溫育15分鐘，之后將其置于冰上5分鐘，并用40μITE緩沖液稀釋，得到pSaMF21(圖8)。將2μI等份的連接反應(yīng)體系依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入ONESHOT?T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)。將轉(zhuǎn)化體鋪板于2XYT+amp平板上，并在37°C溫育過夜。挑取所得的轉(zhuǎn)化體，并對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序以確認(rèn)mdh3基因成功地整合入載體。[0349]實(shí)施例5:米曲霉丙酮酸羧化酶基因的克隆和表達(dá)載體pRyanl的構(gòu)建[0350]構(gòu)建了質(zhì)粒pRyanl,該質(zhì)粒含有丙酮酸羧化酶(pyc)基因序列(D0GAN:A0090023000801)，其是來(lái)自米曲霉的3646bp片段(包含兩個(gè)終止密碼子)，如2010年8月27日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US10/47002中所述。米曲霉丙酮酸羧化酶基因的基因組DNA序列的核苷酸構(gòu)建體(SEQIDNO:9)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:10)示于圖9A和9B。米曲霉NRRL3488和ATCC56747丙酮酸羧化酶基因具有相同的核苷酸序列?；蚓幋a區(qū)的G+C含量是57.1%。3643bp的基因組編碼序列(包含一個(gè)終止密碼子)被I個(gè)61bp(3475-3535bp)的內(nèi)含子分隔。基因編碼區(qū)的G+C含量是57.1%。相應(yīng)的cDNA序列(圖9A和9B中所示的粗體核苷酸序列)為3582bp，包含一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)的編碼蛋白為1193個(gè)氨基酸，具有131kDa的預(yù)測(cè)分子量。[0351]簡(jiǎn)言之，該質(zhì)粒是通過用SexAl和PacI進(jìn)行的限制性消化使pShTh60直鏈化(圖1)而構(gòu)建的。消化的載體通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒純化。使用如下所示的引物066549和067388從米曲霉NRRL3488基因組DNA擴(kuò)增pyc基因。[0352]引物066549:[0353]5’-TAGAACATCGTCCATAATGGCGGCTCCGTTTCGTCA-3’(SEQIDNO:24)[0354]引物067388:[0355]5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTATTACGCTTTGACGATCT-3’(SEQIDNO:25)[0356]PCR反應(yīng)體系由5μIlOX反應(yīng)緩沖液，1μI米曲霉NRRL3488基因組DNA(IIOng/μ1)，1μI引物066549(lOOng/μI)，IμI引物067388(100ng/μI),IμIdNTP混合物(IOmM),45.5μI去離子水,和0.5μIHerculase?:熱啟動(dòng)DNA聚合酶構(gòu)成。將擴(kuò)增反應(yīng)體系在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其編程為:I個(gè)循環(huán)，在95°C進(jìn)行2分鐘；10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在95°C進(jìn)行10秒，58°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行3.5分鐘；20個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在95°C進(jìn)行10秒，58°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行3.5分鐘且每個(gè)循環(huán)增加10秒。然后使用MinElute?PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。[0357]使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)物將純化的PCR產(chǎn)物插入載體,其中反應(yīng)體系由2μ15Χ緩沖液，IμI純化的PCR產(chǎn)物(144ng/μ1),2μI凝膠純化的、SexAl和PacI限制性消化的pShTh60(圖1;78ng/μI)，IμIIn-Fusion?酶和4μI去離子水構(gòu)成。將反應(yīng)體系在37°C溫育15分鐘，接著在50°C溫育15分鐘，之后將其置于冰上5分鐘，并用40μITE緩沖液稀釋，得到pRYANl(圖10)。將2μI等份的連接反應(yīng)體系依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入ONESHOT?T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體鋪板于2XYT+amp平板上，并在37°C溫育過夜。挑取所得的轉(zhuǎn)化體，并對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序以確認(rèn)pyc基因成功地整合入載體。核苷酸1308從C變?yōu)門，但并不影響蛋白序列。[0358]實(shí)施例6:米曲霉轉(zhuǎn)化體ShTh6900的制備[0359]米曲霉NRRL3488的原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化如下進(jìn)行:將大約2xl07個(gè)孢子接種入100mL的YEG培養(yǎng)基，并將燒瓶在27°C以140rpm溫育16-18小時(shí)。將培養(yǎng)物傾倒通過襯有MIRACLOT1-1?啲無(wú)菌漏斗，并用50ml的0.7MKCl漂洗，來(lái)收集菌絲體。將經(jīng)洗滌的菌絲體重懸于含有20ml原生質(zhì)體化溶液(protoplastingsolution)的125ml燒瓶中，其中所述原生質(zhì)體化溶液的組成為:5mg的GLUCANEX?(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)和0.5mg的殼多糖酶(chitinase)(SigmaChemicalC0.,St.Louis,MO,USA)每毫升0.7MKCl(經(jīng)過濾滅菌)，然后在34°C以SOrpm的混合進(jìn)行溫育30分鐘。將所述原生質(zhì)體化溶液傾倒經(jīng)過襯有MIRACLOTH?的無(wú)菌漏斗，并用50ml的STC緩沖液(由IM山梨醇-1OmMTris-HClpH6.5-10mMCaCl2構(gòu)成)漂洗。流過物收集在兩個(gè)50ml聚丙烯管中。將管以1300xg在室溫離心10分鐘。棄去上清，并將原生質(zhì)體離心沉淀重懸于20ml的STC緩沖液。通過將離心沉淀在20ml的STC緩沖液中重懸和以1300xg在室溫離心10分鐘進(jìn)行兩輪來(lái)洗滌原生質(zhì)體。將最終的離心沉淀重懸于2ml的STC緩沖液。移出10μI樣品并將其在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(VWR，WestChester,PA,USA)中計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)。用STC緩沖液調(diào)整體積以獲得2xl07每ml的原生質(zhì)體濃度。[0360]通過用PmeI在37°C限制性消化4小時(shí)分別制備了質(zhì)粒表達(dá)載體PAmFs69(實(shí)施例I)，pSaMF36(實(shí)施例3)，pSaMF21(實(shí)施例4)和pRyanl(實(shí)施例5)以供轉(zhuǎn)化。通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳將來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化體的大約5-6kb的表達(dá)盒與載體序列分離，并使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化出來(lái)。[0361]通過將上述100μI原生質(zhì)體制備物添加至四個(gè)12ml聚丙烯管來(lái)制備四個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系。對(duì)于每個(gè)管，將2微克的經(jīng)消化的pRyanlpyc片段，和各I微克的經(jīng)消化的pAmFs69btl片段，經(jīng)消化的pSaMF36C4T521片段，和經(jīng)消化的pSaMF21mdh片段添加至250μI的聚乙二醇(PEG)溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG),IOmMTris6.5，IOmMCaCl)，接著輕柔地混合并在37°C溫育30分鐘。用6ml的STC緩沖液稀釋每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，接著將三個(gè)單獨(dú)的等分試樣鋪板于COVE平板。然后將每個(gè)平板在34°C溫育7-10日。將所得的轉(zhuǎn)化體中的六十個(gè)轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的COVE平板，并在34°C溫育5日。通過制備每個(gè)培養(yǎng)物的甘油儲(chǔ)備物(800μI孢子儲(chǔ)液，200μ10.1%TWEEN?80)并冷凍于_80°C來(lái)儲(chǔ)藏培養(yǎng)物。[0362]將轉(zhuǎn)化體在搖瓶中培育，并根據(jù)上述描述分離基因組DNA。用于測(cè)試四種表達(dá)載體片段中的每一個(gè)的存在的單獨(dú)PCR反應(yīng)由5μIlOX反應(yīng)緩沖液，0.5μI模板(80_300ng/μI);1.0μI正向引物(50ρΜ，見下);1.0μI反向引物(50ρΜ;見下);0.5μIdNTP混合物(IOmM)，16.75μI去離子水，和0.25μIPhusion?DNA聚合酶構(gòu)成。[0363]正向引物065067(用于pRyanlpyc,pSaMf21mdh，和pSaMf36C4T521片段):[0364]5，-TGACCTTCCACGCTGACCAC-3，(SEQIDNO:46)[0365]正向引物0610854(用于pAmFs69btl片段):[0366]5，-GGCTGAGAAAATATGTTGCA-3’(SEQIDNO:47)[0367]反向引物0611365(用于pSaMF36C4T521片段):[0368]5，-GATAGACCACTAATCATGGTGGCGATGGAG-3，(SEQIDNO:48)[0369]反向引物061752(用于pRyanlpyc片段)[0370]5，-TGCGGTCCTGAGTCAGGCCCAGTTGCTCGA-3’(SEQIDNO:49)[0371]反向引物062400(用于pSaMF21mdh片段)[0372]5’-GGGATTTGAACAGCAGAAGG-3’(SEQIDNO:50)[0373]反向引物996270(用于pAmFs69btl片段)[0374]5，-TCACAAAAGAGTAGAGGCCA-3’(SEQIDNO:51)[0375]擴(kuò)增反應(yīng)體系在EPPENDORF'?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其編程為:1個(gè)循環(huán)，在98°C進(jìn)行30秒；35個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在98°C進(jìn)行10秒，66°C(對(duì)于pRyanlpyc片段)或58°C(對(duì)于pAmFs69btl，pSaMf21mdh,和pSaMf36C4T521片段)進(jìn)行10秒；72°C進(jìn)行15秒；和I個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行10分鐘。使用米曲霉殿此3488基因組0嫩(110叩/^1)作為陰性對(duì)照模板，使用每種質(zhì)粒(pRyanl，pAmFs69，pSaMf21，或pSaMf36，稀釋至20ng/μI)作為陽(yáng)性對(duì)照模板。擴(kuò)增反應(yīng)混合物通過凝膠電泳，使用2μI的每種反應(yīng)混合物在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。[0376]實(shí)施例7:從ShTh6900制備米曲霉轉(zhuǎn)化體ΛPyrG6900[0377]通過將大約2xl07個(gè)孢子接種入100mL的YEG培養(yǎng)基，并將燒瓶在34°C以160rpm溫育16-18小時(shí)來(lái)進(jìn)行米曲霉轉(zhuǎn)化體ShTh6900(見上文)的原生質(zhì)體制備。通過將培養(yǎng)物傾倒通過襯有MIRACLOTH?的無(wú)菌漏斗，并用50ml的0.7MKC1漂洗來(lái)收集菌絲體。將經(jīng)洗漆的菌絲體重懸于含有20ml原生質(zhì)體化溶液(protoplastingsolution)的125ml燒瓶中，其中所述溶液由5mg的GLUCANEX?(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)和0.5mg的殼多糖酶(chitinase)(SigmaChemicalC0.,St.Louis,MO,USA)每毫升0.7MKCl(經(jīng)過濾滅菌)構(gòu)成，然后在34°C以SOrpm的混合進(jìn)行溫育45分鐘。將所述原生質(zhì)體化溶液傾倒通過襯有MIRACLOTH?的無(wú)菌漏斗，并用50ml的STC(1M山梨醇，IOmMCaCl，IOmMTrisPH7)緩沖液漂洗。將流過物收集在兩個(gè)50ml聚丙烯管中。將管以1900xg在室溫離心5分鐘。棄去上清，并將原生質(zhì)體離心沉淀重懸于20ml的STC緩沖液。通過將沉淀在20ml的STC緩沖液中重懸和以1900xg在室溫離心5分鐘進(jìn)行兩輪來(lái)洗滌原生質(zhì)體。將最終的離心沉淀重懸于Iml的STC緩沖液中。通過移出10μI樣品并將其在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)(VWR)來(lái)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)。用STC緩沖液調(diào)整體積以獲得2χ107每ml的原生質(zhì)體濃度。[0378]制備了pyrG缺失盒以供通過使用引物62329和62199從？51111166擴(kuò)增缺失片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。PCR反應(yīng)由40μIlOX反應(yīng)緩沖液，2μIpShTh66模板(圖15;SEQIDN0:62;200ng/μ1),8μI引物62329(50ρΜ/μ1)，8μI引物62199(50ρΜ/μ1)，8μIdNTP混合物(IOmM),328μI去離子水，和6μIExpandDNAPolymerase(Roche,USA)構(gòu)成，并分為4個(gè)試管。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其程序如下:I個(gè)循環(huán)，在95°C進(jìn)行3分鐘；10個(gè)循環(huán)，每個(gè)在95°C進(jìn)行30秒，57°C進(jìn)行30秒，和68°C進(jìn)行3分鐘；25個(gè)循環(huán)，每個(gè)在95°C進(jìn)行30秒，57°C進(jìn)行30秒，和68°C進(jìn)行3分鐘，每個(gè)后續(xù)循環(huán)增加5秒；和一個(gè)循環(huán)，在68°C進(jìn)行7分鐘。PCR產(chǎn)物通過在50mMTris堿-50mM乙酸-0.1mMEDTA二鈉鹽(TAE)緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化。將大約3.2kb的片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK?GelExtractionKit(QIAGENInc.)從瓊脂糖提取。[0379]引物62329:[0380]5，-ATTAACTAAAGACCACGAGAGGGGAACTAGGGAAATC-3’(SEQIDNO:56)[0381]引物62199:[0382]5，-TTAATTAACTTTCCCCCCCGTAATCTAA-3’(SEQIDNO:57)[0383]制備五個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，即將上述的100μI米曲霉ShTh6900原生質(zhì)體制備物與Iμg的上述~3.2kbpyrG缺失片段在12ml聚丙烯管中混合。添加250μI聚丙二醇(PEG)，并將反應(yīng)物輕柔地混合，接著在37°C溫育30分鐘。將5mlYP5%葡萄糖，IOmM尿苷添加至每個(gè)反應(yīng)物，并允許管在34°C溫育過夜。將每個(gè)反應(yīng)物鋪板于兩個(gè)MMlM蔗糖+尿苷+FOA平板，并在34°C溫育7-10日。然后將所得的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至單個(gè)MM+尿苷+FOA平板，并在34°C溫育5日。對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行兩輪孢子純化，然后將其鋪板于MM+尿苷平板上。孢子儲(chǔ)液通過將孢子收集于0.1%TWEEN?80來(lái)制備。將所得的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物(命名為PyrG6900)儲(chǔ)藏于_80°C于甘油儲(chǔ)備中(800μI孢子儲(chǔ)備，200μ10.1%TWEEN?80)。[0384]孢子分離物通過Southern分析確認(rèn),并顯示缺乏pyrG基因，不具有異位整合。用所述孢子分離物制備第二Southern分析，并用amp基因探查以確保菌株中不存在任何質(zhì)粒DNA序列。在任何轉(zhuǎn)化體和amp探針之間未發(fā)現(xiàn)任何雜交。[0385]實(shí)施例8:棒曲霉碳酸酐酶基因的克隆和表達(dá)載體pSaMF58的構(gòu)建[0386]分離來(lái)自棒曲霉NRRLl的基因組DNA，即用來(lái)自10日齡的PDA平板的所有收獲的孢子接種搖瓶中的100mL的YEG培養(yǎng)基，并將搖瓶在34°C以160rpm振蕩溫育過夜。使用MIRACLOTH?(Calbiochem)襯邊漏斗過濾來(lái)收獲菌絲體,并回收了大約2g的菌絲體，并凍結(jié)于液氮。將凍結(jié)的菌絲體通過包裹在Miracloth內(nèi)用錘子迅速砸碎來(lái)破壞。然后將破壞的菌絲體轉(zhuǎn)移至含有IOml的IX裂解緩沖液(IOOmMEDTA,IOmMTrispH8.0,l%TritonX-100,0.5M胍-HCl,200mMNaCl)和3μI的100mg/mlRNaseA的50ml聚丙烯錐形離心管中。將離心管通過輕柔的渦旋來(lái)混合，然后在室溫溫育5分鐘，接著添加150μI的20mg/mlProteinaseK。將離心管通過倒置來(lái)混合，置于50°C溫育I小時(shí)，然后在7240xg離心20分鐘。然后將上清添加至預(yù)平衡的QIAGEN-tiplOO(QIAGENInc.)，且剩余的DNA提取步驟依照生產(chǎn)商的指示。將DNA重懸于50μI的TE緩沖液。[0387]所述碳酸酐酶(CA)基因(ACLA_007930)從分離的棒曲霉基因組DNA通過PCR擴(kuò)增使用下示的引物0612826和0612827擴(kuò)增。[0388]引物0612826:[0389]5，-CCAACAGACACATCTAAACAATGTCCGACAAGGCTC-3，(SEQIDNO:52)[0390]引物0612827:[0391]5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCAGCTCTTGGTGATATTGT-3’(SEQIDNO:53)[0392]PCR反應(yīng)由10μ15Χ反應(yīng)緩沖液，0.5μI棒曲霉NRRLl基因組DNA模板(113ng/yI)，IμI弓丨物0612826(lOOng/μI)，IμI弓丨物0612827(lOOng/μI)，IliIdNTP混合物(IOmM),36μI去離子水，和0.5μIPhusion?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase(FinnzymesInc.)構(gòu)成。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其程序?yàn)?1個(gè)循環(huán)，在98°C進(jìn)行30秒；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)在98°C進(jìn)行10秒，60°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行30秒，和一個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行10分鐘。然后使用MinElute?PCRPurificationKit(QIAGENInc.)根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化PCR產(chǎn)物。[0393]將BstXI限制性位點(diǎn)使用寡聚物引物064011和064012用QuickChangeIISLSiteDirectedMutagenesis試劑盒(AgilentTechnologies)引入質(zhì)粒pAlLo2(參見W02004/099228)的NA2_tpi啟動(dòng)子上游，得到質(zhì)粒pShTh76(圖11)。[0394]引物064011:[0395]5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTATGGATTGTTTAAACGTCGACGC-3’(SEQIDNO:58)[0396]引物064012:[0397]5’-GCGTCGACGTTTAAACAATCCATAATCATGGTCATAGCTGTTTCC-3’(SEQIDNO:59)[0398]然后將質(zhì)粒pShTh76通過用BstXI和BglII消化來(lái)直鏈化。然后將經(jīng)消化的載體通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離，并使用QiagenMinElute?PCR純化試劑盒(QIAGENInc.)根據(jù)生產(chǎn)商的指示來(lái)凝膠純化。[0399]來(lái)自米曲霉NRRL3488的gpd啟動(dòng)子使用引物0612469和0612468擴(kuò)增。[0400]引物0612469:[0401]5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTCCAGATTGTAAATTAC-3’(SEQIDNO:60)[0402]引物0612468:[0403]5’-AGCACTAGTACGCGTAGATCTGTTTAGATGTGTCTGTTGG-3’(SEQIDNO:61)[0404]PCR反應(yīng)由10μ15Χ反應(yīng)緩沖液，0.5μI米曲霉NRRL3488基因組DNA模板(200ng/μI),IμI引物0612826(lOOng/μI)，IμI引物0612827(lOOng/μI),IμIdNTP混合物(10πιΜ),36μ1去離子水，和0.5μIPhusion?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase(FinnzymesInc.)構(gòu)成。將擴(kuò)增反應(yīng)物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?(EppendorfScientificInc.)中溫育，其程序?yàn)?1個(gè)循環(huán)，在98°C進(jìn)行30秒；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)在98°C進(jìn)行10秒，65°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行60秒，和一個(gè)循環(huán)，在72°C進(jìn)行10分鐘。然后使用MinElute?PCRPurificationKit(QIAGENInc.)柱純化PCR產(chǎn)物。[0405]然后將上述含有g(shù)pd啟動(dòng)子的純化的PCR產(chǎn)物使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)物插入消化的pShTh76載體，所述反應(yīng)物由2μ15X緩沖液，2μI純化的PCR產(chǎn)物(42ng/y1)，2.7μI凝膠純化的BstXI和BglII限制性消化的pShTh76(75ng/μI)，IμIIn-Fusion?酶和2.3μI去離子水構(gòu)成。將反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘。之后將其置于冰上5分鐘，并用40μITE緩沖液稀釋，得到pSaMF48。將連接反應(yīng)的2.5μI等分試樣根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入ONESHOT?T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(InvitiOgen)。將轉(zhuǎn)化體置于2XYT+amp平板上，并在37°C溫育過夜。挑取所得的轉(zhuǎn)化體，命名為pSaMF48(圖12)，并對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序以確認(rèn)gpd啟動(dòng)子成功地整合入載體。[0406]將質(zhì)粒pSaMF48(圖12)用BglII和PacI消化，通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用NucleospinRExtractIIKit(Macherey-NageI,Bethlehem,PA，USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將上述含有SEQIDN0:54的棒曲霉碳酸酐酶基因的純化的PCR產(chǎn)物使用In-Fusion?Advantage反應(yīng)插入載體,所述反應(yīng)由2μ15Χ緩沖液，0.25μI純化的PCR產(chǎn)物(187ng/μ1),0.26μI的上述BglII和PacI限制性消化和凝膠純化的pSaMF48(557ng/μI)，IμIIn-Fusion?酶和6.49μI去離子水構(gòu)成。將反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘。之后將其置于冰上5分鐘，并用40μITE緩沖液稀釋，得到pSaMF58(圖13)。[0407]將連接反應(yīng)的2.5μI等分試樣根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入ONESHOT?T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)。將轉(zhuǎn)化體置于2XYT+amp平板上，并在37°C溫育過夜。挑取所得的轉(zhuǎn)化體，并對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序以確認(rèn)CA基因成功地整合入載體。[0408]棒曲霉碳酸酐酶基因的基因組DNA序列(SEQIDN0:54)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:55)的核苷酸構(gòu)建體示于圖14。750bp的基因組編碼序列(包含終止密碼子)由一個(gè)72bp(153-224)的內(nèi)含子所中斷。相應(yīng)的cDNA序列(圖13中所示的粗體核苷酸序列)為678bp，包含一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)的編碼蛋白是225個(gè)氨基酸，具有25.7kDa的預(yù)測(cè)的分子量，和6.48的等電點(diǎn)pH。[0409]實(shí)施例9:將含有棒曲霉碳酸酐酶基因的pSaMF58的表達(dá)載體片段轉(zhuǎn)化入米曲霉轉(zhuǎn)化體ΛPyrG6900(SaMF58Q)[0410]制備了質(zhì)粒表達(dá)載體pSaMF58(圖12)以供通過用AseI和XhoI在37°C消化4小時(shí)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將消化的載體在0.8%瓊脂糖TBE凝膠上分離，將含有表達(dá)盒的3292bp條帶切出，并使用Nudeospin?ExtractIIKit(Macherey-Nagel)根據(jù)生產(chǎn)商的指示來(lái)純化。[0411]通過將100μI的米曲霉APyrG6900轉(zhuǎn)化體原生質(zhì)體制備物(如上所述以類似方式制備)各添加至兩個(gè)12ml聚丙烯管來(lái)制備兩個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系。對(duì)于每個(gè)管,添加5μg不含amp標(biāo)志物、直鏈化的pSaMF58載體(見上文)和250μI的聚乙二醇(PEG)，接著輕柔的混合，并在37°C溫育30分鐘。用6ml的STC緩沖液稀釋每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，分離為3ml等分試樣，接著將每個(gè)等分試樣鋪板于2MM+1M蔗糖平板上。然后將每個(gè)平板在34°C溫育7-10日。將所得的轉(zhuǎn)化體(命名為SaMF58Q)轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的MM平板中，并在34°C溫育5日。通過制備每個(gè)培養(yǎng)物的甘油儲(chǔ)液(800μI孢子儲(chǔ)液，200μ10.1%TWEEN?80)并冷凍于-80°C來(lái)儲(chǔ)藏培養(yǎng)物。[0412]實(shí)施例10:在含有棒曲霉碳酸酐酶基因的米曲霉轉(zhuǎn)化體(SaMF58Q)的搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生蘋果酸[0413]將來(lái)自實(shí)施例9中所述的SaMF58Q轉(zhuǎn)化體和作為對(duì)照的米曲霉NRRL3488的孢子鋪板于單個(gè)PDA平板上，并允許在34°C孢子形成5至7日。將孢子在0.1%TWEEN?80中收集，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。在含有100mL種子培養(yǎng)物B(補(bǔ)充4.4mg/LZnSO4-H2O)的250ml燒瓶中制備種子培養(yǎng)物，并接種ImL收獲的孢子。將種子培養(yǎng)物在30°C在200rpm振蕩下培育大約22個(gè)小時(shí)。在含有50ml產(chǎn)酸培養(yǎng)基C(補(bǔ)充4.4mg/LZnSO4.H2O)和3ml的22小時(shí)種子培養(yǎng)物的250ml不帶擋板的燒瓶中制備產(chǎn)酸培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30°C在200rpm振蕩下溫育3日。[0414]對(duì)于搖瓶培養(yǎng)物的蘋果酸定量通過使用1200系列雙元LC系統(tǒng)和1200系列二極管陣列檢測(cè)器(DAD)(AgilentTechnologies,SantaClara,CAUSA)的反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行。使用Aqua5μCl8丨25A205x4.6mmID柱和AQC184x3.0mm預(yù)柱(SecurityGuardCartridge)(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)進(jìn)行反向分離。流動(dòng)相由10%甲醇(HPLC級(jí))和90%145mM磷酸鹽ρΗ1.5緩沖液組成。[0415]移出全培養(yǎng)物樣品，并將其在HPLC運(yùn)行緩沖液中以1:20稀釋，所述HPLC緩沖液由為900ml的145mM磷酸鹽緩沖液和100mL的甲醇pHl.50構(gòu)成。然后將樣品通過96孔0.45微米DuraporePVDF膜過濾到96孔板中以供酸分析。[0416]使用下述條件進(jìn)行RP-HPLC:注入體積10μ1，流速0.7ml/分鐘(等度洗脫)，柱溫20°C。檢測(cè)為210nm，4nm帶寬，參照為360nm，40nm帶寬。運(yùn)行時(shí)間為13分鐘?？瞻讜r(shí)間(voidtime)確定為3.8分鐘。通過進(jìn)行濃度范圍為49.2-3.93mM的系列稀釋的蘋果酸標(biāo)樣的重復(fù)注入，對(duì)于蘋果酸確定了反相方法的定量能力。對(duì)于重復(fù)注入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為≤5%。蘋果酸顯示R2≥0.9999。[0417]含有棒曲霉碳酸酐酶基因(SEQIDNO:54)的米曲霉SaMF58Q轉(zhuǎn)化體顯示相對(duì)于米曲霉NRRL3488菌株超過兩倍的蘋果酸效價(jià)。此外，米曲霉SaMF58Q轉(zhuǎn)化體與在用類似的菌株米曲霉ShTh6900(轉(zhuǎn)化體SaMF58Q的親本株，但缺乏SEQIDNO:54的異源碳酸酐酶基因)進(jìn)行的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中觀察到的那些相比產(chǎn)生更高的效價(jià)。[0418]實(shí)施例11:含有棒曲霉碳酸酐酶基因的米曲霉轉(zhuǎn)化體(SaMF58Q)的發(fā)酵[0419]將三個(gè)描述于實(shí)施例9中的米曲霉SaMF58Q轉(zhuǎn)化體和對(duì)照轉(zhuǎn)化體米曲霉ShTh6900(轉(zhuǎn)化體SaMF58Q的親本株，但缺乏SEQIDNO:54的異源碳酸酐酶基因)在34°C在PDA平板上生長(zhǎng)大約7日。將5-6ml體積的滅菌的含有0.2%TWEEN?80的磷酸鈉緩沖液(50mM，pH6.8)添加至每個(gè)平板，并通過用接種環(huán)刮擦來(lái)懸浮孢子。將每個(gè)懸液通過移液尖轉(zhuǎn)移至50ml錐形管。對(duì)于每個(gè)管，將25ml滅菌的含有0.2%TWEEN?80的磷酸鈉緩沖液(50mM，pH6.8)添加至含有75ml的種子培養(yǎng)基的500ml不帶擋板的燒瓶，然后將其用2ml的孢子懸液接種。然后將燒瓶在34°C和180rpm溫育約24小時(shí)。將種子燒瓶合并以供應(yīng)每罐所需的144ml接種物。[0420]將含有1.8升發(fā)酵器分批培養(yǎng)基(含或不含15μM補(bǔ)充的ZnSO4)的三升發(fā)酵器分別通過引入144ml(8%)的來(lái)自米曲霉SaMF58Q轉(zhuǎn)化體或米曲霉ShTh6900轉(zhuǎn)化體的三個(gè)合并的種子燒瓶的種子培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行接種。將發(fā)酵罐平衡于34°C±0.1°C，并在700rpm攪拌。將引入空氣流維持在lv/v/m。將30%葡萄糖流以大約7.3g/hr的速率從發(fā)酵約20小時(shí)開始施用，在68小時(shí)增加至9.3g/hr。在第3日添加150g的滅菌的CaCO3以維持發(fā)酵pH在6至7的范圍。[0421]每日移除樣品，并通過液相色譜偶聯(lián)串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)施用具有三重Quad檢測(cè)器和Masshunter工作站的AgilentLC-MS/MS系統(tǒng)(AgilentTechnologies,SantaClara,CAUSA)基于下述分析蘋果酸的產(chǎn)生:[0422]LC柱:ffatersXBridgeAmide柱，3.5μm,150X2.1mmID(Waters,Milford,MA,USA;P/N:186004861)[0423]灃入體積:2.0uL[0424]樣品緩沖液:584.48mgEDTA,154.16mgNH4Ac,200mLMeOH,800mLH2O,500uL25%NH3.H20,11.44mg,13C-標(biāo)記的蘋果酸內(nèi)標(biāo)(CambridgeIsotopeLaboratories,Inc.，Andover,MA,USA)和去離子水至I升(pH8.3).[0425]對(duì)于HPLC的溶劑A:80%Me0H中的5mMNH4Ac[0426]對(duì)于HPLC的溶劑B:20%AcN中的50mM(NH4)2C03,使用25%ΝΗ3.Η20將pH調(diào)整至10[0427]運(yùn)行備件:等度30%B，流速0.3mL/min;柱溫度45°C[0428]極進(jìn):蘋果酸:60g/L,51g/L，45g/L，30g/L，15g/L，7.5g/L，3.75g/L，1.875g/L，每個(gè)用雙蒸水稀釋100倍和用樣品緩沖液稀釋10倍(最終稀釋1000倍)；琥珀酸，延胡索酸，檸檬酸，和草酸:每個(gè)以類似方式從5-10g/L儲(chǔ)備稀釋8級(jí)至1000倍。[0429]MS設(shè)定:氣體溫度:300°C，氣體流動(dòng):10L/min，霧化器:32psi，DeltaEMV(-):450[0430]MRM設(shè)定:下表1。[0431]表1.[0432]【權(quán)利要求】1.一種重組宿主細(xì)胞，其包含編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞與沒有所述異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生更多量的C4二羧酸。2.權(quán)利要求1的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸:(a)編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶與SEQIDNO:55具有至少80%序列同一性；(b)在中等嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:54的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或(ii)SEQIDNO:54的cDNA序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或(c)與SEQIDNO:54，或SEQIDNO:54的cDNA序列具有至少80%序列同一性。3.權(quán)利要求1或2的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶與SEQIDNO:55具有至少90%序列同一性。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:54的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或(ii)SEQIDNO:54的cDNA序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:SEQIDNO:54的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:SEQIDNO:54的cDNA序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸與SEQIDNO:54或SEQIDNO:54的cDNA序列具有至少90%序列同一性。8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸與SEQIDNO:54具有至少95%序列同一‘丨生。9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸與SEQIDNO:54的cDNA序列具有至少95%序列同一1丨生。10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸編碼SEQIDNO:55的碳酸酐酶變體，其中所述變體包含在不多于10個(gè)位置的取代、缺失和/或插入。11.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸編碼碳酸酐酶，所述碳酸酐酶包含或組成為SEQIDNO:55。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源多核苷酸。14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。17.權(quán)利要求16的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自下組:枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、根霉屬(Rhizopus)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)和木霉屬(Trichoderma)。18.權(quán)利要求17的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬宿主細(xì)胞。19.權(quán)利要求18的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞是米曲霉宿主細(xì)胞。20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述C4-二羧酸是蘋果酸。21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述所述宿主細(xì)胞與沒有所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，能夠多產(chǎn)生至少10%的量的C4-二羧酸。22.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述所述宿主細(xì)胞與沒有所述編碼碳酸酐酶的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，能夠多產(chǎn)生至少50%的量的C4-二羧酸。23.產(chǎn)生C4-二羧酸的方法，其包括:(a)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述C4-二羧酸；和(b)回收所述C4-二羧酸。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述C4-二羧酸是蘋果酸?！疚臋n編號(hào)】C12N15/82GK103917649SQ201280051482【公開日】2014年7月9日申請(qǐng)日期:2012年8月17日優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日【發(fā)明者】S.麥克法蘭德,S.布朗,S.魯特林格申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司