重組固氮微生物及其用途
【專利摘要】本文提供一種重組微生物，特別地，一種固氮菌科家族的重組微生物。重組固氮菌微生物能在氧和外部固定的氮源的存在下連續(xù)地固定大氣氮。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于制備重組微生物的方法和用作生物肥料和/或用于制備肥料組合物的包含重組微生物的組合物。本發(fā)明所制備的重組微生物是環(huán)境友好的、非常有益的微生物。
【專利說明】重組固氮微生物及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及重組微生物，特別地，涉及能夠 在固定的氮、氧或其組合存在下固定大氣氮的重組固氮菌。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 生物固氮（BNF)發(fā)生在大氣氮被稱為固氮酶的酶轉(zhuǎn)化成氨時(shí)。僅一些選定的微生 物能夠?qū)⒌獜呢S富的氣體形式轉(zhuǎn)換成可利用的結(jié)合的氮化合物。固定氮的微生物稱為固氮 細(xì)菌。負(fù)責(zé)固氮酶活性的酶很容易受到氧的破壞。nif基因負(fù)責(zé)編碼固氮酶蛋白和涉及并 與將大氣氮固定成植物可用的氮形式相關(guān)的其他蛋白質(zhì)。nif基因有正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控 因子二者。除固氮酶外，nif基因還編碼大量的涉及氮固定的調(diào)控蛋白。nif基因的表達(dá) 是作為對固定的氮的低濃度和低氧濃度的反應(yīng)誘導(dǎo)的（低氧濃度是在根環(huán)境中主動(dòng)維持 的）。在大多數(shù)固氮微生物中，nif基因轉(zhuǎn)錄的激活由NifA蛋白完成。當(dāng)沒有足夠的固定 的氮可供固氮菌使用時(shí)，nifA基因的天然啟動(dòng)子引發(fā)NifA表達(dá)，而NifA蛋白反過來導(dǎo)致 剩余nif基因轉(zhuǎn)錄的激活。如果有足夠量的還原氮或存在氧，那么nifA基因啟動(dòng)子不會被 激活且沒有NifA蛋白表達(dá)發(fā)生。另一方面，另一種蛋白質(zhì)，NifL，在還原氮或氧存在下被激 活，該激活的NifL通過與NifA蛋白相互作用抑制其活性，導(dǎo)致抑制固氮酶和所有其他氮固 定所必需的輔助蛋白的形成。
[0004] 在自養(yǎng)菌、需氧菌、異養(yǎng)菌、固氮的革蘭氏陰性土壤細(xì)菌屬、固氮菌種群中的氮固 定是由nifLA操縱子調(diào)控的。在此，NifA蛋白也激活所有nif基因的轉(zhuǎn)錄，而NifL蛋白對 固定的氮和分子氧反應(yīng)來對抗轉(zhuǎn)錄激活因子NifA。固氮菌的nif操縱子的表達(dá)由sigma-54 轉(zhuǎn)錄因子而不是由更常見的sigma-70轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。sigma-54轉(zhuǎn)錄因子的典型特征是需 要必須在啟動(dòng)子上游約100或更多個(gè)堿基的位置結(jié)合至DNA的激活因子。nifA基因存在于 固氮菌nifLA操縱子中并位于nifLA操縱子的遠(yuǎn)端。nifA基因還存在于固氮菌nifLA操 縱子中并位于nifLA操縱子的近端。在此，NifL還是負(fù)調(diào)控因子，其在氧或氨存在下被激 活。NifL通過與NifA相互作用使其失效。除了 NifA，天然nifLA操縱子的啟動(dòng)子還被氧 和氨抑制。nifLA操縱子作為氮固定整個(gè)過程的主要調(diào)控操縱子。Raina等人[1993, Mol. Gen. Genet. 237:400-406]已經(jīng)充分表征 了掠色固氮菌（Azotobacter vinelandii)的 nifL基因并已經(jīng)闡明其調(diào)控。與肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)的情況 不同，棕色固氮菌中nifLA操縱子的表達(dá)不是自發(fā)調(diào)控的。Bali等人[1992, App. Env. Microbiol. 58:1711-1718]在棕色固氮菌nifA上游插入了一個(gè)抗生素抗性盒并觀察到了 提高的氮固定和氮排泄。Brewin等人[1999, J.Bacteriol. 181:7356-7362]研究了通過插 入抗生素抗性盒獲得的棕色固氮菌的nifL突變體的銨排泄并推斷銨被動(dòng)地從細(xì)胞排泄。 在棕色固氮菌中，目前的證據(jù)表明NifL通過相對穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來控制 NifA活性，所述蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用受氧化還原變化、配體結(jié)合、和與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋 白和膜組件的相互作用調(diào)控。棕色固氮菌NifL包含在組氨酸激酶的遞質(zhì)區(qū)域發(fā)現(xiàn)的保守 組氨酸殘基，表明NifL可能使用傳統(tǒng)的磷酰基轉(zhuǎn)移機(jī)制來將環(huán)境信號傳達(dá)至NifA。然而， 用許多其他氨基酸取代這種保守組氨酸不會使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失效。另外，NifL能夠在體外ATP 不存在下抑制NifA，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要兩個(gè)調(diào)控蛋白之間化學(xué)計(jì)量的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作 用（Martinez-Argudo 等人，J BacterioL，2004,186 (3): 601-610)。
[0005] 在谷類農(nóng)作物和非谷類農(nóng)作物中，都需要用工業(yè)固定的氮或生物固定氮提供額外 的固定的氮以補(bǔ)充土壤中的可用性氮。通過礦化釋放到可用池中的氮期望是取決于所收獲 農(nóng)產(chǎn)品中移除的土壤氮的量、無機(jī)氮（例如，N03'_N)浸析到地下水的量、土壤氮以凡0或隊(duì) 脫氮的量、N固定化的程度和持續(xù)時(shí)間以及N在土壤生物量中的再活化比例（I. R. Kennedy et al, 2004, Soil Biology & Biochemistry 36:1229-1244)。接種生物肥料，特別地，接種 固定氮的細(xì)菌固氮菌可幫助確保維持有助于最佳產(chǎn)量的營養(yǎng)供應(yīng)。然而，在化學(xué)含氮肥料 存在下，沒有生物固氮，因?yàn)榛瘜W(xué)肥料產(chǎn)生的銨關(guān)閉了 nifLA操縱子并因此關(guān)閉了隨后的 所有nif操縱子。
[0006] 美國專利6548289描述了一種用于通過在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子下引入包含 nifA基因的質(zhì)粒、通過增加激活蛋白NifA的細(xì)胞內(nèi)水平來增加根瘤菌（Rhizobium)屬中 大氣氮轉(zhuǎn)化成氨的比例的方法。這種方法的問題是質(zhì)粒具有從環(huán)境考慮所不期望的抗生素 抗性基因。此外，介質(zhì)或土壤中抗生素的存在對質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)的穩(wěn)定維持將是必不可少的。 因此，需要連續(xù)的選擇壓力以維持質(zhì)粒在細(xì)菌中的穩(wěn)定性。
[0007] 美國專利申請20060270555描述了利用過氧化氫酶基因?qū)е绿岣吖痰芰Φ母?瘤菌的轉(zhuǎn)化、用于含有作為活性組分的根瘤菌的豆科農(nóng)作物的制備、以及包括用轉(zhuǎn)換的細(xì) 菌接觸農(nóng)作物種子的培養(yǎng)豆科農(nóng)作物的方法。
[0008] 其他研究者通過插入抗生素抗性盒至nifL基因已經(jīng)研究了表現(xiàn)出不間斷的生物 固氮的重組微生物。然而，由于環(huán)境問題，攜有抗生素抗性基因的這種微生物對農(nóng)業(yè)使用而 言是不能接受的。存在降低與化學(xué)肥料相關(guān)的成本并降低這些化學(xué)肥料對環(huán)境污染的加重 的迫切需要。因此，非常有必要的是：應(yīng)當(dāng)開發(fā)使得在對環(huán)境具有有利影響的情況下降低 農(nóng)業(yè)成本的新的創(chuàng)造性產(chǎn)品和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一方面提供一種重組微生物，其包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作 性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因，其中該微生物能夠在固定的氮和氧存在 下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供用于制備重組微生物的方法，其中該方法包括：（a)通過 與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子和抗生素抗性標(biāo)記基因的nifA基因的 重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因插入到微 生物的染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，其中nifL基因是通過插入誘變、刪除基因組DNA、 靶標(biāo)基因破壞或引入基因組或游離載體被破壞；和（b)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重 組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物的nifA基因的上游以獲 得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組微生物， 其中重組微生物能在固定氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0011]已知固氮菌具有倍數(shù)染色體[Punita 等人 J.Bacteriol 171 (1989)3133-3138]。 采用這個(gè)兩步驟程序以致發(fā)揮強(qiáng)的選擇壓力來確保突變被傳至每一個(gè)復(fù)制染色體是必不 可少的，因?yàn)榉駝t一段時(shí)間后將發(fā)生回復(fù)突變。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1顯示以下元素：
[0013] 圖 1A顯不來自圓褐固氣菌（Azotobacter chroococcum) CBD15 的 7. 5kb Bam HI 片 段的局部限制性酶切圖，所述圓褐固氮菌含有在PUC7中Bam HI位點(diǎn)克隆的與棕色固氮菌 UW的nifL和nifA同源的區(qū)域。該結(jié)構(gòu)表示為pCL6。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)表示為E :EcoRI ; B :BamHI ;Nc:Ncol ;Sa:SacII ;S:Sail ;K:Kpnl。與掠色固氮菌UW 的 nifL和 nifA 雜交的限 制性子片段是下劃線部分。
[0014] 圖1B顯示來自pCL6的4.8kb EcoRI片段，所述pCL6含有在pUC7中克隆的與棕 色固氮菌UW的nifL和nifA同源的區(qū)域。該結(jié)構(gòu)表示為pCL6. 2。
[0015] 圖1C顯示來自ρΗΡ45 Ω Km的2. OkbEcoRI片段，所述ρΗΡ45 Ω Km含有在pCL6. 2的 Sal I位點(diǎn)處插入的插入子ΩΚι?。該結(jié)構(gòu)表示為pCL6. 3。
[0016] 圖ID顯示來自在pCL6. 2的Sal I位點(diǎn)附近刪除1. lkb DNA片段并在相同位點(diǎn)插 入含有PBR322組合型啟動(dòng)子的0· 38kb EcoRI-BamHI片段。該結(jié)構(gòu)表示為pCL6. 4。
[0017] 圖1E顯示通過電穿孔法將結(jié)構(gòu)pCL6. 3插入圓褐固氮菌CBD15。
[0018] 圖1F顯示通過同源重組將Ω Km插入子結(jié)合到圓褐固氮菌CBD15基因組的nifL 基因中。
[0019] 圖1G顯示通過電穿孔法將在nifL基因中具有ΩΚι?插入子的結(jié)構(gòu)pCL6. 4引入圓 褐固氮菌CBD15。
[0020] 圖1H顯示通過同源重組，用含有pBR322組合型啟動(dòng)子的pCL6. 4結(jié)構(gòu)的 EcoRI-BamHI片段取代包含圓褐固氮菌基因組中的ΩΚπι插入子的nifL基因 Sal I位點(diǎn)附 近的1. lkb DNA片段。
[0021] 圖2顯示與圓褐固氮菌CBD15相比，提高的圓褐固氮菌HKD15的氨制造和排泄。
[0022] 發(fā)明目的
[0023] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在固定的氮和氧存在下能夠?qū)⒋髿獾D(zhuǎn)變成生物固定 氮的重組微生物。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在固定氮和氧存在下具有增加的固定大氣氮能力的 重組微生物,其中所述重組微生物不包含任何抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0025] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供農(nóng)作物接種菌和包含能夠在固定氮和氧存在下連續(xù) 生物固氮的本發(fā)明的重組微生物、由此增加農(nóng)作物產(chǎn)量并降低土壤退化的肥料組合物。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供降低農(nóng)業(yè)中化學(xué)含氮肥料的應(yīng)用和減少環(huán)境污染的 方式。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將注意到本文所描述的發(fā)明可以進(jìn)行不同于具體描述的那些的 變化方案和修改。應(yīng)理解本文所描述的發(fā)明包括所有這種變化方案和修改。本發(fā)明還包括 所有這種單獨(dú)地或共同地在本說明書中所提及或指示的步驟、特征、組合物和化合物，和任 意兩個(gè)或更多個(gè)所述步驟或特征的任意組合與所有組合。'
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，可采用現(xiàn)有技術(shù)內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技 術(shù)° 在文獻(xiàn)(T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook ； 1982, Molecular Cloning:a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory ；F.M.Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith,和 K. Struhl, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/ffiley Interscience,紐約）中 充分解釋了這類技術(shù)。
[0029] 定義
[0030] 為了方便，在進(jìn)一步描述本發(fā)明前，在此提供說明書、實(shí)施例和所附的權(quán)利要求中 所使用的特定術(shù)語。這些定義應(yīng)當(dāng)是根據(jù)其余的公開理解并如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。除 非另外限定，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】普通技術(shù)人 員通常理解的含義相同的含義。
[0031] 名詞的單數(shù)形式用于指一個(gè)或多于一個(gè)（即，至少一個(gè)）的該名詞。
[0032] 整個(gè)說明書中，除非上下文需要，術(shù)語"包含/包括"及其變化形式將被理解為意 味著收錄所陳述的元素或步驟或元素組或步驟組但不排除任何其他元素或步驟或元素組 或步驟組。它不意圖被解釋為"僅由· --組成"。
[0033] 術(shù)語"包括"意思是"包括但不限于"。
[0034] 術(shù)語"核酸"或"重組核酸"指的是多聚核苷酸如脫氧核糖核苷酸（DNA)，在適當(dāng)?shù)?情況下指的是核糖核苷酸（RNA)。
[0035] 本發(fā)明中描述的多聚核苷酸包括"基因"，描述的核酸分子包括"載體"或"質(zhì)粒"。 因此，術(shù)語"基因"（也稱作"結(jié)構(gòu)基因"）指的是編碼特定的氨基酸序列的多聚核苷酸，其 包含一種或更多種蛋白質(zhì)或酶的全部或部分，并且可以包括調(diào)控（非轉(zhuǎn)錄的）DNA序列，例 如確定如基因表達(dá)的條件的啟動(dòng)子序列。
[0036] 關(guān)于基因序列的術(shù)語"表達(dá)"指的是基因轉(zhuǎn)錄，在適當(dāng)情況下指的是將產(chǎn)生的mRNA 副本翻譯成蛋白質(zhì)。因此，從上下文清楚可見，蛋白質(zhì)的表達(dá)是來自開放閱讀框序列的轉(zhuǎn)錄 和翻譯的結(jié)果。
[0037] "載體"是通過其可以將核酸在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞成分之間傳播和/或轉(zhuǎn)移的任 意方式。載體包括自主復(fù)制或能結(jié)合到宿主細(xì)胞染色體中的作為"游離體"的病毒、噬菌體、 病毒前體、質(zhì)粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子和人工染色體如YAC(酵母人工染色體）、BAC(細(xì)菌人工染 色體）和PLAC(植物人工染色體）等。載體也可以是本質(zhì)上為非游離的裸露的RNA多聚核 苷酸、裸露的DNA多聚核苷酸、在相同鏈內(nèi)由DNA和RNA二者組成的多聚核苷酸、多聚-賴 氨酸配對的DNA或RNA、多肽配對的DNA或RNA、脂質(zhì)體配對的DNA或類似物，或者載體也可 以是包含以上多聚核苷酸結(jié)構(gòu)的一種或更多種的生物體，例如土壤桿菌或細(xì)菌。
[0038] "轉(zhuǎn)化"指的是通過其將重組DNA分子引入宿主細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)錄（或轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn) 染）可以通過包括電穿孔、顯微注射、基因槍（或離子撞擊介導(dǎo)的傳遞）、或土壤桿菌介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化的許多方式之一實(shí)現(xiàn)。
[0039] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，由于遺傳密碼的退化性質(zhì)，多種其核苷酸序列不同的 DNA化合物可以用來編碼本公開的給定氨基酸序列。在本文中引用編碼所描述的生物合成 酶的天然DNA序列僅以說明公開的一個(gè)實(shí)施方案，所述公開包括編碼本公開的方法中所利 用的多肽的氨基酸序列和酶的蛋白質(zhì)的任何序列的DNA化合物。同樣，多肽可以典型地耐 受在其氨基酸序列中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的取代、刪除、和插入而不缺失或顯著缺失期望 的活性。本公開包括具有不同氨基酸序列的這種多肽，而本文中所顯示的DNA序列編碼的 氨基酸序列僅說明本公開中的實(shí)施方案。
[0040] 本公開提供以重組DNA表達(dá)載體或質(zhì)粒形式的核酸分子。通常，這種載體或者可 以在宿主微生物的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制或者可以結(jié)合到宿主微生物的染色體DNA。在結(jié)合到宿主 染色體DNA的情況下，載體可以是穩(wěn)定載體（即，經(jīng)過多次細(xì)胞分裂后載體仍然存在，即使 僅具有選擇壓力）或是瞬時(shí)載體（即，隨著宿主微生物具有逐漸增加的細(xì)胞分裂次數(shù)，載體 逐漸丟失）。
[0041] 本公開提供經(jīng)分離形式的DNA分子（S卩，不純，但以自然界中未發(fā)現(xiàn)的豐度和/或 濃度存在于制備中）和經(jīng)純化形式的DNA分子（即，基本不含污染材料或基本不含自然界 中用其可以發(fā)現(xiàn)相應(yīng)DNA的材料）。
[0042] 術(shù)語"啟動(dòng)子"指的是能控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。在多數(shù)時(shí) 間或在多數(shù)環(huán)境條件下在多數(shù)細(xì)胞類型中引起基因表達(dá)的啟動(dòng)子通常被稱為"組合型啟動(dòng) 子"。僅在特定化合物或特定環(huán)境條件存在下引起基因表達(dá)的啟動(dòng)子通常被稱為"誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子"。
[0043] 術(shù)語"操作性連接"指的是核酸序列在單個(gè)核酸片段上的締合，所述締合使得其中 一個(gè)的功能受另一個(gè)影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子與該編碼序 列操作性連接。編碼序列可以以有義方向或反義方向操作性連接至調(diào)控序列。
[0044] 本發(fā)明不限于本文中所描述的僅用于舉例說明的目的的具體實(shí)施方案的范圍。如 本文中描述的，功能上等同的產(chǎn)品、組合物、和方法明顯地在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0045] 表現(xiàn)出組成型氮固定的固氮菌突變體可用作生物肥料。因此，從任意負(fù)調(diào)控釋放 涉及氮固定的所有基因應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致甚至在銨或其他固定的氮存在下提高的生物固氮，使得化 學(xué)肥料和細(xì)菌肥料可以一起使用。
[0046] 本發(fā)明提供能在固定的氮和氧存在下固定大氣氮的重組微生物，其中所述微生物 的染色體包含經(jīng)破壞的nifL基因、操作性連接至組合型異種啟動(dòng)子的nifA基因且不包含 任何抗生素抗性標(biāo)記基因，其中nifL基因被插入誘變破壞。本發(fā)明的重組微生物也不含有 其他對環(huán)境有害的任何外部基因如毒性基因。重組微生物中的期望特征通過操控其染色體 而沒有必要維持質(zhì)粒的情況下獲得。
[0047] 本發(fā)明還提供具有如SEQ ID NO :l(GenBank:X70993. 1)中所列出的核苷酸序列并 編碼如SEQ ID N0:2中所列出的氨基酸序列和SEQ ID N0:3中所列出的核苷酸序列的nifL 基因的多聚核苷酸。
[0048] 本發(fā)明還提供具有如SEQ ID NO :4(GenBank:Y00554. 1)中所列出的核苷酸序列并 編碼如SEQ ID N0:5中所列出的氨基酸序列的nifA基因的多聚核苷酸。
[0049] nifLA操縱子作為微生物中氮固定整個(gè)過程的主要調(diào)控操縱子。nifA基因的天然 啟動(dòng)子是受固定的氮和氧調(diào)控的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。當(dāng)發(fā)明人通過部分刪除nifL破壞負(fù)調(diào)控 成分并在用于在自養(yǎng)微生物、固氮微生物中連續(xù)表達(dá)的組合型異種啟動(dòng)子存在下操作性連 接正調(diào)控成分和nifA來操控作為一種二成分調(diào)控系統(tǒng)的nifLA操縱子時(shí)，發(fā)現(xiàn)了出乎意料 的結(jié)果。出人意料地發(fā)現(xiàn)：重組微生物不包含任何抗生素抗性標(biāo)記基因，且存在氮敏感的 NifA轉(zhuǎn)錄激活因子的成功的、不受限制的連續(xù)表達(dá)，所述NifA轉(zhuǎn)錄激活因子增加了重組微 生物中生物固氮水平。還發(fā)現(xiàn)，與非重組微生物相比，重組微生物產(chǎn)生并排泄高水平的氨。 使用組合型啟動(dòng)子使得重組微生物固定大氣氮非常有效。通過部分刪除破壞nifL使得不 可能回復(fù)突變成活性負(fù)調(diào)控成分，由此，使重組微生物非常穩(wěn)定。因?yàn)橐虼双@得的重組微生 物例如登記號為MTCC 5679的重組固氮菌不包含任何抗生素抗性標(biāo)記基因、或任何其他外 部基因如Bt基因、或任何毒性基因，所以它是理想的生物肥料成分。
[0050] 本發(fā)明還提供用于制備能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮的重組微生物的 方法，其中該方法包括：（a)通過與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子和抗生 素抗性標(biāo)記基因的nifA基因的重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和具有天 然啟動(dòng)子的nifA基因插入到微生物的染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，其中nifL基因是 通過插入誘變、刪除基因組DNA、靶標(biāo)基因破壞或引入基因組的或游離的載體；和（b)通過 與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化 微生物的nifA基因的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng) 子的nifA基因的重組微生物，其中重組微生物能在固定氮和氧存在下固定大氣氮并且不 包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0051] 本發(fā)明的方法包括用于通過同源重組轉(zhuǎn)化微生物的方法，其中重組微生物的染色 體包含經(jīng)破壞的nifL基因、操作性連接至組合型異種啟動(dòng)子的nifA基因并且不包含任何 抗生素抗性標(biāo)記基因。因此，通過本發(fā)明的方法制備的重組微生物能夠以連續(xù)方式固定大 氣氮并且不受外部調(diào)控因子控制。本發(fā)明的原理應(yīng)當(dāng)可應(yīng)用至所有的氮固定微生物，特別 在其中通過正的和負(fù)的調(diào)控元素使用二成分調(diào)控的氮固定微生物的情況下如此。
[0052] 在本發(fā)明中，進(jìn)行了圓褐固氮菌CBD15的部分nifL基因的刪除，所述圓褐固氮菌 CBD15是一種在印度德里的印度農(nóng)業(yè)研究所（Indian Agricultural Research Institute) 從土壤分離的一種菌株。將含有從質(zhì)粒PBR322分離的組合型tet啟動(dòng)子的DNA片段插入 包含經(jīng)破壞的nifL基因的圓褐固氮菌CBD15nifA基因的上游。這種新創(chuàng)造的刪除突變的 菌株不包含抗生素抗性標(biāo)記基因并已經(jīng)被指定為圓褐固氮菌HKD15。已經(jīng)將重組微生物遞 交到印度的MTCC，MTECH。該菌株的登記號為MTCC 5679。首先通過插入插入子并選擇nif 負(fù)型的表現(xiàn)型（沒有固定大氣氮的能力）破壞nifL基因和隨后用部分刪除的nifL基因和 異種組合型啟動(dòng)子取代破壞nifL基因的插入子以驅(qū)動(dòng)正調(diào)控元素產(chǎn)生nif正型的表現(xiàn)型 (有固定大氣氮的能力），該兩步驟策略是新的且不是顯而易見的。
[0053] 在本發(fā)明中，用限制性內(nèi)切酶BamHI將來自圓褐固氮菌CBD15的微生物DNA消化 以獲得包含nifL和nifA基因的基因組片段。nifA基因是基于與現(xiàn)有技術(shù)中已知的與nifA 和nifL基因同源性來鑒別和分離的。包含nifL和nifA基因的7. 5kb的基因組片段是基 于與棕色固氮菌UW(圖1A)的nifA和nifL的同源性分離的。該7. 5kb基因組片段被克隆 至pUC7載體并經(jīng)受進(jìn)一步限制酶內(nèi)切以獲得包含nifL和nifA基因的4. 8kb基因組片段。 該4. 8kb片段被克隆至pUC7載體，該結(jié)構(gòu)被指定為pCL6. 2 (圖1B)。pCL6. 2結(jié)構(gòu)還包含 "第二"抗生素抗性標(biāo)記基因（氨芐青霉素，Amp+)并被用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0054] 在該方法中可以使用在用于制備期望的包含關(guān)注的nifL和nifA基因的結(jié)構(gòu)的任 何宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制、但在被轉(zhuǎn)化的微生物中不穩(wěn)定且不復(fù)制的任何載體。
[0055] 在第一組轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，nifL基因通過插入誘變而被破壞。將具有"第一"抗生素 抗性標(biāo)記基因（卡那霉素，Km+)的2. Okb的插入子插入pCL6. 2結(jié)構(gòu)的nifL基因的Sal I 限制位點(diǎn)，該位點(diǎn)為nifA基因的上游而并且結(jié)構(gòu)被指定為pCL6. 3 (圖1C)。這種插入誘變 使nifL基因無功能。將pCL6. 3重組質(zhì)粒通過電穿孔進(jìn)入固氮菌細(xì)胞并允許發(fā)生同源重組 (圖1E)，其中插入子進(jìn)入細(xì)胞染色體的整合通過同源重組發(fā)生。已經(jīng)通過兩點(diǎn)交叉而進(jìn)行 成功同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是通過其對"第一"抗生素標(biāo)記（Km+)的抗性、對"第二"抗生素 標(biāo)記（Amp-)的敏感性以及其不能固定大氣氮來檢測的。
[0056] 在第二組轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，在pCL6. 2結(jié)構(gòu)的Sail位點(diǎn)附近刪除1. lkb的DNA，這使 得nifL基因被部分刪除；并將如SEQ ID N0. :6中所列出的含有組成型sigma-70啟動(dòng)子 /pBR322的tet啟動(dòng)子的375bp EcoRI-BamHI片段插入Sail位點(diǎn)以獲得結(jié)構(gòu)pCL6. 4(圖 1D)?？梢允褂玫暮铣傻幕蛱烊坏摹⒌c微生物相容的其他組合型啟動(dòng)子是合成啟動(dòng)子和天 然啟動(dòng)子如PI、bptII、CAT啟動(dòng)子等。含有組合型異種啟動(dòng)子的重組結(jié)構(gòu)pCL6. 4被進(jìn)一步 電穿孔進(jìn)入從第一組轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌細(xì)胞中。通過組合型啟動(dòng)子的側(cè)翼區(qū) 和第一轉(zhuǎn)化的固氮菌細(xì)胞之間的兩點(diǎn)互換的成功同源重組導(dǎo)致刪除"第一"抗生素抗性標(biāo) 記基因（Km)、成功將操作性連接至nifA基因的組合型異種sigma-70/tet啟動(dòng)子結(jié)合到染 色體和成功抑制微生物nifL蛋白的產(chǎn)生。通過第二轉(zhuǎn)化步驟獲得的重組固氮菌包含無功 能nifL基因、過表達(dá)nifA基因并缺乏任何抗生素抗性（Km-)。基于通過該方法獲得的重 組固氮菌對"第一"抗生素（Km_)的敏感性和其固定大氣氮的能力，測試其成功轉(zhuǎn)化。nifL 基因的部分刪除和在nifA基因上游的組合型異種啟動(dòng)子的插入通過本領(lǐng)域可用的常規(guī)方 法進(jìn)一步被確認(rèn)。這種重組固氮菌已經(jīng)被指定為圓褐固氮菌HKD15并已經(jīng)在2011年12月 14日在印度MTCC，MTECH遞交。該菌株的登記號為MTCC 5679。
[0057] 重組微生物一登記號為MTCC 5679的圓褐固氮菌HKD15在固定的氮存在下的生物 固氮被提高超過了非重組的、天然的圓褐固氮菌CBD15的生物固氮。與非重組天然圓褐固 氮菌CBD15菌株的氮固定相比，在登記號為MTCC 5679的圓褐固氮菌HKD15中觀察到氮固 定的增加3倍（表1)。登記號為MTCC 5679的圓褐固氮菌還顯示提高的氨表達(dá)和排泄，其 中氨排泄與非重組天然圓褐固氮菌CBD15菌株的相比增加了 9倍。另外，觀察到表達(dá)不受 以尿素或銨鹽形式的固定的氮的存在影響。重組微生物一登記號為MTCC 5679的圓褐固氮 菌HKD15的生物肥料效力高于圓褐固氮菌CBD15,如當(dāng)用登記號為MTCC 5679的重組圓褐固 氮菌HKD15接種相比于非重組天然圓褐固氮菌CBD15菌株接種農(nóng)作物植物時(shí)所觀察到的。
[0058] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供一種重組微生物，其包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因 和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因，其中該微生物能夠在固定的氮和 氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0059] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操 作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中該微生物能夠在固 定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，其中所述微生物選自：綠色 硫細(xì)菌（Green sulfur bacteria)、厚壁細(xì)菌（Firmibacteria)、放線菌（Thallobacteria)、 日光桿菌（Heliobacteria)、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria)、彎曲桿菌（Campylobacter)、變形菌 (Proteobacteria)、古細(xì)菌（Archaeobacteria)和丙酸螺菌（Propionispira)。
[0060] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連 接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中該微生物能夠在固定的 氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，其中所述微生物是固氮菌種群 (Azotobacter spp.)〇
[0061] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接 至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中該微生物能夠在固定的氮和 氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，其中所述固氮菌選自：圓褐固氮菌、棕 色固氮菌、Azotobacter armenaicus、拜葉林克氏固氮菌、Azotobacter nigricans和雀稗 固氮菌。
[0062] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了登記號為MTCC 5679的重組固氮菌，其 中所述固氮菌能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0063] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了登記號為MTCC 5679的重組固氮菌，其中 所述固氮菌能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮，其中所述固氮菌包含經(jīng)破壞的染色體 nifL基因和操作性連接至異種組合型啟動(dòng)子的染色體nifA基因且不包含抗生素抗性標(biāo)記 基因。
[0064] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連 接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中所述微生物能夠在固定的 氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，其中nifL基因通過插入誘變、 刪除基因組DNA、靶標(biāo)基因破壞或引入基因組的或游離的載體被破壞。
[0065] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連 接至異種組合型啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組DNA分子。
[0066] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含重組DNA分子的重組載體，所述重組 DNA分子包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至異種組合型啟動(dòng)子的染色體nifA 基因。
[0067] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于制備重組微生物的方法，其中所述方 法包括：（a)通過與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子和抗生素抗性標(biāo)記基 因的nifA基因的重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和nifA基因插入到微生 物的染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，其中nifL基因是通過插入誘變、刪除基因組DNA、靶 標(biāo)基因破壞或引入基因組或游離載體而被破壞的；和（b)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的 重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物的nifA基因的上游 以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組微生 物，其中重組微生物能在固定氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。 [0068] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于制備重組微生物的方法，其中所述方法 包括（a)通過與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子和抗生素抗性標(biāo)記基因的 nifA基因的重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和nifA基因插入到微生物的 染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，其中nifL基因通過利用插入插入子進(jìn)行的插入誘變而 被破壞；和（b)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟 動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物的nifA基因的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接 至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組微生物，其中重組微生物能在固定的氮和氧存在 下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0069] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種重組微生物，其通過包含以下的方法 制備：(a)通過與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子和抗生素抗性標(biāo)記基因 的nifA基因的重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和nifA基因插入到微生物 的染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述nifL基因是通過插入誘變、刪除基因組DNA、 靶標(biāo)基因破壞或引入基因組的或游離的載體被破壞，和（b)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子 的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物的nifA基因的上游 以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組微生 物，其中所述重組微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo) 記基因。
[0070] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過包含以下步驟的方法制備的重組固氮 菌種群：（a)通過與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子和抗生素抗性標(biāo)記基 因的nifA基因的重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和nifA基因插入到固氮 菌的染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其中nifL基因是通過插入誘變、刪除基因組DNA、靶 標(biāo)基因破壞或引入基因組或游離載體被破壞的，和（b)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重 組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌的nifA基因的上游以獲 得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌， 其中所述重組固氮菌能在固定氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0071] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種用于制備重組固氮菌的方法，其中 所述方法包括：（a)提供一種包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因的重 組DNA結(jié)構(gòu)，其中所述nifL基因通過插入誘變、刪除基因組DNA、靶標(biāo)基因破壞或引入基因 組的或游離的載體被破壞；(b)通過用步驟a的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組， 將經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因插入至微生物的染色體中；（c)選擇 經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌不能固定大氣氮；（d)通過與包含組成型異種 啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌的nifA基因 的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重 組固氮菌；和（e)在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇來自步驟（d)的重組固氮菌，其中所述重 組固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0072] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種用于制備重組固氮菌的方法，其中 所述方法包括：（a)提供一種包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因的重 組DNA結(jié)構(gòu)，其中所述nifL基因通過利用插入插入子進(jìn)行的插入誘變破壞；(b)通過用步 驟a的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子 的nifA基因插入至微生物的染色體中；（c)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮 菌不能固定大氣氮；（d)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成 型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌的nifA基因的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操 作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌；和（e)在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基 上選擇來自步驟（d)的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大 氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0073] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于制備登記號為MTCC 5679的圓褐 固氮菌HKD15的方法，其中所述方法包括（a)提供一種包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然 啟動(dòng)子的nifA基因的重組DNA結(jié)構(gòu)，其中所述nifL基因用通過插入插入子進(jìn)行的插入誘 變破壞；(b)通過用步驟a的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基 因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因插入至微生物的染色體中；（c)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其 中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌不能固定大氣氮；（d)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分 子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌的nifA基因的上游以獲得包含 經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌；和（e) 在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇來自步驟（d)的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能在固 定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0074] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過包含以下步驟的方法制備的重組固氮 菌：（a)提供一種包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因的重組DNA結(jié)構(gòu)， 其中所述nifL基因通過插入誘變、刪除基因組DNA、靶標(biāo)基因破壞或引入基因組的或游離 的載體被破壞；(b)通過用步驟a的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組，將經(jīng)破壞的 nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因插入至微生物的染色體中；（c)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮 菌，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌不能固定大氣氮；（d)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組 DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌的nifA基因的上游以獲得 包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌；和 (e)在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇來自步驟（d)的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能 在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0075] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過包含以下步驟的方法制備的重組固氮 菌：（a)提供一種包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因的重組DNA結(jié)構(gòu)， 其中所述nifL基因被通過插入插入子進(jìn)行的插入誘變破壞；(b)通過用步驟a的重組DNA 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因插 入至微生物的染色體中；（c)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌是不能固定 大氣氮的；（d)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟 動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌的nifA基因的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接 至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌；和（e)在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇來 自步驟（d)的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不 包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0076] 本發(fā)明的一個(gè)有益實(shí)施方案中，提供了包含重組微生物的組合物，所述重組微生 物包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因， 其中該微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0077] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含重組微生物的組合物，所述重組微生 物通過包含以下步驟的方法制備：（a)提供一種包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子 的nifA基因的重組DNA結(jié)構(gòu)，其中所述nifL基因被插入子插入破壞；(b)通過用步驟a的 重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組，將經(jīng)破壞的n i fL基因和具有天然啟動(dòng)子的n i fA 基因插入至微生物的染色體中；（c)選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌不能 固定大氣氮；（d)通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種 啟動(dòng)子插入至經(jīng)轉(zhuǎn)化固氮菌nifA基因的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連接 至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌；和（e)在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇來 自步驟（d)的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不 包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0078] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含以下的組合物：(a)包含經(jīng)破壞的染色 體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中所 述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，和（b) 載體。
[0079] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含以下的組合物：(a)包含經(jīng)破壞的染色 體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組固氮菌，其中所 述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，和（b) 載體。
[0080] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含以下的組合物：(a)包含經(jīng)破壞的染 色體nifL基因和操作性連接至異種組合型啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中 所述微生物能在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因；和（b)農(nóng) 業(yè)上可接受的載體。
[0081] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了包含重組微生物的生物肥料組合物， 所述重組微生物包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色 體nifA基因，其中所述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素 抗性標(biāo)記基因。
[0082] 在本發(fā)明的另一個(gè)的實(shí)施方案中，提供了包含重組固氮菌的生物肥料組合物，所 述重組固氮菌包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體 nifA基因，其中所述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性 標(biāo)記基因。
[0083] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種包含登記號為MTCC 5679的重組固氮 菌的生物肥料組合物，所述重組固氮菌包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組 成型異種啟動(dòng)子的染色體的nifA基因，其中所述固氮菌能夠在固定氮和氧存在下固定大 氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0084] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含以下的組合物：(a)包含經(jīng)破壞的染色 體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因的重組微生物，其中所 述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因，和（b) 選自鉀、磷、碳、氮、鐵、硫、鈣、鎂、鋅、微量元素、生長因子、殺蟲劑、抗白蟻劑、細(xì)菌和/或藻 類的一種或更多種成分。
[0085] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供重組微生物用于制備提高土壤肥力的肥料組合物的 用途，所述重組微生物包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子 的染色體nifA基因，其中所述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不包含 抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0086] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組固氮菌用于制備用于提高土壤肥力的肥 料組合物的用途，所述重組固氮菌包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型 異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因，其中所述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮 并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0087] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了登記號為MTCC 5679的重組固氮菌用于制備 用于提高土壤肥力的肥料組合物的用途，所述重組固氮菌包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因 和操作性連接至組成型異種啟動(dòng)子的染色體nifA基因，其中所述固氮菌能夠在固定的氮 和氧存在下固定大氣氮并且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
[0088] 本發(fā)明不限于本文中所描述的僅用于舉例說明的目的的具體實(shí)施方案的范圍。如 本文中描述的，功能等價(jià)的產(chǎn)品、組合物、和方法明顯地在本發(fā)明的范圍內(nèi)。盡管根據(jù)本主 旨的一些優(yōu)選實(shí)施方案已經(jīng)非常詳細(xì)地描述了主旨，其他實(shí)施方案仍是可能的。因此，所附 的權(quán)利要求的精神和范圍不應(yīng)當(dāng)被限制于本文中含有的優(yōu)選實(shí)施例的描述。
[0089] 實(shí)施例
[0090] 現(xiàn)將用操作實(shí)施例來說明本公開，所述操作實(shí)施例意在說明公開的操作并不意在 對本發(fā)明的范圍限制性地采取任何限制。
[0091] 發(fā)明人期初進(jìn)行了限制性刪除從威斯康星大學(xué)獲得的菌株棕色固氮菌UW的nigL 基因的一小部分。將含有從質(zhì)粒PBR322分離的具有375個(gè)堿基的組合型sigma70啟動(dòng)子 的限制酶片段插入棕色固氮菌UW nifA基因的上游。nifA基因的表達(dá)，即銨的產(chǎn)出和排泄 被增加若干倍，且這種表達(dá)不受尿素或銨鹽的存在影響。
[0092] 實(shí)施例1
[0093] 圓褐固氣菌CBD15的nifL和nifA基因的分離
[0094] 在本研究中使用了圓褐固氮菌CBD15, 一種在印度德里的印度農(nóng)業(yè)研究所從土壤 分離的菌株。
[0095] 利用常規(guī)方法并基于與棕色固氮菌UW的nifL和nifA基因的已知序列的同源性， 分離了來自含有nifL基因和nifA基因的圓褐固氮菌CBD15的7. 5kb大小的基因組片段， 所述nifL基因包含如SEQ ID N0 :6中所列出的核苷酸序列。將該片段純化并在BamHI限 制位點(diǎn)連接進(jìn)入克隆載體PUC7以獲得第一重組載體。這種包含7. 5kb片段的重組載體被 指定為pCL6(圖1A)并被引入至感受態(tài)大腸桿菌（E.coli)細(xì)胞。利用放射標(biāo)簽的探針和 克隆雜交技術(shù)篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0096] 用各種限制性內(nèi)切酶將來自擁有7. 5kb插入物的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的質(zhì)粒進(jìn)一步酶切。 通過用EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切，獲得含有nifL基因和nifA基因4. 8kb的片段。將該片 段純化并隨后克隆進(jìn)入載體PUC7以獲得第二重組載體。這種包含4. 8kb片段的重組載體 被指定為PCL6. 2(圖1B)并被用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
[0097] 基因庫登記號為 X70993.1(SEQ ID N0:1)，SEQ ID N0:3，NC_012560. 1，X64832. 1，.3.也可以用于基因操作和制備能夠在固定的氮、氧或其組 合存在下固定氮的重組微生物。
[0098] 基因庫登記號為 Y00554. 1(SEQ ID N0:4)、J03411. 1 和 M26751. 1 的關(guān)于 nifA 基 因的其他已知DNA序列也可以用于基因操作和制備能夠在固定的氮、氧或其組合存在下固 定氮的重組微生物。
[0099] 實(shí)施例2
[0100] nifL的定點(diǎn)插入誘變
[0101] 將插入子Ω Km插入至圓福固氮，菌CBD15的nifL
[0102] 將含有插入子 ΩΚι? 的來自 pH F45QKm(R. Fellay, J. Frey, Η· Krisch, 1987 ; Gene;52:147)的2.0kb EcoRI片段在nifL基因的Sal I位點(diǎn)插入至pCL6.2,所述Sal I位 點(diǎn)是nifA的上游。這種結(jié)構(gòu)被指定為pCL6. 3且其包含"第一"抗生素抗性標(biāo)記基因（Km+) (圖1C)。質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因被指定為"第二"抗生素抗性標(biāo)記基因（Amp+)。
[0103] 用dCL6. 3電穿孔圓福固氮菌CBD15以在其某閔鉬的nifL某閔處插入插入子 Ω Km
[0104] 用重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)pCL6. 3將圓褐固氮菌CBD15電穿孔以獲得第一組經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 選擇顯示卡那霉素 （kanamycin)抗性（m+)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。將細(xì)胞用于沒有氨芐青霉素 抗性（Amp-)和沒有氮固定的分析。這確保了 pCL6. 3在圓褐固氮菌CBD15中不穩(wěn)定，且細(xì) 胞的卡那霉素抗性是PCL6. 3中插入子Ω Km的側(cè)翼區(qū)和圓褐固氮菌CBD15之間的兩點(diǎn)交叉 的同源重組的結(jié)果（圖1E和圖1F)。
[0105] 實(shí)施例3
[0106] nifL基因的部分刪除與pBR322組合型啟動(dòng)子的克隆
[0107] 使用了包含如SEQ ID N0 :6中所列出的組合型啟動(dòng)子（核苷酸1至377)的來自 PBR322 的 375bp EcoRI-BamHI 片段。
[0108] 將在pCL6. 2的Sal I位點(diǎn)附近的1. lkb DNA片段刪除并在pCL6. 2的Sal I位點(diǎn) 附近的1. lkb DNA片段刪除位點(diǎn)處插入含有pBR322組合型啟動(dòng)子（SEQ ID N0:6)的375kb 的EcoRI-BamHI片段。這種含有組合型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)被表示為pCL6. 4(圖ID)。
[0109] 實(shí)施例4
[0110] 將部分刪除的nifL和nifL上游的組合型啟動(dòng)子結(jié)合到微生物的基因組
[0111] 用重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)pCL6.4(圖1G)電穿孔第一組包含ΩΚπι插入子和"第一"抗生素 抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化圓褐固氮菌CBD15。將通過pCL6. 4中插入子Ω Km的側(cè)翼區(qū)和圓褐固 氮菌CBD15的第一組轉(zhuǎn)化細(xì)胞（Km+)之間的兩點(diǎn)交換的同源重組的結(jié)果被成功轉(zhuǎn)化的那些 細(xì)胞用于沒有"第一"抗生素抗性標(biāo)記基因的分析和其固氮能力的分析（圖1H)已經(jīng)經(jīng)過 成功同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞對"第一"抗生素抗性標(biāo)記基因、卡那霉素敏感。該重組微生物已 經(jīng)被指定為圓褐固氮菌HKD15. 2011年12月14日在印度MTCC，MTECH已經(jīng)遞交了該重組 微生物。該菌株的登記號為MTCC 5679。
[0112] 在圓褐固氮菌HKD15的染色體中nifL基因的部分刪除和pBR322組合型啟動(dòng)子的 插入已經(jīng)通過Southern印跡和PCR分析得到確認(rèn)。
[0113] 實(shí)施例5
[0114] 重組圓褐固氮菌HKD15的特征
[0115] 在固定的氮，存在下圓福固氮，菌HKD15的固氮，定會g力
[0116] 氮的還原很難分析。然而，已知固氮酶也能夠還原乙炔。因此，乙炔至乙烯的還原 被接受為固氮酶的測量。向蓋螺蓋的管中培養(yǎng)的細(xì)菌供給特定量的乙炔并在30°C孵育。24 小時(shí)后，通過氣象色譜檢測產(chǎn)生的乙烯量和剩余的乙炔量并與乙炔的起始量比較。
[0117] 與天然菌株圓褐固氮菌CBD1相比，通過圓褐固氮菌HKD15中的組合型啟動(dòng)子，乙 炔還原增加了三倍（參見表1)。
[0118] 表1 :固定氮源（乙酸銨）對圓褐固氮菌CBD15和圓褐固氮菌HKD15還原乙炔的 影響
[0119]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組微生物，其包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至組成型異種啟 動(dòng)子的染色體nifA基因，其中所述微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮并且不 包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
2. 權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物選自綠色硫細(xì)菌、厚壁細(xì)菌、放線 菌、日光桿菌、藍(lán)細(xì)菌、彎曲桿菌、變形菌、古細(xì)菌和丙酸螺菌。
3. 權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物是固氮菌種群。
4. 權(quán)利要求3所述的重組微生物，其中所述固氮菌選自圓褐固氮菌、棕色固氮菌、 Azotobacter armenaicus、拜葉林克氏固氮菌、Azotobacter nigricans 和雀稗固氮菌。
5. -種登記號為MTCC 5679的重組固氮菌，其中所述固氮菌能夠在固定的氮和氧存在 下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
6. 權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述nifL基因通過插入誘變、刪除基因組DNA、 靶標(biāo)基因破壞、或引入基因組的或游離的載體而被破壞。
7. -種重組DNA分子，其包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因和操作性連接至異種組合型啟 動(dòng)子的染色體nifA基因。
8. -種重組載體，其包含權(quán)利要求7所述的重組DNA分子。
9. 一種用于制備重組微生物的方法，其中所述方法包括： (a) 通過與包含經(jīng)破壞的染色體nifL基因、具有天然啟動(dòng)子的nifA基因、和抗生素抗 性標(biāo)記基因的重組DNA分子的同源重組，將經(jīng)破壞的nifL基因和nifA基因插入到所述微 生物的染色體中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述nifL基因是通過插入誘變、刪除基因組 DNA、靶標(biāo)基因破壞、或引入基因組的或游離的載體而被破壞的； (b) 通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子 插入至所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物的nifA基因的上游，以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性 連接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組微生物； 其中所述重組微生物能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo) 記基因。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述插入誘變是通過插入子插入來進(jìn)行的。
11. 一種重組微生物，其通過權(quán)利要求9所述的方法制備。
12. 權(quán)利要求11所述的重組微生物，其中所述微生物是固氮菌種群。
13. -種用于制備能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮的重組固氮菌的方法，其中 所述方法包括： (a) 提供包含經(jīng)破壞的nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因的重組DNA結(jié)構(gòu)，其中 所述nifL基因是通過插入子插入而被破壞的， (b) 通過用步驟（a)的所述重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化固氮菌細(xì)胞的同源重組，將經(jīng)破壞的 nifL基因和具有天然啟動(dòng)子的nifA基因插入至微生物的染色體中， (c) 選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌不能固定大氣氮， (d) 通過與包含組成型異種啟動(dòng)子的重組DNA分子的同源重組，將組成型異種啟動(dòng)子 插入至所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的固氮菌的nifA基因的上游以獲得包含經(jīng)破壞的nifL基因和操作性連 接至組成型異種啟動(dòng)子的nifA基因的重組固氮菌，和 (e) 在缺少氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇來自步驟（d)的重組固氮菌， 其中所述重組固氮菌能夠在固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo) 記基因。
14. 一種根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法獲得的重組固氮菌，其中所述重組固氮菌能夠在 固定的氮和氧存在下固定大氣氮且不包含抗生素抗性標(biāo)記基因。
15. -種包含權(quán)利要求1所述的重組微生物或權(quán)利要求14所述的固氮菌的組合物。
16. 權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述組合物任選地包含載體。
17. 權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
18. 權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述組合物是生物肥料。
19. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其任選地包含選自鉀、磷、碳、氮、鐵、硫、鈣、 鎂、鋅、微量元素、生長因子、殺蟲劑、抗白蟻劑、細(xì)菌、藻類的一種或更多種成分。
20. 權(quán)利要求1所述的重組微生物、或權(quán)利要求14所述的固氮菌、或前述權(quán)利要求中任 一項(xiàng)所述的組合物用于制備用于提高土壤肥力的肥料組合物的用途。
【文檔編號】C07K14/195GK104204211SQ201380012076
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月3日
【發(fā)明者】希倫德拉·庫馬爾·達(dá)斯 申請人:科技部生物技術(shù)局, 尼赫魯大學(xué)