具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂的雙重特異性的重組抗體以及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性和高親和力并且不識(shí)別其他神經(jīng)節(jié)苷脂的新型單克隆抗體和這些抗體的片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及這些抗體及其片段在腫瘤治療中的用途，所述腫瘤具有被這些抗體所識(shí)別的所述兩種抗原中任一種的顯著表達(dá)，或所述兩種抗原的混合表達(dá)。本發(fā)明還涉及這些抗體在表達(dá)所述抗原中至少一種的腫瘤的診斷中的用途。
【專利說明】具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂的雙重特異性的重組抗體以及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，和特別地涉及人類健康。在本發(fā)明中描述了通過基因工程技術(shù)進(jìn)行改造的單克隆抗體，和這些抗體及其片段在腫瘤的治療和/或診斷中的用途。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]作為腫瘤相關(guān)抗原的神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3
[0003]神經(jīng)節(jié)苷脂是包含唾液酸并且存在于脊椎動(dòng)物質(zhì)膜中的鞘糖脂。這些分子參與各種功能例如細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織發(fā)育與分化，并且還參與腫瘤進(jìn)展(Hakomori，PNASUSA 99:225-32，2002)。
[0004]由于它們在一定類型的癌癥中顯現(xiàn)出表達(dá)或其表達(dá)增加，數(shù)種神經(jīng)節(jié)苷脂已被表征為腫瘤相關(guān)抗原。在這些與腫瘤相關(guān)的神經(jīng)節(jié)苷脂之中，包括N-羥乙酰GM3 (NeuGc-GM3)和N-乙酰GM3 (NeuAc-GM3,或簡單地GM3)。
[0005]NeuGc-GM3 在正常的人組織中不表達(dá)(Varki, B1chimie83:615-622, 2001)，但在幾種類型的腫瘤中顯現(xiàn)出表達(dá)(Marquina等人，Cancer Res 56:5165-71，1996 ；Fernandez等人，Expert Rev Vaccines 2:817-23,2003)。本發(fā)明涉及以高親和力識(shí)別N-輕乙酰GM3和N-乙酰GM3兩者的單克隆抗體。
[0006]N-乙酸 GM3 在正常的人組織中是普遍的(Svennerholm, Structure and Funct1nof Gangl1sides, Plenum Press, New York-London,第 533-540 頁，1980 ;Prokazova 等人，B1chemistry (Moscow) 74:235-49, 2009),但它也被定義為腫瘤相關(guān)抗原，因?yàn)樗诓煌愋偷陌┌Y中過表達(dá)(Hersey 等人，Int J Cancer 41:336-43，1988 ;Ravindranath等人,B1chem B1phys Res Commun 353:251-8, 2007 ；Noguchi 等人,Glycob1logy16:641-50, 2006).在一項(xiàng)由美國國家癌癥研究所組織的、旨在確定哪些抗原應(yīng)當(dāng)在癌癥的免疫療法中優(yōu)先考慮作為靶標(biāo)的近期研究中，GM3在75種所選擇的抗原中占據(jù)第48位(Cheever 等人，Clinical Cancer Res 15:5323-37,2009)。
[0007]神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3具有非常相似的結(jié)構(gòu)，其由三個(gè)糖單元(唾液酸、半乳糖和葡萄糖)和一個(gè)神經(jīng)酰胺尾巴構(gòu)成(圖1)。它們之間的差異僅在于在N-乙酰唾液酸(NeuAc)的含氮官能團(tuán)中存在的甲基基團(tuán)的羥基化，這導(dǎo)致形成N-羥乙酰唾液酸(NeuGc)。也就是說，它們之間的差異僅在于在唾液酸中氫原子被羥基基團(tuán)取代。然而，該小的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致被免疫系統(tǒng)的有差別的識(shí)別(Portoukalian, Clin Rev AllergyTmmunol 19:73-78, 2000 ；Varki, B1chimie 83:615-22,2001)。
[0008]識(shí)別N-乙酰GM3的單克隆抗體
[0009]在文獻(xiàn)中已描述了數(shù)種識(shí)別GM3(N_乙?；?的人類或鼠類來源的單克隆抗體:M2590 mAb (鼠類 IgM) (Hirabayashi 等人，J B1l Chem 260:13328-33, 1985) ；FCM1mAb(人 IgM)(Yamaguchi 等人，PNAS 84:2416-20, 1987) ；DH2 mAb(鼠類 IgG) (Dohi 等人，Cancer Res 48, 5680-5，1988) ；GMR6 mAb (鼠類 IgM) (Kotani 等人，B1chim B1physActa 1117:97-103, 1992) ；L612 mAb (人 IgM) (Hoon等人，Cancer Res 53:5244-20, 1993)；mAbs “17” 和 AH18(人 IgM) (Brandt 等人，專利 US005610280A, 1997) ；GMA1 mAb ( A IgG)(Mukerjee 等人,Hybridoma 17:133-42，1998)。在這八種抗體之中，mAbs DH2 和 L612 已被證明對于GM3是特異的，而其余六種抗體顯示對于其他神經(jīng)節(jié)苷脂的擴(kuò)展的反應(yīng)性。這些抗體中沒有一個(gè)顯示出識(shí)別N-羥乙酰GM3，也沒有一個(gè)顯示出識(shí)別其他N-羥乙?；纳窠?jīng)節(jié)苷脂。
[0010]在更近期的一項(xiàng)工作中，從在噬菌體表面上表達(dá)的單鏈Fv片段(SCFv)文庫中獲得了三種抗-GM3抗體(稱為GM3A6、GM3A8和GM3A15)。所述文庫是從一組癌癥患者的抗體基因儲(chǔ)庫開始構(gòu)建的(Lee 等人，J Am Chem Soc 124:12439-46,2002)。通過 SPR/Biacore測得的這些scFv片段的解離常數(shù)(KD)為大約10-5-1(TM。
[0011]通常，抗神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體的親和力是低的或中等的。關(guān)于這些抗體中的幾種抗體的Fab片段,通過SPR/Biacore測得的解離常數(shù)為大約I(T6-1(T7M(Catimel等人，Glycob1logy 8:927-38 ;Boffey 等人，J Neuroimmunol 165:92-103，2005 ;Townson等人，Glycob1logyl7:294-303, 2007)，具有極少的例外，例如抗-GD2和抗-GDlb片段，其具有大約 ICT8M 的 KD (Boffey 等人，J Neuroimmunol 165:92-103, 2005 ；Hu 等人，J Tmmunol183:5748-55，2009)。
[0012]在神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3的特別情況下，其低的免疫原性對于獲得高親和力的IgG抗體是一個(gè)巨大的障礙(Livingston等人，Cancer Tmmunol Immunother29:179-84, 1989 ；Portoukalian, Clin Rev Allergy Tmmunol 19:73-8,2000)。
[0013]用抗-N-乙酰GM3抗體的臨床前和臨床結(jié)果
[0014]在文獻(xiàn)中所描述的各種不同的抗-GM3抗體之中，已經(jīng)發(fā)表了關(guān)于mAbs DH2和L612的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性的證據(jù)?？贵wDH2在體外誘導(dǎo)依賴于抗體的細(xì)胞毒性，并且在C57BL/6小鼠中抑制B16黑素瘤細(xì)胞的生長(Dohi等人，Cancer Res 48，5680-5，1988)。mAb L612在用表達(dá)GM3的癌細(xì)胞在體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(Nishinaka等人，J Immunogenetics 48:73-5,1998)。以六聚體IgM形式的該抗體的經(jīng)工程改造的形式顯示出增加的產(chǎn)生依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞死亡的能力和更大的在小鼠中的抗腫瘤效應(yīng)(Azuma 等人，Clin Cancer Res 13:2745-50,2007)。
[0015]已經(jīng)將mAb L612用于臨床，在包括九名轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的I期試驗(yàn)中(Irie等人，Cancer Immunol Immunother 53:110-7,2004)。迄今為止，這是已被記錄的唯一的用抗-N-乙酰GM3抗體的臨床試驗(yàn)。數(shù)位患者對于治療具有臨床應(yīng)答。此外，該抗體未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，盡管N-乙酰GM3在正常組織中普遍存在。
[0016]N-乙酰GM3還是在臨床中主動(dòng)療法的靶標(biāo)，在黑素瘤患者中用GM3/VSSP疫苗的I期試驗(yàn)中(Guthmann等人，J Immunother27:242-51，2004)。以前,在12個(gè)月期間在猴子中進(jìn)行的臨床前試驗(yàn)中，該疫苗產(chǎn)生了強(qiáng)烈的IgM和IgG類型的抗-GM3抗體的應(yīng)答，然而未產(chǎn)生毒性效應(yīng)(Bada等人，Exp Toxicol.21:263-7, 2002)。在臨床試驗(yàn)中，在患者中產(chǎn)生的抗-N-乙酰GM3抗體是IgM類型的，并且也沒有觀察到重大的毒性效應(yīng)。
[0017]識(shí)別N-羥乙酰GM3的單克隆抗體
[0018]在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了兩種識(shí)別N-羥乙酰GM3但不識(shí)別其N-乙?；凅w的單克隆抗體:mAb P3 (鼠類 IgM) (Vazquez 等人,Hybridomal4:551-56，1995)和 mAb 14F7 (鼠類IgG) (Carr等人，Hybridomal9:241-47，2000)。抗體P3還識(shí)別其他的N-輕乙?；纳窠?jīng)節(jié)苷脂(Moreno等人，Glycob1logy 8, 695-708, 1998),而抗體14F7經(jīng)證明對于N-輕乙酰GM3是特異的。
[0019]作為本發(fā)明的目標(biāo)的抗體的設(shè)計(jì)和基因工程改造基于抗體14F7的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和晶體學(xué)結(jié)構(gòu)(Krengel等人，J B1l Chem279:5597-603，2004)。
[0020]單克隆抗體14F7
[0021]由以登錄號ECACC 98101901進(jìn)行保藏的雜交瘤所產(chǎn)生的鼠類單克隆抗體14F7描述在專利申請EP 0972782/A1中。該抗體的人源化變體和片段描述在專利申請WO2004/094477/A1 中。
[0022]mAb 14F7 是以高特異性(Carr 等人，Hybridoma 19:241-47, 2000)和高親和力識(shí)別N-羥乙酰GM3的IgGl同種型的免疫球蛋白，具有對于其scFv片段而測得的大約10_8M的解離常數(shù)(Rojas等人，J Immunol Methods 293:71-83,2004)。免疫組織化學(xué)研究已證明，抗體14F7識(shí)別數(shù)種類型的腫瘤，例如乳腺導(dǎo)管癌和黑素瘤(Carr等人，Hybridoma19:241-47, 2000),胃、結(jié)腸和膜腺的腺癌(Blanco 等人，ISRN Gastroenterol, ArticleID 645641,2011)，生殖泌尿系統(tǒng)的腫瘤(Blanco 等人，ISRN Pathology, Article ID953803，2011),和神經(jīng)外胚層的腫瘤(Scursoni 等人，Clin Devel Immunol, Article ID245181，2011)。
[0023]mAb 14F7與N-羥乙酰GM3的結(jié)合位點(diǎn)位于其重鏈可變區(qū)(VH)中，如從在噬菌體上表達(dá)的scFv片段的文庫的構(gòu)建中所顯示的，這些scFv片段將mAb 14F7的VH結(jié)構(gòu)域與鼠類和人類的各種各樣的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)相組合(Rojas等人，J Immunol Methods293:71-83, 2004)。該文庫的超過三分之一的片段能夠識(shí)別N-羥乙酰GM3，這也證明了 mAb14F7的VH結(jié)構(gòu)域可以與各種不同的VL結(jié)構(gòu)域相聯(lián)合并保持該抗體的原始的特異性。
[0024]在體外和體內(nèi)研究中，mAb 14F7能夠引起不依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞死亡并抑制在小鼠中骨髓瘤的生長(Carr等人，Hybridoma 21:463-8，2002)。在乳腺癌患者中進(jìn)行的I/II期前瞻性臨床試驗(yàn)之中，用锝標(biāo)記的抗體14F7在腫瘤中積累(Oliva等人，Breast CancerRes Treat96:115-21，2006)。
[0025]后來的研究證明，通過在細(xì)胞膜中引起損傷的新型機(jī)制，抗體14F7殺死腫瘤細(xì)胞，但不殺死正常細(xì)胞(Roque-Navarro 等人，Mol Cancer Ther 7:2033-41, 2008) ? mAb14F7的高親和力對于產(chǎn)生該類型的死亡來說是一個(gè)重要的因素，如用具有增加的親和力的抗體P3的突變體進(jìn)行的近期實(shí)驗(yàn)所證明的那樣(Fernandez-Marrero等人，Mol Immunol48:1059-67, 2011) ο抗體P3或其嵌合變體P3Q(其具有mAb P3的可變區(qū)和人IgGl的恒定區(qū))不能夠在表達(dá)N-羥乙酰GM3的腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生不依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞死亡。然而，由Fernandez-Marrero等人所獲得的突變體P3Q E99R(其具有更高的對于N-輕乙酰GM3的親和力(在mAbs P3Q和14F7的親和力之間))能夠產(chǎn)生不依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞死亡。具有更高親和力的mAb 14F7具有比由突變體P3Q E99R所產(chǎn)生的更大的死亡效應(yīng)。
[0026]以N-羥乙酰GM3作為靶標(biāo)的臨床療法
[0027]迄今為止，關(guān)于識(shí)別神經(jīng)節(jié)苷脂N-羥乙酰GM3的抗體可以具有抗腫瘤效應(yīng)的最強(qiáng)證據(jù)來自以該神經(jīng)節(jié)苷脂作為靶標(biāo)的兩種疫苗產(chǎn)品的II/ΠΙ期臨床試驗(yàn)。這些產(chǎn)品之一為在其制劑中包含N-羥乙酰GM3分子本身的NGcGM3/VSSP疫苗，而另一種產(chǎn)品為稱為雷妥莫單抗(Racotumumab)或IElO的抗獨(dú)特型抗體(Ferndindez等人，Clin DevelImmunol, Article ID 814397,2010)。這兩種疫苗都在癌癥患者中產(chǎn)生高的抗-N-羥乙酰GM3抗體滴度，具有經(jīng)證明的抗腫瘤效應(yīng)(Ferndindez等人，Clin Devel Immunol, ArticleID 814397，2010 ;Hernc5ndez 等人，J Immunol 186:3735-44,2011)。
[0028]在噬菌體上表達(dá)的抗體片段文庫
[0029]作為本發(fā)明目標(biāo)的具有雙重特異性的抗體從在絲狀噬菌體上表達(dá)的scFv片段的組合文庫中獲得，所述文庫是特別為該目的而設(shè)計(jì)的。
[0030]在噬菌體上的抗體片段展示(或縮寫為“噬菌體表達(dá)”)技術(shù)是一種高通量技術(shù)，其允許產(chǎn)生包含大量的(直至數(shù)十億)具有不同氨基酸序列的片段的文庫，和隨后選擇在特異性和親和力方面具有所希望的結(jié)合能力的片段(Hoogenboom, Methods Mol B1l178:1-37，2002)。
[0031]具有雙重特異性的抗體
[0032]癌癥是特征在于遺傳異質(zhì)性的疾病，這使得用單一的治療試劑對其進(jìn)行治療變得困難。由于該原因，針對多個(gè)與該疾病相關(guān)的分子靶標(biāo)的聯(lián)合療法具有更大的成功可能性。在該意義上，可能的是使用具有不同特異性的抗體的混合物，但該類型的療法由于開發(fā)和制造這些不同抗體中的每一種抗體的高成本而結(jié)果會(huì)是非常昂貴的。
[0033]用基因工程技術(shù)已經(jīng)可能產(chǎn)生各種不同的解決方案以獲得具有識(shí)別兩個(gè)或更多個(gè)分子的能力的抗體或源自其的片段。這些分析研究基本上在于將超過一個(gè)的抗體結(jié)合位點(diǎn)(每一個(gè)具有不同的特異性)組合為同一個(gè)分子構(gòu)建物(Hudson和Souriau, Nat Med9:129-34，2003 !Holla nder, Immunotherapy 1:211-22，2009)。
[0034]最近，描述了具有雙重特異性的抗體的一種新的概念設(shè)計(jì)，其中將單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)成用于識(shí)別第二個(gè)抗原，同時(shí)保持對于原始抗原的識(shí)別。該新的概念設(shè)計(jì)被應(yīng)用于抗體赫賽汀，其中使用了噬菌體表達(dá)技術(shù)，從而獲得了突變體，其除了保持以高親和力識(shí)別原始抗原(HER2分子)外，還以高親和力識(shí)別血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) (Bostrom等人，Science 323:1610-14, 2009) 0具有雙重特異性的抗體的該新的概念設(shè)計(jì)(“二合一”)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，其中非常重要的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是:容易將其作為單克隆抗體來產(chǎn)生。
[0035]發(fā)明詳述
[0036]本發(fā)明涉及具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性和高親和力的重組單克隆抗體。源自這些抗體的片段也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0037]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性和高親和力的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含下列CDRs:
[0038]CDR-Hl:GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
[0039]CDR-H2:YIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:17
[0040]CDR-H3:ESPRLRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:34。
[0041]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其特征在于，重鏈可變區(qū)的序列為SEQ IDNO:1:
[0042]QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSSo
[0043]在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及單克隆抗體，其具有有著下列序列的重鏈和輕鏈可變區(qū):
[0044]SEQ ID NO:1:
[0045]QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSS,
[0046]和
[0047]SEQ ID NO:2:
[0048]DLVLTQSPATLSVTP⑶SVSFSCRASQSISNNLHWYQQRTHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNRffPLTFGAGTKLELKRA。
[0049]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及單克隆抗體，其具有有著SEQ ID N0:1的重鏈可變區(qū):
[0050]QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSS,并且輕鏈可變區(qū)的序列為任一的抗體輕鏈可變區(qū)的序列。
[0051]在另一個(gè)方面，輕鏈可變區(qū)為任一的人抗體的輕鏈可變區(qū)。
[0052]在另一個(gè)特別的方面，輕鏈可變區(qū)為任一的人源化抗體的輕鏈可變區(qū)。
[0053]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其特征在于，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含從由下列序列組成的組中選擇的CDR-Hl的序列:
[0054]CDR-Hl GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
[0055]CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:4
[0056]CDR-Hl GYRFTSNQIH, SEQ ID NO:5
[0057]CDR-Hl GYSFNRYQIH, SEQ ID NO:6
[0058]CDR-Hl GYSFRRYQIH, SEQ ID NO:7
[0059]CDR-Hl GYSITRYQIH, SEQ ID NO:8
[0060]CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:9
[0061]CDR-Hl GYSFKSYQIH, SEQ ID NO:10
[0062]CDR-Hl GYSFTSYQIH, SEQ ID NO:11
[0063]CDR-Hl GYRFTRYWIH, SEQ ID NO:12
[0064]CDR-Hl GYTFTRYQIH, SEQ ID NO:13
[0065]CDR-Hl GYPFTRYQIH, SEQ ID NO:14
[0066]CDR-Hl GYSFSRYQIV, SEQ ID NO:15
[0067]CDR-Hl GYHFTRYQIH, SEQ ID NO:16。
[0068]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的特征在于，CDR-H2的序列從由下列序列組成的組中選擇:
[0069]CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO: 17
[0070]CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD, SEQ ID NO: 18
[0071]CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:19
[0072]CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:20
[0073]CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD, SEQ ID NO:21
[0074]CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:22
[0075]CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD, SEQ ID NO:23
[0076]CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD, SEQ ID NO:24
[0077]CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:25
[0078]CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:26
[0079]CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:27
[0080]CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:28
[0081]CDR-H2 YIDPATAffTESNQKFKD, SEQ ID NO:29
[0082]CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:30
[0083]CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:31
[0084]CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD, SEQ ID NO:32
[0085]CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD, SEQ ID NO:33。
[0086]在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的特征在于，CDR-H3的序列從由下列序列組成的組中選擇:
[0087]CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:34
[0088]CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY, SEQ ID NO:35
[0089]CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:36
[0090]CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:37
[0091]CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY, SEQ ID NO:38。
[0092]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含上面所列舉的⑶Rs Hl、H2和H3序列的任一組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的特征在于，CDR-H2的序列和/或CDR-H3的序列包含從由下列置換組成的組中選擇的氨基酸置換中的至少一個(gè):
[0093]CDR-H2 Asp 52 被 Ala、Glu、Asn、Ser 或 Thr 置換
[0094]CDR-H2 Ala 53 被 Asp、Glu、Gly、His、Leu、Ser、Thr 或 Tyr 置換
[0095]CDR-H3 Arg 100-Arg 100A 被 Ala-Lys、His-Arg 或 Thr-Arg 置換
[0096]CDR-H3 Gly 100B 被 Ala、Asp、Phe、Leu、Gin、Arg 或 Ser 置換
[0097]CDR-H3 Tyr 100 D 被 Phe 置換；
[0098]并且另外還包含任一的抗體輕鏈。
[0099]在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含人IgGl恒定區(qū)(對于重鏈)和CK(對于輕鏈)。
[0100]在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及本說明書的抗體的Fab、Fab’、(Fab)i^P scFv片段。
[0101]本發(fā)明的片段的特征在于:
[0102]從由下列序列組成的組中選擇的⑶R-Hl的序列:
[0103]CDR-Hl GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
[0104]CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:4
[0105]CDR-Hl GYRFTSNQIH, SEQ ID NO:5
[0106]CDR-Hl GYSFNRYQIH, SEQ ID NO:6
[0107]CDR-Hl GYSFRRYQIH, SEQ ID NO:7
[0108]CDR-Hl GYSITRYQIH, SEQ ID NO:8
[0109]CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:9
[0110]CDR-Hl GYSFKSYQIH, SEQ ID NO:10
[0111]CDR-Hl GYSFTSYQIH, SEQ ID NO:11
[0112]CDR-Hl GYRFTRYWIH, SEQ ID NO:12
[0113]CDR-Hl GYTFTRYQIH, SEQ ID NO:13
[0114]CDR-Hl GYPFTRYQIH, SEQ ID NO:14
[0115]CDR-Hl GYSFSRYQIV, SEQ ID NO:15
[0116]CDR-Hl GYHFTRYQIH, SEQ ID NO:16 ；
[0117]從由下列序列組成的組中選擇的⑶R-H2的序列:
[0118]CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:17
[0119]CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD, SEQ ID NO:18
[0120]CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:19
[0121]CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:20
[0122]CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD, SEQ ID NO:21
[0123]CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:22
[0124]CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD, SEQ ID NO:23
[0125]CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD, SEQ ID NO:24
[0126]CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:25
[0127]CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:26
[0128]CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:27
[0129]CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:28
[0130]CDR-H2 YIDPATAffTESNQKFKD, SEQ ID NO:29
[0131]CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:30
[0132]CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:31
[0133]CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD, SEQ ID NO:32
[0134]CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD, SEQ ID NO:33 ;從由下列序列組成的組中選擇的CDR-H3的序列:
[0135]CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:34
[0136]CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY, SEQ ID NO:35
[0137]CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:36
[0138]CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:37
[0139]CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY, SEQ ID NO:38。
[0140]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的片段包含上面所列舉的⑶RsHl、H2和H3序列的任一組合。
[0141]這些抗體及其片段對于在本說明書中所披露的診斷和治療目的來說是有用的。因此，另一方面，本發(fā)明涉及包含本說明書的抗體和/或其片段的組合物，所述組合物用于診斷或治療與神經(jīng)節(jié)苷脂抗原N-乙酰GM3和/或N-羥乙酰GM3有關(guān)的疾病。
[0142]優(yōu)選地，本發(fā)明包括組合物(其中包括藥物組合物)，其包含一種或幾種具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性和高親和力的抗體或者源自這些抗體的片段。更優(yōu)選地，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的抗體和/或片段以及藥學(xué)上可接受的載體和/或助劑。更加優(yōu)選地，本發(fā)明包括具有SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:2的輕鏈可變區(qū)的抗體。
[0143]在一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及治療方法，其包括向攜帶表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂抗原N-乙酰GM3和/或N-羥乙酰GM3中至少一種的腫瘤的受試者施用本發(fā)明的抗體及其片段。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述受試者為人。
[0144]在另外一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在腫瘤的診斷中有用的試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體和/或源自其的片段中的至少一種。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述方法包括但不限于診斷，例如，基于在患者的組織或體液樣品(例如腫瘤組織樣品、血液樣品等)中與病理學(xué)狀況相關(guān)的抗原(例如神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和/或N-羥乙酰GM3)的存在。
[0145]獲得本發(fā)明的抗體的方法
[0146]基于mAb 14F7的scFv片段文庫的設(shè)計(jì)和構(gòu)建
[0147]從特別為該目的而設(shè)計(jì)的單鏈Fv區(qū)片段(scFv)的基因文庫開始來獲得作為本發(fā)明的目標(biāo)的抗體。該設(shè)計(jì)的合理性和原創(chuàng)性首先在于仔細(xì)地選擇在抗體片段的氨基酸序列中待隨機(jī)化的位置，從而將突變限制在最可能與抗原相互作用的區(qū)域中。
[0148]在本說明書中使用了 Kabat編號方案來對抗體的VH區(qū)的序列進(jìn)行編號。對于作為本發(fā)明的目標(biāo)的抗體及其片段，該編號方案在位置52(52A)、82(82A至82C)和100(100A至100H)后面將插入字母引入到VH區(qū)中。
[0149]作為該文庫的scFv片段的輕鏈(VL結(jié)構(gòu)域)，選擇在先前工作中獲得的3Fm片段的輕鏈(Rojas 等人，J Immunol Methods 293:71-83，2004)。該片段包含mAb 14F7 的 VH結(jié)構(gòu)域，而其VL結(jié)構(gòu)域從鼠類輕鏈文庫中提取并且不與mAb 14F7的原始VL結(jié)構(gòu)域有關(guān)。然而，盡管有著不同的輕鏈，3Fm片段保持了 mAb 14F7對于NeuGc_GM3的特異性和高親和力，并且此外可以在細(xì)菌中表達(dá)。考慮到由Rojas等人(J Immunol Methods 293:71-83, 2004)和由Krengel等人(J B1l Chem 279:5597-603, 2004)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(其表明輕鏈在抗原的識(shí)別中不是重要的)，該鏈的序列在文庫中保持不變。
[0150]該文庫的片段的重鏈的設(shè)計(jì)采取抗體14F7的VH區(qū)的序列作為基礎(chǔ)。從mAb 14F7的Fab片段的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)的分析出發(fā)(Krengel等人，J B1l Chem 279:5597-603, 2004),并且此外還知道到VH結(jié)構(gòu)域是決定該抗體與N-羥乙酰GM3的結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，在VH結(jié)構(gòu)域的高變環(huán)中選擇一組待突變的位置。待突變的位置的選擇基于兩個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn):I)優(yōu)先突變其側(cè)鏈暴露于溶劑的氨基酸；和2)突變區(qū)域限定于在離VH的位置52半徑為12埃的范圍之內(nèi)的位置。該最后一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)基于由Krengel等人(J B1l Chem 279:5597-603, 2004)所報(bào)告的誘變實(shí)驗(yàn)，其證明了氨基酸Asp 52參與抗體14F7與其抗原的相互作用。
[0151]總之，通過調(diào)整VH結(jié)構(gòu)域的基因合成過程來使VH中的結(jié)合位點(diǎn)的20個(gè)位置經(jīng)歷溫和隨機(jī)化(Fairbrother等人，B1chemistry37:17754-64, 1998),這使得能夠在每個(gè)待突變的位置處引入二十種天然氨基酸中的任一種，而同時(shí)在每個(gè)獨(dú)個(gè)分子中保持其重鏈的有限程度的相對于抗體14F7的原始VH鏈而言的偏離。
[0152]經(jīng)歷隨機(jī)化的位置為下列位置:Ser28,Phe 29,Thr 30,Ser 31、Trp 33、Ile 34、Tyr 50、lie 51、Asp 52、Ala 53、Thr 54、Tyr 56、Glu 58、Arg 98、Leu 99、Arg 100、Arg100A、Gly 100B、Ile 10C 和 Tyr 10D0
[0153]待突變的位置中的三個(gè)位置，Phe29、Ile34和Ile51，相應(yīng)于具有埋在該蛋白質(zhì)內(nèi)部的其側(cè)鏈的疏水性氨基酸，它們對于維持⑶Rs H I和H2的構(gòu)象來說是重要的。特別地對于這三個(gè)氨基酸，以及對于⑶RH3中的Leu 99，分別使用特別設(shè)計(jì)的密碼子:IT1、ATT, ATT和^，其中加下劃線的核苷酸表示所述核苷酸(85%)與其余三種核苷酸的等摩爾混合物(15%)的混合物。這些部分簡并的密碼子編碼疏水性氨基酸，從而特許原始氨基酸插入在每個(gè)位置處。該設(shè)計(jì)的目的是產(chǎn)生有限的多樣性，其可以對于CDRs的構(gòu)象僅具有非常輕微的影響，其中對于與抗原的親和力具有可能的調(diào)節(jié)效應(yīng)。
[0154]考慮到Krengel 等人(J B1l Chem 279:5597-603，2004)證實(shí)了氨基酸 Asp 52對于與NeuGc-GM3的結(jié)合來說是重要的，為該氨基酸設(shè)計(jì)了特殊的密碼子混合物(G_80%/A-20% )A(C-50% /T-50% )，其編碼六個(gè)不同氨基酸，所述氨基酸大多數(shù)具有尺寸小的和中等的側(cè)鏈，并且其中原始的天冬氨酸占優(yōu)勢。對于其余的15個(gè)隨機(jī)化位置，通過使用包含85%的原始核苷酸和15%的其余三種核苷酸的等摩爾混合物的核苷酸混合物，合成了編碼那個(gè)位置的三聯(lián)體的每個(gè)堿基。
[0155]合成所設(shè)計(jì)的VH基因集合，并將其克隆入包含3Fm scFv片段的基因的噬菌粒pHAB 中(Rojas 等人，J Tmmunol Methods 293:71-83,2004)。通過使用輔助卩遼菌體 M13K07，從該文庫中拯救出呈現(xiàn)scFv片段的噬菌體，然后通過使用由Marks等人(J Mol B1l222:581-97, 1991)所描述的實(shí)驗(yàn)方案來進(jìn)行純化。
[0156]具有以高親和力識(shí)別神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3的能力并且同時(shí)保持N-羥乙酰GM3的高親和力識(shí)別的14F7的突變型抗體的片段的獲得是令人驚奇的結(jié)果。賦予突變體以新特性的在抗體14F7的重鏈中的氨基酸改變不是從以前積累的零散知識(shí)中可預(yù)測的。獲得具有雙重特異性的抗體是可能的，這是由于文庫的合理設(shè)計(jì)，其中將溫和隨機(jī)化程序與基于結(jié)構(gòu)知識(shí)的待突變位置的仔細(xì)選擇相組合，以便將文庫的多樣性集中在該抗體的對于其抗原的結(jié)合來說相關(guān)的結(jié)
[0157]具有雙重特異性的scFv片段的選擇
[0158]作為本發(fā)明的目標(biāo)的具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-羥乙酰GM3和N-乙酰GM3的雙重特異性的抗體片段通過該文庫的噬菌體的三輪選擇和擴(kuò)增來獲得，其中僅使用N-乙酰GM3作為靶分子，因?yàn)橄惹斑M(jìn)行的針對N-羥乙酰GM3的單輪選擇證明該文庫包含大量的能夠識(shí)別該抗原的片段。
[0159]遵循與由Rojas等人(J Immunol Methods 293:71-83，2004)所描述的相似的程序來進(jìn)行選擇過程。使用處于指數(shù)生長的TGl細(xì)胞來以50毫升的規(guī)模拯救所選擇的噬菌體，如在(Marks等人，J Mol B1l222:581-97, 1991)中所描述的那樣。使用經(jīng)純化的噬菌體作為起始材料以用于下一輪選擇。在三輪之后，將獨(dú)個(gè)地選擇出的噬菌體克隆在96-孔平板中進(jìn)行拯救(Marks 等人，J Mol B1l 222:581-97,1991)。
[0160]遵循與在(Rojas等人，J Immunol Methods 293:71-83, 2004)中所描述的相似的程序，通過ELISA來評價(jià)所選擇的噬菌體與N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3結(jié)合的能力。由Macrogen公司(韓國)測定了顯示出更大的與這兩種神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的能力的抗體片段的核苷酸序列。
[0161]具有雙重特異性的抗體的結(jié)合位點(diǎn)的表征
[0162]除了具有對于NeuAc_GM3和NeuGc_GM3的雙重特異性的片段外，還對僅識(shí)別N-羥乙酰GM3的源自該文庫的其他抗體片段以及在ELISA實(shí)驗(yàn)中不能夠識(shí)別所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂中任一種的片段進(jìn)行了測序。另外地并且從選自于該文庫的具有雙重特異性的片段之一開始，通過對每個(gè)位置獨(dú)個(gè)地進(jìn)行窮舉隨機(jī)化，研究了 VH區(qū)的特殊的一組位置的影響。
[0163]這些研究使得能夠詳細(xì)地確定該抗體的結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸中的哪些氨基酸對于N-羥乙酰GM3和N-乙酰GM3的雙重識(shí)別來說是最重要的。在表1中，顯示了一組從文庫中提取的具有雙重特異性的scFv片段的重鏈⑶Rs的序列。在表2中，顯示了在VH結(jié)構(gòu)域的序列中的對于雙重特異性來說相關(guān)的位置，和允許不同程度的氨基酸可變性的位置。
[0164]在CDR Hl中僅兩個(gè)或三個(gè)突變就足以賦予抗體片段以除了與N-羥乙酰GM3結(jié)合外，還與N-乙酰GM3結(jié)合的能力。特別地，置換Ser 28 — Arg、Thr 30 — Arg和Trp33 — Gln產(chǎn)生具有對于所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂的高親和力的突變體(突變體RRQ)。
[0165]具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性的重組免疫球蛋白的構(gòu)建
[0166]本發(fā)明包括具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂NeuAc_GM3和NeuGc_GM3的雙重特異性的任何同種型的(無論是人類來源的、鼠類來源的還是其他物種來源的)免疫球蛋白，以及這些免疫球蛋白的任何類型的片段。可以從具有與所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的能力的scFv片段的VH區(qū)的氨基酸序列以及從鼠類、人類或其他物種來源的VL區(qū)的序列開始來構(gòu)建任何所希望的同種型的免疫球蛋白。通過采用已建立的分子生物學(xué)技術(shù)，通過使用被描述用于重組蛋白質(zhì)(特別是單克隆抗體)的有效表達(dá)的載體中的任一種，可以達(dá)到該目的。
[0167]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用通常用于在高等細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白的載體PAH4604 和 pAG4622(Coloma 等人，J Immunol Methods52:89-104，1992)，可以構(gòu)建出 IgGl同種型的免疫球蛋白。
[0168]待用于構(gòu)建具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂NeuAc_GM3和NeuGc_GM3的雙重特異性的免疫球蛋白的VH序列可以從在本發(fā)明中所構(gòu)建的嗤囷體文庫中直接提取，或者可以從在表1中所顯示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)開始進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過在序列中保留對于雙重特異性來說重要的位置和在允許一定程度的可變性的CDRs的位置處引入合適的氨基酸中的任一種。待使用的VL序列允許高程度的可變性(在構(gòu)架區(qū)中和在高變環(huán)中)，如在(Rojas等人，J Immunol Methods293:71-83, 2004)中所證實(shí)的那樣。
[0169]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括嵌合免疫球蛋白(即具有人的恒定區(qū)和人的可變區(qū))，以及具有人源化的可變區(qū)的免疫球蛋白。
[0170]藥物組合物
[0171]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明的抗體或其片段的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0172]如在本發(fā)明中所使用的，表述“藥學(xué)上可接受的載體或助劑”包括與藥物施用相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。還可以在組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體或助劑”是指這樣的載體或助劑，其可以連同所述抗體或片段一起施用給受試者，并且不破壞它們的藥理學(xué)活性且當(dāng)以對于遞送治療量的所述抗體來說足夠的劑量進(jìn)行施用時(shí)不是毒性的。配制藥物組合物以使其與所預(yù)知的其施用途徑相容。施用途徑的例子尤其包括，腸胃外途徑，例如腸胃外、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下途徑。用于腸胃外、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包含下列組分:無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑，例如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖液，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用于調(diào)節(jié)漲度的試劑，例如氯化鈉或右旋糖。PH可以用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉，來進(jìn)行調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。
[0173]對于促進(jìn)按劑量給藥的實(shí)施和均一性來說，配制單劑量形式的腸胃外組合物是有利的。如在本文中所使用的，單劑量給藥形式是指作為用于待治療的受試者的單一劑量來說合適的在物理上分離的單位；每個(gè)單位包含為產(chǎn)生所希望的治療效果而計(jì)算出的預(yù)定量的活性化合物，以及與之相聯(lián)合的所需要的藥學(xué)載體。
[0174]可以將藥物組合物包含在容器、包裝或分配器中，連同關(guān)于其施用的指導(dǎo)說明書一起。
[0175]治療方法
[0176]本發(fā)明的抗體可以用于治療表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3或神經(jīng)節(jié)苷脂N-羥乙酰GM3或同時(shí)這兩種神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤。
[0177]本發(fā)明的抗體的合適的治療劑量在大約Img/劑至大約Ig/劑，優(yōu)選地大約50mg/劑至大約500mg/劑的范圍內(nèi)。本發(fā)明的抗體通過任何合適的途徑進(jìn)行施用，包括腸胃外、皮下、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和顱內(nèi)途徑，和如果希望用于局部治療，損傷內(nèi)途徑。
[0178]治療方法包括以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于用單克隆抗體或其片段進(jìn)行的被動(dòng)療法的劑量方案向患者施用本發(fā)明的藥物組合物。治療方法的一個(gè)例子(但其并不限制本發(fā)明)包括在例如6周期間施用周劑量為200mg的本發(fā)明的抗體，然后例如每2或3周施用維持劑量，直至有限的疾病或毒性進(jìn)展。
[0179]附圖簡述
[0180]圖1.A)在ELISA試驗(yàn)中，mAb 7C1對神經(jīng)節(jié)苷脂N-羥乙酰GM3和N-乙酰GM3的識(shí)別，其中使用不同濃度的抗體。B)在ELISA試驗(yàn)中，抗體14F7hT(具有人IgGl同種型的mAb 14F7的人源化形式)、7C1和Tlh (用作陰性對照的人源化抗體)對神經(jīng)節(jié)苷脂N-羥乙酰GM3的識(shí)別。C)神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3在TLC板上的免疫染色(分別為走樣道I和2，在所述4個(gè)板的每一個(gè)板上)。從左至右:分別為用苔黑酚對所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行的揭示，以及用抗體14F7hT、7Cl和Tlh對所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行的免疫染色。僅抗體7C1顯示出與N-乙酰GM3的反應(yīng)性。D)在ELISA試驗(yàn)中，抗體14F7hT和7C1對一組不同神經(jīng)節(jié)苷脂的識(shí)別。
[0181]圖2.在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，mAb 7C1對表達(dá)N-乙酰GM3或N-羥乙酰GM3的腫瘤細(xì)胞系的識(shí)別。A)僅表達(dá)N-乙酰GM3的轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞系L1210-SH的標(biāo)記。B)主要表達(dá)N-羥乙酰GM3的天然腫瘤細(xì)胞系L1210的標(biāo)記。
[0182]圖3.與抗體14F7hT相比較，抗體7C1對于表達(dá)N-乙酰GM3或N-羥乙酰GM3的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。A)對于天然細(xì)胞系L1210的細(xì)胞死亡效應(yīng)。B)對于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系L1210-SH的細(xì)胞毒性效應(yīng)。C)具有該實(shí)驗(yàn)的數(shù)字結(jié)果的總結(jié)表格。
[0183]圖4.A)在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，人源化抗體7C1對Balb/c小鼠脾細(xì)胞的識(shí)別。B)細(xì)胞生存力試驗(yàn)，其使用以抗體7C1進(jìn)行處理的經(jīng)純化的Balb/c小鼠的B淋巴細(xì)胞。在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，B淋巴細(xì)胞均用抗-B220的多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，并且使用人源化抗體C5Q作為不相關(guān)的對照。實(shí)施例
[0184]實(shí)施例1.具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性的IgGl同種型的重組免疫球蛋白(抗體7C1)的構(gòu)建
[0185]從具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性的scFv片段的VH區(qū)的氨基酸序列開始，設(shè)計(jì)了編碼該結(jié)構(gòu)域的基因，還對其進(jìn)行了優(yōu)化以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。類似地，設(shè)計(jì)了編碼抗體14F7的原始VL區(qū)的基因。這兩個(gè)基因均由Geneart (德國)公司合成。
[0186]所選擇的VH結(jié)構(gòu)域在氨基酸水平上相對于抗體14F7的原始序列而言僅具有三個(gè)突變。這三個(gè)突變?yōu)?Ser 28 — Arg、Thr 30 — Arg 和 Trp 33 — Gin。
[0187]遵循已知的分子生物學(xué)程序，將編碼VH和VL的基因分別克隆到載體PAH4604和pAG4622 中(Coloma 等人，J Tmmunol Methods52:89-104，1992)。這些載體被用于在高等細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白。載體PAH4604包含IgGl同種型的人的恒定區(qū)，而載體pAG4622包含人的K恒定區(qū)。為了表達(dá)重組免疫球蛋白，使用不產(chǎn)生抗體的鼠類骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0，將其相繼地用所獲得的關(guān)于VH和VL的遺傳構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過使用A蛋白柱來純化由這些細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白。
[0188]所產(chǎn)生的重組單克隆抗體接受7C1的編號。
[0189]遵循與由Rojas等人(J Immunol Methods 293:71-83，2004)所描述的相似的程序，對于不同濃度的免疫球蛋白，通過ELISA來測量重組抗體7C1與神經(jīng)節(jié)苷脂NeuAc-GM3和NeuGc-GM3結(jié)合的能力。
[0190]如在圖1A中所顯示的，mAb 7C1實(shí)際上能夠以相同的親和力與所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，其中觀察到量化了抗體7C1對神經(jīng)節(jié)苷脂NeuAc-GM3和NeuGc_GM3的識(shí)別水平的光密度(OD)曲線彼此非常相似。此外，抗體7C1與N-羥乙酰GM3(和通過轉(zhuǎn)換，還與N-乙酰GM3)的結(jié)合親和力與對于mAb 14F7與N-羥乙酰GM3的結(jié)合所觀察的親和力是非常相似的(僅稍微偏低)，如在圖1B中所顯示的。
[0191]在這些實(shí)驗(yàn)中，使用了具有人IgGl同種型的mAb 14F7的人源化形式(稱為14F7hT)，其保留了原始抗體 14F7 的識(shí)別特性(Fernandez-Marrero 等人，Immunob1logy216:1239-47，2011)。作為陰性對照，使用了也具有人IgGl同種型的抗體Tlh (抗-CD6)。
[0192]另外，通過薄層色譜法(TLC)驗(yàn)證了抗體7C1與所述兩種神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的能力，如在圖1C中所顯示的，其中觀察到mAb 7C1能夠標(biāo)記N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的經(jīng)純化的樣品。
[0193]抗體7C1的特異性是真正雙重的，不是多重的，如圖1D中所證明的，其中顯示該抗體不識(shí)別不同神經(jīng)節(jié)苷脂組的分子中的任一種分子，無論是N-乙酰類型的還是N-羥乙酰類型的。
[0194]實(shí)施例2.杭體7C1對表汰N-乙酰GM3或N-羥乙酰GM3的腫瘤細(xì)朐系的識(shí)別
[0195]經(jīng)由使用為小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系的L1210細(xì)胞系(從美國典型培養(yǎng)物保藏中心購買)的兩種變體的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)來證明抗體7C1識(shí)別表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂N-羥乙酰GM3或N-乙酰GM3的腫瘤細(xì)胞的能力。使用表達(dá)N-羥乙酰GM3的所述細(xì)胞系的天然株系本身，和表達(dá)N-乙酰GM3的遺傳轉(zhuǎn)化變體(L1210-SH) (Fernandez-Marrero等人，MolTmmunol 48:1059-67,2011)。
[0196]Roque-Navarro 等人(MoI Cancer Ther 7:2033-41，2008)證實(shí)了由 L1210 細(xì)胞系進(jìn)行的N-羥乙酰GM3的高表達(dá)，這通過抗體14F7對該細(xì)胞系的顯著識(shí)別而得到證明。這些細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂含量的提取分析作為結(jié)果而給出了 85:15的NeuGc-GM3/NeuAc-GM3的比例。
[0197]表達(dá)N-乙酰GM3而非N-羥乙酰GM3的細(xì)胞系L1210-SH通過抑制CMP-NeuAc羥化酶表達(dá)的干擾RNA片段的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來獲得，所述CMP-NeuAc羥化酶將N-乙酰唾液酸轉(zhuǎn)化為 N-輕乙酸唾液酸(Shaw 和 Schauer, B1l Chem Hoppe Seyler 369:477-86,1988)。Ferncindez-Marrero等人(Mol Tmmunol 48:1059-67, 2011)證實(shí)了在該轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中 N-輕乙酰GM3表達(dá)的急劇減少。
[0198]流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)在FACScan設(shè)備(Becton Dickinson)上進(jìn)行。在每個(gè)試驗(yàn)中，收集14個(gè)細(xì)胞。為了對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，使用綴合有FITC的抗-人IgG抗體。作為陰性對照，使用抗體Tlh。
[0199]如在圖2A中所顯示的，抗體7C 1能夠標(biāo)記L1210-SH細(xì)胞系的細(xì)胞(其表達(dá)N-乙酰GM3)，這與不識(shí)別所述細(xì)胞的抗體14F7hT不同。另一方面，抗體7C1還標(biāo)記L1210的天然株系的細(xì)胞(其具有N-羥乙酰GM3的高表達(dá))，所述細(xì)胞也被在該情況下用作陽性對照的抗體14F7hT標(biāo)記(圖2B)。要強(qiáng)調(diào)的是，相比于被mAb 14F7hT進(jìn)行的標(biāo)記而言，L1210的天然株系被mAb 7C1進(jìn)行的標(biāo)記是更強(qiáng)的，這歸因于mAb 7C1可以與GM3的N-羥乙酰變體和N-乙酰變體(兩者均在這些細(xì)胞中表達(dá))結(jié)合。
[0200]實(shí)施例3.杭體7C1對于表汰N-乙酰GM3或N-羥乙酰GM3的腫瘤細(xì)朐的細(xì)朐毒性效應(yīng)
[0201]在用細(xì)胞系L1210和L1210-SH進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了抗體7C1通過不依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞死亡機(jī)制來殺死表達(dá)N-乙酰GM3或N-羥乙酰GM3的腫瘤細(xì)胞的能力。為了用該抗體來誘導(dǎo)死亡，將細(xì)胞以I百萬個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度懸浮在具有1%胎牛血清的培養(yǎng)基中，隨后與該抗體一起在5% CO2的氣氛中在37攝氏度下溫育3小時(shí)。然后，洗滌細(xì)胞，將其懸浮在具有10微克/毫升的碘化丙錠(PI)的PBS中，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。通過測量前向和側(cè)向散射以及PI的摻入來鑒定死細(xì)胞。將具有在活細(xì)胞的特征范圍外的散射水平且還被PI標(biāo)記的細(xì)胞計(jì)數(shù)為死細(xì)胞。
[0202]與僅在天然的L1210細(xì)胞系中產(chǎn)生細(xì)胞死亡的mAb 14F7不同，具有雙重特異性的抗體7C1在天然的L1210細(xì)胞系中(圖3A)和在表達(dá)N-乙酰GM3的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系L1210-SH中(圖3B)都產(chǎn)生顯著的細(xì)胞死亡效應(yīng)。要強(qiáng)調(diào)的是mAb 7C1在天然的L1210細(xì)胞系中產(chǎn)生的強(qiáng)的細(xì)胞死亡效應(yīng)(95% )，其比由mAb 14F7hT所產(chǎn)生的效應(yīng)(54% )更大，這證明抗體7C1在具有神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的混合過表達(dá)的細(xì)胞中具有更高的細(xì)胞毒性效應(yīng)。圖3C總結(jié)了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0203]實(shí)施例4.mAb 7C1對ιΗ常細(xì)胞的識(shí)別，沒有產(chǎn)牛細(xì)胞死亡
[0204]然而，在腫瘤細(xì)胞中具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性效應(yīng)的抗體7C1在表達(dá)N-羥乙酰GM3或N-乙酰GM3的正常細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞死亡，如用Balb/c小鼠的脾細(xì)胞來進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所證明的那樣。
[0205]在通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，將Balb/c小鼠的B淋巴細(xì)胞用抗-B220的多克隆抗體(Dako，稀釋度1:200)和用抗體7C1 (以10微克/毫升的濃度)進(jìn)行雙標(biāo)記。細(xì)胞生存力試驗(yàn)用與抗體7C1 —起溫育的來自Balb/c小鼠脾臟的B淋巴細(xì)胞來進(jìn)行。將一百萬個(gè)用磁珠(Myltecni B1tec)進(jìn)行純化的B淋巴細(xì)胞與溶解在補(bǔ)充有I %BSA的DMEM-F12培養(yǎng)基中的50微克的抗體一起在37°C下在CO2的氣氛中溫育3小時(shí)。由該處理所誘導(dǎo)的死亡通過碘化丙錠的摻入來測定。在細(xì)胞識(shí)別實(shí)驗(yàn)中和在細(xì)胞生存力實(shí)驗(yàn)中均使用人源化抗體C5Q作為不相關(guān)的對照。
[0206]如在圖4A中所顯示的，mAb 7C1產(chǎn)生了 Balb/c小鼠的B淋巴細(xì)胞以及其他脾細(xì)胞的顯著標(biāo)記。盡管有著mAb 7C1對這些細(xì)胞的顯著識(shí)別，但是用經(jīng)純化的B淋巴細(xì)胞來進(jìn)行的細(xì)胞生存力試驗(yàn)證明抗體7C1對于正常的B淋巴細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，如在圖4B中所顯示的。
[0207]表1.從噬菌體文庫中提取的scFv片段(其具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性)的重鏈高變區(qū)(⑶Rs)的序列。
[0208]

【權(quán)利要求】
1.抗神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性和高親和力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其特征在于，重鏈可變區(qū)包含下列⑶Rs:
CDR-Hl:GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
CDR-H2:YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:17
CDR-H3:ESPRLRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:34。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，重鏈可變區(qū)的序列為SEQID N0:1: QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSSo
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，CDR-Hl的序列從由下列序列組成的組中選擇:
CDR-Hl GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:4
CDR-Hl GYRFTSNQIH, SEQ ID NO:5
CDR-Hl GYSFNRYQIH, SEQ ID NO:6
CDR-Hl GYSFRRYQIH, SEQ ID NO:7
CDR-Hl GYSITRYQIH, SEQ ID NO:8
CDR-Hl GYSFTRYQ IH, SEQ ID NO:9
CDR-Hl GYSFKSYQIH, SEQ ID NO:10
CDR-Hl GYSFTSYQIH, SEQ ID NO:11
CDR-Hl GYRFTRYWIH, SEQ ID NO:12
CDR-Hl GYTFTRYQIH, SEQ ID NO:13
CDR-Hl GYPFTRYQIH, SEQ ID NO:14
CDR-Hl GYSFSRYQIV, SEQ ID NO:15
CDR-Hl GYHFTRYQIH, SEQ ID NO:16。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，CDR-H2的序列從由下列序列組成的組中選擇:
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD, SEQ ID NO:18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD, SEQ ID NO:21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD, SEQ ID NO:23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD, SEQ ID NO:24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:26
CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:28CDR-H2 YIDPATAffTESNQKFKD, SEQ ID NO:29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD, SEQ ID NO:32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD, SEQ ID NO:33。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，CDR-H3的序列從由下列序列組成的組中選擇:
CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:34
CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY, SEQ ID NO:35
CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:36
CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO:37
CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY, SEQ ID NO:38。
7.抗神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體具有對于神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和N-羥乙酰GM3的雙重特異性和高親和力，并且其特征在于，所述單克隆抗體包含來自由下列序列組成的組中的⑶Rs H1、H2和H3序列的任一組合:
CDR-Hl GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:4
CDR-Hl GYRFTSNQIH, SEQ ID NO:5
CDR-Hl GYSFNRYQIH, SEQ ID NO:6
CDR-Hl GYSFRRYQIH, SEQ ID NO:7
CDR-Hl GYSITRYQIH, SEQ ID NO:8
CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:9
CDR-Hl GYSFKSYQIH, SEQ ID NO:10
CDR-Hl GYSFTSYQIH, SEQ ID NO:11
CDR-Hl GYRFTRYWIH, SEQ ID NO:12
CDR-Hl GYTFTRYQIH, SEQ ID NO:13
CDR-Hl GYPFTRYQIH, SEQ ID NO:14
CDR-Hl GYSFSRYQIV, SEQ ID NO:15
CDR-Hl GYHFTRYQIH, SEQ ID NO:16
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD, SEQ ID NO:18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD, SEQ ID NO:21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD, SEQ ID NO:23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD, SEQ ID NO:24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:26CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:28
CDR-H2 YIDPATAffTESNQKFKD, SEQ ID NO:29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD, SEQ ID NO:32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD, SEQ ID NO:33
CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:34
CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY, SEQ ID NO:35
CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:36
CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:37
CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY, SEQ ID NO:38。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的單克隆抗體，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的序列為SEQIDNO:2:
DLVLTQSPATLSVTP⑶SVSFSCRASQSISNNLHWYQQRTHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNRffPLTFGAGTKLELKRA。 根據(jù)權(quán)利要求1至7的單克隆抗體，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的序列為任一的抗體輕鏈可變區(qū)的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7的單克隆抗體，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的序列為任一的人抗體的輕鏈可變區(qū)的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要 求1至7的單克隆抗體，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的序列為任一的人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其特征在于，CDR-H2的序列和/或CDR-H3的序列包含從由下列置換組成的組中選擇的氨基酸置換中的至少一個(gè): CDR-H2 Asp 52 被 Ala、Glu、AsruSer 或 Thr 置換 CDR-H2 Ala 53 被 Asp、Glu、Gly、His、Leu、Ser、Thr 或 Tyr 置換 CDR-H3 Arg 100-Arg 100A 被 Ala-Lys、His-Arg 或 Thr-Arg 置換 CDR-H3 Gly 100B 被 Ala、Asp、Phe、Leu、Gin、Arg 或 Ser 置換 CDR-H3 Tyr 100 D 被 Phe 置換。
12.源自根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗體的片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求13的片段，其特征在于: 從由下列序列組成的組中選擇的CDR-Hl的序列:
CDR-Hl GYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3
CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:4
CDR-Hl GYRFTSNQIH, SEQ ID NO:5
CDR-Hl GYSFNRYQIH, SEQ ID NO:6
CDR-Hl GYSFRRYQIH, SEQ ID NO:7
CDR-Hl GYSITRYQIH, SEQ ID NO:8
CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:9CDR-HlGYSFKSYQIH, SEQ ID NO:10 CDR-HlGYSFTSYQIH, SEQ ID NO:11 CDR-HlGYRFTRYWIH, SEQ ID NO:12 CDR-HlGYTFTRYQIH, SEQ ID NO:13 CDR-HlGYPFTRYQIH, SEQ ID NO:14 CDR-HlGYSFSRYQIV, SEQ ID NO:15
CDR-HlGYHFTRYQIH, SEQ ID NO:16 ； 從由下列序列組成的組中選擇的CDR-H2的序列: CDR-H2YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:17 CDR-H2YINPATASTESNQKFKD, SEQ ID NO:18 CDR-H2FIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:19 CDR-H2DIDPGRAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:20 CDR-H2YIDPATANTESNQKFKD, SEQ ID NO:21 CDR-H2FINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:22 CDR-H2FIDPASAYTVSNQKFKD, SEQ ID NO:23 CDR-H2YIDPATAKTESNQKFKD, SEQ ID NO:24 CDR-H2YINPGSAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:25 CDR-H2YLDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:26 CDR-H2YVDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:27 CDR-H2YINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:28
CDR-H2YIDPATAffTESNQKFKD, SEQ ID NO:29 CDR-H2YIDPGTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:30 CDR-H2YIDPRTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:31 CDR-H2YVDPATAHTESNQKFKD, SEQ ID NO:32
CDR-H2YINPATAYTDSNQKFKD, SEQ ID NO:33 ； 從由下列序列組成的組中選擇的CDR-H3的序列: CDR-H3ESPRLRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:34 CDR-H3ESPRFRRGRYYYAMDY, SEQ ID NO:35 CDR-H3ESPRMRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:36 CDR-H3ESPRVRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:37 CDR-H3ESPRLRRGLYYYAMDY, SEQ ID NO:38。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的片段，其特征在于，所述片段包含來自由下列序列組成的組中的⑶Rs H1、H2和H3序列的任一組合: CDR-HlGYRFRSYQIH, SEQ ID NO:3 CDR-HlGYSFTRYQIH, SEQ ID NO:4 CDR-HlGYRFTSNQIH, SEQ ID NO:5 CDR-HlGYSFNRYQIH, SEQ ID NO:6 CDR-HlGYSFRRYQIH, SEQ ID NO:7 CDR-HlGYSITRYQIH, SEQ ID NO:8CDR-Hl GYSFTRYQIH, SEQ ID NO:9
CDR-Hl GYSFKSYQIH, SEQ ID NO:10
CDR-Hl GYSFTSYQIH, SEQ ID NO:11
CDR-Hl GYRFTRYWIH, SEQ ID NO:12
CDR-Hl GYTFTRYQIH, SEQ ID NO:13
CDR-Hl GYPFTRYQIH, SEQ ID NO:14
CDR-Hl GYSFSRYQIV, SEQ ID NO:15
CDR-Hl GYHFTRYQIH, SEQ ID NO:16
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD, SEQ ID NO:18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD, SEQ ID NO:21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD, SEQ ID NO:23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD, SEQ ID NO:24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:26
CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:28
CDR-H2 YIDPATAffTESNQKFKD, SEQ ID NO:29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD, SEQ ID NO:31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD, SEQ ID NO:32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD, SEQ ID NO:33
CDR-H3 ESPRLRRG IYYYAMDY, SEQ ID NO:34
CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY, SEQ ID NO:35
CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:36
CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY, SEQ ID NO:37
CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY, SEQ ID NO:38。
15.根據(jù)權(quán)利要求14或15的片段，其特征在于，所述片段為Fab類型的片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的片段，其特征在于，所述片段為Fab’類型的片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15的片段，其特征在于，所述片段為(Fab)2類型的片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或15的片段，其特征在于，所述片段為scFv類型的片段。
19.用于治療表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和/或N-羥乙酰GM3的惡性腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至12的抗體或源自其的片段中的任一種，以及藥學(xué)上穩(wěn)定的載體。
20.治療表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和/或N-羥乙酰GM3的惡性腫瘤的方法，其特征在于，所述方法包括向有此需要的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述受試者為人。
22.用于診斷表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙酰GM3和/或N-羥乙酰GM3的疾病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1至12的抗體或源自其的片段中的任一種。
【文檔編號】C07K16/30GK104136463SQ201380011913
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月1日
【發(fā)明者】E·莫利諾弗里亞斯, G·羅扎斯多蘭特斯, A·V·卡撒德薩斯帕索斯 申請人:分子免疫中心