通過層流進(jìn)行的維持多能性的單個(gè)分散細(xì)胞的培養(yǎng)法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴于凋亡劑的添加而進(jìn)行的、基于人胚胎干細(xì)胞(hESCs)和人類人工多能干細(xì)胞(hiPSCs)的單個(gè)分散培養(yǎng)的新型克隆化方法。更具體地說，本發(fā)明的課題為提供一種基于利用剪切應(yīng)力的hESCs和hiPSCs的單個(gè)分散培養(yǎng)而進(jìn)行的克隆化方法。通過提供下述方法來解決上述課題，其是使多能性細(xì)胞單個(gè)分散來進(jìn)行培養(yǎng)的方法，其中，將單個(gè)分散的細(xì)胞在層流條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
【專利說明】通過層流進(jìn)行的維持多能性的單個(gè)分散細(xì)胞的培養(yǎng)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多能性細(xì)胞的單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)法。更具體地說，本發(fā)明涉及人胚胎干細(xì)胞(hESCs)或人類人工多能干細(xì)胞(hiPSCs)的單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)法。
【背景技術(shù)】
[0002]預(yù)計(jì)在不久的將來hESCs (非專利文獻(xiàn)I)和hiPSCs (非專利文獻(xiàn)2)會(huì)被用于再生醫(yī)療中，對(duì)于這些細(xì)胞，在通常的維持培養(yǎng)條件下破壞細(xì)胞-細(xì)胞間粘附來分散成單個(gè)細(xì)胞的情況下，在由于肌球蛋白的過度活化而形成細(xì)胞的小泡后，會(huì)產(chǎn)生凋亡所致的細(xì)胞死亡。該半胱天冬酶依賴性細(xì)胞死亡受到由E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附來源的信號(hào)傳遞所帶來的Rho抑制和Rac活性的抑制(非專利文獻(xiàn)3)。由此，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞外信號(hào)傳遞在hiPSCs和hESCs的單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮出重要的作用。因此，在為了進(jìn)行克隆化而進(jìn)行hESC和hiPSC的單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，使用作為抗凋亡劑的ROCK抑制劑(Y-27632)和肌球蛋白抑制劑(Blebbistatin)。
[0003]近年來有報(bào)告指出，在脊椎動(dòng)物的胚胎內(nèi)由纖毛產(chǎn)生的液體的流動(dòng)與胚胎的非對(duì)稱分化相關(guān)(非專利文獻(xiàn)4)，明確了對(duì)于針對(duì)細(xì)胞的外部刺激的應(yīng)答與細(xì)胞命運(yùn)的確定相關(guān)。進(jìn)一步地，還有報(bào)告指出，藉由對(duì)細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白多糖的刺激而產(chǎn)生的剪切應(yīng)力與小鼠ES細(xì)胞的自身復(fù)制相關(guān)(非專利文獻(xiàn)5)。但是，hESCs和hiPSCs可以說是與小鼠ES細(xì)胞不同的上胚層干細(xì)胞，因此有報(bào)告指出，在針對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答等中，其顯示出不同的反應(yīng)等該性質(zhì)上的差異(非專利文獻(xiàn)6)。從而，目前還無法設(shè)想hESCs和hiPSCs針對(duì)剪切應(yīng)力的應(yīng)答。根據(jù)上述內(nèi)容，在目前的情況下尚未明確利用剪切應(yīng)力進(jìn)行的基于hESCs和hiPSCs的單個(gè)分散的克隆化方法。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]非專利文獻(xiàn)
[0006]非專利文獻(xiàn)1:Thomson, J.A.et al,.Science, 1998，282:1145-1147
[0007]非專利文獻(xiàn)2:Takahashi K and Yamanaka S.，Cell.，2006，126:663-676
[0008]非專利文獻(xiàn)3:0hgushi M, st al.，Cell Stem Cell.，2010，7:225-239
[0009]非專利文獻(xiàn)4:Burdine RD and Schier AF., Genes Dev., 2000, 14:763-776
[0010]非專利文獻(xiàn)5:Toh YC and Voldman J.，F(xiàn)ASEB J.，201，25:1208-1217[0011 ]非專利文獻(xiàn) 6:Tesar PJ.st al., Nature.，2007，448:196-199

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明所要解決的課題
[0013]本發(fā)明的課題在于提 供一種不依賴于抗凋亡劑的添加而進(jìn)行的、基于hESCs和hiPSCs的單個(gè)分散培養(yǎng)的新型克隆化方法。更具體地說，本發(fā)明的課題在于提供一種利用了剪切應(yīng)力的基于hESCs和hiPSCs的單個(gè)分散培養(yǎng)的克隆化方法。
[0014]解決課題的手段[0015]本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)，通過在hESCs和hiPSCs的培養(yǎng)中采用層流條件，能夠進(jìn)行基于hESCs和hiPSCs的單個(gè)分散培養(yǎng)的克隆化。本發(fā)明是基于這樣的技術(shù)思想而完成的。
[0016]gp，本發(fā)明提供下述方案:
[0017](I) 一種使多能性細(xì)胞單個(gè)分散來進(jìn)行培養(yǎng)的方法，在該方法中，將單個(gè)分散的細(xì)胞在層流條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0018](2)如(I)所述的方法，其中，將細(xì)胞在基質(zhì)膠(Matrigel)上進(jìn)行培養(yǎng)；
[0019](3)如(I)或(2)所述的方法，其中，使胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基經(jīng)層流流通；
[0020](4)如(3)所述的方法，其中，上述胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基含有纖維原細(xì)胞的培養(yǎng)上清；
[0021](5)如(I)至(4)的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，將細(xì)胞在圓筒形容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，該圓筒形容器的截面是直徑為1_以下的圓；
[0022](6)如(5)所述的方法，其中，將細(xì)胞在寬0.1mm~1_、高0.1mm~1_、長5_~40mm的容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；
[0023](7)如(6)所述的方法，其中，將細(xì)胞在寬0.5mm、高0.5mm、長20mm的容器內(nèi)進(jìn)行
培養(yǎng)；
[0024](8)如⑴至(7)的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，上述層流為50 μ I/分鐘以下的流速；
[0025](9)如⑶所述的方法，其中，上述層流為Inl/分鐘以上50μ I/分鐘以下的流速；
[0026](10)如⑶所述的方法，其中，上述層流為50nl/分鐘以上5μ I/分鐘以下的流速；
[0027](11)如⑴至(10)的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，上述層流為在細(xì)胞表面產(chǎn)生8X 10?以下的微小剪切應(yīng)力的流速；
[0028](12)如⑴至(11)的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，上述層流為在細(xì)胞表面產(chǎn)生8X 10_5Pa以上的微小剪切應(yīng)力的流速；
[0029](13)如(I)至(12)的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，上述多能性細(xì)胞為人多能性細(xì)胞；
[0030](14)如(13)所述的方法，其中，上述多能性細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或人工多能干細(xì)胞；以及
[0031](15)如權(quán)利要求⑴至(14)的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，上述層流是由蠕動(dòng)方式的泵產(chǎn)生的。
[0032]發(fā)明的效果
[0033]本發(fā)明的培養(yǎng)法能夠?qū)⒍嗄苄约?xì)胞以單個(gè)分散狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)、得到該克隆細(xì)胞。因而，利用本發(fā)明，能夠進(jìn)行適用于再生醫(yī)療的iPSCs的品質(zhì)管理、基因操作的效率化、克隆化的效率化等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為示出微流體器件的一個(gè)方式的圖。
[0035]圖2為示出微流體芯片的構(gòu)造的圖。[0036]圖3為微流體芯片的放大圖(a)、和示出微流體芯片中的流體的流動(dòng)的圖(b、c)。箭頭表示培養(yǎng)基流動(dòng)的方向。b表示通道部分的截面圖，c表示將培養(yǎng)基利用蠕動(dòng)泵5從蓄液池6中吸上來、使培養(yǎng)基在通道I中流通、并進(jìn)一步將培養(yǎng)基從通道I灌流到蓄液池6中的流動(dòng)。
[0037]圖4為示出人工多能干細(xì)胞(hiPSCs)在微流體器件內(nèi)的存活的圖。圖4(a)表示在有無培養(yǎng)基的納米流體流動(dòng)的培養(yǎng)條件下的hiPSCs的菌落形態(tài)(照片)。圖4(b)表示在納米流體流動(dòng)條件與靜止條件下的hiPSCs存活率的比較。圖4 (c)表示基于免疫組織化學(xué)的在納米流體流動(dòng)條件下存活的hiPSCs內(nèi)的多能性標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)(照片)。圖4 (d)表示基于RT-PCR的多能性標(biāo)記基因的表達(dá)(照片)。
[0038]圖5表示在納米流體流動(dòng)條件下的針對(duì)hiPSCs (人工多能干細(xì)胞)的剪切應(yīng)力的評(píng)價(jià)。圖5(a)表示利用微流體器件的通道培養(yǎng)的hiPSCs的代表性共聚焦切片(照片)。Φ:直徑、H:高度。圖5(b)表示針對(duì)粘附于通道底的hiPSCs的剪切應(yīng)力分布的模擬。利用白色虛線強(qiáng)調(diào)細(xì)胞邊界。灰色箭頭表示500nl/分鐘下的流體流動(dòng)方向。圖5(c)表示粘附在通道底的hiPSCs的周圍的速度矢量和大小的模擬。圖5(d)表示在并非為培養(yǎng)基的微流體流動(dòng)而為納米流體流動(dòng)下的hiPSCs的存活(照片)。hiPSCs在播種24小時(shí)后從培養(yǎng)底剝落，但在納米流體流動(dòng)條件下能夠以正常細(xì)胞形態(tài)存活。
[0039]圖6表示hiPSCs在各流速下的存活率。存活率為第3天的Nanog陽性活細(xì)胞數(shù)相對(duì)于第I天的該細(xì)胞數(shù)的比例。存活率分別表示n=4的平均值。各誤差線使用標(biāo)準(zhǔn)偏差。
【具體實(shí)施方式】
[0040]<多能性細(xì)胞>
[0041]本發(fā)明中使用的“多能性細(xì)胞”是指具有分化為2種以上細(xì)胞的能力的細(xì)胞。例如，多能性細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)、精子干細(xì)胞(GSCs)、胚胎生殖細(xì)胞(EGCs)、人工多能干細(xì)胞(iPSCs)、培養(yǎng)纖維原細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞來源的多能性細(xì)胞(Muse細(xì)胞)和體性干細(xì)胞，但并不限定于此。多能性細(xì)胞可以來自各種生物。優(yōu)選為來自包括人的哺乳類動(dòng)物的多能性細(xì)胞，更優(yōu)選為來自小鼠的多能性細(xì)胞或來自靈長類的多能性細(xì)胞。特別優(yōu)選來自人的多能性細(xì)胞。
[0042](A)胚胎干細(xì)胞
[0043]ES細(xì)胞為由人或小鼠等哺乳動(dòng)物的早期胚胎(例如胚泡)的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)確立的、具有多能性和基于自身復(fù)制的增殖能力的干細(xì)胞。ES細(xì)胞為來自屬于受精卵的8細(xì)胞期、桑椹胚后的胚胎的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)的胚胎來源的干細(xì)胞，其具有可分化為構(gòu)成成體的所有細(xì)胞的能力的所謂分化多能性、以及基于自身復(fù)制的增殖能力。ES細(xì)胞于1981年在小鼠中發(fā)現(xiàn)(M.J.Evans and Μ.H.Kaufman (1981)，Nature292:154-156)，其后在人、猿等靈長類中也確立了 ES 細(xì)胞株(J.A.Thomson et al.(1998)，Science282:1145-1147 ;J.A.Thomson et al.(1995), Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:7844-7848 ； J.A.Thomson etal.(1996), Biol.Reprod., 55: 254-259 ； J.A.Thomson and V.S.Marshall (1998), Curr.Top.Dev.Bio，l., 38:133-165)。
[0044]ES細(xì)胞可通過從對(duì)象動(dòng)物的受精卵的胚泡中取出內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)并在纖維原細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)來確立。此外，基于傳代培養(yǎng)的細(xì)胞的維持可使用添加有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、堿性纖維原細(xì)胞成長因子(basicfibroblast growth factor (bFGF))等物質(zhì)的培養(yǎng)液來進(jìn)行。人和猿的ES細(xì)胞的確立和維持的方法例如記載于:USP5, 843，780 ;Thomson JA, et al.(1995), Proc Natl.Acad.Sc1.U S A.92:7844-7848 !Thomson JA, et al.(1998), Science.282:1145-1147 ；H.Suemori etal.(2006), Biochem.Biophys.Res.Commun., 345:926-932 ；M.Ueno et al.(2006),Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:9554-9559 ；H.Suemori et al.(2001), Dev.Dyn., 222:273-279 ；H.Kawasaki et al.(2002), Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 99:1580-1585 ；Klimanskaya I, etal.(2006) ,Nature.444:481-485 等中。
[0045]作為用于制作ES細(xì)胞的培養(yǎng)液，例如可使用添加了 0.lmM2-巰基乙醇、
0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20%KSR和4ng/ml bFGF的DMEM/F-12培養(yǎng)液，在37 0C、2%C02/98% 空氣的濕潤氣氛下維持人 ES 細(xì)胞(0.Fumitaka et al.(2008)，Nat.Biotechnol.,26:215-224)。此外，ES細(xì)胞需要每3~4天進(jìn)行傳代，此時(shí)，傳代例如可在含有ImM CaCl2和20%KSR的PBS中使用0.25%胰島素和0.lmg/ml膠原酶IV來進(jìn)行。
[0046]ES細(xì)胞的選擇通?？梢砸詨A性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等基因標(biāo)記的表達(dá)為指標(biāo)利用實(shí)時(shí)PCR法來進(jìn)行。特別是在人ES細(xì)胞的選擇中，可以以0CT-3/4、NANOG、ECAD等基因標(biāo)記的表達(dá)為指標(biāo)(E.Kroon et al.(2008)，Nat.Biotechnol.，26:443-452)。
[0047]人ES 細(xì)胞株中，例如 WAOl(Hl)和 WA09(H9)可由 WiCell Reserch Institute 獲得，KhES-l、KhES-2和KhES-3可由京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所(日本京都)獲得。
[0048](B)精子干細(xì)胞
[0049]精子干細(xì)胞為睪丸來源的多能干細(xì)胞，是用于精子形成的起源細(xì)胞。該細(xì)胞與ES細(xì)胞同樣地能夠分化誘導(dǎo)成各種系列的細(xì)胞，例如具有將其移植到小鼠胚泡中時(shí)能夠制作出嵌合體小鼠等的性質(zhì)(M.Kanatsu-Shinohara et al.(2003)Biol.Reprod., 69:612-616 ；K.Shinohara et al.(2004)，Cell, 119:1001-1012)。其可利用含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))的培養(yǎng)液進(jìn)行自身復(fù)制，并且通過在與ES細(xì)胞同樣的培養(yǎng)條件下反復(fù)進(jìn)行傳代，能夠得到精子干細(xì)胞(竹林正則等(2008)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，26卷，5號(hào)(增刊)，41~46頁，羊土社(日本東京))。
[0050](C)胚胎生殖細(xì)胞
[0051]胚胎生殖細(xì)胞是由胚胎期的原始生殖細(xì)胞確立的、具有與ES細(xì)胞同樣的多能性的細(xì)胞，可通過在LIF、bFGF、干細(xì)胞因子(stem cell factor)等物質(zhì)的存在下對(duì)原始生殖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)來確立(Y.Matsui et al.(1992)，Cell, 70:841-847 J.L.Resnick etal.(1992)，Nature, 359:550-551)。
[0052](D)人工多能干細(xì)胞
[0053]人工多能性干(iPS)細(xì)胞可通過將特定的初始因子以DNA或蛋白質(zhì)的形態(tài)導(dǎo)入到體細(xì)胞中來制作，其是與ES細(xì)胞具有大致相同的特性、例如具有分化多能性與基于自身復(fù)制的增殖能力的體細(xì)胞來源的人工干細(xì)胞(K.Takahashi andS.Yamanaka(2006)Cell, 126:663-676 ;K.Takahashi et al.(2007)，Cell, 131:861-872 ;J.Yu et al.(2007), Scie nce, 318: 1917-1920 ；Nakagawa,M.等，Nat.Biotechnol.26:101-106 (2008);國際公開W02007/069666)。初始因子可以由如下物質(zhì)構(gòu)成:在ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因、其基因產(chǎn)物或者非編碼RNA ;或在ES細(xì)胞的未分化維持中發(fā)揮重要作用的基因、其基因產(chǎn)物或者非編碼RNA ;或者低分子化合物。作為初始因子所含有的基因，例如可示例出Oct3/4、Sox2、SoxU Sox3、Soxl5、Soxl7、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc, L-Myc, Nanog、Lin28、Fbxl5、ERas, ECAT15-2, Tell、β -連鎖蛋白基因(beta-catenin)、Lin28b、SallK Sall4、Esrrb> Nr5a2> Tbx3 或 Glisl 等，這些初始因子可單獨(dú)使用、也可組合使用。作為初始因子的組合，可示例出下述文件中記載的組合:冊2007/069666、W02008/118820, W02009/007852, W02009/032194, W02009/058413,W02009/057831, W02009/075119, W02009/079007, W02009/091659, W02009/101084,W02009/101407, W02009/102983, W02009/114949, W02009/117439, W02009/126250,W02009/126251, W02009/126655, W02009/157593, W02010/009015, W02010/033906,W02010/033920, W02010/042800, W02010/050626, W02010/056831, W02010/068955,W02010/098419, W02010/102267, W02010/111409, W02010/111422、W02010/115050、W02010/124290、W02010/147395、W02010/147612、Huangfu D, et al.(2008), Nat.Biotechnol.，26:795-797、Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cell,2:525-528、Eminli S，et al.(2008), Stem Cells.26: 2467-2474、Huangfu D, et al.(2008), NatBiotechnol.26: 1269-1275、Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cel1，3，568-574、Zhao Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell StemCell, 3，132-135、Feng B, et al.(2009)，Nat Cell Biol.11:197-203、R.L.Judsonet al., (2009)，Nat.Biotech.，27:459-461、Lyssiotis CA, et al.(2009), Proc NatlAcad Sci U S A.106:8912-8917、Kim JB, et al.(2009)，Nature.461:649-643、IchidaJK, et al.(2009), Cell Stem Cel 1.5:491-503、Heng JC, et al.(2010), Cell StemCell.6:167-74、Han J, et al.(2010)，Nature.463:1096-100、MaliP, et al.(2010), StemCells.28:713-720、Maekawa M,et al.(2011)，Nature.474:225-9。 [0054]在上述初始因子中，也可以含有出于提高確立效率的目的而使用的下述因子:組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑[例如，丙戊酸(VPA)、曲古柳菌素A、丁酸鈉、MC1293、M344等低分子抑制劑、針對(duì) HDAC 的 siRNA 和 shRNA (例如:HDAClsiRNA Smartpool (Millipore)、針對(duì)HDACl的HuSH29mer shRNA構(gòu)建體(OriGene)等)等核酸性表達(dá)抑制劑等];MEK抑制劑(例如PD184352、PD98059、U0126、SL327和PD0325901);糖原合成酶激酶_3抑制劑(例如，Bio和CHIR99021) ;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如，5-氮雜胞苷)；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如:BIX-01294等低分子抑制劑、針對(duì)Suv39hl、Suv39h2、SetDBl和G9a的siRNA和shRNA等的核酸性表達(dá)抑制劑等)；L-型鈣通道激動(dòng)劑(例如Bayk8644) ;丁酸；TGF β抑制劑或ALK5抑制劑(例如LY364947、SB431542、616453和Α-83-01) ;p53抑制劑(例如針對(duì)p53 的 siRNA 和 shRNA) ;ARID3A 抑制劑(例如針對(duì) ARID3A 的 siRNA 和 shRNA) ;miR-291_3p、miR-294、miR-295和mir_302等miRNA ；ffnt信號(hào)通路(例如可溶性Wnt3a);神經(jīng)肽Y ;前列腺素類(例如，前列腺素E2和前列腺素J2) ;hTERT、SV40LT、UTFU IRX6、GLIS1, PITX2、DMRTBl等，在本說明書中，對(duì)于這些出于改善確立效率的目的而使用的因子，與初始因子不進(jìn)行特別區(qū)分。
[0055]在初始因子為蛋白質(zhì)形態(tài)的情況下，例如可通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜透過性肽(例如HIV來源的TAT和聚精氨酸)的熔合、顯微注射等方法導(dǎo)入到體細(xì)胞內(nèi)。另一方面，在為DNA形態(tài)的情況下，例如可通過病毒、質(zhì)粒、人工染色體等載體、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、顯微注射等方法導(dǎo)入到體細(xì)胞內(nèi)。作為病毒載體，可示例出逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體(以上記載于 Cell, 126，pp.663-676，2006 ；Cell, 131，pp.861-872，2007 ；Science, 318，pp.1917-1920，2007)、腺病毒載體(Science, 322，945-949，2008)、腺伴隨病毒載體、仙臺(tái)病毒載體(W02010/008054)等。此外，作為人工染色體載體，例如包括人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC、PAC)等。作為質(zhì)粒，可使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞用質(zhì)粒(Science，322:949-953, 2008)。在載體中可以含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子、多聚腺苷化位點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列以使其能夠表達(dá)核初期化物質(zhì)，進(jìn)一步可根據(jù)需要含有藥劑耐性基因(例如卡那霉素耐性基因、氨芐青霉素耐性基因、嘌呤霉素耐性基因等)、胸苷激酶基因、白喉毒素基因等選擇標(biāo)記序列、綠色熒光蛋白(GFP)、β葡糖醛酸酶(GUS)、FLAG等報(bào)告基因序列等。此外，在上述載體中，為了在導(dǎo)入到體細(xì)胞中之后一起切除編碼初始因子的基因或者編碼啟動(dòng)子和其上結(jié)合的初始因子的基因，在其前后可以具有LoxP序列。
[0056]此外，在RNA形態(tài)的情況下，例如可通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射等方法導(dǎo)入到體細(xì)胞內(nèi)，為了抑制分解，可以使用插入了 5-甲基胞苷和假尿苷(TriLink Biotechnologies)的 RNA(Warren L, (2010)Cell Stem Cell.7:618-630)。
[0057]作為用于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液，例如包括:含有10%~15%FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培養(yǎng)液(在這些培養(yǎng)液中可以進(jìn)一步適當(dāng)含有LIF、青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸類、β -巰基乙醇等)或市售的培養(yǎng)液[例如:小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液(TX-WES培養(yǎng)液、THR0MG0X社)、靈長類ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液(靈長類ES/iPS細(xì)胞用培養(yǎng)液、Reprocell社)、無血清培養(yǎng)基(mTeSR、Stemcell Technology社)]等。
[0058]作為培養(yǎng)法的示例，例如可在37°C、5%C02存在下在含有10%FBS的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)液上使體細(xì)胞與初始因子接觸并進(jìn)行約4~7天的培養(yǎng)，其后將細(xì)胞重新播種在飼養(yǎng)細(xì)胞(例如絲裂霉素C處理STO細(xì)胞、SNL細(xì)胞等)上，在體細(xì)胞與初始因子接觸起約10天后利用含有bFGF的靈長類ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在該接觸起約30天~約45天或其以上后，可產(chǎn)生iPS樣菌落。
[0059]或者可在37°C、5%C02存在下在飼養(yǎng)細(xì)胞(例如絲裂霉素C處理STO細(xì)胞、SNL細(xì)胞等)上利用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(其中可以進(jìn)一步適當(dāng)含有LIF、青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸類、β_巰基乙醇等)進(jìn)行培養(yǎng)，在約25天~約30天或其以上后，可產(chǎn)生ES樣菌落。優(yōu)選可示例出不使用飼養(yǎng)細(xì)胞而使用初期化的體細(xì)胞本身(Takahashi K, et al.(2009)，PLoS One.4:e8067或W02010/137746)、或者使用細(xì)胞外底物(例如，層粘蛋白-5 (W02009/123349)和基質(zhì)膠(BD社))的方法。
[0060]除此之外，還可示例出使用不含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方法(Sun N, etal.(2009), Proc Natl Acad Sci U S A.106:15720-15725)。進(jìn)一步地，為了提高確立效率，也可以通過缺氧條件(0.1%以上、15%以下的氧濃度)來確立iPS細(xì)胞(Yoshida Y, etal.(2009)，Cell Stem Cell.5:237-241 或 W02010/013845)。
[0061]在上述培養(yǎng)之間，在從培養(yǎng)開始第2天以后，每天進(jìn)行I次與新鮮的培養(yǎng)液的培養(yǎng)液交換。此外，在核初期化中使用的體細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)沒有限定，在每IOOcm2的培養(yǎng)皿中為約5 X IO3~約5 X IO6細(xì)胞的范圍。
[0062]iPS細(xì)胞可利用所形成的菌落的形狀進(jìn)行選擇。另一方面，在導(dǎo)入與體細(xì)胞被初期化的情況下所表達(dá)的基因(例如，Oct3/4、Nanog)連動(dòng)表達(dá)的藥劑耐性基因作為標(biāo)記基因的情況下，可通過利用含有對(duì)應(yīng)的藥劑的培養(yǎng)液(選擇培養(yǎng)液)進(jìn)行培養(yǎng)來選擇所確立的iPS細(xì)胞。此外，在標(biāo)記基因?yàn)闊晒獾鞍谆虻那闆r下，可通過利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察來選擇iPS細(xì)胞；在為發(fā)光酶基因的情況下，可通過加入發(fā)光底物來選擇iPS細(xì)胞；并且在為顯色酶基因的情況下，可通過加入顯色底物來選擇iPS細(xì)胞。
[0063]本說明書中使用的“體細(xì)胞”這一術(shù)語是指除去卵子、卵母細(xì)胞、ES細(xì)胞等生殖系列細(xì)胞或分化全能性細(xì)胞之外的所有動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選為包括人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。在體細(xì)胞中，非限制性地包含胎兒(仔)的體細(xì)胞、新生兒(仔)的體細(xì)胞、以及成熟健全的或者疾病性的體細(xì)胞中的任意一種，并且還包含原代培養(yǎng)細(xì)胞、傳代細(xì)胞和株化細(xì)胞中的任意一種。具體地說，體細(xì)胞可示例出例如(I)神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間葉系干細(xì)胞、齒髄干細(xì)胞等組織干細(xì)胞(體性干細(xì)胞)；(2)組織前體細(xì)胞、(3)淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、纖維原細(xì)胞(皮膚細(xì)胞等)、毛細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞、腸細(xì)胞、脾細(xì)胞、胰腺細(xì)胞(胰腺外分泌細(xì)胞等)、腦細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等分化后的細(xì)胞等。
[0064]此外，在使用iPS細(xì)胞作為移植用細(xì)胞的材料的情況下，從不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)這樣的方面考慮，優(yōu)選使用移植目的的個(gè)體的HLA基因型相同或者實(shí)質(zhì)上相同的體細(xì)胞。此處，“實(shí)質(zhì)上相同”是指HLA基因型呈現(xiàn)出按照針對(duì)移植后的細(xì)胞能夠利用免疫抑制劑抑制免疫反應(yīng)的程度的一致，例如為具有HLA-A、HLA-B和HLA-DR的3基因座或者加上HLA-C的4基因座一致的HLA型的體細(xì)胞。
[0065](E)通過核移植得到的克隆胚來源的ES細(xì)胞
[0066]nt ES細(xì)胞為通過核移植技術(shù)制作的克隆胚來源的ES細(xì)胞，其與受精卵來源的 ES 細(xì)胞具有大致相同的特性(T.Wakayama et al.(2001)，Science, 292:740-743 ;
S.Wakayama et al.(2005), Biol.Reprod., 72:932-936 ；J.Byrne etal.(2007), Nature, 450:497-502)。即，由通過將未受精卵的核取代為體細(xì)胞的核而所得到的克隆胚來源的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)而確立的ES細(xì)胞為nt ES(核移植ES)細(xì)胞。為了制作ntES細(xì)胞，利用核移植技術(shù)(J.B.Cibelli et al.(1998)，Nature Biotechnol.，16:642-646)與ES細(xì)胞制作技術(shù)(上述)的組合(若山清香等(2008)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，26卷，5號(hào)(增刊)，47~52頁)。在核移植中，可通過在哺乳動(dòng)物的去核未受精卵中注入體細(xì)胞的核并進(jìn)行數(shù)小時(shí)培養(yǎng)來進(jìn)行初期化。
[0067](F)多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞(Muse細(xì)胞)
[0068]Muse細(xì)胞為按照W02011/007900所述的方法制造出的多能干細(xì)胞，詳細(xì)地說，其是對(duì)纖維原細(xì)胞或骨髓間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間的胰島素處理、優(yōu)選進(jìn)行8小時(shí)或16小時(shí)的胰島素處理后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而得到的具有多能性的細(xì)胞，SSEA-3和CD105為陽性。
[0069]<單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)法>
[0070]本發(fā)明中使用的“單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)法”是指對(duì)分散的單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖的方法，其包括對(duì)2個(gè)以上的細(xì)胞未藉由鈣粘蛋白粘合而發(fā)生分離的細(xì)胞進(jìn)行增殖并克隆化的行為。為了使細(xì)胞分散，可以使用力學(xué)方法，或者也可使用藥劑。作為此時(shí)使用的藥劑，可示例出具有蛋白酶活性的酶或者含有EDTA的試劑。例如可舉出胰島素/EDTA、Accutase (TM)和 Accumax (TM),但并不限定于此。
[0071]本發(fā)明中提供了在層流條件下進(jìn)行多能性細(xì)胞的單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)的方法。層流可通過使培養(yǎng)基相對(duì)于粘附在細(xì)胞培養(yǎng)容器上的多能性細(xì)胞進(jìn)行流動(dòng)來實(shí)施。優(yōu)選通過在該條件下的培養(yǎng)來維持增殖細(xì)胞的多能性。本發(fā)明中，多能性的維持可通過細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)多能性標(biāo)記來確認(rèn)。多能性標(biāo)記沒有特別限定，可以舉出例如Oct3/4、Nanog。
[0072]本發(fā)明中的“層流”是指流體的流線與壁面平行，其是指并非為紊流的流場。優(yōu)選層流越靠近壁流速越小，通過與壁面離開一定距離以上，成為流速均勻的流場。因而，在本發(fā)明中，層流的流速是指離開壁面一定距離以上的均勻的流速。
[0073]層流的流速例如為在距離細(xì)胞表面10μπι以上的點(diǎn)測定出的流速。本發(fā)明中的層流的流速例如為50 μ l/分鐘以下、40 μ l/分鐘以下、30 μ l/分鐘以下、25 μl/分鐘以下、20 μ l/分鐘以下、10 μ l/分鐘以下、5 μ l/分鐘以下、3 μ l/分鐘以下、2.5 μ l/分鐘以下、2μ l/分鐘以下、1μ l/分鐘以下、900nl/分鐘以下、800nl/分鐘以下、700nl/分鐘以下、650nl/分鐘以下、600nl/分鐘以下、500nl/分鐘以下、400nl/分鐘以下、300nl/分鐘以下、200nl/分鐘以下、IOOnl/分鐘以下、50nl/分鐘以下、25nl/分鐘以下、1nl/分鐘以下，但并不限定于此。優(yōu)選為5 μl/分鐘以下的流速。更優(yōu)選在距離細(xì)胞表面10μπι以上的點(diǎn)為3 μ l/分鐘以下、2.5 μl/分鐘以下的流速。進(jìn)一步優(yōu)選為2 μl/分鐘以下。還進(jìn)一步優(yōu)選為?μl/分鐘以下。并且，進(jìn)一步優(yōu)選的是，層流的流速在距離細(xì)胞表面ΙΟμπι以上的點(diǎn)為650nl/分鐘以下、600nl/分鐘以下。更優(yōu)選在距離細(xì)胞表面1Oym以上的點(diǎn)為500nl/分鐘或其附近區(qū)域的流速。層流的流速例如還為Inl/分鐘以上、25nl/分鐘以上、50nl/分鐘以上、IOOnl/分鐘以上、120nl/分鐘以上、150nl/分鐘以上、200nl/分鐘以上、300nl/分鐘以上、400nl/分鐘以上、450nl/分鐘以上、500nl/分鐘以上、600nl/分鐘以上、700nl/分鐘以上、800nl/分鐘以上、900nl/分鐘以上、1 μl/分鐘以上、10 μl/分鐘以上、20 μl/分鐘以上、25 μl/分鐘以上、30 μl/分鐘以上、40 μl/分鐘以上、45 μ l/分鐘以上、50 μl/分鐘以上，但并不限定于此。優(yōu)選為50nl/分鐘以上。更優(yōu)選為IOOnl/分鐘以上。進(jìn)一步優(yōu)選為120nl/分鐘以上。更優(yōu)選為150nl/分鐘以上。并且進(jìn)一步優(yōu)選為300nl/分鐘以上、450ηI/分鐘以上。
[0074]通過層流在細(xì)胞表面產(chǎn)生剪切應(yīng)力。在本發(fā)明中，通過層流的流速產(chǎn)生的剪切應(yīng)力例如為8X 10?以下、5X KT3Pa以下、4X KT3Pa以下、3X KT3Pa以下、2X KT3Pa以下、
1X KT3Pa 以下、9 X KT4Pa 以下、8.5 X KT4Pa 以下、1 X KT4Pa 以下、1X KT5Pa 以下、1 X KT6Pa以下、1X KT7Pa以下、1X KT8Pa以下，但并不限定于此。優(yōu)選為8X KT3Pa以下。更優(yōu)選為產(chǎn)生5X10_3Pa以下的微小剪切應(yīng)力的速度，并且進(jìn)一步優(yōu)選為4X10_3Pa以下。更進(jìn)一步優(yōu)選為3 X KT3Pa以下。并且還優(yōu)選為2 X KT3Pa以下、1 X KT3Pa以下、9 X KT4Pa以下、8.5 X KT4Pa以下。通過層流的流速而產(chǎn)生的剪切應(yīng)力例如還為IXlO-8Pa以上、1X KT7Pa以上、1 X KT6Pa 以上、1 X KT5Pa 以上、8 X KT5Pa 以上、1 X KT4Pa 以上、1.5 X KT4Pa 以上、2X IO^4Pa 以上、2.4X KT4Pa 以上、4X KT4Pa 以上、4.5X KT4Pa 以上、7X KT4Pa 以上、
7.5X KT4Pa以上，但并不限定于此。優(yōu)選為8X KT5Pa以上。更優(yōu)選為1.5X KT4Pa以上。進(jìn)一步優(yōu)選為2X 10_4Pa以上，并且更優(yōu)選為2.4X 10_4Pa以上。此外還優(yōu)選為4X 10_4Pa以上、4.5X IO^4Pa 以上、7.5X IO^4Pa 以上。
[0075]在本發(fā)明中，對(duì)于為了維持多能性而使用的培養(yǎng)基，只要是一般用于維持胚胎干細(xì)胞的多能性的胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基，就可以為任意培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基可通過以動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并向其中添加所期望的物質(zhì)來制備。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如包括頂DM培養(yǎng)基、Med1uml99培養(yǎng)基、伊格爾最低必需培養(yǎng)基(EMEM)、a MEM培養(yǎng)基、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Ham’ s F12培養(yǎng)基、RPM11640培養(yǎng)基、F1scher’s培養(yǎng)基、和它們的混合培養(yǎng)基等。作為所添加的物質(zhì)，例如包括1種以上的選自血清、白蛋白、鐵傳遞蛋白、Knockout血清替代物(KSR) (ES細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的FBS的血清代替物)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前體、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫醇甘油、脂質(zhì)、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax (invitrogen)、非必需氨基酸、維生素、bFGF、L1F、抗生物質(zhì)、抗氧化劑、乙酰甲酸、緩沖劑、無機(jī)鹽類中的物質(zhì)。胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基還可以為含有纖維原細(xì)胞、STO細(xì)胞等飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清的馴化培養(yǎng)基。
[0076]在本發(fā)明中，單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)可使用與能夠在培養(yǎng)基中產(chǎn)生層流的送液裝置組合而成的細(xì)胞培養(yǎng)容器來進(jìn)行。優(yōu)選對(duì)培養(yǎng)容器進(jìn)行涂覆處理，作為涂覆劑，可以舉出例如基質(zhì)膠(BD)、膠原蛋白、明膠、層粘蛋白、肝素硫酸蛋白多糖或巢蛋白、以及它們的組合。優(yōu)選基質(zhì)月父。
[0077]能夠在培養(yǎng)基中產(chǎn)生層流的機(jī)器為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的輸液泵即可，例如可以舉出基于蠕動(dòng)方式的輸液泵。
[0078]細(xì)胞培養(yǎng)容器只要具有能夠進(jìn)行多能性細(xì)胞的單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)的大小即可，大小和形狀沒有特別限定，根據(jù)使層流穩(wěn)定流通的目的，可以為在密閉系的流路(通道)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)基的送液來培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器。此時(shí)，該流路的截面形狀沒有特別限定，可以為三角形、四邊形、五邊形等多邊形或圓形。從易于進(jìn)行成形的方面考慮，優(yōu)選為4邊形。并且，通道的截面大小優(yōu)選小于直徑1mm的圓形、優(yōu)選大于直徑0.1_。另外在為多邊形的情況下,一邊可以為1nm~500 μ m。通道的截面面積例如可以舉出0.01mm2~1mm2的范圍。優(yōu)選為0.25mm2。在本發(fā)明中，將比直徑為1mm的圓形小的通道稱為微通道。優(yōu)選為具有一邊為500 μ m的四邊形截面的通道。通道沒有特別限定，可以為直線、可以為曲線、也可以是彎曲。進(jìn)一步地，通道還可以與其它通道交叉。通道的長度沒有特別限定，為1mm以上即可，例如可以舉出5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm或其以上的長度。優(yōu)選為20mm。
[0079]具有通道的細(xì)胞培養(yǎng)容器可以由塑料、例如由硅樹脂(例如聚甲基硅氧烷(PDMS))、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚苯乙烯、SU-8或玻璃之類的材料來制作。此時(shí)，對(duì)于材料，考慮到要進(jìn)行培養(yǎng)基的送液，將其變?yōu)橛H水性，因而可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法對(duì)通道內(nèi)壁部進(jìn)行氧等離子體處理。細(xì)胞培養(yǎng)容器的通道可通過將具有作為通道的槽的層與平坦層組合來制作。該槽可使用通過利用負(fù)型光致抗蝕劑、例如SU-8光致抗蝕劑而制備出的模具來進(jìn)行成型。例如，將光致抗蝕劑涂覆至玻璃母盤，留下作為通道所期望的形狀進(jìn)行遮蓋，由所得到的非涂覆面進(jìn)行曝光，在去除未曝光的抗蝕劑時(shí)，在玻璃母盤上留有隆起圖案，可以使用該隆起作為槽的模具。槽的高度可通過光致抗蝕劑的涂覆厚度進(jìn)行調(diào)整。
[0080]在使用具有通道的細(xì)胞培養(yǎng)容器的情況下，優(yōu)選設(shè)置接受所送液的培養(yǎng)基的溶液儲(chǔ)存部、和用于將細(xì)胞等送達(dá)至通道內(nèi)的投入口。
[0081]進(jìn)一步優(yōu)選進(jìn)行加壓以使密閉系的通道內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生氣泡。加壓可通過利用泵增加送液壓、或?qū)νǖ肋M(jìn)行壓迫等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來進(jìn)行。例如，在使用基于蠕動(dòng)方式的輸液泵的情況下，作為利用泵增加送液壓的方法，可通過使設(shè)于該泵內(nèi)的用于進(jìn)行擠壓送液的軟質(zhì)管的管厚比通常更厚(400μm左右)來進(jìn)行。此外，作為壓迫通道的方法，例如可通過使隔膜(例如厚度30 μ m的聚乙烯膜)與通道接合來進(jìn)行。
[0082]上述的細(xì)胞培養(yǎng)容器和送液裝置例如設(shè)于371:、5%0)2存在的條件下。進(jìn)一步地，為了進(jìn)行維持培養(yǎng)，可設(shè)于缺氧狀態(tài)的狀況下。此處缺氧狀態(tài)是氧分壓為1%至10%的狀態(tài)，優(yōu)選為5%。
[0083]在粘附有通過上述單個(gè)分散細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行維持培養(yǎng)的單個(gè)分散狀態(tài)的多能性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，進(jìn)一步流通添加有作為篩選對(duì)象的候選藥劑的培養(yǎng)基，基于此進(jìn)行多能性細(xì)胞的變化的觀察，由此可以檢查候選藥劑的效果。此處，多能性細(xì)胞的變化可以舉出例如在內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞、脊索中胚層、軸旁中胚層、中間中胚層細(xì)胞、側(cè)板中胚層、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、腎前體細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、骨原細(xì)胞、肌原細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等特定細(xì)胞中的變化。這種情況下，可將候選藥劑作為針對(duì)各細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑進(jìn)行選擇。作為其它方式，例如可以舉出，使用W02010/035885所述的方法來確認(rèn)多能性細(xì)胞的增殖的變化，從而對(duì)候選藥劑的催畸形性進(jìn)行檢查的方法。因而，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行藥劑篩選的含有單個(gè)分散狀態(tài)的多能性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器。出于使候選藥劑的量為盡可能少量的目的，優(yōu)選為具有含有多能性細(xì)胞的微通道的細(xì)胞培養(yǎng)容器。
[0084]實(shí)施例
[0085]通過下述的實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)施例的限制。
[0086](實(shí)施例1)微流體器件的制作 [0087]<微流體芯片>
[0088]將聚乙烯(PE)膜102、聚甲基硅氧烷(PDMS)層103和作為涂覆有SU8的玻璃板的SU8層104利用壓板101和105夾在中間，構(gòu)建微流體芯片100 (圖2)。具體地說，PDMS層是如下得到的:向形成有通過SU8的平板印刷法制作的6個(gè)槽(寬0.5mm、長度20mm、高度0.5mm)的模具中注入熱固化性的PDMS(Slipotl84, Toray-Daw Corning, Japan)使其為3mm的厚度，在80°C在干燥器中固化4小時(shí)進(jìn)行制作。將其從模具中取出時(shí)，得到形成有6個(gè)通道的PDMS層。進(jìn)一步地，PDMS層是如下制作的:使用不銹鋼性的直徑Imm的活檢針將注入口和排出口在通道的兩側(cè)開孔。SU8層是在玻璃板上涂覆SU8(SU-82010，Microchem)后照射紫外線進(jìn)行固化來制作的。通過SU8平板印刷來印上用于在與PDMS層接合時(shí)對(duì)準(zhǔn)XY軸的十字印。接下來通過利用氧等離子體對(duì)SU8層進(jìn)行表面處理來附加親水性特性。PE膜是為了緩和由壓板所致的壓力而設(shè)置的。壓板在底面的通道部分開孔從而能夠利用顯微鏡確認(rèn)流路，夾住各層進(jìn)行固定。
[0089]<微流體器件的裝配>
[0090]在管式泵機(jī)構(gòu)中將使用了管厚為400 μ m的硅橡膠管的蠕動(dòng)泵5利用管(PTFE管TUF-100 系列 AWG-30, Chukoh Chemical Industries, Japan)與通過上述方法制作的微流體芯片100的注入口 2聯(lián)結(jié)。進(jìn)一步地，各注入口與用于設(shè)置注射器(用于裝填細(xì)胞)的一個(gè)注射閥7連接。并且，排出口 3與蓄液池6聯(lián)接(圖3)。在注入口和排出口帶有隔膜4(厚度30μπι的聚乙烯膜)以使得流路內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生氣泡。如此制作的微流體器件A(圖1)可對(duì)通道I內(nèi)的培養(yǎng)基的納米流體流動(dòng)進(jìn)行穩(wěn)定且精確的調(diào)節(jié)。罐流培養(yǎng)系所用的微流體器件使用來自3.0電壓電池的DC電源，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置數(shù)天。[0091](實(shí)施例2)使用微流體器件的iPS細(xì)胞培養(yǎng)及其評(píng)價(jià)
[0092]〈iPS細(xì)胞的制備〉
[0093]使用由JCRB細(xì)胞庫提供的人胎兒肺纖維原細(xì)胞(TIG3)，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入0CT3/4、S0X2、KLF4和c_MYC，誘導(dǎo)hiPSCs株。在包覆有基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿上，在MEF (小鼠胚性纖維原細(xì)胞)馴化hES培養(yǎng)基(添加有20%KnoCkout血清替代品(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巰基乙醇和IOng/mlbFGF(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)的 DMEM/F12)中進(jìn)行 TIG3_iPSC 的培養(yǎng)。
[0094]<免疫染色法>
[0095]使用4%PFA(多聚甲醛)/PBS(磷酸緩沖生理食鹽水)，在室溫下將回收的細(xì)胞固定10分鐘，利用PBST (PBS中、0.l%Triton X-100)清洗后，在4 °C在封閉溶液(PBST中、3%BSA和2%脫脂乳(DIFCO，USA))中進(jìn)行一晚預(yù)處理。接下來與一次抗體:抗 0CT4(1:50，Santa Cruz Biotechnology, USA)> 抗 S0X2(1:500，Abeam, Cambridge, UK)或抗NANOG (1.200, Abeam, Cambridge, UK)發(fā)生免疫反應(yīng)后，利用熒光二次抗體(I: 500, Invitrogen)進(jìn)行染色。進(jìn)一步使用DAPI (4，6- 二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行核的對(duì)比染色，使用SlowFade light防褪色試劑盒(Invitrogen)防止光褪色,之后使用1X70倒立顯微鏡得到熒光圖像。
[0096]〈RT-PCR 法 >
[0097]將細(xì)胞回收，使用TRIzoI試劑(Invitrogen，USA)提取培養(yǎng)細(xì)胞的全RNA。按照制造商的說明，使用隨機(jī)六核苷酸，利用Superscript III (Invitrogen, USA)由l.0yg的全RNA得到cDNA。將所得到的cDNA作為模板，使用表1記載的引物組，通過PCR法擴(kuò)增目的基因。
[0098]【表1】
【權(quán)利要求】
1.一種使多能性細(xì)胞單個(gè)分散來進(jìn)行培養(yǎng)的方法，在該方法中，將單個(gè)分散的細(xì)胞在層流條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，將細(xì)胞在基質(zhì)膠上進(jìn)行培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，使胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基經(jīng)層流流通。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基含有纖維原細(xì)胞的培養(yǎng)上清。
5.如權(quán)利要求1~4的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，將細(xì)胞在圓筒形容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，該圓筒形容器的截面是直徑為1_以下的圓。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中，將細(xì)胞在寬0.1mm~1mm、高0.1mm~1mm、長5mm~40mm的容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求1~6的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，所述層流為50μ I/分鐘以下的流速。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述層流為Inl/分鐘以上50μI/分鐘以下的流速。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述層流為50nl/分鐘以上5μI/分鐘以下的流速。
10.如權(quán)利要求1~9的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，所述層流為在細(xì)胞表面產(chǎn)生8X 10_3Pa以下的微小剪切應(yīng)力的流速。
11.如權(quán)利要求1~10的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，所述層流為在細(xì)胞表面產(chǎn)生8X10_5Pa以上的微小剪切應(yīng)力的流速。
12.如權(quán)利要求1~11的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，所述多能性細(xì)胞為人多能性細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述多能性細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或人工多能干細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求1~13的任意I項(xiàng)所述的方法，其中，所述層流是由蠕動(dòng)方式的泵產(chǎn)生的。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK103917641SQ201280051375
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月21日
【發(fā)明者】小寺秀俊, 巽和也, 橫川隆司, 多田高, 長田翔伍, 興津輝, 小此木孝仁, 野田雄一郎, 中西直之, 松村拓, 大隅孝志 申請(qǐng)人:愛科來株式會(huì)社