專利名稱：異丙醇生產(chǎn)細(xì)菌及異丙醇生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異丙醇生產(chǎn)細(xì)菌及異丙醇生產(chǎn)方法。
技術(shù)背景
丙烯是聚丙烯等合成樹脂和石油化學(xué)制品的重要的基礎(chǔ)原料，廣泛用于汽車用減震器或食品容器、膜、醫(yī)療器械等。
因?yàn)橛蓙碜灾参锏脑现苽涞漠惐伎梢越?jīng)過脫水步驟轉(zhuǎn)化為丙烯，所以有希望作為碳中和的丙烯原料。目前，根據(jù)京都議定書，從2008年至2012年間所有發(fā)達(dá)國家有義務(wù)將二氧化碳排放量與1990年相比削減5%，碳中和的丙烯由于其廣泛適用性而對(duì)地球環(huán)境極其重要。
已知將來自植物的原料同化生產(chǎn)異丙醇的細(xì)菌。例如國際公開2009/008377號(hào)中公開了為了以葡萄糖為原料高效地生產(chǎn)異丙醇而經(jīng)修飾的細(xì)菌，記載了其作為異丙醇工業(yè)生產(chǎn)用生物催化劑優(yōu)異。
已知在大腸桿菌中不能同化蔗糖，如果能夠利用在來自植物的材料中也為廉價(jià)的蔗糖，則在工業(yè)上有利。
根據(jù)現(xiàn)有的發(fā)現(xiàn)，微生物同化蔗糖的機(jī)制大致分成蔗糖PTS (磷酸烯醇丙酮酸糖 M酸轉(zhuǎn)移BS系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate Carbohydrate Phosphotransferase System))禾口蔗糖非PTS兩種(例如日本特開2001-346578號(hào)公報(bào))。已知蔗糖非PTS由cscB (進(jìn)行蔗糖的獲取)、cscA (在微生物內(nèi)部進(jìn)行蔗糖的分解)、cscK (進(jìn)行果糖的磷酸化)及cscR (控制 cscB、A、K 的表達(dá))4 個(gè)因子構(gòu)成。Biotechnolohy Letters, Vol. 27，pp. 1891-1896 (2005) 中記載了使用質(zhì)粒將上述4個(gè)因子的基因?qū)隓-乳酸生產(chǎn)大腸桿菌，由蔗糖生產(chǎn)D-乳酸。
另外，已知蔗糖PTS由scrA(進(jìn)行蔗糖的獲取)、scrY(進(jìn)行蔗糖的磷酸化)、 scrB (在微生物內(nèi)部進(jìn)行蔗糖的分解)、scrR(控制scrA、Y、B的表達(dá))及scrK (進(jìn)行果糖的磷酸化)5個(gè)因子構(gòu)成。
通常，將細(xì)菌所不具有的功能導(dǎo)入微生物時(shí)，研究表達(dá)上述功能的基因的導(dǎo)入。對(duì)于同化蔗糖能力來說，上述各因子的DNA的大小為900 1500bp，且為了表達(dá)用于高效生產(chǎn)異丙醇所需的4種酶(硫解酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶)的基因，所需的DNA大小約為4800bp。即，要對(duì)大腸桿菌賦予同化蔗糖的能力和生產(chǎn)IPA的能力兩者時(shí)，需要導(dǎo)入約9300bp大小的DNA。
但是，由于所要導(dǎo)入的DNA的大小超過了基因?qū)胫惺褂玫馁|(zhì)粒DNA大小的上限， 所以將上述兩種能力同時(shí)導(dǎo)入大腸桿菌非常困難。即使使用2種質(zhì)粒載體，控制各個(gè)質(zhì)粒 DNA大小在IOOOObp以下，通常將2種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，重復(fù)增殖過程中某一方或兩方的質(zhì)粒也經(jīng)常脫落。為了避免上述現(xiàn)象，需要使大腸桿菌經(jīng)常暴露在與選擇標(biāo)記對(duì)應(yīng)的昂貴的抗生素中，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
因此，難以對(duì)大腸桿菌同時(shí)賦予同化蔗糖的能力和高效生產(chǎn)異丙醇的能力。
另一方面，Can.J.Microbiol.，Vol. 45，pp. 18-422(1999)公開了通過向大腸桿菌中僅導(dǎo)入蔗糖水解酶(cscA)，能夠以蔗糖作為原料使大腸桿菌增殖。但是，該論文中同時(shí)也記載了通過基因重組技術(shù)使cscA基因大量表達(dá)時(shí)，cscA幾乎全部存在于細(xì)胞內(nèi)，cscA (轉(zhuǎn)化酶)不在細(xì)胞外而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，不能預(yù)測(cè)cscA在細(xì)胞外分解蔗糖。
作為使用不能同化蔗糖的大腸桿菌由蔗糖生產(chǎn)物質(zhì)的例子，可以舉出以蔗糖作為原料的色氨酸的生產(chǎn)(例如日本特開2001-346578號(hào)公報(bào))。但是，在該例子中表明，為了賦予大腸桿菌由蔗糖生產(chǎn)氨基酸的能力，需要至少導(dǎo)入cSCA、CSCB和cscK的基因組。發(fā)明內(nèi)容
如上所述，由于需要導(dǎo)入的DNA的大小過大，所以同時(shí)對(duì)不能同化蔗糖的大腸桿菌賦予同化蔗糖的能力和高效生產(chǎn)異丙醇的能力非常困難。
本發(fā)明的目的在于提供對(duì)從廉價(jià)且工業(yè)上利用價(jià)值高的蔗糖有效地生產(chǎn)異丙醇有用的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌及異丙醇生產(chǎn)方法。
本發(fā)明提供以下生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌及異丙醇生產(chǎn)方法。
〔 1〕一種生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，至少含有屬于蔗糖非PTS基因組的蔗糖水解酶基因，同時(shí)賦予或強(qiáng)化了異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)。
〔2〕如〔1〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，屬于蔗糖非PTS基因組的基因中， 僅含有上述蔗糖水解酶基因。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌是賦予了乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性的大腸桿菌。
〔4〕如〔3〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性分別是通過導(dǎo)入編碼來自下述細(xì)菌的各酶的基因而得到的，所述細(xì)菌選自梭菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌及埃希氏菌屬細(xì)菌中的至少1種。
〔5〕如〔3〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述乙酰乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自梭菌屬細(xì)菌的各酶的基因而得到的，上述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自埃希氏菌屬細(xì)菌的酶的基因而得到的。
〔6〕如〔3〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述乙酰乙酸脫羧酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的，上述異丙醇脫氫酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自拜氏梭菌的酶的基因而得到的，上述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自大腸桿菌的各酶的基因而得到的。
〔7〕如〔3〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因、 編碼異丙醇脫氫酶的基因及編碼蔗糖水解酶的基因通過質(zhì)粒被導(dǎo)入，上述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過宿主大腸桿菌內(nèi)的基因組基因得到的。
〔8〕如〔3〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因、 編碼異丙醇脫氫酶的基因及編碼蔗糖水解酶的基因通過質(zhì)粒被導(dǎo)入，上述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過宿主大腸桿菌內(nèi)的基因組基因得到的。
〔9〕如〔3〕所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，上述乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、上述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性均是通過導(dǎo)入編碼來自梭菌屬細(xì)菌的各酶的基因而得到的。
〔10〕一種異丙醇生產(chǎn)方法，包括使用〔1〕 〔9〕中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌由來自含有蔗糖的植物的原料生產(chǎn)異丙醇。


[圖1]為表示以葡萄糖及果糖作為糖源，培養(yǎng)大腸桿菌B株10小時(shí)時(shí)的培養(yǎng)上清液中的糖的減少量的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌為至少含有屬于蔗糖非PTS基因組的蔗糖水解酶基因、同時(shí)賦予或強(qiáng)化了異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌。
本發(fā)明的異丙醇生產(chǎn)方法，包括使用上述生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，由來自含有蔗糖的植物的原料生產(chǎn)異丙醇。
本發(fā)明的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌為了同化蔗糖，至少含有構(gòu)成蔗糖非PTS基因組的蔗糖水解酶基因，同時(shí)具有異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)，因此，在不能同化蔗糖的大腸桿菌中，同時(shí)發(fā)揮同化蔗糖的能力和生產(chǎn)異丙醇的能力，能夠由蔗糖有效地生產(chǎn)異丙醇。目前為止完全沒有報(bào)道在不具有同化蔗糖能力的大腸桿菌中導(dǎo)入蔗糖非PTS基因組，以蔗糖作為碳源生產(chǎn)異丙醇的例子。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過至少將屬于構(gòu)成非PTS基因組的基因組的蔗糖水解酶基因?qū)肷a(chǎn)異丙醇的大腸桿菌中，即使高效生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，也高效率地同化蔗糖。結(jié)果， 能夠顯著減小為了賦予同化蔗糖的能力而導(dǎo)入的DNA大小，能夠在1個(gè)質(zhì)粒載體上同時(shí)連接賦予同化蔗糖能力的DNA和賦予異丙醇生產(chǎn)能力的DNA。由此，能夠?qū)Σ荒芡崽堑拇竽c桿菌同時(shí)賦予同化蔗糖的能力和生產(chǎn)異丙醇的能力，能夠從來自甘蔗或甜菜的、廉價(jià)且能大量供給的蔗糖有效地得到異丙醇。
特別是，本發(fā)明的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌幾乎同時(shí)同化蔗糖的分解產(chǎn)物即葡萄糖和果糖，能夠生產(chǎn)異丙醇，因此更有效。
一般認(rèn)為在大腸桿菌中，通常葡萄糖的攝取優(yōu)先于果糖，在葡萄糖存在下不能充分地代謝果糖。因此，令人驚奇的是本發(fā)明能夠不受由葡萄糖引起的代謝抑制(分解代謝產(chǎn)物阻遏(catabolite repression))的影響，有效地進(jìn)行異丙醇的生產(chǎn)。
需要說明的是，在本發(fā)明中，所謂“宿主”，是指接收一個(gè)以上的基因從菌體外的導(dǎo)入，結(jié)果變?yōu)楸景l(fā)明的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌的所述大腸桿菌。
在本說明書中，術(shù)語“步驟”不僅是獨(dú)立的步驟，即使在不能與其它步驟明確區(qū)別時(shí)，如果能實(shí)現(xiàn)本步驟所期望的作用，也包含在本術(shù)語中。
另外，本說明書中，使用“ ”表示的數(shù)值范圍，表示以“ ”前后記載的數(shù)值分別作為最小值及最大值所包含的范圍。
以下，說明本發(fā)明。
所謂本發(fā)明的蔗糖非PTS基因組，是指微生物的同化蔗糖途徑中與非PTS系相關(guān)的4個(gè)基因組。詳細(xì)而言，為由阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透過酶(cscB)構(gòu)成的基因組。本發(fā)明中，其中只要至少含有cscA的1種以上即可，例如可以舉出只有cscA、cscA及cscK的組合、cscA及cscB的組合、cscA及cscR的組合、cscA、cscR及cscK的組合、CSCA、CSCR及cscB的組合等。其中，從更有效地生產(chǎn)異丙醇的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選只具有編碼cscA的基因，不含有其它基因。
本發(fā)明中的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶，CscA)是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)盟(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)3. 2. 1.沈、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反應(yīng)的酶的總稱。
上述酶為K12株及B株等大腸桿菌中本來不具有的酶，為包括質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)化酶、果糖激酶及蔗糖特異性阻抑蛋白的非PTS代謝途徑的酶的1種(參見Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol. 45，pp418_422)。本發(fā)明中，通過賦予上述CscA，特別是通過僅賦予cscA，菌體外的蔗糖可以在細(xì)胞膜上分解為葡萄糖及果糖并被釋放到細(xì)胞外，通過葡萄糖PTS及果糖PTS被磷酸化并被引入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)果，果糖被供給至細(xì)菌內(nèi)的果糖代謝系統(tǒng)，并能夠利用糖酵解系統(tǒng)被同化。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶，CscA)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼蔗糖水解酶(轉(zhuǎn)化酶，CscA)的基因的堿基序列的 DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選的例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。另外，優(yōu)選在cscA中添加用于使cscA移到菌體的外周胞質(zhì)的信號(hào)序列。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼阻抑蛋白(CscR)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼果糖激酶(CscK)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例子，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的蔗糖透過酶(CscB)的基因，可以利用由具有該酶的生物得到的具有編碼蔗糖透過酶(CscB)的基因的堿基序列的DNA、或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選的例子，例如可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0157株的基因的堿基序列的DNA。
本發(fā)明中所說的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，是指通過基因重組導(dǎo)入或修飾后的具有異丙醇生產(chǎn)能力的大腸桿菌。利用該大腸桿菌，使其與上述CscA活性組合，即使本來不具有同化蔗糖能力的大腸桿菌，也可以有效地由蔗糖生產(chǎn)異丙醇。
需要說明的是，本發(fā)明的“通過基因重組”的語句，包括全部通過在原有基因的堿基序列中插入其它DNA、或基因的某部分的置換、缺失或它們的組合而發(fā)生的堿基序列上的改變，例如該基因重組可以是突變產(chǎn)生的。
本發(fā)明中，所謂同化蔗糖，是指將蔗糖直接低分子化或高分子化，優(yōu)選低分子化攝入機(jī)體內(nèi)的能力，或代謝轉(zhuǎn)換成其它物質(zhì)的能力。另外，本發(fā)明中，所謂同化包括將蔗糖進(jìn)一步低分子化的分解。詳細(xì)而言，包括將蔗糖分解為D-葡萄糖和D-果糖。
本發(fā)明中的異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)，只要為在作為對(duì)象的大腸桿菌中生產(chǎn)異丙醇的系統(tǒng)即可，可以為任意的系統(tǒng)。
本發(fā)明中賦予或強(qiáng)化的異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)，是指通過基因重組導(dǎo)入或修飾后的、用于發(fā)揮異丙醇生產(chǎn)能力的構(gòu)造。所述異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)只要是使作為對(duì)象的大腸桿菌中的本來的異丙醇生產(chǎn)量增加的系統(tǒng)即可，可以為任意的系統(tǒng)。優(yōu)選可以舉出與異丙醇生產(chǎn)活性相關(guān)的酶活性的滅活、減少或增強(qiáng)或它們的組合。由此，與上述CscA活性組合，即使為本來不具有同化蔗糖能力的大腸桿菌，也能夠有效地由蔗糖生產(chǎn)異丙醇。
優(yōu)選可以舉出賦予與異丙醇的生產(chǎn)相關(guān)的被增強(qiáng)了的酶活性。更優(yōu)選可以舉出硫解酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸脫羧酶、異丙醇脫氫酶的酶活性的增強(qiáng)。即，本發(fā)明的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌優(yōu)選被賦予乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性4種酶活性。
本發(fā)明中的活性的“賦予”除了包括將編碼酶的基因從宿主細(xì)菌的菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)之外，還包括通過強(qiáng)化宿主細(xì)菌在基因組上具有的酶基因的啟動(dòng)子活性或與其它啟動(dòng)子置換使酶基因強(qiáng)表達(dá)。
本發(fā)明中的乙酰乙酸脫羧酶是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)盟(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)4. 1. 1.4、催化由乙酰乙酸生成丙酮的反應(yīng)的酶的總稱。
作為所述乙酰乙酸脫羧酶，例如可以舉出來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)等梭菌屬細(xì)菌、多粘芽孢桿菌 (Bacillus polymyxa)等芽孢桿菌屬細(xì)菌的乙酰乙酸脫羧酶。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的乙酰乙酸脫羧酶的基因，可以利用從上述各來源生物得到的具有編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因的堿基序列的DNA或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選基因，可以舉出來自梭菌屬細(xì)菌或芽孢桿菌屬細(xì)菌的DNA，例如可以舉出具有來自丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢桿菌的基因的堿基序列的DNA。 特別優(yōu)選具有來自丙酮丁醇梭菌的基因的堿基序列的DNA。
本發(fā)明中的異丙醇脫氫酶是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)盟(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)ι. ι. 1. 80、催化由丙酮生成異丙醇的反應(yīng)的酶的總稱。
作為異丙醇脫氫酶，可以舉出來自拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)等梭菌屬細(xì)菌的異丙醇脫氫酶。
作為被導(dǎo)入本發(fā)明的宿主細(xì)菌中的異丙醇脫氫酶的基因，可以利用從上述各來源生物得到的具有編碼異丙醇脫氫酶的基因的堿基序列的DNA或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選基因，可以舉出來自梭菌屬細(xì)菌的DNA，例如具有來自拜氏梭菌的基因的堿基序列的DNA。
本發(fā)明中的CoA轉(zhuǎn)移酶是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)盟(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)2. 8. 3. 8、催化由乙酰乙?；鵆oA生成乙酰乙酸的反應(yīng)的酶的總稱。
作為所述CoA轉(zhuǎn)移酶，例如可以舉出來自下述細(xì)菌的CoA轉(zhuǎn)移酶，所述細(xì)菌為丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)等梭菌屬細(xì)菌、Roseburia intestinalis等羅其Jf氏菌屬細(xì)菌、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)等 Faecalibacterium 屬細(xì)菌、糞球菌(Coprococcus)屬細(xì)菌、布氏錐蟲 (Trypanosoma brucei)等錐蟲、大腸桿菌(Escherichia coli 大腸桿菌)等埃希氏菌屬細(xì)菌。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的CoA轉(zhuǎn)移酶的基因，可以利用從上述各來源生物得到的具有編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因的堿基序列的DNA或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選的基因，可以為具有來自下述細(xì)菌的基因的堿基序列的DNA， 所述細(xì)菌為丙酮丁醇梭菌等梭菌屬細(xì)菌、Roseburia intestinalis等羅斯氏菌屬細(xì)菌、普拉梭菌等i^ecalibacterium屬細(xì)菌、糞球菌屬細(xì)菌、布氏錐蟲等錐蟲、大腸桿菌等埃希氏菌屬細(xì)菌。作為較優(yōu)選基因，可以舉出來自梭菌屬細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌的基因，特別優(yōu)選為具有來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的基因的堿基序列的DNA。
本發(fā)明中所說的硫解酶是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)盟(I. U. B.)酶委員會(huì)報(bào)告被歸屬于酶編號(hào)2. 3. 1. 9、催化由乙?；鵆oA生成乙酰乙?；鵆oA的反應(yīng)的酶的總稱。
作為所述硫解酶，例如可以舉出來自下述細(xì)菌的硫解酶，所述細(xì)菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)等梭菌屬細(xì)菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等埃希氏菌屬細(xì)菌、鹽桿菌種(Halobacterium sp.)細(xì)菌、生枝動(dòng)膠菌(Zoogloea ramigera)等動(dòng)膠菌屬細(xì)菌、紅原雞(Gallus gallus)等雉科原雞屬、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)細(xì)菌、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌屬細(xì)菌、褐家鼠(Rattus norvegicus)等鼠科鼠屬細(xì)菌、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)等假絲酵母菌屬細(xì)菌、野豬(Sus scrofa)等豬科豬屬細(xì)菌、新月柄桿菌 (Caulobacter crescentus)等柄桿菌屬細(xì)菌、山丘鏈霉菌(Streptomyces collinus)等鏈霉菌屬細(xì)菌、向日葵(Helianthus annuus)等菊科向日葵屬細(xì)菌、歐洲牛(Bos taurus)等牛科牛屬細(xì)菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)等腸球菌屬細(xì)菌。
作為本發(fā)明的被導(dǎo)入宿主細(xì)菌中的硫解酶的基因，可以利用由上述各來源生物得到的具有編碼硫解酶的基因的堿基序列的DNA或基于該基因的公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選基因，可以舉出具有來自下述細(xì)菌的基因的堿基序列的DNA，所述細(xì)菌為丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭菌屬細(xì)菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細(xì)菌、鹽桿菌種的細(xì)菌、生枝動(dòng)膠菌等動(dòng)膠菌屬細(xì)菌、紅原雞等雉科原雞屬、根瘤菌種的細(xì)菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌屬細(xì)菌、褐家鼠等鼠科鼠屬細(xì)菌、熱帶假絲酵母等假絲酵母菌屬細(xì)菌、野豬等豬科豬屬細(xì)菌、新月柄桿菌等柄桿菌屬細(xì)菌、山丘鏈霉菌等鏈霉菌屬細(xì)菌、向日葵等菊科向日葵屬細(xì)菌、歐洲牛等?？婆偌?xì)菌、糞腸球菌等腸球菌屬細(xì)菌。作為較優(yōu)選基因，可以舉出來自梭菌屬細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌的基因，特別優(yōu)選為具有來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的基因的堿基序列的DNA。
其中，從酶活性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選上述4種酶分別為來自下述細(xì)菌的酶，所述細(xì)菌為選自梭菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌及埃希氏菌屬細(xì)菌中的至少一種，其中，更優(yōu)選乙酰乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶來自梭菌屬細(xì)菌的情況，CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性來自埃希氏菌屬細(xì)菌，和所述4種酶均來自梭菌屬細(xì)菌。
其中，從酶活性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選本發(fā)明中的4種酶分別來自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大腸桿菌中的任一種；較優(yōu)選乙酰乙酸脫羧酶為來自丙酮丁醇梭菌的酶，CoA轉(zhuǎn)移酶及硫解酶分別為來自丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌的酶，異丙醇脫氫酶為來自拜氏梭菌的酶；上述4種酶從酶活性的觀點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選乙酰乙酸脫羧酶活性來自丙酮丁醇梭菌，上述異丙醇脫氫酶活性來自拜氏梭菌，CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性來自大腸桿菌。
另外，CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性來自大腸桿菌時(shí)，從異丙醇生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)考慮優(yōu)選上述編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因、編碼異丙醇脫氫酶的基因及編碼蔗糖水解酶的基因通過質(zhì)粒被導(dǎo)入，上述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性通過宿主大腸桿菌內(nèi)的基因組基因獲得。
作為本發(fā)明中與異丙醇的生產(chǎn)相關(guān)的酶活性被增強(qiáng)、生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌的例子,可以舉出W02009/008377號(hào)中記載的pIPA/B株或plaaa/B株。
本發(fā)明中的基因的啟動(dòng)子，只要為能夠控制上述任一種基因的表達(dá)的啟動(dòng)子即可，為平常在微生物內(nèi)發(fā)揮作用的強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，并且為即使在葡萄糖存在下也不易受到表達(dá)抑制的影響的啟動(dòng)子，具體可以舉出甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時(shí)稱作GAPDH) 的啟動(dòng)子和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子。
本發(fā)明中的啟動(dòng)子是指與具有Sigma因子的RNA聚合酶連接的、開始轉(zhuǎn)錄的部位。 例如來自大腸桿菌的GAPDH啟動(dòng)子在GenBank accession number X(^662的堿基序列信息中，被記載于堿基編號(hào)397-440中。
來自大腸桿菌的CoA轉(zhuǎn)移酶基因(atoD及atoA)和硫解酶基因(atoB)以 atoD、atoA、atoB的順序在大腸桿菌基因組上形成操縱子(Journal of Baceteriology Vol. 169pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins等)，因此，通過改變atoD的啟動(dòng)子，能夠同時(shí)控制CoA轉(zhuǎn)移酶基因和硫解酶基因的表達(dá)。
由此，CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性通過宿主大腸桿菌的基因組基因得到時(shí)，從獲得充分的異丙醇生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選通過將擔(dān)負(fù)兩種酶基因的表達(dá)的啟動(dòng)子與其它啟動(dòng)子置換等，強(qiáng)化兩種酶基因的表達(dá)。作為用于強(qiáng)化CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性的啟動(dòng)子，可以舉出上述來自大腸桿菌的GAPDH啟動(dòng)子等。
本發(fā)明中的所述酶的活性可以從菌體外向菌體內(nèi)導(dǎo)入，或者通過強(qiáng)化宿主細(xì)菌在基因組上具有的酶基因的啟動(dòng)子活性或與其他啟動(dòng)子置換使酶基因強(qiáng)表達(dá)。
酶活性的導(dǎo)入可以通過例如使用基因重組技術(shù)將編碼所述4種酶的基因從宿主細(xì)菌的菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)而進(jìn)行。此時(shí)，被導(dǎo)入的酶基因與宿主細(xì)胞同種或不同種均可。從菌體外向菌體內(nèi)導(dǎo)入基因時(shí)需要的基因組DNA的制備、DNA的切斷及連接、轉(zhuǎn)化、 PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成等的方法，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的通常的方法來進(jìn)行。所述方法記載于Sambrook，J.，et. al.，"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等中。
本發(fā)明中的能力的“賦予”或“強(qiáng)化”除了包括將編碼酶的基因從宿主細(xì)菌的菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)之外，還包括通過強(qiáng)化宿主細(xì)菌在基因組上具有的酶基因的啟動(dòng)子活性或與其他啟動(dòng)子置換使酶基因強(qiáng)表達(dá)。
本發(fā)明中賦予了酶的活性的大腸桿菌是指從菌體外向菌體內(nèi)通過任何方法能夠賦予該酶活性的大腸桿菌。所述大腸桿菌例如可以使用下述方法制備，即，使用與上述同樣的基因重組技術(shù)，將編碼該酶及蛋白質(zhì)的基因從菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)等方法。
本發(fā)明中強(qiáng)化了酶的活性的大腸桿菌是指使用任何方法強(qiáng)化了該酶活性的大腸桿菌。所述大腸桿菌例如可以使用下述方法制備，即，使用與上述同樣的基因重組技術(shù)，使用質(zhì)粒將編碼該酶及蛋白質(zhì)的基因從菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)，或通過強(qiáng)化宿主大腸桿菌在基因組上具有的酶基因的啟動(dòng)子活性或與其他啟動(dòng)子置換使酶基因強(qiáng)表達(dá)等方法。
在本發(fā)明中，大腸桿菌是指不論本來是否具有從來自植物的原料生產(chǎn)異丙醇的能力，能夠通過使用任何方法具有從來自植物的原料生產(chǎn)異丙醇的能力的大腸桿菌。
此處，作為用作上述各基因的導(dǎo)入對(duì)象的大腸桿菌，可以為不具有異丙醇生產(chǎn)能力的大腸桿菌，只要能夠?qū)爰案淖兩鲜龈骰颍瑒t可以為任意大腸桿菌。
較優(yōu)選為預(yù)先賦予了異丙醇生產(chǎn)能力的大腸桿菌，由此，能夠更有效地生產(chǎn)異丙醇。特別是，根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)Ρ緛聿痪哂型崽悄芰Φ拇竽c桿菌賦予同化蔗糖能力， 有效地從蔗糖生產(chǎn)異丙醇。作為上述本來不具有同化蔗糖能力的大腸桿菌，可以舉出K12 株、B株、C株及來自它們的株等。
作為上述生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，例如可以舉出國際公開2009/008377號(hào)說明書中記載的賦予乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性、及硫解酶活性、且能夠從來自植物的原料生成異丙醇的異丙醇生成細(xì)菌等。
本發(fā)明的異丙醇生產(chǎn)方法包括使用上述生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌從來自含有蔗糖的植物的原料生產(chǎn)異丙醇，即，包括使上述生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌和來自含有蔗糖的植物的原料接觸進(jìn)行培養(yǎng)的步驟、和回收通過接觸得到的異丙醇的回收步驟。
上述異丙醇生產(chǎn)方法中使用的來自植物的原料只要為從植物得到的碳源、且為來自含有蔗糖的植物的原料即可，沒有特別的限制。在本發(fā)明中指根、莖、稈、枝、葉、花、種子等器官、含有它們的植物體、所述植物器官的分解產(chǎn)物，進(jìn)而在由植物體、植物器官或它們的分解產(chǎn)物得到的碳源中，能在微生物培養(yǎng)中用作碳源的物質(zhì)也包含在來自植物的原料中。
在包含于所述來自植物的原料中的碳源中，除蔗糖之外，作為通常物質(zhì)可以舉出淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類、或者大量含有所述成分的草木質(zhì)分解產(chǎn)物、纖維素水解物等或它們的組合，進(jìn)而來自植物油的甘油或脂肪酸也可以包含在本發(fā)明的碳源中。
作為本發(fā)明中的來自植物的原料的例子，可以優(yōu)選舉出谷物等農(nóng)作物、玉米、米、 小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等或它們的組合，作為這些原料的使用形態(tài)為未加工品、榨汁、 粉碎物等，沒有特別限定。另外，可以為僅是上述碳源的形態(tài)。
培養(yǎng)步驟中的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌與來自植物的原料的接觸一般通過在含有來自植物的原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌而進(jìn)行。
來自植物的原料與生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌的接觸密度根據(jù)生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌的活性而不同，但通常作為培養(yǎng)基中來自植物的原料的濃度，以換算為葡萄糖計(jì)，可以使最初的糖濃度相對(duì)于混合物的總質(zhì)量為20質(zhì)量％以下，從大腸桿菌的耐糖性的觀點(diǎn)考慮， 優(yōu)選可以使最初的糖濃度為15質(zhì)量％以下。其他各成分只要以在微生物的培養(yǎng)基中通常添加的量進(jìn)行添加即可，沒有特別限定。
另外，作為培養(yǎng)基中的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌的含量，根據(jù)大腸桿菌的種類及活性而不同，通?？梢允古囵B(yǎng)開始時(shí)投入的預(yù)培養(yǎng)的菌液的量相對(duì)于培養(yǎng)液為0. 1質(zhì)量％ 30質(zhì)量％，從控制培養(yǎng)條件的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選可以為1質(zhì)量％ 10質(zhì)量％。
作為生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基，只要為含有了碳源、氮源、無機(jī)離子及微生物用于生產(chǎn)異丙醇所需的有機(jī)微量元素、核酸、維生素類等的培養(yǎng)基即可，沒有特別限制。
作為碳源，除蔗糖之外，可以適當(dāng)使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類；富馬酸、檸檬酸、 琥珀酸等有機(jī)酸；甲醇、乙醇、丙三醇等醇類及其他。作為氮源，可以適當(dāng)使用有機(jī)銨鹽、無機(jī)銨鹽、氨氣、氨水等無機(jī)體氮源；及蛋白質(zhì)水解物等有機(jī)體氮源及其他。作為無機(jī)離子，可以根據(jù)需要適當(dāng)使用鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其他。
作為有機(jī)微量成分，可以適當(dāng)使用維生素、氨基酸等及含有它們的酵母提取物、蛋白胨、玉米漿(Corn Steep Liquor)、酪蛋白分解產(chǎn)物及其他。
另外，可以以通常使用的量含有通常被添加到微生物的培養(yǎng)基中的其他添加成分，例如抗生素等。需要說明的是，為了抑制反應(yīng)時(shí)的發(fā)泡，優(yōu)選適當(dāng)添加消泡劑。上述成分在培養(yǎng)基中的含量通常只要為大腸桿菌的培養(yǎng)所適用的范圍即可，沒有特別限制。
需要說明的是，作為本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基，若從用于工業(yè)生產(chǎn)方面考慮，優(yōu)選液體培養(yǎng)基。
本方法中，從分離·回收率的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選異丙醇以溶解在培養(yǎng)基和來自植物的原料的混合液中的形態(tài)、或溶解在捕集液中的形態(tài)進(jìn)行回收。作為捕集液，可以舉出甲苯或二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑或水等。作為捕集液，其中，優(yōu)選易于分離異丙醇生產(chǎn)時(shí)副產(chǎn)的揮發(fā)性雜質(zhì)和異丙醇的水。作為上述回收方法，例如可以舉出國際公開2009/008377號(hào)說明書中記載的方法等。
作為在能以溶解在捕集液或混合物中的形態(tài)回收的異丙醇的生產(chǎn)方法中能夠使用的裝置，例如可以舉出國際公開2009/008377號(hào)說明書的圖1所示的生產(chǎn)裝置。
在上述生產(chǎn)裝置中，在容納有含有異丙醇生產(chǎn)細(xì)菌和來自植物的原料的培養(yǎng)基的培養(yǎng)槽上，連接有用于從裝置外部注入氣體的注入管，能夠?qū)ε囵B(yǎng)基通氣。
另外，在培養(yǎng)槽上通過連接管連接有捕集槽，所述捕集槽容納有作為捕捉液的捕集液(trap solution) 0此時(shí)，向捕集槽移動(dòng)的氣體或液體與捕集液接觸發(fā)生起泡。
由此，在培養(yǎng)槽中通過通氣培養(yǎng)生成的異丙醇由于通氣而蒸發(fā)，易于從培養(yǎng)基中分離，同時(shí)在捕集槽中被捕集液捕集。結(jié)果，能夠以進(jìn)一步精制的形態(tài)連續(xù)且簡(jiǎn)便地生產(chǎn)異丙醇。
實(shí)施例
以下記載本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明并不限于此。需要說明的是，記載中的“％”若沒有特別說明則為質(zhì)量基準(zhǔn)。
[實(shí)施例1]
〈來自大腸桿菌的硫解酶基因、來自大腸桿菌的CoA轉(zhuǎn)移酶基因、來自梭菌屬細(xì)菌的乙酰乙酸脫羧酶基因、來自梭菌屬細(xì)菌的異丙醇脫氫酶基因、來自大腸桿菌0157的轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)載體及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化體的構(gòu)筑>
已經(jīng)報(bào)道了大腸桿菌的硫解酶及大腸桿菌的CoA轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列和基因的堿基序列。即，編碼硫解酶的基因被記載于在GenBank accession number U00096中記載的大腸桿菌MG1655株基因組序列的23M131 2325315中。另外，編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因被記載于上述大腸桿菌MG1655株基因組序列的2321469 2322781中。
作為用于使上述基因表達(dá)所需的啟動(dòng)子的堿基序列，可以使用在GenBank accession number X02662的堿基序列信息中，記載于397-440中的來自大腸桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時(shí)稱作GAPDH)的啟動(dòng)子序列。
為了取得GAPDH啟動(dòng)子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板，通過cga gctacatatgcaatgattgacacgattccg (1)及 cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg ()ψ 列號(hào)2)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶Ndel、SphI進(jìn)行消化，由此得到約IOObp的對(duì)應(yīng)于GAPDH啟動(dòng)子的DNA片段。將得到的DNA片段、和用限制酶NdeI及SphI 消化質(zhì)粒PBR322 (GenBank accession number J01749)而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有 50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)GAPDH啟動(dòng)子被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pBRgapP。
為了取得異丙醇脫氫酶基因，使用Clostridium beijerinckii NRR L B-593的基 Ι3 & DNA {^ !^ ., fflii aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg( Ιψβ}-^ 3) 及 gcggatccggtaccttataatataactactgctttaattaagtc (序歹丨J 號(hào) 4)按照 PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增,將得到的DNA片段用限制酶SphI、BamHI進(jìn)行消化，由此得到約1. Ikbp的異丙醇脫氫酶片段。 將得到的DNA片段、與用限制酶SphI及BamHI消化之前構(gòu)筑的pBRgapP而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903) 中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有 50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)異丙醇脫氫酶被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAP-IPAdh。
為了取得來自大腸桿菌的硫解酶基因，使用大腸桿菌MG 1655株的基因組DNA作 I^IS- fflii atggatccgctggtggaacatatgaaaaattgtgtcatcgtcag (j^^lj^· 5) Jk gcagaagcttgtctagattaattcaaccgttcaatcaccatc (序列號(hào)6)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶BamHI、HindIII進(jìn)行消化，由此得到約1. 2kbp的硫解酶片段。將得到的DNA片段、 與用限制酶BamHI及HindIII消化之前制成的質(zhì)粒pGAP-IPAdh而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/ mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)硫解酶基因被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAP-IPAdh-atoB。
為了取得來自大腸桿菌的CoA轉(zhuǎn)移酶α亞基基因，使用大腸桿菌MG1655株的基纟 DNA 1 !^ , fflii gctctagagctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac (列號(hào) 7)及 tagcaagcttctactcgagttatttgctctcctgtgaaacg(序列號(hào) 8)按照 PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶)(bal、HindIII進(jìn)行消化，由此得到約600bp的CoA轉(zhuǎn)移酶α亞基片段。將得到的DNA片段、和用限制酶^CbaI及HindIII消化之前制成的質(zhì)粒 pGAP-IPAdh-atoB而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)CoA轉(zhuǎn)移酶α亞基基因被正確插入，將該質(zhì)粒命名為 pGAP-IPAdh-atoB-atoD。
進(jìn)而，為了得到來自大腸桿菌的CoA轉(zhuǎn)移酶β亞基基因，使用大腸桿菌MG1655株 WSISiI DNA #IS., ilil aagtctcgagctggtggaacatatggatgcgaaacaacgtattg( ·歹 9)及ggccaagcttcataaatcaccccgttgc(序列號(hào)10)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶》ioI、HindIII進(jìn)行消化，由此得到約600bp的CoA轉(zhuǎn)移酶β亞基片段。將得到的DNA片段、和用限制酶BioI及HindIII消化之前制成的質(zhì)粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD 而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上，于37 °C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)CoA轉(zhuǎn)移酶β亞基基因被正確插入，將該質(zhì)粒命名為 pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA。
進(jìn)而，為了取得來自大腸桿菌0 157株的cscA，使用大腸桿菌0157株的基因組 DNA 作為模板，通過 gctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg(序歹丨J 號(hào) 11)及 ttaacccagttgccagagtgc(序列號(hào)12)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用T4多核苷酸激酶進(jìn)行末端磷酸化，由此得到約1470bp的cscA片段。將該DNA片段、和將之前制成的pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA用限制酶HindiII消化后用T4DNA聚合酶進(jìn)行平端化進(jìn)而用堿性磷酸酶將末端脫磷酸化得到的片段進(jìn)行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/ mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。從得到的菌體中回收質(zhì)粒，連接CoA轉(zhuǎn)移酶 β亞基基因的3’末端側(cè)和cscA的5’末端側(cè)，將確認(rèn)了 cscA被正確插入的質(zhì)粒命名為 pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA-cscA。
需要說明的是，大腸桿菌0157的基因組可以從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及計(jì)量技術(shù)研究所獲得。
為了取得乙酰乙酸脫羧酶基因，使用Clostridium acetobutylicum ATCC8M的 _ 13 纟IL DNA 1 !^ , ffl caggtaccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaatta gc (序列號(hào) 13)、及 gcggatccttacttaagataatcatatataacttcagc (序列號(hào) 14)按照 PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶Kpnl、BamHI進(jìn)行消化，由此得到約700bp的乙酰乙酸脫羧酶片段。將得到的DNA片段、和用限制酶KpnI及BamHI消化之前制成的質(zhì)粒 pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA-cscA而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)乙酰乙酸脫羧酶基因被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAP-Iaaa-cscA。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B株(ATCC1 1303) 中，在含有50μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂板上于37°C下培養(yǎng)一夜，將得到的轉(zhuǎn)化體作為 pGAP-Iaaa-c s cA/B 株。
[實(shí)施例2]
<使用3L培養(yǎng)槽、利用大腸桿菌pGAP-Iaaa-cscA/B株由蔗糖生產(chǎn)異丙醇>
本實(shí)施例中，使用W02009/008377號(hào)說明書圖1所示的生產(chǎn)裝置進(jìn)行異丙醇的生產(chǎn)。培養(yǎng)槽使用3升容積的槽，捕集槽使用IOL容積的槽。培養(yǎng)槽、捕集槽、注入管、連接管、 排出管均為玻璃制。在捕集槽中，以6L的量注入作為捕集液的水(捕集水)。需要說明的是，在培養(yǎng)槽中設(shè)置廢液管，將由糖和中和劑的流入而增加的培養(yǎng)液適當(dāng)排出至培養(yǎng)槽外。
作為預(yù)培養(yǎng)，在加入了 25mL含有50μ g/mL氨芐青霉素的LBBroth，Miller培養(yǎng)液 (Difco244620)的IOOmL容量的錐形瓶中接種實(shí)施例1中得到的pGAP-Iaaa-cscA/B株，在培養(yǎng)溫度35°C、120rpm的條件下攪拌培養(yǎng)一夜。將全部量的預(yù)培養(yǎng)液移至裝入了 1475g以下所示組成的培養(yǎng)基的3L容積的培養(yǎng)槽(ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中，進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)在大氣壓下、在通氣量1. 5L/min、攪拌速度550rpm、培養(yǎng)溫度35°C、pH7. 0 (用 NH3水溶液調(diào)節(jié))下進(jìn)行。從培養(yǎng)開始至8小時(shí)后的期間，以5g/L/小時(shí)的流速添加40wt/ wt%的蔗糖水溶液。之后，以15g/L/小時(shí)的流速添加40Wt/Wt%的蔗糖水溶液。從培養(yǎng)開始至48小時(shí)后，對(duì)菌體培養(yǎng)液取樣，通過離心操作除去菌體后，通過HPLC按照常用方法測(cè)定所得的培養(yǎng)上清液中的異丙醇的蓄積量。
〈培養(yǎng)基組成〉
玉米漿(日本食品化工制)20g/L
Fe2SO4 · 7H20 :0. 09g/L
K2HPO4 :2g/L
KH2PO4 :2g/L
MgSO4 · 7H20 :2g/L
(NH4)2SO4 :2g/L
Adecanol LGU6 (旭電化工業(yè))0. 6g/L
(剩余部分水)
結(jié)果，培養(yǎng)開始48小時(shí)后確認(rèn)到蓄積有5. 9g/L的異丙醇。需要說明的是，測(cè)定值為培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和捕集水(6L)中的合計(jì)值。
由上述結(jié)果可知，通過在蔗糖非PTS基因組中導(dǎo)入cscA分解蔗糖，作為分解產(chǎn)物的葡萄糖和果糖被迅速攝入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化為異丙醇。
[實(shí)施例3]
強(qiáng)化宿主大腸桿菌的基因組上的CoA轉(zhuǎn)移酶基因(atoD及atoA)和硫解酶基因 (atoB)的表達(dá)，在導(dǎo)入的質(zhì)粒載體上僅連接乙酰乙酸脫羧酶基因、異丙醇脫氫酶基因及 cscA,使質(zhì)粒全長(zhǎng)的DNA大小變小，嘗試由蔗糖生產(chǎn)異丙醇。
<大腸桿菌B株基因組上atoD啟動(dòng)子置換為GAPDH啟動(dòng)子>
大腸桿菌MG1655株的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number U00096)，還報(bào)道了編碼大腸桿菌MG1655株的CoA轉(zhuǎn)移酶α亞基的基因(以下有時(shí)簡(jiǎn)寫為atoD)的堿基序列。即，atoD記載于在GenBank accession number U00096中記載的大腸桿菌MG1655株基因組序列的2321469 2322131中。
作為用于表達(dá)上述基因所需的啟動(dòng)子的堿基序列，可以使用在GenBank accession number X02662的堿基序列信息中，記載于397-440的來自大腸桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時(shí)稱作GAPDH)的啟動(dòng)子序列。為了取得GAPDH啟動(dòng)子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板，通過cgctcaattgcaatgattgacacgattccg (序列號(hào)1 及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列號(hào)16)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶MfeI及EcoRI消化，由此得到約IOObp的編碼GAPDH啟動(dòng)子的DNA 片段。將得到的DNA片段和用限制酶EcoRI消化質(zhì)粒pUC19 (GenBank accession number X02514)、進(jìn)而進(jìn)行堿性磷酸酶處理而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的10個(gè)菌落分別在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)一夜，回收質(zhì)粒，選擇用限制酶EcoRI及KpnI進(jìn)行消化時(shí) GAPDH啟動(dòng)子未被切除的質(zhì)粒，進(jìn)而確認(rèn)DNA序列，將GAPDH啟動(dòng)子被正確插入的質(zhì)粒作為 pUCgapP。將得到的pUCgapP用限制酶EcoRI及KpnI消化。
進(jìn)而，為了取得atoD，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板， ffl cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac ( ^lJ 17)及 gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg (序列號(hào)18)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶EcoRI及KpnI消化，由此得到約690bp的atoD片段。將該DNA片段與之前用限制酶 EcoRI及KpnI消化后的pUCgapP混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)atoD被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAPatoD。
需要說明的是，大腸桿菌MG1655株可以由美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection)獲得。
如上所述，還報(bào)道了大腸桿菌MG1655株的基因組DNA中的atoD的堿基序列。使用基于大腸桿菌MG1655株的atoD的5，附近區(qū)域的基因信息制成的gctctagatgctgaaatc cactagtcttgtc (序列號(hào) 19)禾口 tactgcagcgttccagcaccttatcaacc (序列號(hào) 20),以大腸桿菌 MG1655株的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增了約1. Ikbp的DNA片段。
另外，使用基于大腸桿菌MG1655株的GAPDH啟動(dòng)子的序列信息制作的 ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列號(hào)21)和基于大腸桿菌MG1655株的atoD的序列信息制作的序列號(hào)18的引物，以上述制作的表達(dá)載體pGAPatoD作為模板進(jìn)行PCR，得到具有 GAPDH啟動(dòng)子和atoD的約790bp的DNA片段。
將如上得到的片段分別用限制酶I^stI和)(bal、XbaI和KpnI消化，將該片段和將溫度感受性質(zhì)粒 pTH18csl (GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh，Τ·， Gene, 241,185-191 (2000)〕用I^stI和KpnI消化得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到DH5ci株中，得到在含有10yg/ml氯霉素的LB瓊脂板上于30°C繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有10μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中于30°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B株(ATCC11303)中，在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上于30°C下培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將得到的轉(zhuǎn)化體接種在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上，在30°C下培養(yǎng)一夜。將得到的培養(yǎng)菌體涂布在含有10μ g/ml氯霉素的 LB瓊脂板上，在42°C下培養(yǎng)，得到菌落。將得到的菌落在不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中于 30°C下培養(yǎng)2小時(shí)，涂布在不含抗生素的LB瓊脂板上，得到在42°C下繁殖的菌落。
從出現(xiàn)的菌落中隨機(jī)地取出100個(gè)菌落，分別使它們?cè)诓缓股氐腖B瓊脂板和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上繁殖，選擇氯霉素感受性的克隆。進(jìn)而，通過PCR從上述克隆的染色體DNA中使含有GAPDH啟動(dòng)子和atoD的約790bp片段擴(kuò)增，選擇atoD啟動(dòng)子區(qū)域被GAPDH啟動(dòng)子置換的株，將滿足以上條件的克隆命名為大腸桿菌B株atoD缺失 GAPpatoD基因組插入株。
需要說明的是，大腸桿菌B株(ATCC11303)可以從作為細(xì)胞·微生物·基因文庫的美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心獲得。
[實(shí)施例4]
〈來自梭菌屬細(xì)菌的乙酰乙酸脫羧酶基因、來自梭菌屬細(xì)菌的異丙醇脫氫酶基因表達(dá)載體及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化體的構(gòu)筑>
梭菌屬細(xì)菌的乙酰乙酸脫羧酶記載于GenBank accession number M55392中，異丙醇脫氫酶記載于 GenBank accession number AF157307 中。
為了取得異丙醇脫氫酶基因，使用Clostridium beijerinckii NRR L B-593的基因組 DNA 作為模板，通過 AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(序列號(hào) 3) 及gcggatccttataatataactactgctttaattaagtc (序歹丨J號(hào)22)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得至丨J 的DNA片段用限制酶SphI、BamHI消化，由此得到約1. Ikbp的異丙醇脫氫酶片段。將得到的 DNA片段、與用限制酶SphI及BamHI消化之前制成的質(zhì)粒pBRgapP而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/ mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體回收質(zhì)粒，確認(rèn)IPAdh 被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAP-IPAdh。
為了取得乙酰乙酸脫羧酶基因，使用Clostridium acetobutylicum ATCC8M的基纟 DNA 1 !^ , fflii caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc (序歹丨J 號(hào) 23)及 ggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc (序歹丨J 號(hào) 24)按照 PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶BamHI、Ec0RI消化，由此得到約700bp的乙酰乙酸脫羧酶片段。將得到的DNA片段、與用限制酶BamHI及EcoRI消化之前制成的質(zhì)粒pGAP-IPAdh 而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織株式會(huì)社DNA-90;3)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。將得到的菌落在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)adc被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAP-Ia。
將上述質(zhì)粒pGAP-Ia轉(zhuǎn)化到實(shí)施例3中制成的大腸桿菌B株atoD缺失GAPpatoD 基因組插入株的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上于37°C下培養(yǎng)一夜，由此得到大腸桿菌pGAP-Ia/GAPpatoD基因組插入株。
需要說明的是，Clostridium acetobutylicum ATCC824、大腸桿菌B株可以從作為細(xì)胞·微生物·基因文庫的美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心獲得。另外，Clostridium beijerinckii NRRL B-593可以從作為細(xì)胞·微生物文庫的VTT生物品收藏中心獲得。
[實(shí)施例5]〈來自梭菌屬細(xì)菌的乙酰乙酸脫羧酶基因、來自梭菌屬細(xì)菌的異丙醇脫氫酶基因、 來自大腸桿菌0157的轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)載體及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化體的構(gòu)筑〉大腸桿菌0157株的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank accession number AE005174)，還報(bào)道了編碼大腸桿菌0157株的轉(zhuǎn)化酶的基因(以下有時(shí)簡(jiǎn)寫為 cscA)的堿基序列。艮口，cscA記載于在GenBank accession number AE005174中記載的大腸桿菌0157株基因組序列的3274383 3275816中。為了取得cscA，使用大腸桿菌0157株的基因組DNA作為模板，通過ATGGTACCGCTG GTGGAACATATGACGCAATCTCGATTGCATG (序列號(hào) 2 及 CGAATTCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC (序列號(hào)26)按照PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的DNA片段用限制酶KpnI及EcoRI消化，由此得到約 1470bp的cscA片段。將上述DNA片段、和用限制酶KpnI及EcoRI消化之前實(shí)施例4中制成的pGAP-Ia(來自梭菌屬細(xì)菌的乙酰乙酸脫羧酶基因、來自梭菌屬細(xì)菌的異丙醇脫氫酶基因表達(dá)載體)而得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞 (東洋紡織株式會(huì)社DNA-903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上繁殖的轉(zhuǎn)化體。從得到的菌體中回收質(zhì)粒，確認(rèn)cscA被正確插入，將該質(zhì)粒命名為pGAP-Ia-cscA。將上述質(zhì)粒pGAP-Ia-cscA轉(zhuǎn)化到實(shí)施例3中制成的大腸桿菌B株atoD缺失 GAPpatoD基因組插入株的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂板上，于 37°C下培養(yǎng)一夜，由此得到大腸桿菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因組插入株。需要說明的是，大腸桿菌0157的基因組可以從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及計(jì)量技術(shù)研究所獲得。[實(shí)施例6]<使用3L培養(yǎng)槽、利用大腸桿菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因組插入株由蔗糖生
產(chǎn)異丙醇>使用實(shí)施例5中得到的大腸桿菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因組插入株，與實(shí)施例2同樣地進(jìn)行異丙醇生產(chǎn)研究。另外，測(cè)定培養(yǎng)槽中的蔗糖、葡萄糖、果糖的蓄積量，結(jié)果示于表1。結(jié)果，在培養(yǎng)開始48小時(shí)后確認(rèn)到蓄積了 31.4g/L的異丙醇。需要說明的是，測(cè)定值為培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和捕集水中的合計(jì)值。[表1]
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，至少含有屬于蔗糖非PTS基因組的蔗糖水解酶基因， 同時(shí)被賦予或強(qiáng)化了異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，僅含有所述屬于蔗糖非PTS基因組的基因中的蔗糖水解酶基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌是被賦予了乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性的大腸桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性，分別是通過導(dǎo)入編碼來自下述細(xì)菌的各酶的基因而得到的，所述細(xì)菌為選自梭菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌及埃希氏菌屬細(xì)菌中的至少1 種。
5.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述乙酰乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自梭菌屬細(xì)菌的各酶的基因而得到的，所述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自埃希氏菌屬細(xì)菌的酶的基因而得到的。
6.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述乙酰乙酸脫羧酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的，所述異丙醇脫氫酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自拜氏梭菌的酶的基因而得到的，所述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過導(dǎo)入編碼來自大腸桿菌的各酶的基因而得到的。
7.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因、編碼異丙醇脫氫酶的基因及編碼蔗糖水解酶的基因通過質(zhì)粒被導(dǎo)入，所述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性是通過宿主大腸桿菌內(nèi)的基因組基因得到的。
8.如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述用于表達(dá)編碼CoA轉(zhuǎn)移酶的基因及編碼硫解酶的基因的啟動(dòng)子為甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子中的至少一個(gè)。
9.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，其中，所述乙酰乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、所述CoA轉(zhuǎn)移酶活性及硫解酶活性均是通過導(dǎo)入編碼來自梭菌屬細(xì)菌的各酶的基因而得到的。
10.一種異丙醇生產(chǎn)方法，包括使用權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌由來自含有蔗糖的植物的原料生產(chǎn)異丙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)異丙醇的大腸桿菌，該大腸桿菌至少含有屬于蔗糖非PTS基因組的蔗糖水解酶基因，同時(shí)被賦予或強(qiáng)化了異丙醇生產(chǎn)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供使用該大腸桿菌由來自含有蔗糖的植物的原料生產(chǎn)異丙醇的異丙醇生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102498203SQ20108003990
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者和田光史, 森重敬, 竹林望, 高橋均 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社