專利名稱：流感檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及引物、探針以及使用該引物和/或探針用來檢測A和/或B型流感病毒存在的方法和試劑盒。
背景技術：
共計有三種類型的流感病毒毒株A、B和C。在這三種毒株中，A型流感病毒被認為致病性最強，因為其可以感染包括人類在內(nèi)的許多種動物。B型流感病毒和C型流感病毒通常僅感染人類。利用野生禽類作為天然宿主的流感病毒稱為“禽流感病毒”，而利用人作為天然宿主的流感病毒稱為“人流感病毒”。在一些病例中，人和其它動物通過接觸感染的家禽和/或感染的野生禽類而感染禽流感病毒。具有交叉的物種并感染人類的禽流感病毒對近來廣泛流行的人流感負有責任。流感病毒，一種有包膜病毒，具有包含8個單鏈負義RNA片段的基因組。病毒包膜具有源自宿主的脂雙分子層，其帶有兩種負責病毒吸附的主要表面病毒糖蛋白血凝素 (“HA”)和神經(jīng)氨酸酶(“NA”)。在包膜內(nèi)，基質(zhì)蛋白(“Ml”)和核蛋白(“NP”)保護病毒RNA。流感病毒的A、B和C型的命名是基于Ml基質(zhì)蛋白和NP的抗原特征。所述8個RNA 片段編碼至少10種病毒蛋白片段1、2和3編碼三種病毒聚合酶蛋白；片段4編碼HA ’片段5編碼NP ；片段6編碼NA ；片段7編碼Ml和M2基質(zhì)蛋白，前者具有離子通道活性并且嵌入病毒包膜；以及片段8編碼非結(jié)構蛋白NSl和NS2，前者阻斷宿主抗病毒反應并且后者參與病毒顆粒的裝配。根據(jù)病毒表面上的HA和NA蛋白，A型流感病毒株可以進一歩分成亞型。A型流感病毒具有16種不同的HA亞型和9種不同的NA亞型，所有這些亞型可以以許多不同的組合存在于病毒表面上。例如，H5W病毒在其表面上有HA5蛋白和NAl蛋白。高度的遺傳以及由此的免疫變異性(尤其是A型流感病毒)的原因是由于這樣的事實除了通常的遺傳漂變(點突變)以外，也可以罕有發(fā)生遺傳漂移(病毒基因的重配)。這是由于這樣的事實 與其他病毒相反，流感病毒的基因組是分段的并且A型流感病毒是人以及動物體內(nèi)的病原體。所有亞型在鳥中都有發(fā)現(xiàn)。在人體中發(fā)現(xiàn)的更常見的A型流感病毒亞型是H1、H2 和H3亞型，已經(jīng)知道H5、H7和H9亞型也會感染人類。B型流感病毒株和C型流感病毒株不根據(jù)亞型分類。自1997年，先前僅感染鳥類的A型流感病毒已經(jīng)感染人類并具有致命的后果。被證實的一些導致人死亡的禽流感病毒的爆發(fā)已經(jīng)在1997年(H5W在香港)、1999年(H9N2 在中國和香港)、2002年(H7N2在美國弗吉尼亞)、2003年(H5m在中國和香港；H7N7在荷蘭；H9N2在香港；H7N2在美國紐約)、2004年(H5m在泰國和越南；H7N3在加拿大)以及 2005年(H5N1在泰國和越南)報道。A型流感病毒和B型流感病毒主要感染鼻咽腔和ロ咽腔并最初在受感染的人中引起一般的呼吸系統(tǒng)癥狀。即使是有經(jīng)驗的醫(yī)療專業(yè)人員也不可能僅僅根據(jù)患者的臨床癥狀非常可靠地診斷流感，這是因為其他感染鼻腔和咽腔的病毒(如腺病毒、副流感病毒或呼吸道合胞病毒(RS病毒))會引起相似癥狀。傳統(tǒng)的檢測A型禽流感病毒和B型禽流感病毒的方法包括噬菌斑測定，如培養(yǎng)增強酶聯(lián)免疫吸附測定(“CE-ELISA”)和雞胚蛋中病毒分離。通過血清學方法在檢測后進行病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶分型。雖然傳統(tǒng)方法表現(xiàn)出足夠的靈敏性，但是過程費時并因此對于個體患者不能快速診斷；例如，在胚胎蛋中分離病毒花費一到兩周的時間得到結(jié)果。其他的檢測A/B型流感病毒感染的方法包括抗原檢測、細胞培養(yǎng)分離或者通過逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測流感特異性RNA。由于這些測試的靈敏性，使用抗原檢測過程中有ー個巨大的問題?？焖贉y試試劑盒通常在M小時內(nèi)提供結(jié)果，并且具有約70% 的檢測流感靈敏性和約90%的特異性。快速測試試劑盒的靈敏性表示多達30%的樣本可產(chǎn)生假陰性，并且測試并非多重的(multiplexed)。它們都是在實驗室中進行，并且通常得出結(jié)果不夠快而不能影響處方治療。目前世界衛(wèi)生組織規(guī)定，推薦的在人體中識別A型禽流感病毒的診斷方法是免疫熒光測定(IFA)、病毒培養(yǎng)和PCR測定。IFA和病毒培養(yǎng)方法均費カ并且對于大量樣本是不可行的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述在所附的獨立權利要求中限定本發(fā)明。在所附的從屬權利要求中限定本發(fā)明的一些可選特征。特別是，本發(fā)明提出了上述問題，并且提供了用于更有效地檢測患者樣品中流感病毒的方法中的高度靈敏和特異的寡核苷酸、其片段和/或衍生物。引物和/或探針在流感檢測中可為靈敏的且特異的，并提供了快速和經(jīng)濟有效的用于確定因流感和/或與此相關的病情引起的感染的診斷和預后試劑。特別是，這些引物提供了特異的和/或靈敏的檢測方法，該檢測方法能夠通過區(qū)分季節(jié)性A和B型流感與新型A型流感而檢測所有A型流感和B型流感病毒株和亞型以及檢測新出現(xiàn)的A和B型流感病毒株。這些引物可以提供能夠在現(xiàn)場中(即，及時現(xiàn)場護理(“P0C”))進行的詳實的流感測定。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種分離的寡核苷酸，其包含選自SEQ ID NO 1 到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物、突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列，基本由選自 SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物、突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成，或者由選自SEQ IDNO :1到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物、突變和互補序列中的至少一種核苷酸序列組成。所述寡核苷酸可以與A和/或B型流感病毒結(jié)合，和/或從A和/ 或B型流感病毒擴增。根據(jù)另ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :10, SEQ ID N0:13、SEQ ID NO 16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列；基本由選自 SEQID N0:1、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO :13,SEQID NO 16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；或者由選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :10、SEQID NO :13、SEQ ID NO :16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；以及所述反向引物包含選自 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO : 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列；基本由選自 SEQID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :14、 SEQID NO 17,SEQ ID NO 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；或者由選自 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :14、 SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成。根據(jù)另ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー組寡核苷酸，其包括一對根據(jù)本發(fā)明任一方面的寡核苷酸和至少ー種探針。所述探針包含可選自SEQ IDNO 3, SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :15、SEQ IDNO 19，其片段，衍生物，突變和互補序列中的一種核苷酸序列；基本由選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、 SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 19，其片段，衍生物，突變和互補序列中的一種核苷酸序列組成; 或者由選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、SEQID NO :15、SEQ ID NO :19，其片段，衍生物，突變和互補序列中的一種核苷酸序列組成。根據(jù)再ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種使用至少ー種正向引物和至少ー種反向引物從A和/或B型流感病毒擴增的擴增子，所述正向引物包含選自SEQ ID NO=USEQ ID NO 4, SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :13 禾ロ SEQ ID NO 16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的核苷酸序列；基本由選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 10, SEQ IDN0:13和SEQ ID NO 16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的核苷酸序列組成；或者由選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO :16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的核苷酸序列組成；以及所述反向引物包含選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :14、 SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的核苷酸序列；基本由選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO :18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的核苷酸序列組成；或者由選自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 1 USEQID NO 14,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO : 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的核苷酸序列組成。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種檢測生物樣本中A和/或B型流感病毒存在的方法，該方法包括以下步驟(a)提供至少ー種生物樣本；(b)使根據(jù)本發(fā)明任一方面的至少ー種寡核苷酸、一對寡核苷酸或一組寡核苷酸， 與生物樣本中的至少ー種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴增的至少ー 種核酸接觸；以及(c)檢測從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當檢測到結(jié)合時A和/或B型
流感病毒存在。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種擴增A和/或B型流感病毒核酸的方法，其中，所述方法包括使用至少ー種根據(jù)本發(fā)明任一方面的正向引物和至少ー種根據(jù)本發(fā)明任一方面的反向引物進行聚合酶鏈式反應。
根據(jù)另ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種檢測A和/或B型流感病毒的試劑盒，該試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明任一方面的至少ー種寡核苷酸、一對寡核苷酸或者一組寡核苷酸。 所有引物和探針可以混合從而在單管中構成具有高度特異和靈敏的基于多重一步熒光探針的實時PCR。根據(jù)ー個特別的方面，提供了用于能檢測患者樣本中A和/或B型流感病毒DNA 的PCR的方法中的高度靈敏和特異的引物、其片段和/或衍生物。該測試可以用于檢查來自攜帶A和/或B型流感病毒患者的樣品。該引物可以是靈敏和特異的。而且，可以在每個反應中包括至少ー種IC分子從而監(jiān)測PCR的進行。


圖1 為顯示檢測(A) (FAM)A 型流感；(B) (HEX)豬 HlNl ； (C) (TexRD)B 型流感；(D) (CY5)A型H3N2流感的4-重RT-PCR的結(jié)果的圖。圖2為顯示通過溴化乙錠分析的顯示PCR產(chǎn)物大小的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果的照片。
具體實施例方式為方便起見，本說明書中涉及的參考文獻以文獻列表的形式列出并加入到實施例后面。這些參考文獻的全部內(nèi)容在此處通過引用的方式并入。定義本文所用術語“生物樣本”定義為來自至少一種動物和/或植物的任何組織和/ 或流體的樣本。生物樣本可以是動物(包括人)的流體、固體(例如，糞便)或者組織，以及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品和原料，如乳制品、蔬菜、肉和肉類加工副產(chǎn)品以及廢料。生物樣本可以從所有各種各樣的家畜以及野化家畜或者野生動物中獲得，包括，但不限于，這些動物，如有蹄類動物、熊、魚、兔形動物、嚙齒動物等等。環(huán)境樣本包括環(huán)境材料，如表面物質(zhì)、土壌、水、空氣和エ業(yè)樣本，以及從食物、乳品加工器械、設備、裝備、器具、一次性和非一次性產(chǎn)品中得到的樣本。這些實例并不解釋為限制可適用于本文中所公開方法的樣本類型。特別是，生物樣本可以是至少來自人類的任何組織和/或流體。本文所用術語“互補”是指與堿基配對規(guī)則有關的多核苷酸(即，如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)。例如，“5' -A-G-T-3' ”序列與“3' -T-C-A-5' ”序列互補。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈之間的雜交的效率和強度具有顯著作用。這在擴增反應以及依賴于核酸之間結(jié)合的檢測方法中尤為重要。特別是，“互補序列”是指ー種處干“反向平行聯(lián)會”的寡核苷酸，此時其與核酸序列排列以使ー種序列的5'末端與另ー序列的3'末端配對。ー些在天然核酸中不常發(fā)現(xiàn)的堿基可以被包含在本文所公開的核酸中，并且包括， 例如，次黃嘌呤核苷和7-脫氮鳥嘌呤(7-deazaguanine)?；パa性無需是完全的；穩(wěn)定的雙鏈體可以包含錯配堿基對或不匹配的堿基。核酸技術領域的技術人員可以憑經(jīng)驗考慮ー些變量來確定雙鏈體的穩(wěn)定性，所述變量包括，例如，寡核苷酸的長度、寡核苷酸的堿基組成和序列、離子強度和錯配堿基對的發(fā)生率。在第一寡核苷酸與靶核酸的區(qū)域互補并且第二寡核苷酸與相同區(qū)域(或者該區(qū)域的部分)具有互補性的情況下，沿所述靶核酸的這一位置處就存在ー種“重疊區(qū)”。重疊程度可以根據(jù)互補性的范圍而變化。
本文所用術語“包含(包括)”定義為“主要包含(包括)，但不是必須唯一的”。而且，本領域技術人員會自發(fā)地將術語“包含(包括)”解讀為包括“由……組成”。詞語“包含 (包括)，，的變形，如“包含(包括)(動詞原形)，，以及“包含(包括)(第三人稱単數(shù))”， 具有相應的各種含義。本文所用術語“衍生物”定義為本發(fā)明的寡核苷酸的化學修飾，或者與所述寡核苷酸互補的多核苷酸序列的化學修飾。多核苷酸序列的化學修飾可以包括，例如，由烷基、酰
基或氨基取代氫。本文所用術語“片段”定義為一種寡核苷酸的全序列的不完整的或分離的部分，其包括賦予序列所述寡核苷酸的特征和功能的活性/結(jié)合位點。特別是，其可以短至少ー個核苷酸或者氨基酸。更特別的是，所述片段包含能夠使所述寡核苷酸與流感病毒結(jié)合的結(jié)合位點。例如，正向引物的片段可以包含SEQ ID NO =USEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :13或SEQ ID NO :16的至少10、12、15、18或19個連續(xù)的核苷酸，和/或反向引物的片段可以包含 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ IDNO =IUSEQ ID NO :14,SEQ ID NO :17 或 SEQ ID NO : 18 的至少 10、12、15、18、19、20、22 或 24 個連續(xù)的核苷酸。更特別的是，引物片段的長度可以為至少15個核苷酸。本文所用術語“內(nèi)對照(IC)分子”定義為體外轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子是通過本發(fā)明的方法中使用的針對流感病毒的相同引物組進行共擴增的。特別是， 所述IC可以在反應混合物中混合以監(jiān)測PCR的運行，從而避免假陰性結(jié)果。用于檢測該IC 分子的探針可以特異性針對該分子的內(nèi)部。該內(nèi)部可以為人工設計的并且在自然界不會發(fā)生。本發(fā)明上下文中使用的術語“流感病毒”包括所有落入“禽流感病毒”和“人流感病毒”范疇的流感病毒的亞型。所述流感病毒可以是A、B或C型流感病毒。特別是，所述A 型流感病毒可以包括，但不限于 HlNl、H3N2、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7 和H9N2等。本文所用術語“突變”定義為在核酸序列中一定長度的核苷酸的改變。本領域技術人員將理解的是，小的突變，特別是置換、缺失和/或插入的點突變對核苷酸的延長影響不大，特別是在所述核酸是用作探針時。因此，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包括至少ー個核苷酸的替換、缺失和/或插入的突變。而且，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸及其衍生物也可以用作探針， 因此，本文所涉及的任何寡核苷酸也包括它們的突變和衍生物。例如，如果突變發(fā)生在靶基因的任何引物雜交位點的幾個堿基位置處，特別是在5'-末端，引物的序列不會影響引物的靈敏性和特異性。術語“生物樣本中的核酸”是指任何包含核酸(RNA或DNA)的樣本。特別是，核酸的來源是包括但不限于血液、唾液、腦脊髓液、胸膜腔積液、乳汁、淋巴液、痰和精液的生物樣本。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種分離的寡核苷酸，其包含選自SEQ ID NO 1 到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物、突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列，基本由選自 SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物、突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成，或者由選自SEQ IDNO :1到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物、突變和互補序列中的至少一種核苷酸序列組成。所述寡核苷酸可以能夠與流感病毒結(jié)合和/或從流感病毒中被擴
9増。所述流感病毒可以選自A和/或B型流感病毒中。特別是，所述寡核苷酸可以用作引物和/或探針并且可用于特異性檢測樣本中的A和/或B型流感病毒的方法中，所述樣本含有流感病毒株和/或其他不相關病毒/顯微生物中的任ー種或兩種。這些本發(fā)明的引物和探針的核苷酸序列被設計成特異性地與A型流感病毒基因組和B型流感病毒基因組的區(qū)域雜交，所述區(qū)域相對于各個毒株的基因組是獨特的，但是在各個毒株內(nèi)很多病毒交叉中又是保守的。根據(jù)本發(fā)明任一方面的引物可以用于區(qū)分A型流感和B型流感的基因型。特別是， 根據(jù)本發(fā)明的引物可以用于區(qū)分A型流感病毒的不同亞型的基因型。甚至更特別的是，所述引物可以用于區(qū)分A型流感病毒和/或B型流感病毒的豬源Hmi分型確定、季節(jié)性Hmi 和季節(jié)性H3N2等。流感病毒可以為耐藥性毒株。所述流感病毒的耐藥性毒株可以對選自金剛烷胺 (aantadine)、奧司他串(oeltamivir)、金剛乙胺(rimantadine)和扎那米韋(zanamivir) 等中的一種或多種藥物有耐藥性。所述流感病毒的耐藥性毒株可以是對多種藥物有耐藥性的多藥耐藥性毒株。所述寡核苷酸序列的長度可以在13至35個連接的核苷酸之間并且可以包含與選自SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 19中的任意序列的至少70%序列同一性。本領域技術人員將理解的是，給出的引物無需以100%的互補性雜交以有效地啟動擴增反應中互補核酸鏈的合成。引物可以在ー種或多種片段上雜交，以使插入片段或相鄰片段沒有參與雜交事件 (例如，環(huán)結(jié)構或發(fā)夾結(jié)構)。特別是，所述寡核苷酸的序列可以具有與選自SEQ ID NO 1 到SEQ IDNO 19中的任一序列的80%、85%、90%，、95%或98%的序列同一性。序列同一性的70%到100%的變化范圍，或者這其中的任何范圍可以與公開的特異性引物序列相關。下述實例中描述了序列同一性的確定一種長度為20個核苷酸的引物與另ー種具有兩個非全同殘基的長度為20個核苷酸的引物一致，20個中具有18個相同殘基(18/20 = 0.9或90%序列同一性)。另ー個實例中，ー種長度為15個核苷酸的引物的所有殘基與ー種長度為20個核苷堿基的引物中的15個核苷酸的片段一致，就會與20個核苷酸的引物具有15/20 = 0. 75或75%的序列同一性。同源性、序列同一性或者互補性的百分比可以通過，例如使用默認設置的Gap程序(Wisconsin序列分析包，UNIX版本8，遺傳學計算機組，大學研究園，Madison WI)來確定，其采用 Smith 和 Waterman 的運算法則(Adv. Appl. Math.，1981，2，482-489)。技術人員能夠計算出序列同一性百分比或者序列同源性百分比，并能夠無需過多實驗就能確定引物序列同一性的變化對引物行使其啟動用于制備擴增產(chǎn)物的核酸互補鏈的合成的功能的影響。根據(jù)另ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :4、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列，基本由選自 SEQID NO 1, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO :13,SEQID NO 16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；或者由選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :10、SEQID NO :13、 SEQ ID NO :16，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；以及所述反向引物包含選自 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO : 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列；基本由選自 SEQID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :14、 SEQID NO 17,SEQ ID NO 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；或者由選自 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :14, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO : 18，其片段，衍生物，突變和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成。根據(jù)又ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー組寡核苷酸，其包括根據(jù)本發(fā)明任一方面的一對寡核苷酸和至少ー種探針。所述探針可以包含選自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQID NO :12, SEQ ID NO :15和SEQ ID NO : 19，其片段，衍生物，突變和互補序列中的能夠與擴增子結(jié)合的核苷酸序列；基本由選自 SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、SEQ ID N0:15和SEQ ID NO :19，其片段，衍生物，突變和互補序列中的能夠與擴增子結(jié)合的核苷酸序列組成；或者由選自 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 12、SEQID NO :15和SEQ ID NO 19，其片段，衍生物，突變和互補序列中的能夠與擴增子結(jié)合的核苷酸序列組成。所述探針可以用熒光染料在其5'和3'末端標記。5'-標記熒光染料的實例可以包括，但不限干，6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)、四氯-0-羧基熒光素和花青-5(Cy5)。3'-標記熒光染料的實例可以包括，但不限干，5-羧基四甲基若丹明 (TAMRA)和黑洞猝滅劑-1，2，3 (BHQ-1，2，3)。本發(fā)明的寡核苷酸可以用于本領域中已知的各種核酸擴增技木，如，舉例來說， 聚合酶鏈式反應(PCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、滾環(huán)擴增 (RCA)、鏈置換擴增(SDA)、耐熱SDA(tSDA)或連接介導的擴增(LMA)。本發(fā)明的寡核苷酸也可以用于本領域普通技術人員已知的在不擴增的情況下通過直接與病毒核酸雜交來直接檢測A和B型流感的各種方法中，或者用于檢測病毒核酸的DNA或RNA拷貝或它們的互補。根據(jù)本發(fā)明任一方面的寡核苷酸可以用于檢測臨床或培養(yǎng)樣本的流感的方法中， 其中，所述臨床樣本包括但不限干，鼻咽拭子、鼻拭子和咽喉拭子以及鼻咽分泌物和清洗物。所述臨床樣本可以在測試以前進行初步處理從而使病毒核酸的檢測更有效。例如，可以收集樣本并加入到運送培養(yǎng)基中以使病毒穩(wěn)定?？梢詫⒈茄适米?、鼻拭子和咽喉拭子加入到運送培養(yǎng)基中。鼻咽分泌物和清洗物可以或不可以通過添加運送培養(yǎng)基而穩(wěn)定。測試實驗室一旦收到病毒，就可以將其滅活并溶解以釋放病毒RNA。核酸可以任選地隨后被提取從而除去后來的測試步驟的潛在的抑制劑或其他干擾劑。為了進行本發(fā)明的方法，可以將病毒核酸與對于特異性檢測A型流感和/或B型流感必不可少的組分混合。根據(jù)再ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種使用根據(jù)本發(fā)明任一方面的至少ー種正向弓丨物和至少ー種反向弓丨物從流感擴增的擴增子。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種檢測和/或定量生物樣本中流感病毒的存在的方法，所述方法包括步驟(a)提供至少ー種生物樣本；(b)使根據(jù)本發(fā)明的任一方面的至少ー種寡核苷酸、一對寡核苷酸或一組寡核苷酸，與生物樣本中的至少ー種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴增的至少ー種核酸接觸；以及(c)檢測和/或定量從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當檢測到結(jié)合時流感病毒存在。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種擴增A和/或B型流感病毒核酸的方法，其中，所述方法包括使用至少ー種根據(jù)本發(fā)明任一方面的正向引物和根據(jù)本發(fā)明任一方面的反向引物進行聚合酶鏈式反應。根據(jù)另ー個方面，本發(fā)明提供了至少ー種用于檢測A和/或B型流感病毒的試劑盒，該試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明任一方面的至少ー種寡核苷酸、一對寡核苷酸或一組寡核苷酸。臨床醫(yī)生可以使用該試劑盒檢測患有流感癥狀的患者中的人和禽流感病毒。這樣的試劑盒將包括用于檢測A型禽流感、A型流感或B型人流感的一種或多種引物和探針組。用于檢測A型禽流感、A型流感或B型人流感的引物和/或探針組可見于表1。
權利要求
1.一種分離的寡核苷酸，其包含選自SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸序列的長度在13至35個連接的核苷酸之間并且包含與SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 19中的任一序列的至少70%序列同一性。
3.一種分離的寡核苷酸，其由選自SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :19、其片段、衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成。
4.根據(jù)權利要求1 3中任一項所述的分離的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能夠與A 和/或B型流感病毒結(jié)合和/或者從A和/或B型流感病毒擴增。
5.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:7、SEQ IDNO 10,SEQ ID NO :13,SEQ ID NO :16，其片段，衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列；以及所述反向引物包含選自 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18，其片段，衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列。
6.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物由選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:7、SEQ IDNO : 10、SEQ ID NO :13 禾ロ SEQ ID NO :16，其片段，衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成；以及所述反向引物由選自 SEQ ID NO 2,SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 14、SEQ ID NO :17、 SEQID NO :18，其片段，衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列組成。
7.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :1、其片段、衍生物或互補序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO :2、其片段、衍生物或互補序列。
8.根據(jù)權利要求7所述的ー對寡核苷酸序列，其能夠與A型流感病毒結(jié)合和/或從A 型流感病毒擴增。
9.一組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求7或8所述的ー對寡核苷酸和至少ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :3、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
10.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :7，其片段，衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列； 以及所述反向引物包含SEQ ID NO 5,SEQID NO :8，其片段，衍生物，突變或互補序列中的至少ー種核苷酸序列。
11.根據(jù)權利要求10所述的ー對寡核苷酸，其中，所述正向引物包含SEQID N0:4、其片段、衍生物或互補序列，以及所述反向引物包含SEQ IDNO :5、其片段、衍生物或互補序列。
12.根據(jù)權利要求10所述的ー對寡核苷酸，其中，所述正向引物包含SEQID N0:7、其片段、衍生物或互補序列，以及所述反向引物包含SEQ IDNO :8、其片段、衍生物或互補序列。
13.根據(jù)權利要求10 12中任一項所述的ー對寡核苷酸，其能夠與A型流感病毒結(jié)合和/或者從A型流感病毒擴增。
14.根據(jù)權利要求13所述的ー對寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的 HlNl亞型。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的ー對寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的豬源Hmi亞型。
16.一組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求10 15中任一項所述的ー對寡核苷酸和至少 ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :9、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
17.—組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求11所述的ー對寡核苷酸和至少ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :6、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
18.—組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求12所述的ー對寡核苷酸和至少ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :9、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
19.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :10、其片段、衍生物或互補序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO=IU 其片段、衍生物或互補序列。
20.根據(jù)權利要求19所述的ー對寡核苷酸，其能夠與A型流感病毒結(jié)合和/或者從A 型流感病毒擴增。
21.根據(jù)權利要求20所述的ー對寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的季節(jié)性Hmi亞型。
22.—組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求19 21中任一項所述的ー對寡核苷酸和至少 ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :12、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
23.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :13、其片段、衍生物或互補序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO 14, 其片段、衍生物或互補序列。
24.根據(jù)權利要求23所述的ー對寡核苷酸，其能與A型流感病毒結(jié)合和/或者從A型流感病毒擴增。
25.根據(jù)權利要求M所述的ー對寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的季節(jié)性H3N2亞型。
26.一組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求23 25中任一項所述的ー對寡核苷酸和至少 ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :15、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
27.ー對寡核苷酸，其包括至少ー種正向引物和至少ー種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :16、其片段、衍生物或互補序列；以及所述反向引物包括SEQ ID NO :17、 SEQ ID NO :18，其片段，衍生物或互補序列中的至少ー種核苷酸序列。
28.根據(jù)權利要求27所述的ー對寡核苷酸，其能與B型流感病毒結(jié)合和/或者從B型流感病毒擴增。
29.一組寡核苷酸，其包括根據(jù)權利要求27或觀所述的ー對寡核苷酸和至少ー種探針，所述探針包含SEQ ID NO :19、其片段、衍生物或互補序列的核苷酸序列。
30.ー種使用至少ー種正向引物和至少ー種反向引物從A和/或B型流感病毒擴增的擴增子，其中，所述正向引物包含選自SEQ ID NO =USEQ IDNO :4、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :16，其片段，衍生物和互補序列中的至少ー種核苷酸序列； 所述反向引物包含選自 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18，其片段，衍生物和互補序列中的核苷酸序列。
31.根據(jù)權利要求30所述的擴增子，其中，至少ー種探針能夠與所述擴增子結(jié)合，所述探針包含選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :15、 SEQ ID NO :19，其片段，衍生物和互補序列中的核苷酸序列。
32.—種檢測和/或定量生物樣本中流感存在的方法，該方法包括步驟(a)提供至少ー種生物樣本；(b)使至少ー種根據(jù)權利要求1 4中任一項所述的寡核苷酸，與生物樣本中的至少ー 種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴增的至少ー種核酸接觸；以及(c)檢測和/或定量從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當檢測到結(jié)合時所述病母存在。
33.一種檢測和/或定量生物樣本中A和/或B型流感病毒存在的方法，該方法包括步驟(a)提供至少ー種生物樣本；(b)使根據(jù)權利要求9、16 18、22J6或四中任一項所述的一組寡核苷酸，與生物樣本中的至少ー種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴增的至少ー種核酸接觸；以及(c)檢測和/或定量從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當檢測到結(jié)合時所述病母存在。
34.根據(jù)權利要求32或32所述的方法，其中，所述流感病毒是A型流感病毒或B型流感炳母。
35.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述A型流感病毒的亞型選自豬源Hmi、季節(jié)性HlNl和季節(jié)性H3N2中。
36.根據(jù)權利要求32 35中任一項所述的方法，其進ー步包括在步驟(a)之后將內(nèi)分子(IC)和特異性針對所述IC的探針與生物樣本混合的步驟。
37.ー種用于檢測A和/或B型流感病毒的試劑盒，所述試劑盒包括至少ー種根據(jù)權利要求1 4中任一項所述的寡核苷酸。
38.ー種用于檢測A和/或B型流感病毒的試劑盒，所述試劑盒包括至少ー對根據(jù)權利要求5 8、10 15、19 21、23 25或27 觀中任一項所述的寡核苷酸。
39.ー種用于檢測A和/或B型流感病毒的試劑盒，所述試劑盒包括至少ー組根據(jù)權利要求9、16 18、22、沈或四中任一項所述的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了簡單、特異和/或靈敏的測試A和/或B型流感病毒的存在的寡核苷酸。還提供了用于測試中的包括用作探針和/或引物的寡核苷酸的試劑盒。
文檔編號C12N15/44GK102597261SQ201080039846
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權日2009年7月13日
發(fā)明者T·巴克漢姆, 井上雅文 申請人:新加坡科技研究局, 陳篤生醫(yī)院