專利名稱：一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)廣泛分布于海水環(huán)境中，能夠感染脊椎與非脊椎動物，包括魚、蝦、貝等。如同其它感染，哈氏弧菌感染的早期診斷將有利于弧菌病的防控。然 而，哈氏弧菌檢測受到下列因素的制約(1)在形態(tài)上不同菌株間存在較大的差異，(2)在 遺傳進(jìn)化上該菌與數(shù)種其它弧菌，如溶藻弧菌和副溶血弧菌，非常相近。目前，已有幾種利 用分子生物學(xué)手段檢測哈氏弧菌的方法，包括通過PCR分析溶血素基因vhh、調(diào)控蛋白基因 toxR、促旋酶基因gyrB、以及16S rRNA基因。由于這些基因都不僅存在于哈氏弧菌中而且 存在于其它弧菌中，因而其檢測結(jié)果難免有假陽性和假陰性。另外，這些方法皆需要細(xì)胞培 養(yǎng)以及DNA提取，在操作上有一定的時間要求和技術(shù)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列。特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用所述遺傳標(biāo)記可特異性的檢測哈氏弧菌。1)根據(jù)序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示的哈氏弧菌特異性 分子遺傳標(biāo)記，涉及的引物為引物F6(5’ -TGGATGTAAATGAGTTTGG-3’ )和 R4(5' -CGTTACGATTATTTGATAG-3‘)；2)待測魚血液與組織樣品的制備于無菌條件下取魚尾靜脈血和魚腎、脾臟，將 腎、脾臟加入Iml PBS進(jìn)行勻漿，而后進(jìn)行稀釋，待用；3)環(huán)境樣品的制備自環(huán)境中取IOml水體，用0. 45uM濾膜過濾，將濾膜用無菌水 沖洗，收集沖洗后的無菌水水樣，于100°c煮沸5min。4)取IOuM的F6和R4為引物，以2ul步驟2)或3)中的樣品為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，若得到159bp PCR產(chǎn)物，即可確定待測魚血液與組織樣品被哈氏弧菌感染。所述步驟2)的血液和組織勻漿液用無菌水進(jìn)行IOx稀釋，而后將稀釋液于100°C 煮沸5min。所述步驟3)的濾膜用0. 5ml無菌水沖洗。所述步驟4)的PCR反應(yīng)體系為15ul ； PCR 過程為94°C 4min 預(yù)變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 40s, 25-30 個循環(huán)后 再在72°C延伸反應(yīng)5min。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.準(zhǔn)確性較高。本發(fā)明所用的遺傳標(biāo)記廣泛存在于哈氏弧菌中而且具有一定的屬 內(nèi)保守性，因而與其它弧菌交叉反應(yīng)的可能性很小。2.快速簡單。本發(fā)明的哈氏弧菌檢測方法實施過程簡單，毋需細(xì)胞培養(yǎng)、DNA提取等步驟，只需常規(guī)的PCR，3小時左右即可獲得結(jié)果。3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明的檢測方法對樣品無特殊要求，可以檢測環(huán)境及生物源性樣品。4.本發(fā)明通過哈氏弧菌基因vhhP2，該基因廣泛存在于哈氏弧菌中，但不存在于其它弧菌中，包括上述與哈氏弧菌進(jìn)化關(guān)系非常近的兩種弧菌中，因而該基因是一種特異 的哈氏弧菌遺傳標(biāo)記，用其作為PCR探針可以準(zhǔn)確、快速地從多種生物和環(huán)境樣品中檢測 哈氏弧菌。


圖1為本發(fā)明從魚血液、組織中檢測哈氏弧菌的電泳圖譜(其中泳道1 分子量 marker ；泳道2，陽性對照；泳道3、4、5分別為以注射過T4的魚血液、脾臟、肝臟為模板所 得的PCR產(chǎn)物；泳道6、7、8分別為以注射過PBS的魚血液、脾臟、肝臟為模板所得的PCR產(chǎn) 物。)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相 應(yīng)試劑盒。2. PCR反應(yīng)各種組分皆購于“天根生化科技(北京)有限公司”。實施例1哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記由序列表SEQ ID No. 1中的vhhP2堿基序列組成。序列表SEQ ID No. 1 為:ATGAAGAGAAGGAATCCTCAAGGCCTTACCCTACTAGAACTTATCATTGCGATAGTCATTCTCGGCATC CTAGCTGTTGTTGCAGCTCCCCGTTTTTTAAACCTCCAAGACGATGCGTATCAAGCAAAAATGGAATCCATCGCTGACCA ATTCGMACAGGCGTGCGATTTACCCAAAGCCAATGGTTAGTCAATGGTGGAACACAGGAAGCTCAAACAGATATCGATG GATATGGTGGTGGCGAACTGGATGTAAATGAGTTTGGCTTTCCGCTTGGCACTAACAAGGGCAACAGAAATGGCGTGATT GGCAACCCGTATAACATAGGACAAGGGAATGCTGGTTGTATTGCCGTGTGGCAAGCTTTACTCGGCAACGAATACTCTCT ATCAAATAATCGTAACGCGAACGATAGGTTTGATTTTATTACCCGACGAGTCCAAGACAAAGAATCCCACCAATCTGTTT GTTATTATACCTTTACTAAAAAAGGTTACGATCGCAATCCTGATAACTCTAGCTTCGTCATATGGTATGACTCAAAAACA GGCAGCGTCACGACATCAAAACCAACTAGATTGAAATAA
(a)序列特征·長度588bp·類型堿基序列·鏈型單鏈·拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否 (e)最初來源哈氏弧菌T4(f)特異性名稱vhhP2哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，其遺傳標(biāo)記可特異性的檢測哈氏弧菌。魚血液與組織中哈氏弧菌的檢測1)牙鲆的人工感染在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈氏弧菌T4 (保存于CGMCC，保藏編號為CGMCCNo. 1985) 至OD6tltl為0.6，離心(500(^，4°0101^11，收集菌體，將其懸浮于？83中至終濃度為51106(^11/ ml。將10條牙鲆(每條重約12g)隨機(jī)分為2組，每組5條。將這2組分別命名為A和B。 將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述哈氏弧菌懸浮液。將B組的每條魚分別腹腔注射 lOOulPBS。其中LB液體培養(yǎng)基組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏， 1.0% NaCl, 97. 5% H20 ；PBS 組成成分按重量百分比計0. 8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358% Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4 ；2)牙鲆血和組織樣品制備在上述步驟1)牙鲆感染48h時，于無菌條件下取魚尾靜脈血，置于1. 5ml離心管。 同時取魚腎、脾臟，置于玻璃勻漿器中，加入Iml PBS進(jìn)行勻漿。將血液和組織勻漿液用無 菌水進(jìn)行IOx稀釋。將稀釋液于100°C煮沸5min。3) PCR 檢測在0. 5ml PCR管中，加入下列成分2ul上述步驟2)高溫處理后的 血液或組織稀釋液，IOuM引物F6(5，-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3，)，IOuM弓丨物 R4(5，-CGTTACGATTATTTGATAG-3，)，1.5μ 1 PCR buffer(200mM Tris-NCl(pH 8. 4),200mM KCl, 15mM MgCl2), 1. 5μ 1 IOmM dNTP,0. 25 μ 1 Taq DNA 聚合酶，加水至總體積為 15ul。其中引物F6和R4為vhhP2特異性引物，其PCR產(chǎn)物大小為159bp。按下列條件進(jìn)行PCR 94 °C 4min預(yù)變性模板DNA，然后94 °C 40s, 50 °C 60s， 72°C 40s, 25-30個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)5min。取IOul PCR產(chǎn)物于0. 8%瓊脂糖凝膠 電泳，電泳后凝膠用溴化乙錠染色觀察。結(jié)果表明(見附圖1)，只有用注射哈氏弧菌的牙鲆 血液和組織做模版的PCR擴(kuò)增出一條159bp的陽性條帶，而用注射PBS的牙鲆血液和組織 做模版的PCR則無任何條帶。實施例2養(yǎng)殖蝦池中哈氏弧菌的檢測1)水樣采集和處理
自兩個不同對蝦養(yǎng)殖池(命名為A和B)中分別取IOml水體，分別用0. 45uM濾膜 過濾，去掉過濾后的水體。將濾膜用0. 5ml無菌水沖洗，分別收集沖洗后的無菌水水樣，即 為A和B沖洗液。將A和B沖洗液于100°C煮沸5min。2) PCR 檢測在0. 5ml PCR管中，加入下列成分2μ 1上述步驟1)高溫處理過的A或B沖洗液， IOuM 引物 F6 (5，-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3，)，IOuM 引物 R4 (5，-CGTTACGATTATTTGATAG-3，)， 1. 5 μ 1 PCR buffer (200mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)，200mM KCl，15mM MgCl2)，1· 5 μ 1 IOmM dNTP, 0. 25 μ 1 Taq DNA聚合酶，加水至總體積為15ul。PCR條件同實施例1步驟3)。結(jié)果表明，只有蝦池A的水樣擴(kuò)增出一條159bp的 陽性條帶，蝦池B的水樣無任何PCR條帶，說明蝦池A含有哈氏弧菌，蝦池B不含有哈氏弧菌。3)上述步驟2) PCR結(jié)果的分子驗證為了檢驗上述步驟2) PCR結(jié)果的正確性，將IOOul上述步驟1)沒有經(jīng)過高溫處理 的沖洗液A和B涂布于TCBS平板(購于“海博生物技術(shù)有限公司”)，28°C培養(yǎng)24_32h后， 每個平板挑取20個菌落，于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。在0. 5ml PCR管中，加入下列成分 1 μ 1 細(xì)菌培養(yǎng)液，IOuM 引物 8F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，IOuM 引物 1492R(5，-GG TTACCTTGTTACGACTT-3，)，1. 5 μ 1 PCR buffer(200mM Tris-HCl(pH 8. 4)，200mM KCl,15mM MgCl2)，1. 5μ 1 IOmM dNTP，0. 25 μ 1 Taq DNA聚合酶，加水至總體積為15ul。PCR條件同實 施例1步驟3)。其中8F和1492R為16SrRNA基因特異性引物。將PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果表明來自蝦池A水樣的菌落中有15 %為哈氏弧菌，而來自蝦 池B水樣的菌落皆非哈氏弧菌。由此證明上述步驟2)的PCR結(jié)果正確。以上結(jié)果表明，本發(fā)明的哈氏弧菌檢測方法可以快速準(zhǔn)確地檢測血液、組織以及 環(huán)境樣品中的哈氏弧菌。序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院海洋研究所<120> 一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>588<212>DNA<213> 哈氏弧菌 T4<220><221>CDS<222>(1). . (588)<223>
<400>1atg aag aga agg aat cct caa ggc ctt acc cta cta gaa ctt ate att 48Met Lys Arg Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015
gcg ata gtcatt ctc ggc ate cta get gtt gtt gca get ccc cgt ttt 96Ala lie Vallie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530tta aac ctccaa gac gat gcg tat caa gca aaa atg gaa tcc ate get 144Leu Asn LeuGln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045gac caa ttcgaa aca ggc gtg cga ttt acc caa age caa tgg tta gtc 192Asp Gln PheGlu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560aat ggt ggaaca cag gaa get caa aca gat ate gat gga tat ggt ggt 240Asn Gly GlyThr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580ggc gaa ctggat gta aat gag ttt ggc ttt ccg ctt ggc act aac aag 288Gly Glu LeuAsp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095ggc aac agaaat ggc gtg att ggc aac ccg tat aac ata gga caa ggg 336Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110aat get ggttgt att gcc gtg tgg caa get tta ctc ggc aac gaa tac 384Asn Ala GlyCys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125tct cta teaaat aat cgt aac gcg aac gat agg ttt gat ttt att acc 432Ser Leu SerAsn Asn Arg Asn Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140cga cga gtccaa gac aaa gaa tcc cac caa tct gtt tgt tat tat acc 480Arg Arg ValGln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160ttt act aaaaaa ggt tac gat cgc aat cct gat aac tct age ttc gtc 528Phe Thr LysLys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175ata tgg tatgac tea aaa aca ggc age gtc acg aca tea aaa cca act 576lie Trp TyrAsp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190aga ttg aaataa588Arg Leu Lys
195<210>2<211>195<212>PRT<213> 哈氏弧菌T4<400>2Met Lys Arg Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015Ala lie Val lie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110Asn Ala Gly Cys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asn Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175lie Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190Arg Leu Lys19權(quán)利要求
一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記，其特征在于序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。
2.一種按權(quán)利要求1所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述 遺傳標(biāo)記可特異性的檢測哈氏弧菌。
3.按權(quán)利要求2所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于1)根據(jù)序列表SEQID No. 1中的堿基序列所示的哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記，涉及 的引物為引物 F6(5，-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3，)和 R4(5，-CGTTACGATTATTTGATAG-3，)；2)待測魚血液與組織樣品的制備于無菌條件下取魚尾靜脈血和魚腎、脾臟，將腎、脾 臟加入Iml PBS進(jìn)行勻漿，而后進(jìn)行稀釋，待用；3)環(huán)境樣品的制備自環(huán)境中取IOml水體，用0.45uM濾膜過濾，將濾膜用無菌水沖 洗，收集沖洗后的無菌水水樣，于100°C煮沸5min。4)取IOuM的F6和R4為引物，以2ul步驟2)或3)中的樣品為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若 得到159bp PCR產(chǎn)物，即可確定待測魚血液與組織樣品被哈氏弧菌感染。
4.按權(quán)利要求3所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述步驟2)的血液和組織勻漿液用無菌水進(jìn)行IOx稀釋，而后將稀釋液于100°C煮沸5min。
5.按權(quán)利要求3所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述步驟3)的濾膜用0.5ml無菌水沖洗。
6.按權(quán)利要求3所述的哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4)的PCR反應(yīng)體系為15ul；PCR過程為94°C 4min預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s，50°C 60s， 72°C 40s, 25-30個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)5min。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種哈氏弧菌特異性分子遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。具體為所述哈氏弧菌遺傳標(biāo)記具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列，其應(yīng)用為利用遺傳標(biāo)記可特異性的檢測哈氏弧菌；本發(fā)明基于該標(biāo)記可快速、準(zhǔn)確檢測哈氏弧菌，并且應(yīng)用范圍廣泛，并且簡單易行，無需細(xì)胞培養(yǎng)、DNA提取等步驟。
文檔編號C12Q1/68GK101818191SQ20091001451
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者孫鯤, 孫黎 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所