專利名稱：哈氏噬纖維菌的電轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電轉(zhuǎn)化方法，特別是一種哈氏噬纖維菌的電轉(zhuǎn)化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哈氏曬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是一類好氧的能夠徹底降解結(jié)晶纖維素的革蘭氏陰性細(xì)菌，土壤當(dāng)中廣泛存在，屬于噬纖維擬桿菌屬。由于哈氏噬纖維菌不含有類似厭氧纖維素降解細(xì)菌的纖維小體的結(jié)構(gòu)，而且也不分泌游離的纖維素酶，所以其新型的纖維素降解機制到目前為止仍未得到闡明。因其能徹底地降解結(jié)晶纖維素，在促進(jìn)纖維素生物能源轉(zhuǎn)化利用方面具有潛在的應(yīng)用前景。鑒于其獨特的纖維素降解機理及良好的應(yīng)用前景，對于其進(jìn)行分子水平的功能研究就顯的極為重要，這對于進(jìn)一步闡釋其纖維素降解機制來說是必要的，而哈氏噬纖維菌的高效轉(zhuǎn)化則是實現(xiàn)基因功能研究的必要手段。目前，哈氏噬纖維菌的遺傳轉(zhuǎn)化經(jīng)常采用接合轉(zhuǎn)化的方法來完成外源基因的導(dǎo)入，如MARK J. McBRIDE等人通過Tn4351轉(zhuǎn)座的方法得到了突變子，但該方法操作復(fù)雜、轉(zhuǎn)化效率低，不穩(wěn)定且重復(fù)性較差，所以尋找新的轉(zhuǎn)化方法是完成哈氏噬纖維菌遺傳操作的必要前提。電轉(zhuǎn)化法由于具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于多種微生物，但對于哈氏噬纖維菌來說，由于其培養(yǎng)條件特殊、細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)含有粘多糖等特點，電轉(zhuǎn)化較難完成，在國內(nèi)外則鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種哈氏噬纖維菌的電轉(zhuǎn)化方法。該方法通過對哈氏菌的培養(yǎng)條件、生長狀態(tài)、電擊緩沖液、電場強度、質(zhì)粒濃度、復(fù)蘇時間等因素進(jìn)行優(yōu)化，得到電轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件并提高了電轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種哈氏噬纖維菌的電轉(zhuǎn)化方法，步驟如下(I)制備外源DNA質(zhì)粒，獲得濃度大于40 U g/ml的重組質(zhì)粒溶液；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的終濃度為8mM，甘油體積占溶液總體積的10%，將上述水溶液置于冰浴中，制得電擊緩沖液；(3)將菌種保藏號為ATCC NO. 33406的哈氏噬纖維菌菌體在液體培養(yǎng)基TY2中培養(yǎng)活化，170rpm，30°C培養(yǎng)35_50h，再轉(zhuǎn)接TY2液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，170rpm，30°C培養(yǎng) 35-50h，然后，離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的無菌水洗滌重懸細(xì)胞，離心；再用步驟(2)制得的電擊緩沖液洗滌重懸細(xì)胞1-2次，離心；最后用電擊緩沖液重懸細(xì)胞，制得感受態(tài)細(xì)胞；(4)將步驟(3)制得的感受態(tài)細(xì)胞在14KV/cm、400 Q>25uF的條件下電擊4_6ms， 然后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基TY2，170rpm，30°C復(fù)蘇培養(yǎng)12-16小時，在含有30 y g/ml紅霉素的固體平板培養(yǎng)基TY2上篩選轉(zhuǎn)化子，制得電轉(zhuǎn)化后的哈氏噬纖維菌。所述步驟(I)中的外源DNA質(zhì)粒為質(zhì)粒pEP4351。所述步驟(3)和步驟(4)中的液體培養(yǎng)基TY2，每升組分如下蛋白胨2g,酵母浸出物0. 5g,葡萄糖2g,純水定容至1L, pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。所述步驟(3)的離心條件為4°C、7000rpm、5min。所述步驟(3)的轉(zhuǎn)接量為1% (v/v);培養(yǎng)時間為40h ;最后用100-200倍的電擊緩沖液重懸細(xì)胞，_70°C凍存。所述步驟⑷中液體培養(yǎng)基TY2的溫度為30°C。提前預(yù)冷的液體培養(yǎng)基TY2，可以在一定程度上對受損的細(xì)胞加以保護(hù)，減少致死率。所述步驟(4)中固體平板培養(yǎng)基TY2，每升組分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂10g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。有益效果I、本發(fā)明通過研究不同影響因素對哈氏噬纖維菌轉(zhuǎn)化效率的影響，優(yōu)化電轉(zhuǎn)化參數(shù)，使外源DNA能利用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入哈氏噬纖維菌，最終在篩選平板上可以得到較多轉(zhuǎn)化子菌落，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到5 X IO4/ u g DNA。2、本發(fā)明在電擊緩沖液中添加MgCl2，通過去除哈氏噬纖維菌細(xì)胞表面的粘多糖成分，使外源DNA更容易進(jìn)入哈氏噬纖維菌，從而提高轉(zhuǎn)化效率2-3倍。3、本發(fā)明通過降低加入篩選培養(yǎng)基的溫度，對受損的細(xì)胞加以保護(hù)，減少致死率。4、本發(fā)明可以彌補目前使用的接合轉(zhuǎn)化方法的不足，為哈氏噬纖維菌的遺傳操作系統(tǒng)及分子生物學(xué)研究提供一種了方便、快速的途徑。


圖I為不同電場強度對轉(zhuǎn)化效率的影響；圖2為添加MgCl2對轉(zhuǎn)化效率的影響；圖3為復(fù)蘇培養(yǎng)時加入培養(yǎng)基的溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響；
具體實施方案下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實施例中所述哈氏噬纖維菌購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，菌種保藏號 ATCCN0. 33406。實施例I一種哈氏噬纖維菌的電轉(zhuǎn)化方法，步驟如下(I)用 Takara Plasmid Purification Kit 于 E.coli S17-1 A pir BW19851 菌株中提取質(zhì)粒 pEP4351(A J COOPER 等人構(gòu)建，見 J. Bacteriol. 1997,179(20) :6221)，利用分光光度計測定質(zhì)粒濃度為40 u g/ml重組質(zhì)粒溶液；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的終濃度為8mM，甘油體積占溶液總體積的10%，將上述水溶液置于冰浴中，制得電擊緩沖液；
(3)將哈氏噬纖維菌菌體在液體培養(yǎng)基TY2中培養(yǎng)活化，170rpm, 30°C培養(yǎng)40h，再轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基TY2液體培養(yǎng)基中，170rpm, 30°C培養(yǎng)40h，然后，7000rpm，5min, 4°C離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的無菌水洗滌重懸細(xì)胞，7000rpm, 5min, 4°C離心收集細(xì)胞沉淀，棄上清以除去培養(yǎng)基中的雜質(zhì)；用預(yù)冷的電擊緩沖液洗滌重懸細(xì)胞2次，7000rpm，5min，4°C離心收集細(xì)胞，最后用100倍的電擊緩沖液重懸細(xì)胞，制得感受態(tài)細(xì)胞后分裝，_70°C凍存待用，制得感受態(tài)細(xì)胞；(4)從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；將裝有質(zhì)粒的I. 5m的離心管與1_的電擊杯以及含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基TY2(含有終濃度為5ug/ml的卡那霉素) 置于冰上預(yù)冷；取IOul的pEP4351質(zhì)粒加入90ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，然后將混合物轉(zhuǎn)移至已經(jīng)預(yù)冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;打開電轉(zhuǎn)化儀，調(diào)節(jié)參數(shù)為14KV/ cm、400Q、25ii F將電擊杯放進(jìn)電轉(zhuǎn)化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入lml、0°C的液體培養(yǎng)基TY2 ;將菌液轉(zhuǎn)入搖管中，再加入2ml液體培養(yǎng)基TY2，30°C，170rpm，復(fù)蘇培養(yǎng)14小時；離心收集細(xì)胞，涂布含30 u g/ml紅霉素的固體平板培養(yǎng)基TY2上，培養(yǎng)7天，觀察結(jié)果， 篩選陽性轉(zhuǎn)化子，同時設(shè)置不加質(zhì)?；虿浑姄舻母惺軕B(tài)細(xì)胞作為陰性對照涂布抗性平板， 陽性轉(zhuǎn)化子即為電轉(zhuǎn)化后的哈氏噬纖維菌。液體培養(yǎng)基TY2，每升組分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。固體平板培養(yǎng)基TY2，每升組分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂10g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。轉(zhuǎn)化子數(shù)=菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)X轉(zhuǎn)化實驗原液總體積/涂板菌液體積=2 X IO4轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子數(shù)/ U g DNA = 2 X 104/0. 4u g DNA = 5 X IO4/ U g DNA經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到5 X IO4/ ii g DNA。實施例2不同電場強度對哈氏噬纖維菌電轉(zhuǎn)化效率影響的實驗實驗采用哈氏噬纖維菌ATCC 33406菌株，質(zhì)粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取于E.coli S17-1入pir BW19851菌株，利用分光光度計準(zhǔn)確測定質(zhì)粒濃度為40 ii g/ml。電擊緩沖液配方如下10%甘油、8mM MgCl2，使用前在冰上預(yù)冷。將對數(shù)期的哈氏噬纖維菌ATCC 33406接種于液體培養(yǎng)基TY2中，170rpm，30°C 振蕩培養(yǎng)40h，7000rpm, 5min，4°C離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的無菌水洗滌重懸細(xì)胞，7000rpm, 5min，4 °C離心收集細(xì)胞沉淀，棄上清以除去培養(yǎng)基中的雜質(zhì)；用預(yù)冷的電擊緩沖液洗滌重懸細(xì)胞2次，7000rpm，5min，4°C離心收集細(xì)胞，最后用電擊緩沖液重懸細(xì)胞，濃縮比例為 I 200，制得感受態(tài)細(xì)胞后分裝，-70°C凍存待用。從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；將裝有質(zhì)粒的I. 5m的離心管與 Imm的電擊杯以及TY2液體(含有終濃度為5ug/ml的卡那霉素)置于冰上預(yù)冷；取IOul的 PEP4351質(zhì)粒加入90ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，然后將混合物轉(zhuǎn)移至已經(jīng)預(yù)冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;設(shè)置不同的電場強度參數(shù)，以考察電壓對轉(zhuǎn)化效率的影響， 電阻設(shè)置為400 Q，電容25ii F ;用吸水紙將電擊杯外壁上的冰水擦干，立即放進(jìn)電轉(zhuǎn)化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入lml、0°C的液體培養(yǎng)基TY2 ;將菌液轉(zhuǎn)入搖管中，再加入 2ml液體培養(yǎng)基TY2，30°C，170rpm，復(fù)蘇培養(yǎng)16小時；離心收集細(xì)胞，涂布含30ug/ml紅霉素的TY2固體平板上，培養(yǎng)7天，觀察結(jié)果，對不同電壓得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行計數(shù)，計算并比較不同電壓的轉(zhuǎn)化效率。同時設(shè)置不加質(zhì)?；虿浑姄舻母惺軕B(tài)細(xì)胞作為陰性對照涂布抗性平板。對于不同電壓來說，其對轉(zhuǎn)化效率的影響是比較顯著的，一方面如果電壓太低，對細(xì)胞膜的穿透能力較弱難以形成外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的孔道，會使最終轉(zhuǎn)化效率降低；另一方面倘若電壓過大，又會致使感受態(tài)細(xì)胞受到電脈沖的沖擊太大，降低細(xì)胞的存活率，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化克隆的產(chǎn)生。本實驗結(jié)果見圖1，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著電壓的升高電轉(zhuǎn)化效率也逐漸升高，當(dāng)電壓達(dá)到14KV/cm時，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，隨后又隨電壓的升高而降低。實施例3不同MgCl2濃度對哈氏噬纖維菌電轉(zhuǎn)化效率影響的實驗實驗采用哈氏噬纖維菌ATCC 33406菌株，質(zhì)粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取于E.coli S17-1入pir BW19851菌株，利用分光光度計準(zhǔn)確測定質(zhì)粒濃度為40 ii g/ml。電擊緩沖液成分為含有不同濃度MgCl2的10%的甘油溶液，目的是確定最優(yōu)的 MgCl2濃度，電擊緩沖液在冰上冷凍保存。將對數(shù)期的哈氏噬纖維菌ATCC 33406接種于液體培養(yǎng)基TY2中，170rpm，30°C 振蕩培養(yǎng)4011，7000印111，51^11，41離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的無菌水洗滌重懸細(xì)胞，7000rpm， 5min，4°C離心收集細(xì)胞沉淀，棄上清以除去培養(yǎng)基中的雜質(zhì)；用預(yù)冷的含不同濃度MgCl2的電擊緩沖液洗滌重懸細(xì)胞2次，7000rpm，5min，4°C離心收集細(xì)胞，最后用相應(yīng)的電擊緩沖液重懸細(xì)胞，濃縮比例為I : 200，制得感受態(tài)細(xì)胞后分裝，-70°C凍存待用。從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；將裝有質(zhì)粒的I. 5m的離心管與 Imm的電擊杯以及TY2液體(含有終濃度為5ug/ml的卡那霉素)置于冰上預(yù)冷；取IOul 的pEP4351質(zhì)粒加入90ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，然后將混合物轉(zhuǎn)移至已經(jīng)預(yù)冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;打開電轉(zhuǎn)化儀，調(diào)節(jié)參數(shù)為14KV/cm、400Q、25iiF，將電擊杯放進(jìn)電轉(zhuǎn)化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入lml、0°C的液體培養(yǎng)基TY2 ;將菌液轉(zhuǎn)入搖管中，再加入2ml液體培養(yǎng)基TY2，30°C，170rpm，復(fù)蘇培養(yǎng)16小時；離心收集細(xì)胞，涂布含30ug/ml紅霉素的TY2固體平板上，培養(yǎng)7天，觀察結(jié)果，對由含不同濃度MgCl2的電擊緩沖液制備的感受態(tài)所得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行計數(shù)，計算并比較不同濃度的MgCl2對轉(zhuǎn)化效率的影響。同時設(shè)置不加質(zhì)?；虿浑姄舻母惺軕B(tài)細(xì)胞作為陰性對照涂布抗性平板。由于在哈氏噬纖維菌的細(xì)胞表面存在多糖類的粘性物質(zhì)，這對電擊轉(zhuǎn)化來說是不利的，在電擊緩沖液中加入MgCl2,能夠有效去除其細(xì)胞表面粘多糖，實施例驗證了不同 MgCl2濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響，實驗結(jié)果見圖2。MgCl2濃度過大會使體系中的離子濃度升高，易引發(fā)爆杯現(xiàn)象從而降低轉(zhuǎn)化效率，當(dāng)MgCl2的濃度為8mM時,效果最佳。實施例4復(fù)蘇培養(yǎng)時不同加入培養(yǎng)基的溫度對哈氏曬纖維菌電轉(zhuǎn)化效率影響的實驗實驗采用哈氏噬纖維菌ATCC 33406菌株，質(zhì)粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取于E. coli S17-1入pirBW19851菌株，利用分光光度計準(zhǔn)確測定質(zhì)粒濃度為40 ii g/ml。電擊緩沖液配方如下10%甘油、8mM MgCl2，使用前在冰上預(yù)冷。將對數(shù)期的哈氏噬纖維菌ATCC 33406接種于液體培養(yǎng)基TY2中，170rpm，30°C 振蕩培養(yǎng)4011，7000印111，51^11，41離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的無菌水洗滌重懸細(xì)胞，7000rpm， 5min，4 °C離心收集細(xì)胞沉淀，棄上清以除去培養(yǎng)基中的雜質(zhì)；用預(yù)冷的電擊緩沖液洗滌重懸細(xì)胞2次，7000rpm, 5min，4°C離心收集細(xì)胞，最后用電擊緩沖液重懸細(xì)胞，濃縮比例為 I 200，制得感受態(tài)細(xì)胞后分裝，-70°C凍存待用。從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；將裝有質(zhì)粒的I. 5m的離心管與 Imm的電擊杯以及TY2液體(含有終濃度為5ug/ml的卡那霉素)置于冰上預(yù)冷；取IOul 的pEP4351質(zhì)粒加入90ul的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，然后將混合物轉(zhuǎn)移至已經(jīng)預(yù)冷的電擊杯中，冰上放置約IOmin ;打開電轉(zhuǎn)化儀，調(diào)節(jié)參數(shù)為14KV/cm、400Q、25iiF，將電擊杯放進(jìn)電轉(zhuǎn)化儀卡槽中，電擊5ms，向電擊杯中加入Iml不同溫度的液體復(fù)蘇培養(yǎng)基TY2 ； 將菌液轉(zhuǎn)入搖管中，再加入2ml30°C的液體培養(yǎng)基TY2，30°C，170rpm，復(fù)蘇培養(yǎng)16小時；離心收集細(xì)胞，涂布含30ug/ml紅霉素的TY2固體平板上，培養(yǎng)7天，觀察結(jié)果，計算陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)并比較不同復(fù)蘇培養(yǎng)基加入溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響，實驗結(jié)果見圖3。同時設(shè)置不加質(zhì)?；虿浑姄舻母惺軕B(tài)細(xì)胞作為陰性對照涂布抗性平板。電擊過程會放出熱量，在一定程度上會影響感受態(tài)的活性，同時會使細(xì)胞受損，電擊后立即加入低溫的復(fù)蘇培養(yǎng)基會對受損細(xì)胞予以保護(hù)并降低由電擊所導(dǎo)致的細(xì)胞致死率，最終提高電轉(zhuǎn)化效率。
權(quán)利要求
1.一種哈氏噬纖維菌的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟如下(1)制備外源DNA質(zhì)粒，獲得濃度大于40μ g/ml的重組質(zhì)粒溶液；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的終濃度為8mM，甘油體積占溶液總體積的 10 %，將上述水溶液置于冰浴中，制得電擊緩沖液；(3)將菌種保藏號為ATCCNO. 33406的哈氏噬纖維菌菌體在液體培養(yǎng)基TY2中培養(yǎng)活化，170rpm，30°C培養(yǎng)35_50h，再轉(zhuǎn)接TY2液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，170rpm，30°C培養(yǎng)35_50h，然后，離心收集細(xì)胞；用預(yù)冷的無菌水洗滌重懸細(xì)胞，離心；再用步驟(2)制得的電擊緩沖液洗滌重懸細(xì)胞1-2次，離心；最后用電擊緩沖液重懸細(xì)胞，制得感受態(tài)細(xì)胞；(4)將步驟(3)制得的感受態(tài)細(xì)胞在14KV/cm、400Ω、25 μ F的條件下電擊4-6ms，然后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基TY2，170rpm，30°C復(fù)蘇培養(yǎng)12-16小時，在含有30 μ g/ml紅霉素的固體平板培養(yǎng)基TY2上篩選轉(zhuǎn)化子，制得電轉(zhuǎn)化后的哈氏噬纖維菌。
2.如權(quán)利要求I所述的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(I)中的外源DNA質(zhì)粒為質(zhì)粒 PEP4351。
3.如權(quán)利要求I所述的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(3)和步驟(4)中的液體培養(yǎng)基TY2，每升組分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，純水定容至lL，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。
4.如權(quán)利要求I所述的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(3)的離心條件為4°C、 7000rpm、5mino
5.如權(quán)利要求I所述的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(3)的轉(zhuǎn)接量為1%(v/v)； 培養(yǎng)時間為40h ;最后用100-200倍的電擊緩沖液重懸細(xì)胞，_70°C凍存。
6.如權(quán)利要求I所述的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(4)中液體培養(yǎng)基TY2的溫度為30。。。
7.如權(quán)利要求I所述的電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(4)中固體平板培養(yǎng)基 TY2，每升組分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，瓊脂10g，純水定容至1L，pH 7. 2 ;高壓蒸汽滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電轉(zhuǎn)化方法，步驟如下(1)制備外源DNA質(zhì)粒；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，將上述水溶液置于冰浴中，制得電擊緩沖液；(3)將菌種保藏號為ATCCNO.33406的哈氏噬纖維菌菌體制備感受態(tài)細(xì)胞；(4)電擊，然后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基TY2復(fù)蘇培養(yǎng)，在含有紅霉素的固體平板培養(yǎng)基TY2上篩選轉(zhuǎn)化子，制得電轉(zhuǎn)化后的哈氏噬纖維菌。
文檔編號C12N15/63GK102586305SQ20121004977
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者盧雪梅, 季曉飛, 張為燦, 徐元喜, 李鵬偉 申請人:山東大學(xué)