專利名稱：利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及使用以多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法。
背景技術：
丁酸是一種多用途的精細化學品，廣泛應用于食品、化學和醫(yī)藥等行業(yè)。在食品工業(yè)中配制糖果、飲料調(diào)味劑，在香料工業(yè)中用于配制果子香精；丁酸纖維素在防老化、耐水性、收縮性等方面均優(yōu)于醋酸纖維素；醋酸丁酸纖維素酯能溶于許多溶劑中，與樹脂、塑料互混能力比單醋酸纖維素酯強，并具有良好的耐熱、耐光和抗?jié)裥裕贿€能用于醫(yī)藥中間體的制備，如Y-氨基丁酸的抗缺氧能力顯著，(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的重要中間體，用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病；此外，丁酸鈉鹽還可作為替代抗生素的飼料添加劑飼喂家禽，以促進生長。目前，丁酸的工業(yè)生產(chǎn)是以化學合成法為主，其中以間歇式丁醛氧化法最為普遍， 但其工藝復雜，環(huán)境污染嚴重。隨著化石性資源日漸枯竭、傳統(tǒng)化工造成環(huán)境污染以及人們對生物基化學品需求的快速增加，化學工業(yè)呈現(xiàn)出從石油基到生物基的轉(zhuǎn)變趨勢。另外，由于丁酸和下游衍生產(chǎn)品相當比例應用于食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)，從生物質(zhì)出發(fā)經(jīng)過生物合成的丁酸(稱為生物丁酸)更受歡迎。目前，生物法制備丁酸的工作僅限于實驗室研究，尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。主要問題是生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸存在原料成本高(占產(chǎn)品成本的20-50%)、單位體積產(chǎn)量低(質(zhì)量濃度小于100 g/L)、副產(chǎn)物乙酸含量高等缺點，使其始終無法替代化學合成法。因此，一方面需要尋找和利用廉價的基質(zhì)原料，另一方面需要探索高效穩(wěn)定的發(fā)酵生產(chǎn)丁酸工藝。生物丁酸只能利用酪丁酸梭菌(中文名為酪丁酸梭菌，拉丁文學名為 Clostridium等厭氧微生物經(jīng)厭氧發(fā)酵獲得。固定化發(fā)酵被證實能有效降低發(fā)酵成本并大幅提高厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物終濃度。美國俄亥俄州立大學的楊尚天教授等人在傳統(tǒng)的填充床反應器上(packed bed reaCtor，PBR)的基礎上設計出的一種簡單、高效的固定床生物反應器，適用于厭氧性微生物發(fā)酵。但是，目前這種反應器的應用僅限于實驗室小規(guī)模(反應器體積小于1升)，并只能單個使用。若單純體積放大，將無法解決復雜的多相傳質(zhì)問題和填充物強度問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對游離發(fā)酵中由于產(chǎn)物抑制以及細胞密度小而引起的發(fā)酵效率低下、產(chǎn)量和得率低以及常見的固定化發(fā)酵反應器難以工業(yè)放大等問題，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)過程中能夠大幅縮短生產(chǎn)周期、提高終產(chǎn)物濃度，有利于發(fā)酵液的后續(xù)分離，并有效解決生物反應器系統(tǒng)放大問題、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法。本發(fā)明的利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，包括以下步驟，(1)多聯(lián)纖維床生物反應器的制備多聯(lián)纖維床生物反應器由數(shù)個纖維床生物反應器相互間通過管道串聯(lián)或并聯(lián)連接而成，所說的串聯(lián)是前一個纖維床生物反應器的物料出口與下個纖維床生物反應器的物料進口依次連接，形成串聯(lián)式纖維床生物反應器；所說的并聯(lián)是所有纖維床生物反應器的物料進口并聯(lián)成一個共同的物料進口，所有纖維床生物反應器的物料出口并聯(lián)形成一個共同的物料出口，形成并聯(lián)式纖維床生物反應器。在各個纖維床生物反應器的物料進口和物料出口管道上設置泵和流量計，在每個纖維床生物反應器出口管路設置PH計和溫度計，每個纖維床生物反應器為由同心式內(nèi)、外圓筒構成的帶夾層的填充柱體，在填充柱體上、下兩端的密封蓋上分別設置物料進口和物料出口，填充柱體的夾層通水浴循環(huán)水，填充柱體的內(nèi)圓筒中充滿填充物，該填充物以棉纖維織物為填充基質(zhì)，鋼絲網(wǎng)做支撐材料，鋼絲網(wǎng)在外側(cè)，棉纖維織物置于內(nèi)側(cè)，卷制成圓筒狀，將預發(fā)酵罐的出料口與多聯(lián)纖維床生物反應器的物料進口相連接，預發(fā)酵罐的進料口與多聯(lián)纖維床生物反應器的物料出口相連構成封閉循環(huán)系統(tǒng)；
(2)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50mg / mL 丁酸鈉的強化培養(yǎng)基平板上劃線后，置37 °C培養(yǎng)72小時；
(3)將步驟2)平板上的單菌落接種于含50mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng)72 小時，得到發(fā)酵母種；
(4)取3mL發(fā)酵母種接種于含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中培養(yǎng)48小時后，接種于含2 L生長培養(yǎng)基的5 L預發(fā)酵罐中進行M小時的擴大培養(yǎng)，使菌體濃度達到6. 0-10. 0 g/L，用泵以10-100 mL/min的速度將經(jīng)擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)液泵入步驟(1)制備的多聯(lián)纖維床生物反應器內(nèi)，維持循環(huán)，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，更換新鮮生長培養(yǎng)基進行下一批次發(fā)酵，或補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，得到丁酸；發(fā)酵過程中通過PH計、溫度計、流量計檢測各個纖維床生物反應器的發(fā)酵狀態(tài)，控制發(fā)酵溫度為37° C，用6 mol/L的 NaOH維持pH在6. 0，通過泵來控制發(fā)酵液的循環(huán)速度；
上述的生長培養(yǎng)基成分為葡萄糖30 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4) 2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7Η20 0.6 g/L、FeS04*7H20 0. 03 g/L ； 上述的強化培養(yǎng)基是在生長培養(yǎng)基的基礎上添加50 mg/mL 丁酸鈉。通常，對于實驗室小試發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，構成多聯(lián)纖維床生物反應器的各纖維床的填充柱體體積為100-800mL，填充柱體為玻璃材質(zhì)。對于工業(yè)化中試發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，構成多聯(lián)纖維床生物反應器的各纖維床的填充柱體體積為100-800L，填充柱體為不銹鋼材質(zhì)。本發(fā)明中，所說的鋼絲網(wǎng)的孔徑一般為30目。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明工藝簡單，利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，一方面，可以較低的成本實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)放大，另一方面，可以避免單純反應器體積放大所產(chǎn)生的多相傳質(zhì)問題和纖維床填充物強度不足問題，同時還減短了發(fā)酵過程的延滯期、大幅縮短了生產(chǎn)周期、 提高了終產(chǎn)物濃度，有利于發(fā)酵液的后續(xù)分離，并便于發(fā)酵過程的檢測和控制，以及設備的維護。


圖1是多個纖維床生物反應器串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸系統(tǒng)示意圖； 圖2是多個纖維床生物反應器并聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸系統(tǒng)示意圖1和圖2中1.預發(fā)酵罐；2.纖維床生物反應器；3.泵；4.流量計；5.溫度計； 6.物料進口 ；7. pH計；8.物料出口 ；9.填充物。
具體實施例方式實施例1
本實例給出的是兩個纖維床生物反應器串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的工藝，步驟如下
(1)多聯(lián)纖維床生物反應器的制備圖1的多聯(lián)纖維床生物反應器為由兩個纖維床生物反應器2串聯(lián)形成的纖維床生物反應器；在各個纖維床生物反應器的物料進口和物料出口管道上設置泵3和流量計4，在每個纖維床生物反應器出口管路設置pH計7和溫度計5。 通過流量計、PH計、溫度計等檢測元件檢測各個纖維床生物反應器的發(fā)酵狀態(tài)，通過泵來控制發(fā)酵液的循環(huán)速度。每個纖維床生物反應器為由同心式內(nèi)、外圓筒構成的帶夾層的填充柱體，此例中各纖維床填充柱體的體積為500mL，填充柱體為玻璃材質(zhì)。在填充柱體上、下兩端的密封蓋上分別設置物料進口 6和物料出口 8，填充柱體的夾層通水浴循環(huán)水，填充柱體的內(nèi)圓筒中充滿填充物9，該填充物以棉纖維織物為填充基質(zhì)，鋼絲網(wǎng)做支撐材料，鋼絲網(wǎng)在外側(cè)，棉纖維織物置于內(nèi)側(cè)，卷制成圓筒狀，將預發(fā)酵罐1的出料口與多聯(lián)纖維床生物反應器的物料進口相連接，預發(fā)酵罐的進料口與多聯(lián)纖維床生物反應器的物料出口相連構成封閉循環(huán)系統(tǒng)；
(2)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50mg / mL 丁酸鈉的強化培養(yǎng)基平板上劃線后，置37 °C培養(yǎng)72小時；
(3)將步驟2)平板上的單菌落接種于含50mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng)72 小時，得到發(fā)酵母種；
(4)取3mL發(fā)酵母種接種于含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中培養(yǎng)48小時后，接種于含2 L生長培養(yǎng)基的5 L預發(fā)酵罐中進行M小時的擴大培養(yǎng)，使菌體濃度達到10.0 g/L，利用泵以80 mL/min的速度將經(jīng)擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)液泵入上述纖維床生物反應器內(nèi)，維持循環(huán)，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，更換新鮮生長培養(yǎng)基進行下一批次發(fā)酵，得到丁酸；發(fā)酵溫度設定為37° C，用6 mol/L的NaOH維持pH在6.0;利用批次發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度達21. 29g/L0 本例，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，采用補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度達71. 2g/L。發(fā)酵時間120小時。(結(jié)果見表1)。實施例2:
本實例給出的是以兩個纖維床生物反應器并聯(lián)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的工藝，步驟如下
1)多聯(lián)纖維床生物反應器的制備同實施例1，區(qū)別在于多聯(lián)纖維床生物反應器為由兩個纖維床生物反應器2并聯(lián)形成的纖維床生物反應器；各纖維床填充柱體的體積為500mL， 填充柱體為玻璃材質(zhì)；
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)同實施例1步驟4)，利用批次發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度19.44g/L。本例，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，采用補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度74. 72g/L。發(fā)酵時間96小時。(結(jié)果見表1)。實施例3:
本實例給出的是以三個纖維床生物反應器并聯(lián)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的工藝，步驟如下
1)多聯(lián)纖維床生物反應器的制備同實施例1，區(qū)別在于多聯(lián)纖維床生物反應器為由三個纖維床生物反應器2并聯(lián)形成的纖維床生物反應器；各纖維床填充柱體的體積為500mL， 填充柱體為玻璃材質(zhì)；
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)同實施例1步驟4)，利用批次發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度26.09g/L。本例，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，采用補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度約78g/L。發(fā)酵時間84小時。(結(jié)果見表1)。實施例4:
本實例給出的是以四個纖維床生物反應器并聯(lián)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的工藝，步驟如下
1)多聯(lián)纖維床生物反應器的制備同實施例1，區(qū)別在于多聯(lián)纖維床生物反應器為由四個纖維床生物反應器2并聯(lián)形成的纖維床生物反應器(見圖2)；各纖維床填充柱體的體積為500mL，填充柱體為玻璃材質(zhì)；
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)同實施例1步驟4)，利用批次發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度18.28g/L0本例，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，采用補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度86. 42g/L。發(fā)酵時間80小時。(結(jié)果見表1)。比較例
本實例給出的是單個纖維床生物反應器發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的工藝，步驟如下
1)同實施例1步驟1)，區(qū)別在于纖維床生物反應器為單個；
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)同實施例1步驟4)，利用批次發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度16.5g/L。本例，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，采用補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，發(fā)酵液中丁酸終濃度達60. 94g/L。發(fā)酵時間140小時。(結(jié)果見表1)。表1多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸結(jié)果比較
權利要求
1.利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，其特征是包括以下步驟(1)多聯(lián)纖維床生物反應器的制備多聯(lián)纖維床生物反應器由數(shù)個纖維床生物反應器相互間通過管道串聯(lián)或并聯(lián)連接而成，所說的串聯(lián)是前一個纖維床生物反應器的物料出口與下個纖維床生物反應器的物料進口依次連接，形成串聯(lián)式纖維床生物反應器；所說的并聯(lián)是所有纖維床生物反應器的物料進口并聯(lián)成一個共同的物料進口，所有纖維床生物反應器的物料出口并聯(lián)形成一個共同的物料出口，形成并聯(lián)式纖維床生物反應器，在各個纖維床生物反應器的物料進口和物料出口管道上設置泵和流量計，在每個纖維床生物反應器出口管路設置PH計和溫度計，每個纖維床生物反應器為由同心式內(nèi)、外圓筒構成的帶夾層的填充柱體，在填充柱體上、下兩端的密封蓋上分別設置物料進口和物料出口，填充柱體的夾層通水浴循環(huán)水，填充柱體的內(nèi)圓筒中充滿填充物，該填充物以棉纖維織物為填充基質(zhì)，鋼絲網(wǎng)做支撐材料，鋼絲網(wǎng)在外側(cè)，棉纖維織物置于內(nèi)側(cè)，卷制成圓筒狀，將預發(fā)酵罐的出料口與多聯(lián)纖維床生物反應器的物料進口相連接，預發(fā)酵罐的進料口與多聯(lián)纖維床生物反應器的物料出口相連構成封閉循環(huán)系統(tǒng)；(2)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50mg / mL 丁酸鈉的強化培養(yǎng)基平板上劃線后，置37 °C培養(yǎng)72小時；(3)將步驟2)平板上的單菌落接種于含50mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng)72 小時，得到發(fā)酵母種；(4)取3mL發(fā)酵母種接種于含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中培養(yǎng)48小時后，接種于含2 L生長培養(yǎng)基的5 L預發(fā)酵罐中進行M小時的擴大培養(yǎng)，使菌體濃度達到6. 0-10. 0 g/L，用泵以10-100 mL/min的速度將經(jīng)擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)液泵入步驟(1)制備的多聯(lián)纖維床生物反應器內(nèi)，維持循環(huán)，當發(fā)酵液中糖濃度接近0時，更換新鮮生長培養(yǎng)基進行下一批次發(fā)酵，或補入葡萄糖液進行補料發(fā)酵，得到丁酸；發(fā)酵過程中通過PH計、溫度計、流量計檢測各個纖維床生物反應器的發(fā)酵狀態(tài)，控制發(fā)酵溫度為37° C，用6 mol/L的 NaOH維持pH在6. 0，通過泵來控制發(fā)酵液的循環(huán)速度；上述的生長培養(yǎng)基成分為葡萄糖30 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4) 2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7Η20 0.6 g/L、FeS04*7H20 0. 03 g/L ；上述的強化培養(yǎng)基是在生長培養(yǎng)基的基礎上添加50 mg/mL 丁酸鈉。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，其特征是構成多聯(lián)纖維床生物反應器的各纖維床的填充柱體體積為100-800mL，填充柱體為玻璃材質(zhì)。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，其特征是構成多聯(lián)纖維床生物反應器的各纖維床的填充柱體體積為100-800L，填充柱體為不銹鋼材質(zhì)。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，其特征是所說的鋼絲網(wǎng)的孔徑為30目。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，其步驟包括制備多聯(lián)纖維床生物反應器、菌種活化、種子液培養(yǎng)、預發(fā)酵培養(yǎng)、及進行批次或補料發(fā)酵。本發(fā)明工藝簡單，利用多聯(lián)纖維床生物反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，一方面，可以較低的成本實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)放大，另一方面，可以避免單純反應器體積放大所產(chǎn)生的多相傳質(zhì)問題和纖維床填充物強度不足問題，同時還減短了發(fā)酵過程的延滯期、大幅縮短了生產(chǎn)周期、提高了終產(chǎn)物濃度，有利于發(fā)酵液的后續(xù)分離，并便于發(fā)酵過程的檢測和控制，以及設備的維護。
文檔編號C12R1/145GK102559783SQ20121004926
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權日2012年2月29日
發(fā)明者徐志南, 施周銘, 王金, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江大學