專利名稱：：一種篩選以神經(jīng)酰胺糖脂為作用靶標(biāo)的抗真菌物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種篩選以神經(jīng)酰胺糖脂為作用靶標(biāo)的抗真菌物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：植物防御素(plantdefensin)是一類植物中普遍存在的廣譜抗真菌短肽,對(duì)植物抵御病原真菌入侵起著關(guān)鍵作用。其中來自紅蘿卜的植物防御素RsAFP2機(jī)制目前相對(duì)比較清楚，RsAFP2抑菌作用是通過與真菌細(xì)胞膜中神經(jīng)酰胺糖脂(glucosylceramide)的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。RsAFP2對(duì)人和植物沒有毒性，這是由于RsAFP2不能與人和植物的神經(jīng)酰胺糖脂結(jié)合。因此，研發(fā)作用機(jī)制類似于植物防御素RsAFP2的農(nóng)藥是實(shí)現(xiàn)植物真菌病害綠色防控的理想途徑。利用微生物大量表達(dá)植物防御素是實(shí)現(xiàn)其規(guī)?；瘧?yīng)用的理想模式，然而，由于植物防御素的合成方式特殊，大量表達(dá)很難實(shí)現(xiàn)，嚴(yán)重地限制了其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。因此，篩選微生物等其它來源的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)將是更為有效和可行的途徑，而目前尚無特異性篩選方法的報(bào)道。目前抗真菌物質(zhì)的篩選方法主要是平板法。常規(guī)平板法雖然是一種活體篩選方法，但其工作量大、篩選到的抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)與毒性均不清楚，需要進(jìn)一步通過大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種篩選以神經(jīng)酰胺糖脂為作用靶標(biāo)的抗真菌物質(zhì)的方法本發(fā)明提供的篩選靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的方法，包括如下步驟A:將野生真菌菌株和突變菌株分別在含有待測(cè)物質(zhì)的固體平板上進(jìn)行培養(yǎng)，如果突變菌株在平板上的生長情況優(yōu)于野生真菌菌株在平板上的生長情況，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂；所述突變菌株為將所述野生真菌菌株的神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因進(jìn)行功能缺失得到的菌株。所述篩選靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的方法還可包括如下步驟B和/或步驟C:步驟B:將所述野生真菌菌株的孢子分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；步驟C:將所述野生真菌菌株的菌絲分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)。所述步驟A中，所述神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄蠭所示的神經(jīng)酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因。所述步驟A中，所述野生真菌菌株為構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28。所述步驟A中,所述突變菌株為構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-I或構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1已于2012年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo.5806。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1又稱構(gòu)巢曲霉barA基因突變體。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13已于2012年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo.5807。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13又稱構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體。所述步驟A中，所述培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)3d。以上步驟A中，所述固體平板具體可為MAG固體平板。所述步驟B中，所述培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)8-12h。所述步驟C中，所述培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)3-6h。所述步驟B和/或所述步驟C中，所述液體培養(yǎng)基具體可為MAG液體培養(yǎng)基。所述待測(cè)物質(zhì)可為微生物提取物、植物提取物或中藥提取物等，也可為化合物。本發(fā)明還提供了一種鑒定待測(cè)物質(zhì)是否是靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的方法，包括如下步驟D:將野生真菌菌株和突變菌株分別在含有待測(cè)物質(zhì)的固體平板上進(jìn)行培養(yǎng)，如果突變菌株在平板上的生長情況優(yōu)于野生真菌菌株在平板上的生長情況、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)，如果突變菌株在平板上的生長情況與野生真菌菌株在平板上的生長情況沒有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的非抗真菌物質(zhì)或候選的不含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂；所述突變菌株為將所述野生真菌菌株的神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因進(jìn)行功能缺失得到的菌株。所述鑒定待測(cè)物質(zhì)是否是靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的方法還可包括如下步驟E和/或步驟F步驟E:將所述野生真菌菌株的孢子分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支與在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支沒有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的非抗真菌物質(zhì)或候選的不含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；步驟F:將所述野生真菌菌株的菌絲分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支與在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支沒有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的非抗真菌物質(zhì)或候選的不含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)。所述步驟D中，所述神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄蠭所示的神經(jīng)酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因。所述步驟D中，所述野生真菌菌株為構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28。所述步驟D中,所述突變菌株為構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-I或構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13ο所述步驟D中，所述培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)3d。所述步驟D中，所述固體平板具體可為MAG固體平板。所述步驟E中，所述培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)8-12h。所述步驟F中，所述培養(yǎng)條件可為28°C培養(yǎng)3-6h。所述步驟E和/或所述步驟F中，所述液體培養(yǎng)基具體可為MAG液體培養(yǎng)基所述待測(cè)物質(zhì)可為微生物提取物、植物提取物或中藥提取物等，也可為化合物。本發(fā)明還保護(hù)構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1,它的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5806。本發(fā)明還保護(hù)構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13,它的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5807。本發(fā)明還保護(hù)構(gòu)巢曲霉UV-I和/或構(gòu)巢曲霉UV-13在篩選抗真菌物質(zhì)中的應(yīng)用；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂。本發(fā)明還保護(hù)真菌的神經(jīng)酰胺合成酶編碼基因和/或神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因在篩選抗真菌物質(zhì)中的應(yīng)用；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂。所述神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因具體可為序列表的序列I所示的神經(jīng)酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因。所述真菌具體可為構(gòu)巢曲霉野生菌株A28。本發(fā)明所依據(jù)的原理如下植物防御素RsAFP2等靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的作用機(jī)制是通過與真菌細(xì)胞膜中神經(jīng)酰胺糖脂(glucosylceramide)的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。真菌存在兩種參與神經(jīng)酰胺糖脂合成的酶神經(jīng)酰胺合成酶和神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶。因此，真菌中的上述兩種酶任一或全部功能的缺失都會(huì)致使突變體細(xì)胞膜中神經(jīng)酰胺糖脂含量降低或喪失，從而對(duì)這類抗真菌物質(zhì)的敏感性降低或喪失。此外，靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)還具有引起真菌菌絲過度分叉的特點(diǎn)，可以作為進(jìn)一步驗(yàn)證的方法。本發(fā)明建立的方法不僅靶標(biāo)明確，而且將活體篩選與活性檢測(cè)集于一體，僅根據(jù)突變菌株和野生菌株對(duì)抗真菌物質(zhì)的敏感性差異就可以判斷是否是靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)，篩選過程更加簡單、省時(shí)省力，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明對(duì)于真菌病害的綠色防控藥物的篩選與研發(fā)具有巨大的應(yīng)用前景。圖I為HSAF對(duì)構(gòu)巢曲霉野生菌株A28以及構(gòu)巢曲霉barA基因突變體的抑制作用。圖2為HSAF對(duì)構(gòu)巢曲霉野生菌株A28以及構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體的抑制作用。圖3為構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的孢子在HSAF脅迫后鏡檢的形態(tài)特征。圖4為活性物質(zhì)HB-2和HB_3對(duì)構(gòu)巢曲霉野生型菌株A28和構(gòu)巢曲霉barA基因突變體的生長影響。圖5為活性物質(zhì)HB-2和HB-3對(duì)構(gòu)巢曲霉野生型菌株A28和構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體的生長影響具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28,購自美國真菌遺傳學(xué)保藏中心(FungalGeneticsStockCenter,簡稱FGSC,網(wǎng)址www.fgsc.net),保藏號(hào)為FGSC#A28(GenotypepabaA6,biAl)。MAG液體培養(yǎng)基取20g麥芽抽提物、20g葡萄糖、2g蛋白胨、Iml微量元素混合液和2ml維生素混合液，用蒸餾水溶解并定容至1L。微量元素混合液的制備方法依次將2.2gZnSO4·7Η20、1·IgH3BO3>O.5gMnCl2·4Η20、0·5gFeSO4·7Η20、0·17gCoCl2·6Η20、0·16gCuSO4·5Η20、0·15gNa2MoO4·2Η20和05gNa4-EDTA用蒸餾水溶解并定容至IOOml(用KOH調(diào)pH至6.5)。維生素混合液的制備方法取IOOmg生物素(維生素H)、IOOmg維生素BI、IOOmg維生素B2、IOOmg維生素B6、IOOmg煙酸和IOOmg對(duì)氨基苯甲酸,用蒸懼水溶解并定容至100ml。注維生素混合液需避光保存。MAG固體平板在MAG液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上每升添加15g瓊脂。實(shí)施例I、兩個(gè)突變體菌株的構(gòu)建一、構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的紫外誘變將構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的孢子涂布到含有50μg/mlHSAF的MAG固體平板上，在紫外燈下(100J/m2，致死率為90%)進(jìn)行誘變處理。二、構(gòu)巢曲霉barA基因突變體與gcsl基因突變體的篩選與鑒定I、將誘變處理后的平板置于28°C培養(yǎng)3天，然后挑取大的菌落于含有50μg/mlHSAF的MAG固體平板上進(jìn)一步確認(rèn)。2、以突變體基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增barA基因(神經(jīng)酰胺合成酶基因)并進(jìn)行測(cè)序分析。以突變體基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增gcsl基因(神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因)并進(jìn)行測(cè)序分析。如果barA基因發(fā)生突變、gcsl基因發(fā)生突變或barA基因和gcsl基因均發(fā)生突變，從而導(dǎo)致神經(jīng)酰胺糖脂合成喪失或明顯降低，且能通過相應(yīng)野生基因進(jìn)行功能互補(bǔ)，該突變體即為barA基因功能缺失突變體、gcsl基因功能缺失突變體或barA基因和gcsl基因功能缺失雙突變體。PCR擴(kuò)增barA基因所用引物對(duì)如下barAFI:5’-ATCTCCGAGCTTTTATCCCAC-3’；barARl:5’-ATTTTCAGAACACGACATTTAGG-3’。該引物對(duì)的退火溫度為56°C，靶序列為1639bp。PCR擴(kuò)增gcsl基因所用的引物對(duì)如下gcslFl:5’-GTCTCCTCGTCTTCTCTCTTCTC-3’；gcslRl:5’-TATTCTTTTTTTGCTTGGTTTGT-3’。該引物對(duì)的退火溫度為56°C，靶序列為1930bp。獲得了兩個(gè)突變體。通過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變體的barA基因發(fā)生了缺失突變，導(dǎo)致BarA蛋白中間212個(gè)氨基酸殘基的缺失而喪失功能；另一個(gè)突變體的gcsl基因發(fā)生了無義突變，導(dǎo)致產(chǎn)生長度僅為170氨基酸殘基的功能喪失的截短的蛋白。三、構(gòu)巢曲霉barA突變體與gcsl突變體的保藏構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1已于2012年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo.5806。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1又稱構(gòu)巢曲霉barA基因突變體。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13已于2012年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo.5807。構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13又稱構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體。實(shí)施例2、抗真菌因子(HSAF)的制備抗真菌因子(HSAF)一種來自產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacterenzymogenes)C3的抗真菌物質(zhì)，祀標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂(Rittenour,ff.R.,Chen,M.,Cahoon,E.B.,andHarris,S.D.(2011).ControlofglucosylceramideproductionandmorphogenesisbytheBarlceramidesynthaseinFusariumgraminearum.PLoSOne6,el9385.doi:10.1371/journal,pone.0019385)。按照文獻(xiàn)中的方法制備HSAF(YuF,Zaleta-RiveraK,ZhuX,HuffmanJ,MilletJC,etal.(2007)Structureandbiosynthesisofheat-stableantifungalfactor(HSAF),abroad-spectrumantimycoticwithanovelmodeofaction.AntimicrAgentsChemoth51:64-72.)。實(shí)施例3、HSAF對(duì)野生菌株以及突變菌株的抑制作用一、HSAF處理與形態(tài)觀察將構(gòu)巢曲霉barA基因突變體分別于兩個(gè)固體平板中間(第一種固體平板為MAG固體平板，第二種固體平板為含50μg/mlHSAF的MAG固體平板)，28°C培養(yǎng)3天。將構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體分別于兩個(gè)固體平板中間(第一種固體平板為MAG固體平板，第二種固體平板為含50μg/mlHSAF的MAG固體平板)，28°C培養(yǎng)3天。將構(gòu)巢曲霉野生菌株A28分別于兩個(gè)固體平板中間(第一種固體平板為MAG固體平板，第二種固體平板為含50μg/mlHSAF的MAG固體平板)，28°C培養(yǎng)3天。結(jié)果見圖I和圖2。在第一種固體平板上，三種菌株的生長情況沒有顯著差異。在第二種固體平板上，構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的生長受到顯著抑制(只能觀察到很小的菌落)，barA基因突變體和gcsl基因突變體的菌落顯著大于構(gòu)巢曲霉野生菌株A28，也就是受抑制的程度較小。結(jié)果表明，HSAF中含有靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)。二、結(jié)果驗(yàn)證將構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的孢子分別接種于兩種液體培養(yǎng)基中(第一種液體培養(yǎng)基為液體MAG培養(yǎng)基，第二種液體培養(yǎng)基為含50μg/mlHSAF的液體MAG培養(yǎng)基)，28°C培養(yǎng)8-12h，然后在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)和菌絲的生長特征。結(jié)果見圖3。在第一種液體培養(yǎng)基中，孢子形態(tài)正常。在第二種液體培養(yǎng)基中，真菌菌絲過度分叉。該結(jié)果可以進(jìn)一步確認(rèn)HSAF中含有靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)。也可按如下方法進(jìn)行驗(yàn)證，將構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的孢菌絲接種于兩種液體培養(yǎng)基中(第一種液體培養(yǎng)基為液體MAG培養(yǎng)基，第二種液體培養(yǎng)基為含50μg/mlHSAF的液體MAG培養(yǎng)基)，28°C培養(yǎng)3-6h，然后在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)和菌絲的生長特征，若真菌菌絲過度分叉，則可以進(jìn)一步確認(rèn)所篩選的待檢物中含有靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)。實(shí)施例4、來源于微生物的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的篩選方法一、具體的篩選方法I、將微生物來源的待檢物質(zhì)進(jìn)行粗提，獲得待檢物質(zhì)粗提物(即將微生物發(fā)酵收集發(fā)酵上清)。2、分組處理將構(gòu)巢曲霉barA基因突變體分別于兩個(gè)固體平板中間(第一種固體平板為MAG固體平板，第二種固體平板為含粗提物的MAG固體平板)，28°C培養(yǎng)3天。將構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體分別于兩個(gè)固體平板中間(第一種固體平板為MAG固體平板，第二種固體平板為含粗提物的MAG固體平板)，28°C培養(yǎng)3天。將構(gòu)巢曲霉野生菌株A28分別于兩個(gè)固體平板中間(第一種固體平板為MAG固體平板，第二種固體平板為含粗提物的MAG固體平板)，28°C培養(yǎng)3天。在含有粗提物的MAG固體平板上，若突變體菌落較大、其生長不受此待檢物質(zhì)粗提物的影響或影響較少，而野生菌株菌落較小、生長受到抑制，則可以基本判斷此粗提物中含有靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)。二、篩選結(jié)果依據(jù)上述方法，本發(fā)明人對(duì)900多株土壤微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的分析，新篩選3株微生物其次級(jí)代謝產(chǎn)物的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂。其中有代表性的兩株鏈霉菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì)HB-2和HB-3對(duì)野生型菌株A28和構(gòu)巢曲霉barA基因突變體的生長影響見圖4，活性物質(zhì)HB-2和HB-3對(duì)野生型菌株A28和構(gòu)巢曲霉gcsl基因突變體的生長影響見圖5。三、篩選結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證為了進(jìn)一步對(duì)所篩選出的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，首先將構(gòu)巢曲霉野生菌株A28的孢子或菌絲接種于含有待檢物質(zhì)粗提物的液體MAG培養(yǎng)基中分別于28°C培養(yǎng)8-12h或3-6h，然后在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)和菌絲的生長特征。鏡檢結(jié)果顯示所篩選到的3株微生物其次級(jí)代謝產(chǎn)物均能導(dǎo)致構(gòu)巢曲霉菌絲過度分叉。這進(jìn)一步確認(rèn)了所篩選到的3株微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物含有靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)。以Hela細(xì)胞、小鼠、小麥種子和幼苗等為材料進(jìn)行生物測(cè)定分析，證明這3株微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的對(duì)動(dòng)植物均無毒性。權(quán)利要求1.一種篩選靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的方法，包括如下步驟A:將野生真菌菌株和突變菌株分別在含有待測(cè)物質(zhì)的固體平板上進(jìn)行培養(yǎng)，如果突變菌株在平板上的生長情況優(yōu)于野生真菌菌株在平板上的生長情況，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂；所述突變菌株為將所述野生真菌菌株的神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因進(jìn)行功能缺失得到的菌株。2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟B和/或步驟C步驟B:將所述野生真菌菌株的孢子分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；步驟C:將所述野生真菌菌株的菌絲分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)。3.一種鑒定待測(cè)物質(zhì)是否是靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)的方法，包括如下步驟D:將野生真菌菌株和突變菌株分別在含有待測(cè)物質(zhì)的固體平板上進(jìn)行培養(yǎng)，如果突變菌株在平板上的生長情況優(yōu)于野生真菌菌株在平板上的生長情況、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)，如果突變菌株在平板上的生長情況與野生真菌菌株在平板上的生長情況沒有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的非抗真菌物質(zhì)或候選的不含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂；所述突變菌株為將所述野生真菌菌株的神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因進(jìn)行功能缺失得到的菌株。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟E和/或步驟F步驟E:將所述野生真菌菌株的孢子分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支與在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支數(shù)量沒有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的非抗真菌物質(zhì)或候選的不含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；步驟F:將所述野生真菌菌株的菌絲分別在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基或不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支多于在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)，如果在含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支與在不含所述待測(cè)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中的菌絲分支數(shù)量沒有顯著差異、所述待測(cè)物質(zhì)為候選的非抗真菌物質(zhì)或候選的不含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)。5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述神經(jīng)酰胺糖脂代謝途徑相關(guān)基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄蠭所示的神經(jīng)酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因。6.如權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述野生真菌菌株為構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28;所述突變菌株為保藏編號(hào)為CGMCCNo.5806的構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV_l或保藏編號(hào)為CGMCCNo.5807的構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13。7.構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1，它的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5806。8.構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13，它的保藏編號(hào)為CGMCCNo.5807。9.保藏編號(hào)為CGMCCNo.5806的構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1和/或保藏編號(hào)為CGMCCNo.5807的構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13在篩選抗真菌物質(zhì)中的應(yīng)用；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂。10.真菌神經(jīng)酰胺合成酶編碼基因和/或神經(jīng)酰胺糖苷轉(zhuǎn)移酶基因在篩選抗真菌物質(zhì)中的應(yīng)用；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂。全文摘要本發(fā)明公開了一種篩選以神經(jīng)酰胺糖脂為作用靶標(biāo)的抗真菌物質(zhì)的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟將野生真菌菌株和突變菌株分別在含有待測(cè)物質(zhì)的固體平板上進(jìn)行培養(yǎng)，如果突變菌株在平板上的生長情況優(yōu)于野生真菌菌株在平板上的生長情況，所述待測(cè)物質(zhì)為候選的抗真菌物質(zhì)或候選的含抗真菌物質(zhì)的物質(zhì)；所述抗真菌物質(zhì)的靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂。本發(fā)明建立的方法不僅靶標(biāo)明確，而且將活體篩選與活性檢測(cè)集于一體，僅根據(jù)突變菌株和野生菌株對(duì)抗真菌物質(zhì)的敏感性差異就可以判斷是否是靶標(biāo)為神經(jīng)酰胺糖脂的抗真菌物質(zhì)，篩選過程更加簡單、省時(shí)省力，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明對(duì)于真菌病害的綠色防控藥物的篩選與研發(fā)具有巨大的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12Q1/18GK102586394SQ20121004826公開日2012年7月18日申請(qǐng)日期2012年2月28日優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日發(fā)明者孫憲昀,張振穎,張晗星,李少杰申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所