專利名稱：α-半乳糖神經(jīng)酰胺的類似物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的神經(jīng)酰胺衍生物及其合成。這些化合物可有效作為 免疫刺激劑，并具有可稱為免疫調(diào)節(jié)作用或佐劑作用的作用。
背景技術(shù)：
化合物A (a-半乳糖神經(jīng)酰胺)及其衍生物作為生物活性劑為人們 所知已有時日。參見例如Higa等的美國專利號5,936,076和Taniguchi 等的美國專利號6,531,453，其中描述了作為抗腫瘤劑以及免疫刺激劑的數(shù) 個衍生物，這兩篇文獻均通過引用M并入本文中。化合物A: a-半乳糖神經(jīng)酰胺描述于Nattori等Tetrahedron, 50:2271 (1994)(該文獻通過引用并入 本文中)中的基礎(chǔ)化合物，即下文中的a-半乳糖神經(jīng)酰胺或"aGal-Cer" 本身已顯示抑制腫瘤生長。參見Koeiuka等Recent Res. Cancer, 1:341 (1999)、 Sharif等Nature Med., 7:1057 (2001)以及Hong等Nature Med., 7:1052 (2002)，在這些文獻中顯示了針對I型糖尿病的功效。對aGal-Cer結(jié)構(gòu)的研究表明其含有鞘氨醇鏈.Miyamoto等(Nature, 413:531(2001))已顯示，該鏈的截短產(chǎn)生了預(yù)防自身免疫性腦脊髄炎的化 合物。在平行的研究工作中，已顯示天然殺傷T細胞(NKT細胞)識別通過 I型主要組織相容性復(fù)合物樣蛋白例如CDld呈遞的脂質(zhì)抗原。例如參見 Godfrey等J. Clin. Invest, 114:1379-1388 (2004)。Singh等J. Immunol.. 163:2373 (1999)和Burdin等Eur. J. Immunol., 29:2014 (1999)中已顯示，aGal-Cer和CDld通過活化Val4天然殺傷T (NKT)細胞而增強Th-2介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。提出的aGal-Cer預(yù)防疾病的機制是其通過NKT細胞抑制干擾素-Y、 而不是抑制白細胞介素-4的能力。參見例如Brossay等J. Exd. Med., 188:1521 (1998); Spada等J. Exp. Med., 188:1529 (1998),這兩篇文獻顯示 了 NKT細胞對aGal-Cer的識別，提示其在人類中的療效。已經(jīng)開發(fā)aGal-Cer作為潛在的治療化合物，并已進行臨床試驗，參閱 如Giaccone等Clin Canc. Res., 8， 3702-3709 (2002)。然而，在采用aGal-Cer 治療之后，受治癌癥患者外周血中NKT細胞的水平在治療24小時內(nèi)下降 到檢測不到的水平，并且在該研究余下的時間過程中未恢復(fù)到治療前的水 平。NKT細胞循環(huán)水平的損失可能代表了治療上的明顯限制，因為這可能 表明NKT細胞的治療刺激不可用作重復(fù)治療。因此，合成aGal-Cer類似物是有意義的，所述aGal-Cer類似物作為 NKT細胞的刺激劑，但其不會在治療性施用之后引起NKT細J!WMt環(huán) 水平的快速損失。有多個出版物描述了 aGal-Cer及其衍生物的合成。這些參考文獻的一 個示范性而決非窮舉的列表包括Morita等J. Med. Chem., 38:2176 (1995); Sakai等J. Med. Chem., 38: 1836 (1995); Morita等Bioorg. Med. Chem. Lett" 5:699 (1995); Takakawa等Tetrahedron, 54:3150 (1998); Sakai等 Org. Lett" 1:359 (1998); Figueroa-Perez等Carbohvdr. Res., 328:95 (2000); Plettenburg等J. Org. Chem. 67:4559 (2002); Yang等Angew. Chem., 116:3卯6 (2004); Yang等Angew. Chem. Int. Ed., 43:3818 (2004);以及Yu 等Proc Natl. Acad. Sci. USA, 102(9):3383-3388 (2005)。已進行了研究以考察對其結(jié)構(gòu)進行修飾時aGal-Cer分子的生物學(xué)影 響。Higa等，同上和Zhou等Org. Lett., 4:1267 (2002); Schmieg等J. Exp. Med. 198:1631 (2003), Barbieri等J. Org. Chem" 468 (2004);以及Fan等 Tetrahedron, 61:1855 (2005)是此^題的有限文獻中的實例。Tsuji等^J^ Med., 198:1631 (2003)制備了合成的C-糖苷類似物即a-C-Gal-Cer，其在體 內(nèi)作用于NKT細胞，在小鼠中刺激Thl型免疫應(yīng)答的增強。針對微生物 感染的保護和抗腫瘤效力(Sk61d等Infect. Immun., 71:5447 (2003); Sharif 等，同上；Hong等，同上)特別有意義。其它的針對這些化合物作用機理的研究工作參閱如Parekh等丄Immunol., 173:3693-3706 (2004)中和Brossay等，同上。描述這些衍生物和/或aGal-Cer類似物的生物活性的美國專利和專利 申請或國際專利申請的實例包括Higa等的美國專利號5，936，076和 Taniguchi等的美國專利號6，531，453、 Modlin等的美國專利號5,853,737、 Jiang等的美國專利申請2003030611 、 Tsuiji等的美國專利申請 20030157135、 Uematsu等的美國專利申請20040242499、以及Yamamura 等的國際專利申請?zhí)朠CT/JP20021008280.基本上所有這些現(xiàn)有實例都描述了基于aGal-Cer的類似物結(jié)構(gòu)。非糖 脂分子(如aGal-Cer及其類似物)的鑒定和表似艮有限。描述似乎不類 似于aGal-Cer的結(jié)構(gòu)的專利申請實例包括Moody等的美國專利申請?zhí)?20040265976和Masunaga等的日本專利申請34540997的醃基肽。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了一組新的化合物，其基本上模擬a-GalCer與人CDld 分子的結(jié)合特性，但在與T細胞受體(TCR)的相互作用上存在顯著差異， 這導(dǎo)致了與a-GalCer相比意想不到并有利的性質(zhì)。


圖1: OCH和a-Gal Cer的解離速率的比較。hCDld上配體的解離。 將所標(biāo)明的hCDld ( a-GalCer或OCH)復(fù)合物在t = 0時裝到表面等離 子共振(Surface Plasmon resonance) (Biacore)傳感器的表面上，并 使用Fab 9B測量在指定的時間點保留的hCDld的量。圖2: TCR對OCH和a-GalCer的結(jié)合親和力的比較；iNKT TCR與同a-GalCer或OCH相復(fù)合的hCDld相結(jié)合的親和 力和動力學(xué)。將從0.4jiM到194nM遞增濃度(兩倍稀釋度)的iNKT TCR 在5秒鐘的期間注射到指定的hCDld-GSL復(fù)合物上。通過疊加顯示5 種濃度的結(jié)合應(yīng)答。右圖顯示平衡時的結(jié)合應(yīng)答。圖3: a-GalCer的低親和力類似物的表面等離子共振(Biacore)的測量測量了可溶性NKT細胞TCR對于與不同a-GalCer類似物一起重 新折疊的人CDld分子的親和力。分別對a-GalCer (A和B)、蘇糖醇 神經(jīng)酖胺(C和D)、 4S-蘇糖醇神經(jīng)酰胺(E和F)、 4R-蘇糖醇神經(jīng)酰胺(G和H)的平衡結(jié)合和動力學(xué)測量值。由平衡結(jié)合計算Kd值(jiM)。由K。ff和Kd值計算K。n值。圖4:當(dāng)與iNKT細胞共培養(yǎng)時，在體外采用a-GalCer類似物4吏人 DC成熟。將所指出的不同a-GalCer類似物或LPS加入到人DC與iNKT細 胞的共培養(yǎng)物中。(A)在40小時后評估所述DC的成熟，對CDllc陽 性細胞設(shè)置門控。直方圖表明來自不同處理的DC的CD83和CD86鐠； 百分比顯示了 CD83hi成熟DC的百分比，括號內(nèi)的數(shù)字表明所標(biāo)記門 控內(nèi)所包含群體的平均熒光強度。在a-GalCer不同類似物的存在下， 將DC與iNKT共培養(yǎng)24小時。采用ELISA分析上清液中DC所釋放 的IL-12p40的存在情況(B )以及來自iNKT細胞的IFN-y存在情況(C )。 除了阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺以外，所有這些測試化合物均誘導(dǎo)了相比于 a-GalCer較弱但仍顯著的細胞因子產(chǎn)生。(D)a-GalCer、 OCH或蘇糖 醇神經(jīng)酰胺對DC和與iNKT細胞的共培養(yǎng)物的滴定在體外誘導(dǎo)DC的 成熟。在指定濃度的類似物存在下共培養(yǎng)細胞，顯示了 CD83/CD80提 高的DC的百分比。(E)當(dāng)與iNKT細胞共培養(yǎng)時，a-GalCer的滴定 在體外誘發(fā)DC的顯著死亡，而低親和力的類似物則不然。在iNKT細 胞存在下共培養(yǎng)40小時后，通過流式細胞術(shù)評估以a-GalCer或類似物 進行脈沖處理的DC的活力。用碘化丙錠將細胞染色，顯示仍保留在培 養(yǎng)基中的活CDllc門控細胞的百分比。圖5: a-GalCer的非糖脂類似物在體內(nèi)剌激iNKT細胞的活化以及 隨后DC的成熟。對C57BL/6或iNKT一小鼠靜脈內(nèi)注射1 載體、a-GalCer、類似 物或25ngMPL。注射20小時后，用抗CDllc、 B220和CD86的抗體 對脾細胞染色并通過流式細胞術(shù)分析。(A)對DC ( CDllc+)設(shè)置門控， 通過在細胞表面CD86的上調(diào)來評估成熟。標(biāo)出了每個直方圖的平均熒 光強度。它們是兩個獨立實驗的代表性譜。如所述在注射后2、 6和18-24 小時對小鼠取血，并采用ELISA檢測血清中應(yīng)答于所述類似物而釋放 的(B) IL-4和(C) IFN-y的存在情況。圖6:非糖脂抗原在與靶標(biāo)抗原共施用時作為有效的佐劑(A) 對C57BL/6小鼠共注射1 ng a-GalCer或類似物以及800jigOVA。 6天后，將取自尾靜脈的血樣離體以熒光性SIINFEKL-Kb四聚 體和抗CD8抗體直接染色，并通過流式細胞術(shù)進行分析。數(shù)據(jù)顯示為 四聚體陽性細胞占CD8+細胞的百分比。(B)注射后7天，以預(yù)防性設(shè) 置用lxl(^個E.G7-OVA肺瘤細胞皮下攻擊小鼠，并在隨后日子中監(jiān)測 腫瘤的大小。在與OVA共同注射a-GalCer、阿拉伯糖醇或蘇糖醇神經(jīng) 酰胺的小鼠中沒有或幾乎沒有腫瘤生長。圖7: a-GalCer非糖脂類似物在iNKT細胞存在下體內(nèi)剌激B細胞 的成熟和隨后的抗體產(chǎn)生，(A )對C57BL/6或iNKT々-小鼠靜脈內(nèi)注射1將載體、a-GalCer、 類似物或25 pg MPL。注射后20小時，用針對B220和CD86的抗體對 脾細胞染色，并通過流式細胞術(shù)分析。對B細胞(B220+)設(shè)置門控， 通過細胞表面CD86的上調(diào)來評估成熟。標(biāo)出了每個直方圖的平均熒光 強度。(B ) 1 fig a-GalCer或類似物及400照OVA的同時施用誘導(dǎo)大量 的OVA特異性IgG,在施用后11-14天對小鼠取血，并通過ELISA檢 測血清的抗體。簡言之，以10jig/mlOVA包裹ELISA板，然后加入血 清的連續(xù)稀釋液并在41C孵育過夜，然后用HRP綴合的綿羊抗小鼠IgG 進行檢效'J 。圖8在體外使用經(jīng)蘇糖醇神經(jīng)酰胺脈沖處理的DC來擴增Melan A 特異性CD8+ T細胞至少與用經(jīng)a-GalCer脈沖處理的DC —樣有效。在體外使用經(jīng)蘇糖醇神經(jīng)酰胺脈沖處理的DC來擴增Melan A特異 性CD8+ T細胞至少與用經(jīng)a-GalCer脈沖處理的DC —樣有效。向人 PBMC中加入不同的a-GalCer類似物和Melan-A26-35肽誘導(dǎo)了 DC的 成熟，以及隨后Melan A特異性CD8+ T細胞的擴增，如通過 HLA-A2/Melan- A26-35四聚體分析所評估的。對與自體的經(jīng)輻射APC共 培養(yǎng)并以Melan-A26-35肽進行脈沖處理的PBMC10-15天培養(yǎng)物進行的 流式細胞術(shù)使用所述四聚體和抗CD8+-FITC來染色。標(biāo)出了四聚體+細 胞占總CD8+細胞的百分比士 SE。圖9基于肌醇的a-GalCer衍生物在體外具有功能性。將源自人單 核細胞的DC用150 ng不同的肌醇類似物進行脈沖處理，并與iNKT細 胞共培養(yǎng)24小時。如由CD83和CD86的上調(diào)所評估的，6-脫氧-11^0-肌醇神經(jīng)酰胺和6-磺基(sulfono)-myo-肌醇神經(jīng)跣胺類似物的效能僅稍低于a-GalCer。數(shù)值表示對CDllc+細胞設(shè)置門控的直方圖的平均熒光 強度。6-脫氧-myo-肌醇神經(jīng)酰胺和6-磺基-myo-肌醇神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)DC 和iNKT共培養(yǎng)細胞上清液中分別由DC和iNKT細胞顯著產(chǎn)生(B ) IL-12p40和(C ) IFN-y。通過ELISA檢測上清液，發(fā)現(xiàn)6-脫氧-myo-肌醇it經(jīng)酰胺誘導(dǎo)釋放與使用a-GalCer時所觀察到的濃度相似的 IL-12p40和IFN-y。與經(jīng)a-GalCer、 6-脫氧-myo-肌醇神經(jīng)酰胺或6-橫 基-myo-肌醇神經(jīng)酰胺脈沖處理的ClR-人CDld細胞培養(yǎng)24小時之后， 從iNKT細胞中釋放(D) IFN-g和(E) IL-4。對類似物的滴定提示，人 iNKT細胞TCR對這些化合物的親和力較低。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了式I化合物及其可藥用鹽， O人R2OHRb j 其中，W代表適于占據(jù)人CDld的C，通道的疏水性部分，W代表適于占據(jù)人CDld的A，通道的疏水性部分，從而在與人CDld結(jié)合時，與a-半乳糖神經(jīng)酰胺的鞘氨醇鏈的末端 11<:141129所占據(jù)的體積相比，W充滿C，通道被占據(jù)體積的至少30%;在 與人CDld結(jié)合時，與a-半乳糖神經(jīng)酰胺的跣基鏈的末端11<:251151所占 據(jù)的體積相比，議2充滿A，通道被占據(jù)體積的至少30%，R3代表氫或OH，Ra和Rb各自代表氫，此外，當(dāng)RS代表氫時，Ra和Rb可一起形成單鍵，X代表-CHA(CHOH)nY或-P(-O)(O)OCH2(CHOH)mY，其中Y代表 C跳B2，n代表l至4的整數(shù)，m代表O或l,xloA代表氫，Bi和B2之一代表H、 OH或苯基，另一個代表氫，或者Bi和B2之一代表 羥基，另一個代表苯基，此外，當(dāng)n代表4時，則A與Bi和B2之--起形成單鍵，并且Bi和B2中的另一個代表H、 OH或OS03H。根據(jù)本發(fā)明，我們還提供了生產(chǎn)式I化合物或其鹽、或其可藥用衍 生物的方法，其包括從相應(yīng)的式II化合物上除去一個或多個保護基，其中，XP代表受保護的X， RP為鞋基保護基，R"代表受保護的羥基或 氫，R1、 R2、 Ra和Rb如以上所定義。Xp中可用于保護X的合適的保護基包括碳水化合物合成領(lǐng)域的技 術(shù)人員所熟知的保護基，尤其是用于保護分開的羥基和相鄰羥基的保護 基。在P.J. Kodenski的Protecting Groups (Publisher, Thieme Publishing Group, ISBN 3131356030 )中給出了保護基的實例，其內(nèi)容通過參考并 入本文中。此夕卜，在Geert國Jan Boons的Carbohydrate Chemistry (Editor, G. J. Boons, Publisher, Springer, ISBN 0751403962 )中也給出了實例，其 內(nèi)容通過參考并入本文中。對于xp來說，具體的OH保護基包括雙-O-亞異丙基、雙-O-亞環(huán)己 基、叔丁基二苯基曱硅烷基、烯丙基和節(jié)氧基。脫保護反應(yīng)可在室溫下 在甲醇二氯甲烷混合物中使用三氟乙酸進行數(shù)天。在甲醇或曱醇/EtOAc混合物中，脫保護可在氫氣存在下涉及Pd/C。在XP基團包含 O-P鍵的情況下，也可加入三乙胺以形成銨鹽。對于RP和R化而言，合適的保護基包括O-節(jié)基以及RP和R化一起 形成雙-O-亞異丙基的情形。式ii化合物(其中orp和rsp是o-節(jié)基基團，W是<:251151基團，HN R2XP， ^xp由下式代表)Bn OBn Bno|可通過還原式IIa化合物來制備，其中xp是.BnOl na ，并且其中ORP和RSp、 W基團如上定義，其中基團W是苯氧基硫代羰 基酯基。該反應(yīng)可通過在加熱至回流的曱苯中用氫化三丁基錫、AIBN 進行4小時。式IIa化合物可由式lib化合物制備，其中xp由下式所代表Bn。| 孤其中OR1", R3p、 W如上所定義，W是氫。該反應(yīng)可用苯氧基硫代羰基 氯、吡咬、DMAP和二氯甲烷在室溫下進行30分鐘。式IIb化合物可由式IIc化合物制備，其中xp由下式所代表Bn OBnB510) nc ，其中ORP、 R3p、 W如上所定義，W是A11基團。該反應(yīng)可使用三(三苯 基膦)釕(II)氯化物、DBU在901C下進行30分鐘，隨后加入1MHC1/ 丙酮。式II和式IIc化合物可通過使式III化合物(其中W如上所定義)o義HO八R2 m與式IV化合物<formula>formula see original document page 12</formula>反應(yīng)來制備，其中XP、 ORp、 R3p、 R1、 Ra和Rb如上所定義，只要XP 不是下式即可<formula>formula see original document page 12</formula>該反應(yīng)可在45n下在DMF中用EDC、 HOBt、 TEA進行24小時。 式III化合物本身是市售的，或可通過常規(guī)方法由商品材料制得。 式IV化合物可通過使式V化合物發(fā)生反應(yīng)來制備<formula>formula see original document page 12</formula>其中Xp、 ORp、 R3p、 R1、 Ra和Rb如上所定義。該反應(yīng)可在0"至室溫 下用LiAlH4進行l(wèi)小時以上。式V化合物(其中ORP和RSP是節(jié)氧基，XP由下式代表)<formula>formula see original document page 12</formula>可通過將式Va化合物進行節(jié)基保護而制得，其中ORP和RSp如上所定 義，XP由以下基團代表<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula>該反應(yīng)可在NaH、 BnBr、 DMF存在下在室溫下進行5小時。式Va化合物可通過將式Vb化合物(其中ORp、 R"如上所定義, xp由以下基團代表)脫保護來制備。<formula>formula see original document page 13</formula>該反應(yīng)可在鹽酸存在下在甲苯/乙醇混合物中進行。式V和Vb化合物可通過使式VI化合物(其中ORP、 R3p、 R1、 Ra和Rb如上所定義)與式VII化合物反應(yīng)而制備，其中基團xp如上所定義，只要基團xp不由下式代表即可,<formula>formula see original document page 13</formula>該反應(yīng)可在THF中在氫化鈉存在下以0C至室溫進行過夜,售的，或可通過常規(guī)方法由商品材料制得。 式VII化合物可通過使式VIII化合物(其中xp如上所定義)與三氟甲磺酸酐在二氯曱烷和2,6-二叔丁基吡啶中反應(yīng)而制備。式VIII化合物本身是市售的，或者可通過常規(guī)方法由商品材料制得.或者，式VIII化合物可采取式IX化合物的形式IX其中113是氫，式IX化合物可通過催化氫化使式X化合物Ph, 、\脫保護來制備，其中基團RS如上所定義，保護基P為節(jié)基。該反應(yīng)可 采用10%Pd/C、 H2在MeOH/EtOAc(2:3)中進行過夜。式X化合物可由式XI化合物制備XI其中P如上所定義，RS是苯氧基疏代羰基酯。該反應(yīng)可在加熱至回流的 曱苯中用氫化三丁基錫、AIBN進行4小時。式XI化合物可由式XII化合物制備，其中P如上所定義，W是羥基。該反應(yīng)可用苯氧基硫代羰基氯、吡啶、 DMAP和二氯甲烷在室溫下進行30分鐘。式XII化合物本身是市售的，或者可通過常規(guī)方法由商品材料制得。再或者，式VIII化合物可采取式XIII化合物的形式其中P"是氫，P是爺基或A11基團。式XIII化合物可通過用節(jié)基保護 式XIV化合物來制備，OH XIV其中pz和ps如上所定義。該反應(yīng)可用NaH、 BnBr在加熱至回流的甲 苯中進行10小時，隨后分離異構(gòu)體。式XIV化合物本身是市售的，或者可通過常規(guī)方法由商品材料制得。W是C25H51、 ORP和R化一起形成雙-0-亞異丙基保護基并且XP由 下式代表的式II化合物<formula>formula see original document page 16</formula>可通過使式XV化合物(其中W如上所定義)與式XVI化合物反應(yīng)來制備。<formula>formula see original document page 16</formula>該反應(yīng)可以用二氯甲烷中的四唑作為活化劑在室溫下進行3小時， 然后加入作為氧化劑的叔-BuOOH?；衔颴V和XVI本身是市售的，或者可通過常規(guī)方法由商品材料 制得。式III化合物可采取式XVII化合物的形式。<formula>formula see original document page 16</formula>n = 20, Q =<formula>formula see original document page 16</formula>或n = 17、Q= <formula>formula see original document page 16</formula>式XVII化合物可由式XVIII化合物制備，其中n和Q如上所定義。<formula>formula see original document page 17</formula>該反應(yīng)可在NaOH (當(dāng)n=20時)和LiOH (當(dāng)n=17時)存在下在 加熱至回流的甲醇中進行2小時，然后加入酸。式XVIII化合物可由式XIX化合物制備。<formula>formula see original document page 17</formula>該反應(yīng)可在正丁基三苯基溴化鑄(當(dāng)11 = 20時)和庚烯三苯基溴化 (當(dāng)n = 17時)存在下在-78lC用雙(三曱基硅烷基)氨基鈉進行過夜。式XIX化合物可由式XX化合物制備，其中n如上所定義。<formula>formula see original document page 17</formula>該反應(yīng)可在DMP存在下在二氯甲烷中室溫進行3-4小時。 式XX化合物可由式XXI化合物制備，其中n如上所定義。<formula>formula see original document page 17</formula>該反應(yīng)可在對TSA存在下在甲醇中進行3-4小時。式XXI化合物可由式XXII化合物制備，其中n如上所定義。<formula>formula see original document page 17</formula>該反應(yīng)可在重氮甲烷存在下在THF中以0X:至室溫進行4小時?；衔?其中m = 9 (當(dāng)n-20時)， 以及m-6 (當(dāng)n-17時))與式XXIV化合物制備。HO >f9 Br xxjy該反應(yīng)可在MeMgCl、 Li2CuCl4存在下在THF中以-20t:至室溫進 行16個小時。式XXIII化合物可由式XXV化合物制備，其中m如上所定義。Br^MC。THP該反應(yīng)可在Mg、 THF回流存在下進行4小時。式XXV化合物可由式XXVI化合物制備，其中m如上所定義。Br^VCX)H XXVI該反應(yīng)可在3，4-二氫-2H-吡喃、PPTS存在下進行?；衔颴XTV和XXVI本身是市售的，或者可通過常規(guī)方法由商品 材料制得。式I化合物合適的可藥用鹽包括與合適的堿形成的鹽。這些鹽的實 例包括堿金屬(例如鈉和鉀)鹽以及堿土金屬(例如鈣和鎂)的鹽。式I化合物可以鹽的形式獲得，便利地以可藥用鹽的形式獲得。在需要時，可使用常規(guī)方法將這些鹽轉(zhuǎn)化為游離堿?？稍诤线m溶劑 的存在下，通過使式I化合物與合適的酸或堿反應(yīng)來制備可藥用鹽。式I化合物可表現(xiàn)出互變異構(gòu)，還可包含一個或多個不對稱碳原子， 并由此可表現(xiàn)出光學(xué)異構(gòu)和/或非對映異構(gòu)?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)(例如層析或分步結(jié)晶)分離非對映異構(gòu)體?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)(例如分步結(jié)晶或HPLC )通過分離化合物的外消旋混合物或其它混合物來分離各種光學(xué) 異構(gòu)體?；蛘?，可以通過使具有適當(dāng)光學(xué)活性的起始原料在不引起消旋 的條件下反應(yīng)來制得期望的光學(xué)異構(gòu)體。我們特別優(yōu)選其中親水部分的 立體化學(xué)與a-GalCer的a-半乳糖部分相似的式I化合物。如a-GalCer所表現(xiàn)的A，通道和C，通道均基本完全占據(jù)的情況詳細 描述于Koch等Nature Immunology, 6(8) 819-826(2005)。在Koch等的文 獻中，使用VOLUMES程序?qū)⑶昏b定為水分子(半徑，1.4 A)可表面接 近，但大探針(半徑，6 A )則不能(R. Esnouf, University of Oxford, Oxford, UK) 。 TCR識別表面處口袋的開放性質(zhì)需要對該口袋的外部界限引入 自洽的限定，在此基礎(chǔ)上，作者計算了對于小鼠CDld、 CDla和CDlb 以及人CDld來說的口袋體積。盡管這得到的絕對值與以前所報道的絕 對值有一些差異，但注意到了同樣的相對趨勢。使用程序SC( h加〃w靴 ccd4. ac . uk/ccp4i main, html)進行了形狀互補性分析。我們特別優(yōu)選以 良好的形狀互補性結(jié)合人CDld的式I化合物，即具有大于0.50、更優(yōu) 選大于0.55、特別是大于0.60的Sc。a-GalCer的26號碳酰基鏈和18號碳鞘氨醇鏈分別以良好的形狀互 補性(Sc0.61)裝入A，袋和C，口袋。人CDld結(jié)合溝中這些腔的總體積 (1,400 A3)被烴鏈基本充滿。所述?；溚ㄟ^采取從結(jié)合溝上方看為 逆時針方向的圓曲線來裝入A，袋中，填充該口袋。所述鞘氨醇鏈釆取更 直一些的構(gòu)象來裝入所述C，袋并在所述結(jié)合溝的末端終止。因此， a-GalCer可能具有能夠裝入人CDld抗原結(jié)合溝的最大脂鏈長度。因此， 我們優(yōu)選R2 (酰基鏈)的長度不超過25個碳-碳單鍵，R1 (鞘氨醇鏈) 的長度不超過13個碳-碳單鍵。從文獻中報道的結(jié)合研究了解到，碳-碳雙鍵可被數(shù)種碳-碳單鍵取代，前提是所述疏水性部分仍能夠采取結(jié) 合其相應(yīng)通道所必需的構(gòu)象。例如， 一些研究已經(jīng)顯示，這些通道能接 納相對大的疏水性殘基，比如苯基。我們優(yōu)選其中R1充滿上文所定義的C，通道被占據(jù)體積的至少 35%、更優(yōu)選至少60%、還更優(yōu)選至少80%并且特別優(yōu)選至少90%的 的式I化合物。我們優(yōu)選其中Rz充滿上文所定義的A，通道被占據(jù)體積的至少40%、 更優(yōu)選至少50%、還更優(yōu)選至少60%、特別優(yōu)選至少70%并且尤其優(yōu)選至少80%的式1化合物。根據(jù)X-射線衍射研究和建模實驗，似乎當(dāng)W基團短于所述優(yōu)選最 大長度時，余下的空間可被"間隔基"分子占據(jù)，所述間隔基分子在體 內(nèi)天然存在并完全可供于占據(jù)CDld分子內(nèi)的未用空間。這些間隔基分 子是脂質(zhì)等。因此，其中W比最大占據(jù)A，通道小得多的式l化合物仍 將與CDld分子良好結(jié)合。優(yōu)選地，R2的長度至少為一碳單位(即甲基)，更優(yōu)選長度至少為 五碳單位，特別是長度至少為八碳單位。我們優(yōu)選其中W代表包含1 至25個、更優(yōu)選5至25個、特別是8至25個碳原子的飽和或不飽和 線型烴鏈的式l化合物。與?；溄Y(jié)合A，通道相比，鞘氨醇鏈的結(jié)合似乎更依賴于占據(jù)C， 通道的比例，因為據(jù)本發(fā)明人了解，迄今尚未觀察到間隔基分子對該通 道的占據(jù)。因此，Ri的長度優(yōu)選為至少5個碳-碳單鍵，更優(yōu)選長度為 11個碳-碳單鍵，特別是長度為12或13個碳-碳單鍵。我們優(yōu)選W和112中任一個或二者包含一個或多個雙鍵的式I化合 物。我們特別優(yōu)選Ri和RZ中任一個或兩者包含一個、兩個或三個雙鍵 的化合物。我們優(yōu)選112包含雙鍵的化合物。我們優(yōu)選所述雙鍵為順式(Z)的化合物。我們優(yōu)選X代表CHA(CHOH)nCHB^2的化合物。我們優(yōu)選X代表CH2(CHOH)nCHB!B2的式I化合物。我們優(yōu)選n代表1、 2或3 (特別是2 )的式I化合物。我們優(yōu)選n代表2且為蘇式(與赤式相反)構(gòu)型的式I化合物。我們優(yōu)選R3代表氫的式I化合物。我們優(yōu)選113和Rb均代表氬的式I化合物。我們優(yōu)選Bi和B2中之一代表氫而另 一個代表羥基的式I化合物。 我們優(yōu)選m代表1的式I化合物。我們優(yōu)選Y代表CH2OH、 CH2PH或C(OH)(Ph)的式I化合物。我 們尤其優(yōu)選Y代表CH2OH的化合物。我們還優(yōu)選n代表4且其中A與Bi和BZ—起形成單鍵且Ri和B2 中另一個是OH或OS03H的式I化合物。式I化合物調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng)答的能力使得該化合物可用于 癌癥治療、預(yù)防性及治療性疫苗、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫病。根據(jù)本發(fā)明，還提供了用作藥物的式I化合物。根據(jù)本發(fā)明，還提供了針對病毒、微生物感染、寄生蟲、自身免 疫病、癌癥、變態(tài)反應(yīng)或哞喘為哺乳動物受試者提供保護或者治療上述 疾病的方法，包括對所述受試者施用藥物有效量的本發(fā)明化合物，所述 化合物具有對抗或治療比如病毒、微生物感染、寄生蟲、自身免疫病、 癌癥、變態(tài)反應(yīng)或哮喘的藥物活性。根據(jù)本發(fā)明，我們還提供了式I化合物及其鹽在制備用于治療或預(yù) 防病毒、微生物感染、寄生蟲、自身免疫病、癌癥、變態(tài)反應(yīng)或哮喘的 藥物中的用途.具體地，式I化合物可用于治療或預(yù)防以下疾病癌癥例如基底細胞癌、乳腺癌、白血病、伯基特淋巴瘤、結(jié)腸癌、 食管癌、膀胱癌、胃癌、頭頸癌、肝細胞癌、何杰金淋巴瘤、毛細胞白 血病、腎母細胞瘤、甲狀腺癌、胸腺瘤和胸腺癌、睪丸癌、T細胞淋巴 瘤、前列腺癌、非小細胞肺癌、肝癌、腎細胞癌以及黑色素瘤?？商峒暗牟《靖腥景ú《拘愿窝桌鏗BV、 HCV;皰療病毒感染例如單純皰滲病毒。其它皮膚趨向性病毒(skin tropic virus )如人乳頭瘤病毒。肺趨向性病毒(lung tropic virus )如流感病毒或呼吸道合胞病毒。HIV、 EBV或CMV的'漫性或急性病毒感染或者病毒聯(lián)合感染或者 病毒和細菌聯(lián)合感染肺的細菌感染，例如流感嗜血桿菌或分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌，以 及腸的細菌感染例如幽門螺桿菌或皮膚樣金黃色葡萄球菌。哞喘、變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)的哮喘、接觸性皮炎、銀屑病、克羅恩病。更特別地，可用式I化合物治療的疾病是病毒、微生物感染、寄生 蟲、癌癥。式I化合物可以單獨使用或與其它治療劑組合使用。與其它治療劑的組合包括免疫調(diào)節(jié)劑如抗CD40/CD40L抗體、抗CTLA-4封閉抗體或基于 可溶性LAG3的免疫調(diào)節(jié)劑；Toll樣受體激動劑如MPL、 CpG;單鏈 RNA、核苷酸、核苷酸類似物如CL087或洛索立賓；聚肌胞、鞭毛蛋 白、瑞會莫德或咪喹莫特(immiquimod )、 gardiquimod等。NOD配體 如胞壁跣二酞、莫拉丁酯或肽聚糖、胞壁酰二酞等?？共《緞┤缪澦釆W 斯米韋、抗真菌劑如兩性霉素B以及抗生素?？共《究贵w如帕利珠單抗。其它有用的組合包括其它癌癥免疫治療劑如赫塞汀、阿侖單抗、 吉姆單抗、利妥昔單抗、替伊莫單抗以及其它基于單克隆抗體的癌癥治療?；瘜W(xué)治療劑、激酶抑制劑如伊馬替尼(Imatinib)或埃洛替尼 (Erlotinib)或細胞毒劑如環(huán)磷酰胺。平喘劑和抗組胺劑以及抗炎藥也 可用在組合中。其它可能的組合包括疫苗佐劑如病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)、脂質(zhì)體以及人工抗原呈遞細胞。它可作為添加劑用于 活細胞治療，例如基于DC的免疫療法。其它可能的組合包括細胞因子或趨化因子阻斷抗體，如英夫利昔 單抗、阿達木單抗和巴利昔單抗。我們還提供了藥物組合物，其包含與可藥用賦形劑、栽體或佐劑 混合的本發(fā)明化合物。這些制劑通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并可與 EP 0 609 437B、 EP-A-1 437 358和WO 2004/028475中所描述的相似， 這些文獻的內(nèi)容通過引用并入本文中。適于對肺局部給藥的組合物形式包括氣霧劑，例如加壓或未加壓 的粉劑組合物；適于食管給藥的組合物形式包括片劑、膠嚢劑和糖錠劑；適于皮膚給藥的組合物形式包括霜劑，例如水包油型乳劑或油包水型乳劑；適于靜脈內(nèi)給藥的組合物形式包括注射劑和輸注劑；適于眼部給 藥的組合物形式包括滴劑和軟骨劑。根據(jù)本發(fā)明，還提供了藥物組合物，其包含與可藥用稀釋劑或載 體混合的優(yōu)選少于80%、更優(yōu)選少于50% (以重量計)的式I化合物 或其可藥用衍生物，這些稀釋劑和栽體的實例是對于片劑和糖錠劑-乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸；對于膠囊劑-酒石酸或乳糖；對于注射液-水、醇、甘油、植物油。打算將式I化合物對肺施用時，可將式I化合物作為加壓或不加壓 的粉劑吸入。式I化合物的加壓粉劑組合物可包含液化氣體推進劑或壓 縮氣體。在不加壓的粉劑組合物中，處于細分形式的活性成分可與較大 粒徑的可藥用載體混合而使用，所述可藥用載體包含高達如100 nm直 徑的顆粒。合適的惰性栽體包括如結(jié)晶乳糖。對于上述用途而言，所施用的劑量當(dāng)然將隨所施用的化合物、給 藥模式和所需的治療而變化。然而， 一般來說，當(dāng)式I化合物以約1照 至約20 mg/千克動物體重、優(yōu)選以每日1至4次分劑量或以持續(xù)釋放形 式施用時，可獲得令人滿意的結(jié)果。對于人而言，總?cè)談┝繛?0ng至l，400mg，適于施用的單位劑型 包含與固體或液體的藥物稀釋劑或載體混合的20 mg ~ 1,400 mg的該化 合物。與類似結(jié)構(gòu)的化合物(例如GalCer)相比，式I化合物具有毒性 更低、更有效、作用時間更長、具有更廣泛的活性范圍、效力更強、產(chǎn) 生更少的副作用、更易于吸收的優(yōu)點，或具有其它有用的藥理性質(zhì)。本發(fā)明的幾種類似物表現(xiàn)出了優(yōu)秀的免疫調(diào)節(jié)活性，如以下事實所顯示的當(dāng)與抗原一起注射進小鼠時，類似物發(fā)揮免疫刺激劑或佐劑 作用，其證據(jù)為產(chǎn)生了抗原特異性的IgG應(yīng)答，或產(chǎn)生了抗原特異性的 細胞毒性CD8+T淋巴細胞應(yīng)答，或如在將類似物作為單一治療劑注射 進入保護的動物中或成熟的胂瘤生長模型的動物中時保護小鼠免于死 亡所證實的。此外，當(dāng)作為單一治療劑注射進小鼠時，類似物發(fā)揮免疫刺激劑 作用，其證據(jù)為誘導(dǎo)了 IL-12應(yīng)答，或者證據(jù)為在成熟的流感感染模型 中保護小鼠免于體重降低和/或死亡。此外，類似物在加入人外周血淋巴細胞("PBL")的樣品中時發(fā)揮 免疫刺激劑或佐劑作用，其證據(jù)為在這些PBL樣品中誘導(dǎo)了樹突細胞 成熟的標(biāo)記，或者在加入人PBL樣品中時(通過加入已知的免疫原性 MelanA26-35肽ELAGIGILTV (SEQ ID NO: l)而進行了脈沖處理)發(fā)揮 免疫刺激劑作用，其證據(jù)為誘導(dǎo)了對靶標(biāo)MelanA26-35肽具有特異性的 CD8+T淋巴細胞。重要的是，現(xiàn)有技術(shù)中的很多aGal-Cer類似物在體內(nèi)誘導(dǎo)如此強 的NKT細胞因子應(yīng)答，以致于迫使NKT細胞進入無應(yīng)答狀態(tài)，并對進 一步的免疫刺激產(chǎn)生耐受，參見Parekh等J. Clin. Invest., 115:2572-2583 (2005)。與現(xiàn)有技術(shù)中的化合物相反，本發(fā)明的某些類似物是人樹突細胞 成熟的高效誘導(dǎo)劑，而同時與aGal-Cer相比在人NKT細胞中僅產(chǎn)生有 限的NKT細胞因子應(yīng)答。這種樹突細胞刺激與其后缺乏NKT細胞因子 分泌情況下成熟的分離是本發(fā)明的一個獨特的方面。預(yù)計這個獨特而新穎的方面允許在施用本發(fā)明的化合物后對樹突 細胞進行重復(fù)刺激，而不耗盡或清除NKT細胞群。在以下的實例中描述了新的分子以及其合成方法。在這些實例后 顯示了這些分子的免疫調(diào)節(jié)特性?？梢钥吹剑衔奶岬降拇碳た商峁┽槍ζ渲衅谕庖呦到y(tǒng)有效應(yīng) 答的病癥(比如感染性疾病或癌癥)的保護。此外，本發(fā)明化合物可與TLR配體比如多聚I:C (TLR3)、 MPL(TLR4)、咪會莫特(TLR7) 、 R848 (TLR8 )或CpG ( TLR9)組合 使用，以產(chǎn)生增強的免疫刺激并產(chǎn)生對其中期望免疫系統(tǒng)有效應(yīng)答的病 癥(比如感染性疾病或癌癥)的保護。本發(fā)明化合物還可用作免疫刺激劑或佐劑與抗原材料(例如但不 僅限于蛋白質(zhì)、肽或核酸等)組合使用，以產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答，比如 對所施用抗原的B細胞和IgG抗體應(yīng)答。本發(fā)明化合物還可用作免疫刺激劑或佐劑與抗原材料(例如，但 不限于蛋白質(zhì)、肽或核酸等)組合使用，以產(chǎn)生保護性的免疫應(yīng)答，比 如對所施用抗原的T細胞或CTL應(yīng)答。這些抗原材料可以是適于預(yù)防或治療該特定疾病的任何材料。具 體地，對于癌癥而言，可施用以誘導(dǎo)或增強免疫應(yīng)答的腫瘤相關(guān)肽或蛋 白抗原的實例來自腫瘤相關(guān)基因和所編碼的蛋白質(zhì)，包括MAGE-A1 、 MAGE-A2、 MAGE- A3、 MAGE國A4、 MAGE曙A5、 MAGE-A6、 MAGE畫A7、 MAGE畫A8 、 MAGE國A9 、 MAGE國AIO 、 MAGE誦All 、 MAGE-A12 、 MAGE誦A13、 GAGE-1、 GAGE國2、 GAGE-3、 GAGE國4、 GAGE-5、 GAGE-6、 GAGE-7、 GAGE-8、 BAGE-1、 RAGE-1、 LB33/MUM-1、 PRAME、 NAG、 MAGE-Xp2 (MAGE國B2) 、 MAGE-Xp3 (MAGE-B3) 、 MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、酪氨酸酶、腦糖原罅酸化酶、Melan-A、 MAGE-C1、 MAGE-C2、 NY-ESO-l、 LAGE-1、 SSX-1、 SSX-2(HOM-MEL-40)、 SSX-1、 SSX-4、 SSX-5、 SCP-1和CT-7。例如，腫瘤特征性抗原肽包括已'>開 的PCT申請WO00/20581 (PCT/US99/21230)中所列出的那些。已經(jīng)顯示，本發(fā)明化合物在體外和體內(nèi)均有效，并且在小鼠和人 中均有效。因此，本發(fā)明的一個方面涉及通過施用一種或多種本發(fā)明化 合物(與抗原分子一起或不與抗原分子一起)來刺激受試者的免疫應(yīng)答， 其中所施用本發(fā)明化合物的量足以在這些受試者中剌激有利的免疫應(yīng) 答。還將明確，包含一種或多種本發(fā)明衍生物以及一種或多種免疫原 性蛋白質(zhì)或肽(作為組合物)、或作為單獨部分的衍生物和蛋白或肽(作 為試劑盒)的組合物和/或試劑盒是本發(fā)明的另一個特征。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的其它方面將是清楚的，且無需 在此贅述。有兩個確定NKT細胞被其配體CDld活化的主要參數(shù)，1) iNKT TCR對CDld的親和力(主要由CDld結(jié)合配體的性質(zhì)決定)。2 ) CDld復(fù)合物的穩(wěn)定性(由CDld結(jié)合配體的性質(zhì)所決定)。對結(jié)合CDld-脂質(zhì)復(fù)合物的可溶性TCR的復(fù)合結(jié)構(gòu)、動力學(xué)及功 能的分析以及不變NKT (iNKT)細胞的活化已經(jīng)為鑒定供臨床^f吏用的 最佳iNKT細胞激動劑提供了重要的線索。這些研究的目的是鑒定iNKT 細胞激動劑，所述iNKT細胞激動劑與a-半乳糖神經(jīng)酰胺(a -GalCer) 不同，能夠符合3個標(biāo)準(zhǔn)a)能夠誘導(dǎo)iNKT細胞活化而不會過度剌激 iNKT細胞，以使iNKT細胞依賴性樹突細胞(DC )裂解和細胞因子擾 動(storm)最小化；b)能夠保證DC成熟；c)能夠保證最佳抗原特異 性T細胞的引發(fā)。來自CDld-a-GalCer特異性TCR結(jié)構(gòu)(Gadola, Koch等，J Exp Med, 2006, 203; 699-710)以及來自空的和栽有a-GalCer的人CDld分子 結(jié)構(gòu)的知識(Koch， Strange等，Nat Immunol, 2005， 6; 819-26 )推動我們 進行了一系列動力學(xué)和功能實驗，以評估a-GalCer烷基鏈的極性頭和 長度以及飽和度在控制結(jié)合CDld分子的脂質(zhì)的解離速率和結(jié)合脂質(zhì)特 異性TCR的親和力上的作用。為解決這些問題，我們設(shè)計了兩種試劑i)來自iNKT細胞克隆 的可溶性TCR，以及ii)對CDld-a-GalCer復(fù)合物具有特異性的抗體。 使用這兩種試劑，我們進行了組合動力學(xué)和功能研究，以將iNKT TCR 與載有a-GalCer或其類似物的人CDld分子結(jié)合的親和力進行比較， 所述類似物具有截短的?；颓拾贝兼溁蛘咝揎椀臉O性頭。腐^長產(chǎn)在控刺cix^力瞎^名合參/A^:r ^^定^々^，7r及^ cdw-腐H合浙辨錄合親一力J:好#^我們在體外重新折疊了還原的和生物素化的CDld單體，并對其裝 入帶有截短的?；蚯拾贝兼湹亩喾Na-GalCer類似物。然后，我們獨 立地分析了所述類似物從CDld分子上解離的速率以及結(jié)合可溶性 iNKT TCR的親和力。我們測試了 a-GalCer和(2S，3&4及)-l-6Ka-D-半乳吡喃糖基HV-二四酰基-2-氨基-l,3，4-壬三醇(以下稱OCH)，后者具有比a-GalCer短的 鞘氨醇鏈，并且先前已顯示以較短的半衰期結(jié)合小鼠CDld分子，導(dǎo)致 小鼠iNKT細胞較弱的活化(Miyamoto, Miyake等，Nature, 2001， 413; 531-4， Oki， Chiba等，J Clin Invest, 2004， 113; 1631-40 )。為測量從CDld分子上的解離速率，我們通過噬菌體展示文庫制備 了對栽有a-GalCer的CDld分子具有特異性的Fab抗體(以下稱9B Fab )。最初的Biacore測量和以脂質(zhì)脈沖處理的ClR-CDld細胞的FACS 染色證明，9B Fab特異性識別載有所有測試化合物的人CDld分子，而 同時它又不能染色未經(jīng)脈沖處理的ClR-CDld細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。使 用9B Fab，我們利用表面等離子共振考察了所有測試化合物從可溶性人 CDld分子上解離的速率。將生物素化的CDld-脂質(zhì)復(fù)合物固定到包被 了鏈霉抗生物素蛋白的芯片上，并隨時間測定9B Fab的結(jié)合水平。使 用抗體結(jié)合隨時間的喪失來確定脂質(zhì)從CDld分子上解離的速率。結(jié)果OCH的解離速率是a-GalCer的3.9倍(圖1 )。這些結(jié)果與 以前公開的數(shù)據(jù)是一致的，這證實了結(jié)合CDld分子的糖脂的穩(wěn)定性取 決于烷基鏈的長度(Oki, Chiba等，J Clin Invest, 2004， 113; 1631-40 )。然后，我們評估了酰基和鞘氨醇鏈的長度是否可影響iNKT TCR 結(jié)合糖脂-CDld復(fù)合物的親和力。我們?nèi)缜笆鲋匦抡郫B了 iNKT TCR的 Va24和Vpil鏈(Gadola， Koch等，J Exp Med， 2006， 203; 699-710 ), 并將純化的重折疊iNKT TCR用于針對栽有a-GalCer或OCH的固定化 生物素化CDld單體的表面等離子共振研究中。這些實驗的結(jié)果證明， 鞘氨醇鏈長度的增加與TCR結(jié)合親和力的增加相關(guān)，這提示脂質(zhì)鏈長 度的減少會不利地影響TCR對脂質(zhì)-CDld復(fù)合物的結(jié)合親和力(圖2)。結(jié)論人CDld-GalCer的晶體結(jié)構(gòu)證明，a-GalCer充分利用了 CDld的結(jié)合能力。我們利用表面等離子共振發(fā)現(xiàn)i)縮短任一烷基鏈 均顯著降低CDld/脂質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性(圖1，數(shù)據(jù)未顯示)；ii)縮短 a-GalCer的鞘氨醇鏈?zhǔn)筰NKT細胞TCR親和力降低100倍(圖2 )，導(dǎo) 致iNKT細胞免疫突觸(immunological synapse )、 iNKT細胞細胞毒性 顆粒的極化以及iNKT細胞活化的變化(數(shù)據(jù)未顯示)。與此相反，酰 基鏈的長度或飽和度的變化不改變iNKT細胞TCR的親和力(數(shù)據(jù)未 顯示)。對以前報道的空的和栽有人CDld分子的結(jié)構(gòu)的分析提示，以 縮短的鞘氨醇鏈不完全占據(jù)結(jié)合溝可導(dǎo)致TCR識別表面的構(gòu)象差異。這種間接影響提供了占據(jù)CDld C，通道的脂質(zhì)鏈長度在控制脂質(zhì)特異 性CDld限制性T細胞的親和力方面發(fā)揮作用的一般機制。因此，實現(xiàn)所觀察到的調(diào)節(jié)OCH/CDld復(fù)合物對TCR的結(jié)合親和 力的代價為CDld脂質(zhì)復(fù)合物更大的不穩(wěn)定性，這是由縮短的鞘氨醇鏈 導(dǎo)致的。由于帶有較短鞘氨醇鏈的NKT細胞激動劑在體內(nèi)具有較短的 壽命，因此我們的目標(biāo)是確定能以高親和力與CDld結(jié)合的一個新化合 物家族。這些新的分子類別將為我們提供精細調(diào)節(jié)NKT TCR與CDld/ 脂質(zhì)復(fù)合物之間的結(jié)合親和力范圍的機會。i.甘油神經(jīng)酰胺衍生物不爻ro r/"vflf/fl"z re/ J對fl-(7fl/c^類似浙"^e^N^力為表征a-GalCer類似物的親和力，采用前述的方案(Karadimitris， Gadola等，Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98; 3294-8 )產(chǎn)生與不同類似物 結(jié)合的生物素化hCDld單體。使用二硫鍵連接的可溶性人不變 Va24+/Vpil+ TCR (Gadola, Koch等，J Exp Med， 2006, 203; 699- 710 )進 行表面等離子共振(Biacore )，以測量TCR與不同單體結(jié)合的平衡解離 常數(shù)(Kd)(圖3)。TCR與含有a-GalCer的單體結(jié)合的IQ為1.29 jiM，而蘇糖醇神經(jīng) 酰胺的Kd則為5.78 jiM，具有較低親和力。TCR與4S和4R蘇糖醇神 經(jīng)酰胺單體的結(jié)合稍高于與未修飾蘇糖醇神經(jīng)酰胺的結(jié)合，分別為3.84 fiM和4.25 fiM。如平衡研究(圖3)中所顯示的，TCR與不同單體之間的解離速率 (Koff)動力學(xué)測量值的差異在類似物之間程度相似，對于a-GalCer為 0.37s1，對于4R和4S蘇糖醇神經(jīng)酰胺衍生物分別為0.506和0.650s_1。 在這些測試化合物中，最快的Koff是與未修飾蘇糖醇神經(jīng)酰胺類似物， 為1.04s"，指示較低親和力的相互作用。由此可以推測，在4S和4R變 體之間所觀察到的親和力差異是由于苯基-蘇糖醇頭基與TCR相互作用 的穩(wěn)定性增加所致。這些數(shù)據(jù)提示，先前產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)可用于推理性設(shè)計 具有不同于a-GalCer特性的結(jié)合CDld的類似物。在確定刺激iNKT細胞所需的最小殘基的努力過程中，我們決定生成一類化合物，所述化合物保留了與CDld分子的高親和力(即具有最 大長度的兩個烷基鏈)，并包含3碳(即模擬甘油的頭基)、4碳(即模 擬蘇糖醇的頭基，以下稱為蘇糖醇-神經(jīng)酰胺)或5碳(即模擬阿拉伯 糖醇(arabinitol)的頭基)。將未成熟人DC在人iNKT細胞克隆存在下與不同濃度的類似物或 栽體一起或不與之一起培養(yǎng)。24小時后，通過流式細胞術(shù)對DC評估不 同成熟標(biāo)記的上調(diào)。a-GalCer誘導(dǎo)所有檢測標(biāo)記(CD83、 CD86和CD38 ) 的顯著上調(diào)(圖4，數(shù)據(jù)未公開)。在每種情況下，使用類似物觀察到的 成熟度都低于a-GalCer。蘇糖醇神經(jīng)酰胺比甘油神經(jīng)酰胺和阿拉伯糖醇 神經(jīng)酰胺更有效，而苯基變體4R-蘇糖醇神經(jīng)酰胺和4S-蘇糖醇神經(jīng)酰 胺中的修飾則似乎沒有影響其功能。有趣的是，阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺似 乎在該系統(tǒng)中僅有很弱的功能，這可能是很重要的，并指示了通過人不 變TCR進行刺激所必需的相互作用的程度。DC釋放IL-12p40 (以及生物活性p75 )是活化的標(biāo)記，并且被認(rèn) 為在應(yīng)答于那些DC而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答譜的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用 (Trinchieri等，Nat Rev Immunol, 2003， 3; 133-46 )。從混合培養(yǎng)物的上 清液中測量IL-12p40，所釋放的IL-12p40的濃度(圖4B)反映了前述 的成熟應(yīng)答(圖4A)。 a-GalCer誘導(dǎo)了顯著水平的IL-12p40，而蘇糖醇 神經(jīng)酰胺和甘油神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)了在a-GalCer存在下可見水平的約50 %。 4R和4S蘇糖醇神經(jīng)酰胺均誘導(dǎo)了效力較低的應(yīng)答，而在阿拉伯糖 醇神經(jīng)酰胺存在下幾乎檢測不到IL-12p40。檢驗iNKT細胞活化時得到了相似的應(yīng)答。iNKT細胞應(yīng)答于DC 所呈遞類似物的刺激而釋放IFN-y在a-GalCer存在下謙導(dǎo)約40 ng/ml 的IFN-y，在蘇糖醇神經(jīng)酰胺和甘油神經(jīng)酰胺存在下為20 ng/ml，當(dāng)向 培養(yǎng)物中加入阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺時，則沒有可檢測的IFIVy (圖4C)。根據(jù)這些試驗，發(fā)現(xiàn)蘇糖醇神經(jīng)酰胺是一種高效、低親和力的 a-GalCer類似物。為了將高親和力的a-GalCer、中間親和力的蘇糖醇神 經(jīng)酰胺的功能與已知低親和力的類似物OCH進行比較，將這三種化合 物滴定到DC上，并用于對iNKT細胞呈遞。在48小時后檢查DC的成 熟狀況和DC活力。盡管與蘇糖醇神經(jīng)跣胺或OCH的67ng/ml相比， a-GalCer僅在0.8 ng/ml下即誘導(dǎo)最大的DC成熟，但在相同濃度下(圖 4D)，當(dāng)以a-GalCer刺激時僅10o/。的DC仍有活力，而當(dāng)使用任一種類似物時，明顯更大比例的dc為碘化丙錠陰性(圖4E)。這些數(shù)據(jù)表 明，蘇糖醇神經(jīng)酰胺可在體外誘導(dǎo)iNKT細胞良好的功能性應(yīng)答，而同 時與a-GalCer相比又保持顯著的DC活力。這些數(shù)據(jù)表明a-GalCer的較低親和力類似物可刺激高效的iNKT 細胞依賴性DC成熟，而沒有使用a-GalCer時所觀察到的對DC的顯 著殺傷。不同于OCH，蘇糖醇神經(jīng)酰胺對于CDld應(yīng)當(dāng)具有同樣的結(jié) 合親和力，因為其鞘氨醇和?；溑ca-GalCer中相同。以下實驗進一步舉例說明這一新類別的CDld配體的潛在用途在CDld的情形中，a-GalCer對iNKT細胞的刺激迅速誘導(dǎo)釋放 顯著水平的多種細胞因子，包括IFN-y和IL-4 ( Burdin， Brossay等，J Immunol, 1998， 161; 3271-81 ) 、 IL-3和GM誦CSF (Leite-de誦Mor狄s, Lisbonne等，Eur J Immunol, 2002， 32; 1897-卯4),并活化其它下游細胞 類型，包括DC ( Kitamura， Iwakabe等，J Exp Med， 1999， 189; 1121-8 ) 和NK細胞(Carnaud， Lee等，J Immunol, 1999,163; 4647-50 )。已經(jīng)顯 示類似物如OCH( Miyamoto, Miyake等，Nature, 2001， 413; 531-4 )和20:2(Yu, Im等，Proc Natl Acad Sci U S A， 2005， 102; 3383-8 )謙導(dǎo)改變的細 胞因子應(yīng)答，并釋放IL-4，但沒有或幾乎沒有IFN卞像由于缺乏iNKT 細胞依賴性DC而預(yù)料到的那樣(圖5A),向野生型小鼠體內(nèi)注射甘油 神經(jīng)酰胺并未誘導(dǎo)任何可檢測的細胞因子釋放(圖5B和c)。然而，當(dāng) 注射蘇糖醇神經(jīng)酰胺或阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺時，在血清中檢測到了 IL-4(圖4B )、 IFN-y (圖5C )和IL-12p40/70 (數(shù)據(jù)未顯示)，其時程與使 用a-GalCer所觀察到的相似。在等效劑量下，兩種化合物效力均低于 a-GalCer。兩種化合物均未顯示傳j吏用OCH時所見到的偏向性Th2細 胞因子應(yīng)答(Miyamoto, Miyake等，Nature, 2001， 413; 531-4, Silk, Hermans等，J Clin Invest, 2004， 114; 1800-11 )。"-g"/c"類似參在琳力謬#才放^^###遂r勿應(yīng)^吝辨遂浙《遂先前，我們和他人已經(jīng)顯示，模型抗原(如OVA) ( Silk, Hermans 等，J Clin Invest, 2004， 114; 1800-11， Fujii， Shimizu等，J Exp Med, 2003， 198; 267-79， Hermans, Silk等，J Immunol, 2003， 171; 5140-7)和p畫半乳糖 苷酶(Silk， Hermans等，J Clin Invest, 2004， 114; 1800-11)與a-GalCer — 起的共注射誘導(dǎo)增強的CD8+、 CD4+T細胞和B細胞應(yīng)答。它們有效地用于針對表達靶抗原的肺瘤細胞的治療。將多種類似物與OVA共注射 到野生型小鼠體內(nèi)，6天后使用熒光Kb-SIINFEKL四聚體檢查血液中抗 原特異性CD8+T細胞的存在情況。盡管效力不及a-GalCer，但阿拉伯 糖醇神經(jīng)酰胺和蘇糖醇神經(jīng)酰胺均在6天后誘導(dǎo)顯著的CD8+ T細胞應(yīng) 答，而甘油神經(jīng)酰胺則不誘導(dǎo)應(yīng)答(圖6A)。使用ELISA檢查小鼠血 清中OVA特異性抗體的存在情況，并顯示出與使用CD8+T細胞時所見 數(shù)量級相似的應(yīng)答(圖7B和7C )。B細胞應(yīng)答在iNKT細胞存在下，a-GalCer的非糖脂類似物在體內(nèi)刺激B細 胞成熟和隨后的抗體產(chǎn)生。(A)對C57BL/6或iNKT一小鼠靜脈內(nèi)注射 ljig栽體、a-GalCer、類似物或25 jig MPL。注射后二十小時用針對B220 和CD86的抗體將脾細胞染色，并通過流式細胞術(shù)分析。對B細胞 (B220+)設(shè)置門控，通過細胞表面的CD86上調(diào)來評估成熟情況(圖 7A)。標(biāo)出了每個直方圖的平均熒光強度。(B)同時施用lfiga-GalCer 或類似物以及400將OVA誘導(dǎo)顯著的OVA特異性IgG。施用后11-14 天對小鼠取血，并通過ELISA檢測血清中的抗體(圖7B)。使用人體外引發(fā)模型來引發(fā)(priming )抗原特異性的T細胞應(yīng)答。采用人外周血淋巴細胞進行的實驗證實，蘇糖醇-神經(jīng)酰胺在擴增 Melan-A 26-35特異性T細胞應(yīng)答方面優(yōu)于甘油-神經(jīng)酰胺(圖8 )。II. a-GalCer的肌醇衍生類似物隨后，產(chǎn)生了新的一類新型a-GalCer類似物。第一種是含有25 碳脂肪酸鏈的肌醇神經(jīng)酰胺(INOC-25)。 INOC-25誘導(dǎo)可檢測的DC 成熟和來自iNKT細胞的細胞因子產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。進行了進一步 的結(jié)構(gòu)修飾以產(chǎn)生6-磺基-myo-肌醇神經(jīng)酰胺和6-脫氧-myo-肌醇神經(jīng) 酰胺。在人共培養(yǎng)系統(tǒng)(圖9A)中以及在小鼠體內(nèi)(數(shù)據(jù)未公開)測 試這些化合物對DC成熟的作用。盡管肌醇衍生物INOC-25通過上調(diào) CD83和CD86僅誘導(dǎo)極少的DC成熟(數(shù)據(jù)未顯示)，但6-myo-脫氧-肌醇神經(jīng)酰胺和6-磺基-myo-肌醇神經(jīng)酰胺均以iNKT細胞依賴性方式 (圖9 )誘導(dǎo)DC成熟，其程度與使用a-GalCer所觀察到的相似。與對DC成熟所觀察到的相似(圖9A)， DC的IL-12p40產(chǎn)生在a-GalCer與6-脫氧-myo-肌醇神經(jīng)酰胺之間幾乎相同，而6-磺基衍生物 則稍弱(圖9B)。然而，DC應(yīng)答于經(jīng)6-脫氧和6-磺基衍生類似物刺激 的iNKT細胞而產(chǎn)生的IL- 12p40量顯著高于由于INOC-25 (未顯示) 而產(chǎn)生的量，也高于使用LPS所觀察到的量。檢測來自DC與肌醇衍生 化合物共培養(yǎng)物的上清液中的IFN-y，作為iNKT細胞活化的度量。盡 管6-脫氧化合物誘導(dǎo)與加入a-GalCer時所見相似的IFN々釋放(圖9C )， 但6-磺基-myo-肌醇神經(jīng)酰胺幾乎不誘導(dǎo)iNKT細胞釋放IFN-y。將這三種肌醇化合物對表達人CDld的C1R細胞進行滴定，并用 于刺激iNKT細胞克隆。從IFN-y (圖9D)和IL-4(圖9E)的釋放中均可 看出，似乎盡管INOC-25不誘導(dǎo)或幾乎不誘導(dǎo)IFN-y和IL-4，但6-脫 氧-肌醇神經(jīng)酰胺刺激iNKT細胞釋放顯著水平的這兩種細胞因子。有趣 的是，像與DC共培養(yǎng)時所觀察到的那樣(圖9C)，盡管6-磺基-肌醇 神經(jīng)酰胺刺激不剌激或幾乎不刺激IFN-y釋放(圖9D),但在使用更高 濃度的化合物時產(chǎn)生了可檢測的IL-4 (圖9E)。與a-GalCer相比，每種肌醇衍生物化合物似乎都具有較低的親和 力。就IFN-y (圖9C )和IL-4 (圖9B )而言，a-GalCer均誘導(dǎo)釋放明 顯更高濃度的細胞因子。當(dāng)以200ng/ml的a-GalCer進行剌激時，IFN-y 和IL-4似乎開始到達平臺。盡管由肌醇衍生物豫導(dǎo)的IFN-y和IL-4似 乎也隨化合物濃度的增加而逐漸增加，但它們并未達到由a-GalCer誘 導(dǎo)的水平。有可能盡管C1R細胞有效呈遞較高親和力的配體(比如 a-GalCer)，但其在呈遞親和力較低親和力化合物方面效力低于專職 APC (比如DC)。這可以解釋所觀察到的DC和轉(zhuǎn)染了 CDld的CIR 細胞所呈遞的類似物之間在細胞因子產(chǎn)生量上的差異。結(jié)論精細調(diào)節(jié)iNKT TCR與CDld/脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和力以 及脂質(zhì)配體對CDld分子的穩(wěn)定性已導(dǎo)致鑒定了一組新的化合物，它們 能誘導(dǎo)iNKT細胞活化，而不過度刺激iNKT細胞。這類新化合物可有 效穩(wěn)定CDld分子，對于NKT刺激而言是優(yōu)化的，因為它使NKT細胞 依賴性DC裂解和細胞因子釋放最小化，而同時又確保DC成熟和抗原 特異性T細胞與B細胞引發(fā)。這種分子與生物屬性的有用新組合是通 過設(shè)計一類優(yōu)化iNKT/CDld相互作用而不損害CDld/配體復(fù)合物穩(wěn)定 性的CDld配體而實現(xiàn)的。因此，這樣的化合物可以比現(xiàn)有化合物更廣泛的有效劑量范圍使用。實施例A這些實驗描述了樹突細胞(以下稱為"DC")的引發(fā)。在本實施例 以及以下實施例中使用了化合物l(阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺)、化合物2(甘 油神經(jīng)酰胺)或化合物3(蘇糖醇神經(jīng)酰胺)衍生物。遵循Salio等J, Immunol., 167:1188-1197 (2001)(其通過引用并入本 文中)的方法。簡言之，用100ng/ml化合物2、 3、 aGal-Cer或栽體溶 液(作為對照)中之一對源于DC的2xl()S人單核細胞進行脈沖處理。 對于DC脈沖處理來說，將阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺(化合物1 )、蘇糖醇神 經(jīng)酰胺(化合物3)、甘油神經(jīng)酰胺(化合物2)和aGal-Cer各自溶于 栽體溶液(0.5% Tween 20/PBS )中，并加入DC培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中。還 以10 DC/NKT細胞的比例向所述DC培養(yǎng)物中加入NKT細胞。36小 時后，從培養(yǎng)物中移出上清液，并分析已知DC成熟標(biāo)記CD83、 CD80、 CD86、 CD25和CD38的存在情況，所有這些都4吏用熟知的方法通過 FACS進行分析。結(jié)果表明，當(dāng)DC在化合物1 (阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺)或化合物2 (甘油神經(jīng)酰胺)或化合物3(蘇糖醇神經(jīng)酰胺)中任一種存在下與NKT 組合時，均誘導(dǎo)DC成熟標(biāo)記。成熟標(biāo)記誘導(dǎo)的水平與使用aGal-Cer 所見的相似。使用對照時未見上調(diào)。另外，還使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過用ELISA檢測IL- 12的p40形式來測 量白介素-12(IL-12)水平，作為DC刺激的指示。由于NKT細胞不產(chǎn)生 IL-12,所以這代表了 DC特異性應(yīng)答。所有化合物在本測定中均產(chǎn)生 IL-12分泌。在本測定中，發(fā)現(xiàn)化合物3的效力約為aGal-Cer的50%， 而化合物1和2的效力則約為化合物3的1/1000以下，這證實在本測定 系統(tǒng)中這些化合物有不同的生物活性。實施例B在這些實驗中，通過使用100 nM已知的免疫原性肽MelanA26-35 ELAGIGILTV對來自PBL的人DC進行脈沖處理來測量T細胞擴增。 將該肽與來自同樣供體的同基因(syngeneic) PBL —起加入到DC中。 為更充分詳述這些實驗，以3000拉德輻射DC樣品，然后在無血清培養(yǎng)基中用該肽脈沖處理3小時。然后將細胞充分洗滌，并在RPMI 1640/5%人血清中以1:10的比 例與自體PBL—起孵育。從第4天至第7天以10U/ml加入重組人IL-2。 在第10天，在加入PBL后分析細胞。將培養(yǎng)的細胞用抗CD8和 A2/MelanA25-35四聚體染色。通過FACS分析測定MelanA特異性CD8 T細胞在總CD8陽性細胞中所占的百分比。結(jié)果表明，當(dāng)人DC在NKT細胞存在下進行培養(yǎng)時，發(fā)生蘇糖醇 和甘油交叉引發(fā)(cross-priming),且兩種化合物在體外均為比aGal-Cer 更有效的抗原特異性CTL應(yīng)答刺激劑。這證實了化合物2——甘油神 經(jīng)酰胺和化合物3——蘇糖醇神經(jīng)酰胺均可能用作CD8+ CTL免疫剌激 劑，并提示本發(fā)明的其它化合物也可有類似表現(xiàn)。實施例C工作。使每5只小鼠一組的受試動物在檢查下接受靜脈注射的400嗎卵 清蛋白(OVA)與ljig本發(fā)明化合物之一或等體積以PBS稀釋的栽體 溶液。對小鼠亞組注射溶于PBS中的25 ng分子MPL ( Sigma- Aldrich; 從明尼蘇達沙門氏菌中提取)。注射后，從側(cè)尾靜脈取血并采用標(biāo)準(zhǔn)方法分離PBL。然后按照 Palmowski等的方法(J. Immunol" 168:4391-4398 (2002))(通過引用并 入本文中)用四聚體H-2Kb/OVA 257-264、 H-2Kb復(fù)合物在體內(nèi)直接將 PBL染色。所述四聚體根據(jù)Whaan等J. Immunol., 163:4342-4348 (1999)(通過引用并入本文中)進行制備。當(dāng)將來自未處理動物的PBL與來自以無關(guān)四聚體進行染色的動物 的PBL相比時，背景染色是等同的。當(dāng)使用aGal-Cer、化合物1——阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺或化合物3— —蘇糖醇神經(jīng)酰胺時，OVA特異性應(yīng)答增強。對于化合物2——甘油神 經(jīng)酰胺而言增強最弱。當(dāng)將MPL與aGal-Cer或化合物3蘇糖醇神經(jīng)酰胺共注射時，CTL應(yīng)答增強，正如從Silk等/. C7/". /"ve對.，114:1800-1811， 2004可預(yù)見到的。 實施例D這些實驗評估了在已注射OVA蛋白的小鼠的血清中OVA特異性 IgG抗體的存在情況。使用熟知的方法制備包被了 OVA蛋白的ELISA板。然后在免疫后 10天^jfiL樣，制備血清'從已用以下物質(zhì)免疫的小鼠中取得樣品僅OVA、 OVA和化合物l 阿拉伯糖醇神經(jīng)酖胺、OVA和aGal-Cer或者OVA和化合物2甘油神經(jīng) 酖胺。此外，將小鼠用這些方案中的每種并加上MPL進行免疫。通# 入連續(xù)稀釋的小鼠血清來測定血清IgG效價，使用綴合了辣根過氧化物酶 (HRP)的a-小鼠IgG進行檢測。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明化合物產(chǎn)生OVA特異性抗體應(yīng)答。發(fā)現(xiàn)化合物1 阿拉伯糖醇神經(jīng)酖胺和aGal-Cer作為佐劑比MPL更有效，而化合物2甘 油神經(jīng)酖胺則沒有MPL有效，但仍產(chǎn)生OVA特異性抗體。另外，當(dāng)加入MPL時，在所有情況下都可見應(yīng)答的強烈增強，這證 明當(dāng)與TLR4配體組合使用時，4^發(fā)明化合物在擴增抗原特異性抗體的效 價方面極為有效。實施例E在這些實驗中，對得自受試動物的脾的DC進行表型確定。簡言之，在每個實驗中，將l照所選擇的本發(fā)明化合物注射進受試 小鼠的尾靜脈中。24小時后，從動物中取出脾組織并通過紗網(wǎng)輕柔地擠進 含有5 mM EDTA的完全培養(yǎng)基中。通過抗CD11磁珠采用已7〉開的技術(shù) 在針對CDllc富集細胞。富集后，使用抗體染色和流式細胞術(shù)測定細胞的 成熟標(biāo)記。使用對Fc-RI11/11受體具有特異性的抗體來顯示非特異性染色?；衔?阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺和化合物2蘇糖醇神經(jīng)酰胺以及 aGal-Cer均類似地在體內(nèi)誘導(dǎo)CD86,這證實了這兩種化合物在小鼠體內(nèi) 高效產(chǎn)生T細胞和B細胞應(yīng)答。相反，化合物3甘油神經(jīng)酰胺并不顯著誘 導(dǎo)DC86標(biāo)記。這些結(jié)果顯示，盡管MPL與甘油的組合在小鼠中有效驅(qū)動抗原特異性B細胞應(yīng)答(實施例25和26)，但DC成熟和T細胞擴增 似乎并未被化合物2甘油神經(jīng)酰胺顯著增強。這與在人中的發(fā)現(xiàn)相反，其 中在人中化合物2甘油神經(jīng)酖胺在NKT細胞存在下使DC細胞成熟，其 后DC細胞作為人CTL的有效引發(fā)劑。進行這些實驗以確定選定的本發(fā)明化合物在刺激受試動物產(chǎn)生IL-12 中的作用。使動物接受1照或10 ng蘇糖醇、甘油或Gal-Cer。 一組動物 還接受50照MPL。在注射后6小時，采集尾血樣，并使用ELISA測定 IL-12p70蛋白，所有操作均按標(biāo)準(zhǔn)程序進行。在化合物3蘇糖醇神經(jīng)酰胺處理的小鼠中觀察到了劑量依賴性 IL-12/p70分泌增加，這證實了此分子在誘導(dǎo)IL- 12/p70釋，放方面的效能。 化合物3的有效性與MPL相比極為有利。優(yōu)選實施方案詳述化合物l:阿拉伯糖醇神經(jīng)酰胺(a)按照熟知的方法將L(+)阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為阿拉伯糖醇三氟甲磺酸 酯(arabinitol triflate) 4匕合物，即參見Zinner等Chem. Ber., 92:1614 (1959); Qin等Can.
Chem., 77:481 (1999);以及Yann等Carbohvdr. Res., 74:323 (1979)，所有這些文獻均通 過引用并入本文中。此化合物與鞘氨醇成分即結(jié)合，鞘氨醇按照Zimmermiann等Liebigs A肌Chem., 663 (1988); Schmidt等Carbohvdr. Res., 172:169 (1988)和Figueroa-Perez等 Carbohvdr. Res., 328:95 (2000)中的任何方法由4，6-0-亞節(jié)基-D-半乳糖實施例F(Gros等J. Org. Chem., 29:3647 (1941))合成。一旦有這兩種化合物可供利用，在0X:下加入鞘氨醇成分(220 mg, 0.575 mmol)在3 ml無水THF中的溶液和95% NaH (17 mg, 0.708 mmol)。 攪拌15分鐘后，在同樣溫度下加入阿拉伯糖醇三氟甲磺酸酯化合物U51 mg, 0.6卯mmol)在2 mL無水THF中的溶液。將所得混合物緩慢溫?zé)嶂?室溫，然后攪拌過夜'以NH4C1水溶液猝滅反應(yīng)混合物，置于EtOAc中 并將層分離.以水洗滌有機層，以無水MgS04干燥，蒸發(fā)至干。通過快速層析(1:9， 乙酸乙酯:石油醚)純化粗材料，得到無色液體產(chǎn)率95%。 Rf=0.54 (1:9，乙酸乙酯:石油醜)- + 5.2 (c 1.0， CHCW.'H NMR (250 MHz, CDC13):5 4.19-4.00 (m, 5H), 3.99-3.86 (m, 2H), 3.S4-3.61 (m, 5H), 1.60-1.25 (m， 26H), 1.41 (s, 3H), 1.40 (br s, 6H), 1.38 (s, 3H), 1.33 (s, 3H)， 1.30 (s, 3H)， 0.87 (t, /= <5.5 Hz, 3H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 109.6, 108.2, 96.0, 79.7， 77.7, 77.07， 77.3， 75.7, 72.8, 71.8, 67.5, 60.0， 31.9， 29.6, 29.5' 29.66, 29.62 29.59， 29.56, 29,4, 29.3, 28.1， 26.9, 26.6， 26.4, 25.6, 25.2, 22.6, 14丄MALDI-MS (正性模式 ，Matrix CHCA): m/z 620.2 [M + Na]+. C32H59N307 (597,43)計算值C， 64.29;H， 9.95;N, 7.03..實測值C, 64.35; H, 10.01;N,7.15(b)室溫下，在H2氣氛下將上述(a)的產(chǎn)物(150 mg， 0.251 mmol) 與4 ml甲醇中的10% Pd/C (100 mg)以及一滴乙酸攪拌20小時。然后 將混合物過濾，濃縮，并與曱苯共蒸發(fā)。將所得糖漿溶于5 ml無水DMF 中，然后依次加入二十六酸(FLuka) (120 mg, 0.303 mmol)、 N-羥基-苯并 三唑(40 mg, 0.301 mmol)和l-3-(二曱基^J^丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸 鹽(EDC, 58 mg， 0.303 mmol)，并將所得混合物在45匸下攪拌1天。將 所述化合物置于乙酸乙酯中并以水、飽和鹽水溶液洗滌，以無水MgS04 干燥，濃縮。通過快速層析純化殘留物，得到182mg無色固體產(chǎn)率75%。 mp89r。及f-0.46(2:8，乙酸乙酯:石油醚)。=十11.4 (c 1.0, CHC13). 'H NMR (250 MHz, CDC13): 5 5.84 (d, 8.5 Hz, 1H), 4.25-4.00 (m, 6H), 3.98-3.92 (m, 1H), 3.85-3.74 (m， 2H), 3.70-3.62 (m, 1H), 3.56-3.49 (m> 2H), 2.17-2.11 (m, 2H), 1.60-1.24 (m, 72H), 1.41 (s, 3H)， 1.38 (s, 6H), 1.36 (s, 3H),1.32 <寬峰，s, 6H)， 0.86 (t 6.7 Hz， 3H). 3C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 172.4, 109.6， 107.8， 79.8, 77.9， 77.8, 77.1, 76.1， 72.4, 71.3, 67.6, 48.3, 36.9, 29.69,29.64， 29.5, 29.3, 29.0, 28.0, 27.1, 27.0, 26.7, 26.4， 25.77, 25.72, 25.2， 22.6, 14.0. MALDI-MS (正性模式，Matrix CHCA): iti/z 972.6 [M + Na〗+. C5BH1UN08 (949.83) 計算值:C, 73.29; H, 11.77; N， 1.47.實測值:C, 73.59; H, 11,99; N, 1.41(c)在室溫下將上述(b)的產(chǎn)物(120 mg, 0.123 mmol)在含有TFA (100 jil)的MeOH:CH2Cl2 (10:1， 22 ml)中攪拌3天。將所得固體過濾并干 燥，得到OH以下稱為化合物l("阿拉伯糖醇-神經(jīng)跣胺")63mg,產(chǎn)率60%， mpl25 匸。'H NMR (400 MHz, C5D5N): S 8.66 (d, 8.8 Hz, 1H), 5.30-5.25 (m, 2H), MS-ASA (m, IH)， 4.<5(5-4.58 (m， 2H), 4.44-4.22 (m， 7H)， 2.57-2.53 2H)， 2.07-1.37 (m， 72H), 0.99 (t> 6.7 Hz， 6H). 13C NMR (150.9 MHz, C5D5N): 5 173.3' 78.1, 76.3, 74.6， 73.2, 72.7, 71.3， 70.0, 65.4' 51.8, 36.8, 32.1-29.6 (m), 26.4, 22.9, 14丄MALDI-MS 〔正性模式 ，Matrix CHCA): m/z 853.3 [M + Na〗+. C49H99N08 (830.73) 計算值'、C, 70.88; H, 12.02; N， 1.69.實測值.C, 73.59; H, 11.99; N, i.41.化合物2:甘油神經(jīng)SU^使用 ^〃 作為三氟甲磺酸酯起始材料，重復(fù)l (a)的操(Cassel等Eur. J. Org Chem., 875 (2001))，得到無色固體(產(chǎn)率卯％) 。 i f = 0.47 (1:9，乙酸乙酯:石油醚)。[a]^5-+24.6 (c 1:0, chc13). h nmr (250 MHz, cdci3): 5 4.32-4.23(m, 1h), 4.16~ 4.04 (m: 2H), 3.9(5 (d> J-7.8 Hz, IH)， 3.87-3.76 (m, 2H)， 3.68-3.48 (m, 4H), 1.57-U8 (m, 26H), 1.42 (s， 3H), 1.40 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 0.87 (t, /= (5.5 Hz, 3H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 109.3, 108,2, 77.7, 75.6, 74.5， 72.8， 72.4, 66.7, 59.8， 31.8, 29.6, 29.5， 29.4, 29.3， 2S>.1, 2S.0, 26.7, 26.3， 25.6, 25.3, 22.6, 14. 1. MALDI-MS (正性 模式，Matrix CHCA): m/z 520.1 [M + Naf. C27H51N305. (497.38)計算值C,65.16; H, 10.33; N， 8.44.實測值C, 65.25;10.41; N, 8.50.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物重復(fù)l (b)的操作，得到無色固體產(chǎn)率72%， mp81"C。 i f=0.43 (2:8，乙酸乙酯:石油醚)。[org = + 13.5 (c 1.0, CHC13),HNMR (400 MHz' CDCI3): 5 5.75 (d， /= 9,0 Hz, 1H), 4.27-4.00 (m， 5H)， 3.74 (dd, ■/= 9.3, 3.1 Hz, 1H), 3.69 (dd, /= 8.2, 6.2 Hz, 1H), 3.54-3.45 (m, 3H), 2.20-2.07 (m, 2H), 1.60-1.23 (m, 72H)， 1.40 (s, 6H)， 1.34 (s, 3H)， 1.31 (s， 3H), 0.86 (t, /= 6.8 Hz,御.13C NMR (100 MHz' C0C13): S 172.4, 109.4, 107.8, 77.7， 75.9， 74.7, 72.5, 66.4， 48.1, 36.9, 31,8, 29.6, 29.5, 29.39， 29,34, 29.2, 28.9, 27.9, 26.7, 26,4, 25.7, 25.3, 22.6, 14.1. MALDI-MS (正性模式 ，Matrix CHCA): m/z 873.2 [M + Na〗+ C53H103NO6 (849.77)計算值C> 74.86; H， 12.21; N> 1.65.實測值C, 74.81; H, 12.26; N, 1,70.(c)使用上述(b)的產(chǎn)物重復(fù)l (c)的^Mt，得到無色固體<formula>formula see original document page 40</formula>以下稱為化合物2("甘油神經(jīng)跣胺")。產(chǎn)率70%， mpl40"C。'H NMR (400 MHz, C5D5N): 5 8.64 (d, 8.67 Hz, 1H), 4.92-4.83: (m, 1H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.41-4.31 (ni, 2H), 4.12-3.96 (m, 6H), 2.f7 (t, /= 7.2 Hz, 2H), 2.03-1.37 (也，72H), 0.99 (t， /= 6.8 Hz， 6H). MALDI-MS (正性模式 ，Matrix CHCA): m/z 793.6〖M + Na]+. C47H95N06 (769.72)計算值.C, 73.29; H, 12.43;N, 1.82.實測值C， 73.33; H 12.47; N, 1.91.化合物3:蘇糖醇神經(jīng)跣胺將推^據(jù)熟知的方法(參見Wagner等J. Cliem. Soc.， Perkin Trans. 1,780 (2001))制備的4t合物(100 mg, 0.4 mmol)加入無水CH2C12 (1 mL)中的2，6-二叔丁基吡啶(92 mg， 0.48 mmol)中，將 Tf20 (0.08 mL， 0.48 mmol)在OC下攪拌溶于無水CH2C12 (1 mL)中。將反 應(yīng)混合物在同樣溫度下攪拌l小時。將反應(yīng)混合物置于乙酸乙酯中并以冷 水洗滌(2xl5 mL)。將合并的有機層以鹽水溶液洗滌、干燥并蒸發(fā)以得 到粗產(chǎn)物，將所i^扭產(chǎn)物通過^柱層析(1:10，乙酸乙酯:石油醚，含有 數(shù)滴Et3N)純化以得到OTf145mg，95%。 i f = 0.41 (1:10，乙酸乙酯:石油瞇)，H NMR (250 MHz,CDC13): S 7.41-7.27 (m, 5H)， 4,71 (dd, 10.9, 2.8 Hz， 1H)， 4.57 (s, 2H), 4.50 (dd, J = 10.9, 4.9 Hz, 1H), 4.14 (ddd， 8.0, 4.9, 2.8 Hz, 1H), 4.05 (ddd, 8.1, 6.3, 4.5 Hz， 1H), 3.73 (dd, 9.7,4.5 Hz， 1H), 3.55 (dd' 9.7, 6.3 Hz, IH)， 1.42 (s, 6H). 13C NMR (62.5雇z, CDC13): S 128.6' 128.5， 128.0， 127.7, 110.7, 76.8, 75.03, 75.00, 73.8, 69.9, 26.9， 26.6.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物進行上述l(a)的操作，得到BnCT 、\ v v w 、Ci.4h29將其通過快速層析(1:9，乙酸乙酯:石油醚)純化，得到無色液體(30611^， 94%) 。 i f = 0.46 (1:9，乙酸乙酯:石油瞇)。[ g =+7.3 (c 1.0， CHCl:^HNMR(250MHz，CDCl3):S 7.36-7.23 (m, 5 H)， 4.50 (s, 2H), 4.17-3.98 (ms 3H), 3.94 (dd, 9.8' 2.0 Hz, 1H)， 3.83 (dd, /- 9.2, 5.6 Hz, l印，3.70-3.53 (m,卿,1.62-1.21 (m, 26 H), 1.43 (s,卿,〗.40 (s, 3印，1.30 (s' 3H), 0.88 (t,/= 6.2 Hz, 3H). I3C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 138.0， 128.3, 127.63， 128.60, 109.6, 108.2， 77.8， 77,5, 77.4, 75.7, 73.5， 72.9, 72.2, 70.6' 60.0, 31.9， 29.7, 29.62, 29.57, 20.5, 29.4, 29.3, 28.1, 27.0, 26.4， 25.6, 22.7, 14.1, 4.8. MALDI-MS (正性模式 ，Matrix DHB):(c)使用上述(b)的產(chǎn)物進行上述l(b)的操作，得到將其通過快速層析(4:6，乙酸乙酯:石油醚)純化，得到無色固體(116 mg， 81%) 。 J f = 0.23 (3:7，乙酸乙酯:石油醚)。!h:nmr(250 MHz, CDCI3): S 5.74 (d, 8.7 Hz, 1H), 4.27-4,14 (m, 1H), 4.13-3.99 (m, 3H), 3.93-3.87 (m, IH)， 3.81 (3.55 (m, 6H), 2.20-2.13 (m, 2H), 1.65-1.20 (m, 72 H), 1.42 (s， 9H), 1.33 (s, 3H), 0.S8 (t, 6.3 Hz, I3C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 172.6,109.2, 107.9, 79.2, 77.7, 76.7, 76.2, .71.9， 71.6， 62.4, 48.1， 36.9, 31.9, 29.6> 29.5， 29.4, 29.3, 29.0, 27.9, 26.9, 26.4， 25.7, 25.6， 22.6， 14.4, 14.0. MALDI-MS (正性模式 ，Matrix DHB): m/z亂4 [M +爛+(d)使用上述(C)的產(chǎn)物重復(fù)上述1(C)的操作，得到無色固體R = C25H51(71mg，產(chǎn)率71%)，以下稱為化合物3 ("蘇糖醇神經(jīng)酰胺")。NMR (250 MH^ C5D5N): 5 8.62 (d, 8.6 Hz, 1H), 4.81-4.05 (m, 9H), 2.52-2.39 (m, 2H), 2.35-1.15 (m, 72 H), 0.87-0.83 (m, 6H). MALDI-MS (:正性模式 ， Matrix CHCA): m/z 822.9 [M + Na]+.化合物4:蘇糖醇神經(jīng)酖胺ds跣基(a)將含有一滴乙酸的甲醇(3mL)中的上述3(b)產(chǎn)物例如( & 〔9廣 廣(175 mg， 0.284 mmol)和10% Pd/C (150 mg)在H2氣氛(氣球)下于室溫下攪拌22小時。然后將混合物過濾、濃縮并 與甲苯共蒸發(fā)。將所得糖漿溶于無水DMF (4mL)中。依次加入棕櫚酸 (Fluka) (73 mg， 0.284 mmol )、 N-羥基苯并三哇(38 mg， 0.284 mmol) 和1-[3-(二甲基#^-丙基-3-乙^i^l二亞胺鹽酸鹽(54 mg， 0.284 mmol)， 并將所得混合物在451C下攪拌1天。然后將其置于乙酸乙酯中并用水、飽 和鹽水溶液洗滌，以無水MgS04干燥，濃縮。將殘留物通過M層析(4:6， 乙酸乙酯:石油醚)純化，得到(168mg，80%) 。 i f=0.16 (7:3，乙酸乙酯:石油醚)?！?g =+ 11.6 (c 1.0,CHC13). 'H NMR (250 MHz, CDC13): S 5.77 (d, J - 9.4 Hz, 1H), 4.27-4.14 (m, 1H), 4.13-3.99 (m, 3H), 3,93-3.87 (m 1H), 3.81-3,55 (rt^ 6H), 2.20-2.13 (m 2H), 1.75-1.20 (m, 52H), 1,42 (s, 9H)， 1.33 (s, 3H)， 0.S8 (t, 6.4 Hz,卿.MALDI-MS (正性 模式，CHCA): m/z 762.9 [M + Naf. 778.8 [M + K〗+.(b )將含有TFA (100 jiL)的MeOH/CH2Cl2 (10:1， 22 mL)中的上述 (a)的產(chǎn)物(120 mg，0.162 mmol)在室溫下攪拌65小時。將析出的固體 過濾并干燥，以得到(75mg，產(chǎn)率65%),以下稱為化合物4("蘇糖醇神經(jīng)酰胺ds酖基")。'H NMR (250 MHz, DMSO-c 6): 5 5.45-5.35 (m, 1H), 4.60-3.75 (in, 10 H), 2,04-1.89 (邁， 2H), 1.57-1.02 (m, 52H)， O.S3-0.72(m， (5H). MALDI-MS (正性模式，CHCA): m/z 682.8 [M + Na]+, 698.6 [M +1(〗+.合成22-(Z)-二十六酸(a)將以THP保護的11-溴代十一醇(lO.Og， 29.85 mmol)如n-9 與無水THF (150 mL)中的鎂(1.0 g， 41.66 mmol)在回流下加熱3-4小時以制備格氏試劑。在-20t:下，將其在氬氣下加入無水 THF (100 mL )中的ll-溴代i"一烷酸(8.0 g， 30.22 mmol)中，例如<formula>formula see original document page 44</formula>HCrVfg 、Br加入THF中的甲基氯化鎂(-10.2 ml, 3M)直到停止釋放氣體，然后加 ALi2CuCl4，繼續(xù)在-20匸下攪拌1小時，然后4吏溫度上升到室溫。15小 時后，將M混合物用K)o/。H2S04小心地中和，并以乙酸乙酯萃取(2x150 mL)。將有機層以MgS04干燥，濃縮得到無色固體，將其通過快速層析 (1:9,乙酸乙酯:石油酸)純化，得到o(10.9 g,產(chǎn)率82% )。將此化合物溶于THF(50 mL)中并以重氮甲烷酯化。 蒸發(fā)溶劑，通過層析(5:95，乙酸乙酯:石油瞇)純化，得到THP保護的 ll-溴代十一醇的酯，例如無色固體oH3CO^>Tn 、OTHP n = 20(10.9g，產(chǎn)率97%) 。 J f=0.65 (5:95，乙酸乙酯:石油醚)。^NMR (250 MHz, CDC13): S 4.56 (t， ■/= 3.3 Hz, 1H), 3.90-3.81 (m, 1H), 3.76-3.65 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.52-3.45 (m, 1H), 3.40-3.31 (m, 1H), 2.28 (t, /= 7.5 Hz, 2H), 1.62-1.51 (m, 10H)， 1.23 (寬峰，s, 32H).I3CNMR(62.5 MHz, CDC13): S 174.3, 98.8, 67.7, 62.3， 51.4, 34.1， 30.7, 29.7, 29.68,29,(53,29.60， 29.49,29.44,29.2， 29.1， 2(5.2, 25.5， 24.9， 19.6. MALDI-MS (正性模式，CHCA): ib/z 477.3 [M + Na〗+.(b)用對甲笨碌酸(6.7g， 35.26 mmol) 處理甲醇(200 mL)中 上述(a)的產(chǎn)物(8.0g， 17.62 mmoL)。將反應(yīng)混合物攪拌3-4小時。 在反應(yīng)完成(TLC監(jiān)測)后，蒸發(fā)溶劑，將殘留物溶于氯仿中并以飽 和NaHC03溶液洗滌。將氯仿層干燥并濃縮，得到無色固體，將其重結(jié) 晶(石油醚/乙酸乙酯)，得到無色晶體的on = 20(6.4g，產(chǎn)率98%)。及嚴(yán)0.21(2:8，乙酸乙酯:石油瞇)。t Nm (250 MHz, CDQ3): S 3.66 (s, 3H), 3.63 (t, /= 6.5 Hz, 2H), 2.30 (、 J= 7.$ Hz, 1H)， 1.64-1.53 (m, 4H), 1.25 (br. & 32H). I3C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 174.3, 63.0, 51.4, 34.1, 32.8, 29.6, 29,59, 29.58, 29.4， 29.2, 29.1， 25.7, 24.9. MALDI-MS (正性 模式，CHCA): m/z 393.8 [M + Na]+.(c )用Dess-Martin periodinane ( DMP) (13.74g， 32.42mmol) 處理無水CH2Cl;j (200mL)中的上述(b)產(chǎn)物(6.0g， 16.21mmol)。 將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3-4小時。反應(yīng)完全后，蒸發(fā)溶劑；將殘留 物懸于乙瞇中并濾除。將濾出液以NaHC03溶液洗滌，然后以鹽水溶液 洗滌。將醚層干燥并濃縮以得到固體，將其通過快速層析(5:95，乙酸乙 酯:石油瞇)純化，得到無色固體的(5.5g，產(chǎn)率92%)。 i f=0.62 (5:95,乙酸乙酯:石油醚)。'H NMR (250 MHz, CDC13): 5 9.73 (t, 1.8 Hz， 1H), 3.63 (s， 3H), 2.39沐 /= 14.0， 7.5, 2.0 Hz, 2H), 2.26 (t， /= 7.5 Hz, 2H), 1.66-1.56 (m, 4H), 1.21 (br. s， 32H). 13C NMR (62.5 MHz, CDCI3): S 202.8, 174.2， 51.3, 43.8, 34.0' 29.65， 29.61， 29.5， 29.49, 29.42, 29.40,29.3， 29.2, 29.1, 24.9, 22-0. MALDI-MS (正性模式 ，CHCA): m/z 391.9 [M + Naf.(d )在氬氣下于-78t;用雙(三曱桂烷基)氨基鈉(21.73 mL， 1.0 M) 處理無水THF ( 80 mL )中的正丁基三苯基溴化鑄(8.66 g, 21.73 mmol) 懸液。將反應(yīng)混合物在相同溫度下攪拌15分鐘，然后加入上述(c)產(chǎn)物 (5 g, 13.58 mmol)在無水THF ( 30 mL )中的溶液，然后4吏溫度上升 到室溫。在反應(yīng)完成后，將其以NH4Cl水溶液猝滅并以乙醚萃取(2x80 mL)。將醚層以鹽水洗滌、干燥并蒸發(fā)，得到殘留物，將所述殘留物通 過快速層析(5:95,乙酸乙酯石油醚)純化，得到無色固體(5.42g，產(chǎn)率98%)。 R產(chǎn)0.65 (乙酸乙酯:石油醚)。'H NMR (250 MHz, CDC13): S 5.38-5.33 (m, 2H), 3.66 (s， 3H), 2.30 (t /= 7.5 Hz, 2H)， 2.04-196 (m. 4H); 1.67-1.56 (m， 2H), 1.40-1.25 (m, 36H)' 0.90 (t， J- 7.5 Hz, 3H). '13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 174.3, 130.0, 129.5， 51.3, 34.1, 29.7, 29.69， 29.64, 29.59, 29.56， 2SU, 29.3! 29.28' 29.25, 29.1, 27.2, 24.9， 22.S, 13.7. MALDI-MS (正性模式 ， CHCA): m/z 431.8 [M + Naf.以冰冷卻后，將甲醇中的上述(d)產(chǎn)物(2 g, 4.893 mmol)和氫氧化 鈉(2.3 g, 5.872 mmol)加熱至回流2小時，將沉淀收集、懸于水中并 以濃鹽酸(~ pH 1)酸化。濾出產(chǎn)物并以冰乙酸重結(jié)晶，得到22-(Z)-二十六酸，例如無色晶體的3.33 (m, 2H), 2.26 (t, /= 7.5 Hz, 2H)， 2.02-1.99 (m, 4H), 1.64-1.58 (m， 2H), 1.38-1.26 (m，0.90 (t, 7.5 Hz, 3H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 176.6,129.8, 129.3 33.9， 29.5,29.49,29.41， 29. 38, 29.35,29.31， 29.2， 29.1， 29.0， 28.9, 26.9， 24.7, 22.6, 13.5.化合物5:蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酰胺(a)使用22-(Z)-二十六酸和3(b)的產(chǎn)物例如重復(fù)l (b)的操作，得到無色固體(1.9g，產(chǎn)率98%)。'HNMR (250 MHz, CDC13): S 12.11 (s， 1H)， 5.38-(產(chǎn)率68%)。 i f=0.23 (3:7,乙酸乙酯:石油醚)。+ 12.7 (c l.O,- CHC13). !HNMR(250 MHz, CDC13): S 5.71 (+/=9.5 Hz， 1H), 5.35-5.31 (m, i2H), 4.21-3.97 (m， 4H), 3.91-3.84 (m, 1H), 3.78-3.63 (m> 5H), 3.59-3.52 (m， 1H), 2.35 (寬峰，t, J - 6.7 Hz, 1H), 2,14 (dt, 10.5, 7.5, 3.0 Hz, 2H), 2.01-1.94 (m, 4H)， 1.61-1.22 (m, 76H), 0.90-0.82 (m， 6H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 172.5, 130.0, 129.5, 109.2, 107.9, 79.1, 77.7, 76.6, 76.1, 71.8, 71.6, 62.3, 48.1, 36.8, 31.8, 29.66, 29.60， 29.5, 29.37， 29.32， 29.28, 29.26, 29.23, 28.9， 27,8， 27.1， 26.9，窗，25.69， 25.64, 22:8, 22.6, 14.0， 13.7. MALDI-MS (正性模式 ，DHB): m/z卯2.3 [M + Naf. C54Hi03NO7 (877.77)計算值 C， 73.84; H, U.82;N, 1.59.實測值C,，i97; H, U.96;N, 1.67.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物進行上述l(c)的操作，得到無色固體(產(chǎn)率81%)，以下稱為化合物5 ('蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)跣胺，)。'H NMR (250 MHz, C5D5N): 5 8.48 (4 8.7 Hz, 1H)， 5.39-5.30 (邁， 2H)， 4.39-4.35 (m, 1H)， 4.42-4,08 (m， 8H), 3.97-3.95 (m, 2H), 2.32 (t， 7.5 Hz, 2H), 1.99-1.87 (rn, 4H), 1.81-1.64 (m， 4H), 1.77-U2 (m, 60H), 0.78-0.71 (m, 6H). MALDI-MS ( 正性模式，Matrix CHCA):m/z 820.8 [M + Na〗+. C48H9sN07 (797.71) 計算值:C, 72.22; H， 12.00; N, 1.75: C> 72.29; H, 11.93; N, 1.80.化合物6: 4-脫氧-4-苯基-蘇糖醇-神經(jīng)酰胺(a)采用熟知的方法(參見Su等Tetrahedron, 57:2147 (2001); Surivet等Tetrahedron Lett" 39:7299 (1998)和Surivet等Tetrahedron, 55:1311 (1999))制備化合物<formula>formula see original document page 47</formula>CH2C12 ( 20 mL )中的上述化合物(1 g， 3.048 mmol)以吡啶(1.48 mL， 18.291 mmol)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP) (110 mg， 0.901 mmol )、 隨后用苯氧基硫代羰基氯(phenoxythiocarbonyl chloride) (0.630 mL，4.56 mmol)在室溫下進行處理。30分鐘后，將反應(yīng)混合物以CH2C12 稀釋，以10% NaHC03溶液、水洗滌，以MgS04干燥并與甲苯共蒸發(fā) 得到殘留物。將粗產(chǎn)物溶于甲苯(30mL)中，加入氫化三丁基錫(2.45 mL， 9.144 mmol)和AIBN (150 mg， 0.914 mmol )，并將反應(yīng)混合物在 氬氣氛下回流4小時。濃縮并通過快速層析(1:9，乙酸乙酯:石油醚) 純化，得到無色液體的還原產(chǎn)物Ri = H, R2 = OBn(卯0mg，產(chǎn)率95%)。 ^f=0.40 (l:9,乙酸乙酯:石油瞇)。[a￡5 = -10.2 (c 1.0, CHC13). & NMR (250 MHz, CDC13): 5 7,31-7.13 (m, IOH), 3.99 (寬峰，s, 2H)， 4.01-3.93 (m, 2H), 3.87-3.80 (m， 2H), 3.31-3.18 (m, 2H), 2.92 (dd, / = 13.7, 6.5 Hz， IH)， 2.77 (dd, 13.7, 6.5 Hz, IH)， 1.31 (s, (5H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 137.9, 137.2， 129.3, 128.2, 127.5, 126.4, 108.9, 79.6， 78.4' 76.4, 73.3, 70.3, 39.4， 27.1, 26.9. MALDI-MS (正性模式 ，CHCA): m/z 335.1 [M + Na]+(b)將上述(a)的產(chǎn)物(8卯mg， 2.852 mmol)與乙酸乙酯甲醇 (3:2，20mL)中的10% Pd/C (200 mg)在112氣氛(氣球)下于室溫 攪拌8，然后將混合物過濾，濃縮并通過快速層析(2:8，乙酸乙酯:石 油醚)純化以得到Ri = H, R2 = OH(608 mg，產(chǎn)率96%)。 i f = 0.20 ( 2:8，乙酸乙酯:石油醚)。[《=-19.0 (c1.0, CHC13). 'H NMR (250 MHz^ CDC13): S 7.28-7:19 (m, 5H)， 4.12 (dt, J= 12.5, 8.2' 6.2 'Hz， 1H), 3.80 (ddd, J= 8.0， 4.7， 3.0 Hz, IH)， 3.51 (dd, /= 12.0, 3.0 Hz, 1H), 3.2S ((14/= 12.0, 4.7 Hz, 1H), 3.04 (dd, </= 14.0， 6.5 Hz, lH), 2.82 (dd, /= 14.0， 6.5 Hz， 1H), 1.40 (s, 6H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 136.9, 129.2, 128.4， 126.6, 108.7, 81.1,77.06, 61.9， 39.3,27.2， 27.0. MALDI-MS (正性模式 ，CHCA): m/z 345.0 + Na]+.(c)使用在上述操作l(a)中提及的方法，將上述(b)的化合物轉(zhuǎn) 化為三氟甲磺酸酯產(chǎn)物，得到無色液體= H, R2 - OTf(產(chǎn)率78%).[《- - 15.5 (c 1:0, CHa3). 'H NMR (250 MHz， CDC13): 5 7,32-7.19 (m, 5H), 4.23-4.08 (m^ 2H〉, 4.01-3.91 (m， 2H), 3.16 (純 /= 13.5, 6.0 Hz, IH), 2.81 (d4 13,5, 6.0 Hz， 1H)， 1.42 (s, 3H), 1.39 (s, 3H). 13C NMR (62.5 MHz, CDCi3): S 211.4, 135.8, 129.1, 128.8， 127.2, 110.0, 77.7, 76.9， 74.5, 39,2, 27.2， 26.6.(d)使用上述(c)的產(chǎn)物重復(fù)上述l(a)的操作，得到其通過快速層析(1:9，乙酸乙酯:石油醚)純化成無色液體(產(chǎn)率93%), i f=0.42 ( 15:85，乙酸乙酯:石油瞇)。[afDs- ",9(c 1.0, CHC13).NMR (250 MHz, CDCl3):S7.30-7.22 (m, 5H)， 4.13-4.05 (m, 2H)， 3.92-3.80 (ra, 3H), 3.61-3.53 (m, 2H)， 3.45-3.34 (m， 2H), 3.03 (dd^ /= 14.0， 6.7 Hz， 1H), 2.88 (dd， 14.0,6.7 Hz, 1H), 1.53-1.24 (m, 2卿,TL37 (寬峰，s, 12H), 0.86 & /= 6.5 Hz, 3H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 137.3, 129.3, 128.3, 127.6, !26.5， 108.9， 108.2， 79.7， 78.2, 77.7, 75.6, 72.7， 71.9, 59.8, 39.5> 31.9,29.67, 29.64, 29.58， 29.54, 29,4, 29.3, 28.1， 27.2, 26.9， 26.4， 25.6， 22.6, 14丄MALDI-MS ( 正性才莫式，CHCA): m/z 610.9 [M + Naf.(e)使用上述(d)的產(chǎn)物重復(fù)上述l(b)的操作，得到<formula>formula see original document page 50</formula>其通過快速層析(15:85，乙酸乙酯:石油醚)純化成無色固體(產(chǎn)率: 72%)。 J f=0.35 (2:8，乙酸乙酯:石油醚X9.2 (c 1.0， CHCI3). lH NMR (250 MHz, CDC13): 5 7.31-7.23 (ra， 5H), 5.70 (d, /= 9.0 Hz, 1H), 4.19-4.00 (m, 4H), 3.95-3.88 (m, IH)， 3.71 (4d, 7= 9.7， 3.0 Hz, 1H), 3.46-3.33 (m, 3H), 3.03 (dd, 14.0, 6.5 Hz， 1H), 2.88 (dd， J=f 14.0, 6,5 Hz, 1H), 2.14 (dt, J = 10.5, 7.2, 2.7 Hz， 1H), 1.6—6-1.27 (m, 84H)， 0.90 (t, 6.5 Hz, 6H). l3C NMR (62.5 MHz, CDCI3): S 172.3, 137.2, 129.3, 128.3, 126.5， l則，107.8, 79.7, 78.4, 77.7, 75.9， 72.1, 48.1, 39.6， 36.9, 31.9, 29.6， 29.5， 29.4, 29.35, 29.32, 29.0, 28.0, 27.3, 27.1, 26.4, 25.79, 25.72, 22.6, 14.1. MALDI-MS ( 正性模式 ，DHB): m/z 962.4 [M + Na〗+.C60Hi09NO6 (939.83)計算值C, 76.62; H 11.68; N, 1.49.實測值C, 76.70; H, 11.59; N， 1.53.(f)使用上述(e)的產(chǎn)物重復(fù)上述l(c)的操作，得到無色固體(產(chǎn)率70%),以下稱為化合物6 ("4-脫氧-4-苯基-蘇糖醇-神經(jīng)跣胺 類似物")。'H NMR (250 MHz, CSD5N): S 8.4(3 (d, 8,5 Hz, IH)， 7.37-7.13 (ni, 5H), 4.22-4.04 (m, 7H), 3.94-3.92 2H), 3.17 (dd, /= 14.0, 4.6 Hz, IH), 3.03 (dd, /- 14.0, 7.5 Hz, 1H)， 2'31(寬峰，'t 7.2 Hz, 2H)， 1,73- 1.70 (m, 4H)， 1.19-1.13 (叫68H), 0.74 (t, J - 6.7 Hz, 6H). MALDI-MS (正性模式，DHB): m/z882.9 [M + Na]+. C54H,01NO6 (859.76)計算值C, 75.38; H, 11.83; N, 1.63.實測值C， 75.36; H， 12.03; N, 1.68.化合物7: 4-脫氧-4-苯基-蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酰胺(a)使用22-(Z)-二十六酸和上述6 (d)的產(chǎn)物例如(產(chǎn)率72。/。)。 i f=0.38 ( 2:8,乙酸乙酯:石油醚)。["]^ = + 8.0 (c 1.0, CHCl3)JHNMR (250 MHz, CDC13):5 7.31-7-22 (邁，5H)， 5.66 (d, 9.2 Hz, IH)， 5.36-5.31 (m, 2H), 4.12-3.98 (m, 4H)， 3.91-3.84 (m， 1H), 3.67 (d4 J= 10.0, 3.5Hz, 3.43-3.28 (m, 3H), 2.99 (dd, /= 14.0, 6.6 Hz, 1H), 2.84諷J- 14.0, 6.5 Hz,1H), 2.00 (dt, J- 10.5, 7.2, 2.7 Hz, 2H), 2.02-1.97 (邁，4H), 1.57-1.23 (m, 76H), 0.91-0.81 (邁，卿.13CNMR(62.5 MHz, CDC13): 5 172.3, 137.2, 130.1, 129.5, 129.3,128.4，126.6， 109.0， 107.8, 79.7， 78.4, 77.7,75.9, 72.2， 71.2,48.1, 39.6， 36.9， 31.9,29.76,29.71,29.5, 29.4, 29.36, 29.31, 29.2, 29.0, 28.0, 27.3， 27.2， 27.1, 26.4, 25.8， 25.7, 22.8， 22.6，14.1, 13.8. MALDI-MS ( 正性模式，DHB): m/z 960.1 [M + Na]+. CeoH'ovNOs(937.81)計算值C, 76.79;氏11.4S>;N, 1.49.實測值C, 76.86;H, 11.57;N, 1.55.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物重復(fù)上述l(c)操作，得到無色固體以下稱為化合物7 ( "4-脫氧-4-苯基-蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酰胺")(產(chǎn)率:重復(fù)l (b)的操作，得到無色固體68% )。!H NMR (250 MHz, C5D5N): S 8.46 (d, 8.4 Hz:IH)， 7.37-7.13 (m, 5H), 5.41-5.25 (ra， 2H), 4.22-4.05 (叫7H), 3.94~3.92 (n^ 2H), 3.17 (d4 ■/= 14.0， 4.6 Hz, 1H), 3.05 (d《J"= 14.0, 7.5 Hz, 1H), 2.31(寬峰，t, ■/= 7.2 Hz， 2H), 1.99-1.87(in, 4H)， 1.80-1.64 (m, 4H), 1.17-U3 (ra, 60H), 0.79-0.71 (叫6H). MALDI-MS(正性模式 ，,DHB):m/z 88U [M + NaJ+.C54H9i>N06 (857.75) 計算值 C, 75.5(5; H, 11.63; N, 1.63.實測值C, 75.47; H, U.58;N, 1.68.化合物8: D-褲酸甘油神經(jīng)酰胺(a )按Maye等Angew. Chem., 106:2289 (1994); An狄w.Chem., Int. Ed.， 33:2177 (1994)和Kratzer等Eur. J, Org. Chem., 291 (1998)所描述制 備(150 mg， 0.204 mmol)在CH2C12 (4 mL)中的溶液，并在室溫下與乙腈 (1.16 mL， 0.50 mmol)中的0.45 M四唑溶液合并。攪拌10分鐘后，>j￡ 同樣溫度下加入Chen等J. Org. Chem., 63:6511 (1998)中所述的化合物(97 mg， 0.265 mmol)在無水CH2C12 (3 mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物攪 拌2.5小時，然后向反應(yīng)混合物+加入叔丁基過氧化氫(0.26 mL, 0.266 mmol )。將反應(yīng)混合物再攪拌15分鐘，并以CH2Cl2和水萃取混合物， 將有機層以飽和NaHC03和鹽水洗滌，以無水MgS04千燥。蒸發(fā)溶劑 得到粗材料，將其通過快速層析(4:6，乙酸乙酯:石油醚)進行純化得 到無色固體形式的純。vA^。、p乂(191mg，92%)， mp87t:。 Uf 0.40 ( 6:4，乙酸乙酯:石油醚)[or〗f - + 4.0 (c 1.0, CHC13). lH N^R (400 MHz, CDC13，非對映體 混合物 ):5 7.36-7.32 (m， 5H), 6.01 (d, J= 8.9 Hz, IH)， 5.89 (d, ■/= 9.3 liz, 1H), 5.07 (d, 8.5取2H), 5.04 (d, 8.6 Hz, 2H), 4.29-4.19 (m, 3H)， 4.10-3.86 (m, 6H), 3.76-3.69 (m; 1H), 2.11-2,03 (m, 2H)， 1.55-1.18 (m, 72H), 1.38 (s, 6H)， 1.37 (s， 3H), 1.36 (s, 3H)， 1.31 (s，卿,1.28 (s, 3H)J.27 (s， 3H)' 0,85 (t, J- 6.6 Hz, 6H). 13C NMR (100 MHz, CDCI3):S 172.64， 172.61, 135.6, 135.5, 128.6-127.7 (m)， 109.9' 108.0， .77.5, 75.3, 73.9, 65.9,48.2, 36.7， 31.9,29.6， 9.5,29.3, 27.8, 26.5, 25.5, 25.1, 22.6,14.1.' 31P NMR (162 MHz, CDC3):S 0.1, 0.04. MALDI-MS(正性模式 ，Matrix CHCA): m/z 1043.2 [M + Na]+. CMHU0NO9P (1019.79) 計算值C， 70.62; H, 10.86; N, 1.37.實測值 C, 70.66; H, 10.94; N, 1.41.(b )在H2氣氛中于室溫下將上述(a)的產(chǎn)物(160 mg， 0.157 mmol) 和甲醇(8mL)中的10%Pd/C (50mg)攪拌1小時。向此反應(yīng)混合物 中加入三乙胺(26 jiL, 0.188 mmol )，攪拌15分鐘后，通過珪藻土過濾 并蒸發(fā)得到粗材料，所述粗材料不經(jīng)進一步純化而用于隨后的反應(yīng)中。 將所得化合物溶于含有TFA (150 )的MeOH/CH2Cl2 (10:1， 22 mL))中，并在室 溫下攪拌3天。蒸發(fā)溶劑得到固體。將所述固體過濾并以乙酸乙酯和 CH2Cl2充分洗滌(以除去可溶性有機材料)。將此固體溶于二氧六環(huán)(1 mL ) + ，向其中加入數(shù)滴MeOH和三乙胺(26 jiL， 0.188 mmol)并加熱到60t:。將此混合物冷凍干燥以得到未受保護的無色固體形式目標(biāo)分 子(97 mg， 60% )，以下稱為化合物8 ( "D-磷酸甘油神經(jīng)酰胺")。HNMR (2S0 MHz, C5D諷5 9.09 (d, J - 8.5 Hz， 1H)， 5.24-5.09(m, 2H), 4.96-4.卯(m, 1H), 4.80-4.75 (m, 2H), 4.60-4.52 (m, 2H), 4.44-4.40 (m, 1H)， 4.28 (寬峰，d, 5,5 Hz， 2H)，3.10 (q, /= 7,5 Hz，卿,2.(50 (t; /= 6.7 Hz, 2H), 2.05-1.32 (m, 81H), 0.97-0.95 (m,卿.l3C NMR (150.9 MHz, C5D5N): 5 173.4， 75.5， 72.67, 72.65, 72.5, 68.3, 65,94, 65.92, 65.8， 45.7, 36.8, 33.3， 32.1; 30.3， 30.2, 30.0， 29.8, 29.6, 29.2, 6.4, 22.9, 14.2. 3lP NMR (162 MHz, C5D5N): S 3.0. MALDI-MS (負性模式 ， Matrix ATT): m/z 929.1 [M - HNEt3)]「. C59H119N09P (1031.86) 計算佳C， 68.70; H， 11.63; N， 2.72.實測值C, 68.75; H， 10.99; N， 2.79.進行上述8(a)中的操作，得到粗材料，將其通過快速層析(4:6，乙 酸乙酯:石油醚)進行純化以得到無色固體形式的純(195mg，94%)， mp85"C。 Wf 0.47 ( 6:4，乙酸乙酯:石油醚)。[a〗，=+ 2.5 (c 1.0, CHC13). 'H NMR (400 MHz, CDCI3, 非對映體 混合物 ):S 7.40-7.30 (m, 5H), 6.05 (d, /= 9.1 Hz, IH)， 5.99 (d, 9.2 Hz, 1H), 4.32-4.20 (m, 3H), 4.13-3.93 (in, 6H),3.75(寬峰,dd^ /- 8.S， 5.6 Hz, IB),2.20-2.09 (取 2H), 1.58-1.13 (m, 72H), 1.38 (s, 6H), 1.34 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 1.31 (s, 6H), 1.29 (s, 3H), 1.25 (s, 3H), 0.93 (t， J= 6.6 Hz, 6H), "C NMR (100 MHz, CDC13): S 172.64, 172.61, 135.(5, 135.5, U8.6-I27.7 (邁)，109.9, i08.0, 108.0, 77.65, 77.63> 75.46, 75.43, 73.9, 73.S, 65.9， 48.2， 36,7， 31.9, 29.6,29.5, 29.3， 28.9， 27.9, 27.8, 26.6， 26.5, 25,5, 25.1， 22.6， 141, 31P NMR(162 MHz, CDC13): S 0.3,0.2. MALDI-MS (正性模式，Matrix CHCA):m/z 1043.2 [M + Na〗+. C60Hii0NO9P (1019.79)計算值 C, 70.62; H, 10.86;風(fēng)1.37.實測值C, 70.69; H, 10,S)'8; N, 1.47,化合物9: L-磷酸甘油神經(jīng)酰胺使用異構(gòu)體(b)使用上述8 (a)的操作得到無色固體OH(83 mg， 55% )，以下稱為化合物9 ( "L-磷酸甘油神經(jīng)酰胺")。(m, 5H), 4、59-4.33 (in, 3H), 4.28 (寬峰，d, 5.0 Hz， 2H), 3.10 (q, /= 7.5 Hz, 6H)， 2.63 (t, /- 6.7 Hzj 2H), 2.05-1.37 (m, 81H), 0.99-0.96 (m， 6H). l3C NMR (150.9 MHz, CsD5N): 5 173.4,.75.6,72.65, 72.5, 68.4， 65.96， 65.7' 46.0， 36.9, 33.4, 32.1， 31.6, 31.2， 31.0, 29.8, 29.6, 29.2, 26.4, 22.9， 14.2. P NMR (162 MHz, C5D5N): S 3.6. MALDI-MS (負性 模式'Matrix ATT): m/z 929.1 [M — HNEt3)r. C59Hll9N09P (1031.86)計算值 C， 68.70; H， 11.63; N, 2.72.實測值:C， 68.79;H, 10.95; N, 2.78.化合物10:肌醇神經(jīng)酰胺(a)將根據(jù)熟知方法(參見Mayer等Liebigs Ann.ZRecueil, 859 (1997)和Jiang等.Carbohvdr. Chem,, 6:319 (1987))得到的化合物(366 mg， 0.691 mmol)的經(jīng)攪拌溶液與在無水CH2C12 (3 ml)中的2，6國 二叔丁基吡咬(159 mg, 0.83 mmol)以及Tf20 (136 jil， 0.83 mmol)(溶于 2 mL CH2Cl2中)在or:下混合。將反應(yīng)混合物在相同溫度下攪拌3小 時。將反應(yīng)混合物置于乙酸乙酯中并以冷水洗滌(2x25mL)。將合并的 有機層以鹽水洗滌，干燥并蒸發(fā)以得到粗產(chǎn)物，將其通過快速層析(8:92， 乙酸乙酯:石油醚，含有數(shù)滴Et3N)純化以得到H NMR (250 MHz, C5D5N): S 9.09 (d, 8.4 Hz, 1H), 4.87-4.65(413mg，卯0/。)， J f0.41 (19,乙酸乙酯:石油瞇)。): S 7.41-7.28(m, 15H), 4.88 (d, /- 11.9 Hz, 1H), 4.78-4.67 (m, 5'H), 4.30 (dd, J= 6.0， 3.7 Hz， 1H), 4.17 (t, ■/= 6.4 Hz, IH),.德(t, J= 7.6 Hz，恥3.97諷9.1, 6.5取IH)， 3.77 (dd, 7= 8.0, 3.6 Hz, IH)， 1.83-UO (m, 10 H). I3C NMR (62,5 MHz, CDC13): 5 137.6, 137.32, 137.29, 128.4, 128.3, 128.2， 128.1, 128.0, ii7.9, 127.7, 111.1, 87:7， 79.0, 77.83, 77.77, 76.4, 74.6， 73,6, 73.3, 37.0、 34.5， 25.0,23.9， 23.6.(b )使用NaH ( 60%, 7 mg, 0.181 mmol )、 58 mg ( 0.151 mmol) 鞘氨醇成分即在l ml無水DMF中的溶液，重復(fù)上述1 (a)的操作。攪拌30分鐘 后，在相同溫度下加入上述(a)的產(chǎn)物(100 mg, 0.151 mmol)在無水 DMF (1.5 ml)中的溶液。攪拌過夜后，通過加入NH4C1水溶液猝滅反 應(yīng)混合物。將其置于EtOAc中并分離層。將有機層以水洗滌，以無水 MgS04干燥，蒸發(fā)至干。將粗材料通過快速層析(1:9,乙酸乙酯:石油 醚)純化以得到無色液體形式的純化合物(108mg，80%)， J f=0.44 (l:9，乙酸乙酯:石油醚)。^NMR (250 MHz,CDCi3): S 7.45-7.23 (m，15H), 4.88-4.63 (m, 6H),4.30-3.83 (m， 8H， 3.75-3.69 (m, 1H), 3.56-3.47 (m,叫3.40-3.35 (m, 1H), 1.72-1.26 (m， 36 H), 1.37 (s， 3H), 1.35 (s, 3H), 0.88 (t, 7.2 Hz， 3H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 139.0, 138.8, 138.7, 138.6, 138.4> 138.3, 128.3, 128.22， 128.18, 128.1, 128.0， 127.59， 127.55, 127,5, 127-4, 127.3, 109.7， 108.0， 79.2, 79.1, 78.9, 78.8， 78.7, 78.0, 77.9, 77.8， 77.2, 76.25， 76.20, 75.4， 75,3， 74.2, 73.9， 73.7, 73.4, 73.3, 73.13, 73.09, 71.7,71,5， 60.22, 60.16， 37.9, 35.3, 31.9， 29.64, 29.61, 29.5, 29.3， 28.13， 28.10, 26.4, 25.7， 25.1， 24.0, 23.5, 22.6， 14-0. MALDI-MS(正性模式 ，DHB):m/z 919.8 [M + Na〗+. C54H77N308 (896.20) 計算值C, 72J7; & 8.66; N, 4.69.實測值C, 71.91; H, 8.36; N, 4.68.(c )將上述(b )的產(chǎn)物160 mg( 0.178 mmol )和MeOH/CH2Cl2/H20 (7.5:7.5:1, 3 mL)中的少量Pd(OH)2/C在H2氣氛中于室溫攪拌過夜。然 后將混合物過濾，濃縮并與甲苯共蒸發(fā)。將所得糖漿溶于無水DMF (4 mL )中。依次加入二十六酸(71 mg， 0.178 mmol )、 N-羥基苯并三喳(24 mg， 0.178 mmol )和l-3- (二甲基氨基)-丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(34 mg, 0.178 mmol)，并在45t:攪拌所得混合物1天。然后將其置于乙酸 乙酯中并以水、飽和鹽水溶液洗滌，以無水MgS04干燥并濃縮。通過 快速柱層析(7:3,乙酸乙酯:石油醚)將殘留物進行純化以得到化合物(75mg,43%)。 ^f=0.23 ( 7.5: 2.5,乙酸乙酯:石油醚)。lH NMR (250 MHz,CDC13): S 6.09 (t, J= 9.5 Hz, IH)' 4.47-4.40 (m, IH)， 4.27-3.68 (m'卿，2.36-2.11 " 2H)， 1.72-1.18 (m, 82 H), 1.44 (s' 3H)， 1.34 (s, 3H), 0.88 (t, 6.4 Hz, 6H). MALDI-MS(正性模式 ，DHB): 1002.0 [M + Na]+. C59HU1N09 (978.51)計算值C， 72.42; H, 11.43; N, 1.43.實測俏C, 72.16; H, 11.46; N, 1.36.(d )將上述產(chǎn)物(c) ( 46 mg, 0.047 mmol)在MeOH/CH2Cl2 (1:1， 2 ml)中的溶液與少許CSA晶體在室溫下攪拌2天。將析出的固體干燥 得到22 mg化合物(產(chǎn)率55% )，以下稱為化合物10 ("肌醇-神經(jīng)酰胺")。HNMR(250MHz, C5D5N): S 5.20-4.15 (m, 11H), 2.49-2.38 (m,卿,2.38-1.10 (m, 72H)， 0.91-0.80 (m, 6H). MALDI-MS (正性模式 ，DHB): m/z 881.6 [M + Ma]+. C50HwNO9 (858.32)計算值C, 69.97; H, 11.63; N， .1.63. Found: C, 70.07; H， 11.70;N， 1.67.(114 mg (0.127 mmol))與MeOH/CH2Cl2/H20 ( 7.5:7.5:1， 3 mL )中的 10% Pd/C (100 ng)合并，并在H2氣氛中于室溫下攪拌過夜。然后將化合 物過濾，濃縮并與曱苯共蒸發(fā)。將所得糖漿溶于無水DMF(4mL)中。 依次加入棕櫚酸(33 mg, 0.127 mmol)、 N-羥基苯并三哇(17 mg, 0.127 mmol )和l-[3- (二甲基氨基)-丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(24 mg， 0.127 mmol)，將所得混合物在45"C下攪拌1天。然后將其置于乙酸乙酯中并 以水、飽和鹽水溶液洗滌，以無水MgS04干燥并濃縮。將殘留物通過 快速層析(7:3，乙酸乙酯:石油醚)純化，得到化合物ll:肌醇神經(jīng)酰胺ds?；?"將10的產(chǎn)物如(48mg,45%)。 i f=0.24 ( 3: 4，乙酸乙酯:石油醚)。'H NMR (250 MHz,CDC13): S 6.05 (t, 9.3 Hz， 1H), 4.47-4.39 (m, 1H), 4.27-3.67 (m， IO印，2.28-2.13 (加， 2H), 1.72-1.20 (rn^ 62 H), 1.44 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 0,88 (t, J - 6.4 Hz， 6H). MALDI-MS( 正性模式，DHB): 861.7 [M + Naf. C49H9iN09 (838.24):計算值 C， 70.11; H, 10.94; N, 1.67.實測值C, 70.19; H, 11.03; N, l.議(b )將含有少許CSA晶體的MeOH:CH2Cl2 (1:12 ml)中的上述(a ) 產(chǎn)物(44 mg, 0.047 mmol)在室溫下攪拌36小時。將析出的固體過濾 并干燥以得到(19 mg， 50% )，以下稱為化合物11 ("肌醇-神經(jīng)酰胺C15酰基")。HNMR (250 MHz,C5D3N): 5 5.35-4.25 (m, 11H), 2.48-2.37(m， 2H), 2.37-1.10 (ra, 52H), 0.90-0.78 (叫6H). MALDI-MS (正性模式 ，DHB): 741.2 [M + Na]+. C40H79NO9 (718.05)計算值C, 66.91; H， 11.09; N, 1.95.實測值C, 66.98; H, 11.47; N, 1,39,化合物12: D-myo-肌醇神經(jīng)酰胺(a)采用熟知的方法(參見Stadelmaier等Carbohvdr. Res. 338:2557(2003))制備化合物使用NaH (95%，在礦物油中，200 mg, 8.333 mmol )、千基溴(900 pL, 7.578 mmol)處理無水曱苯(25 mL )中的上述化合物(2.66 g， 6.820 mmol)。將反應(yīng)混合物回流IO小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并以乙 酸乙酯稀釋，以水洗滌，以MgS04干燥并蒸發(fā)以得到殘留物，將其通 過快速層析(15:85，乙酸乙酯:石油瞇)從異構(gòu)體混合物(~1: 1.4)中進 行純化，得到R = C15H31 OAll 一OH:85，乙酸乙酯:石油醚)。H NMR (600 MHz， CDCI3): S 7.37-7.28 (m， 10H), 5.96-5.卯(m, 1H)， 5.29 (dd,J- 17.4,1.8-Hz， 1H)， 5.18 (dd， 10.8, 1.8 Hz， 1H), 4.87 (d, 11.4 Hz, 1H,卡基-H))， 4.76-4.71 (m, 3H,芐基-H), 4,38-4.36 (m, 1H,辟丙基-H), 4.29 (dd, 6.0,4.2 Hz, 1H, H-4)，4.23-4.21(m, 1H,烯丙基-H),4.01 (dd, 7.2， 6.0 Hz， m' H-5), 3.79 (t， /- 8.1 Hz， 1H, H-2)， 3.68 (dd， /= 8.1, 3.9 Hz, H-3), 3.59 (dd, /- 9.(5,7.2 Hz， 1H, H-6), 3.44 (dd, > 9.(5, 8.1 Hz， 1H, H-l), 2.32 ( br. s,lH, -OH), 1,80-1.41 (m, 10H). 13CNMR (150 MHz， CDC13): S 138.5, 138.1， 135,0, 128.59, 128.57, 128.47, 128.43, m.O, 127,98， 127.94, 127,8, 127.7, 117.2， 81.4 (C-6)'80.6 (C-2)， 78.4 (C-5), 77,4 (C-3), 74.6， 74.9 (C-4), 73.3 (CM), 72,8， 72.2, 37.3, 35'0, 25.0, 23.9, 23.6. MALDI-MS (正性模式 ，DHB): m/z 503.5 [M + Naf.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物，重復(fù)l (a)和l (b)的操作，得到通過快速層析(5:95,乙酸乙酯:石油酸)將碎碑化(產(chǎn)率87% )。 i f = 0.54(1:9,乙酸乙酯:石油醚)。MS = + L4 (e LG，CHCl3).lHMMR (600 MHz.CDCl3): S '.39-7.23 (m， 20H), 5.96-5.90 (m, 5.20 (dd, 17.4, 1.8, Hz, IH,), 5.10 (dd， /- 10,8, 1.8 Hz, 1H), 4.84-4.81 (m, 2H,卡基-H)， 4.72 (4 J-12,0 Hz, 1H,芐基-H), 4.68-4.(54 (m， 2H,芐基-H), 4.59-4.54 (in, 2H,千基-H)， 4.46 (d, 11.4 Hz, 1H,芐基-H), 4.26 (t, J- 4.8 Hz, 1H, H-4)， 4.19-4.16 (m, 3H, H-5， H二3，蜂丙基-H), 4.14-4.06(m, 2H, H-l',烯丙基-H)，3.99-3.96 (m, 1H, H-l'), 3.81 (d> /= l.S Hz, 1H, H-l), 3.75 (dd, 9.6,1.8 Hz, 1H, H-2)， 3,72-3.70 (邁，1H, H-2')， 3.58-3.56 (m, 2^， H-3'， 3.33 (d4 /= 8.4> 2:4 Hz, 1H, H-6), 1.61-1.41 (iu, 10H), 1.26-1.24 (m， 26H), 0.88 (t, 7.2 Hz, m, 3H). l3C NMR (150 MHz, CDC13): S 138.5-127.4 (m, 24C)， 135.1,116.8,109.7， 79.6 (C-4'), 79.1 (C-l， C-<5), 7S.8 (C~2), 78.7 (C-3'), 78,0 (C-5)， 7$.3 (C-3)， 73.8 (CM), 73.6, 73,5 (C-l')， 73'.3, 71.9, 70.9, 62.4 (C-2'), 37.5, 35.0, 25.0, 23.-9, 23.6, _22.7, 14.1. MALDI-MS ( 正性模式，DHB): nVz 1009,1 [M + Na]+. C61HS3N308 (985.62)計算俏c, 74.28; H, 8.48; N, 4.26.實測值C' 74,19; H， 8.42;- N， 4.28.將甲苯/乙醇/lM鹽酸水溶液(3:6:1,15 mL)混合物中的上述(b) 的產(chǎn)物(700 mg， 0.710 mmol)于60C下加熱3小時。溶劑與甲苯共蒸 發(fā)，i空千燥，將殘留物溶于無水DMF(10mL)中，加入NaH(600/。， 礦物油，85 mg, 3.553 mmol)并在室溫下攪拌30分鐘，然后加入芐基溴 (220 nL, 1.77 mmol)。將反應(yīng)混合物再攪拌5小時，然后以乙醚萃取 (2x20mL),將醚層以水洗滌，以MgS04干燥并蒸發(fā)以得到粗材料， 將所述粗材料通過快速層析(5:95，乙酸乙酯:石油醚)純化，得到(655mg，產(chǎn)率85%) 。 Wf=0.40 ( 5:95，乙酸乙酯:石油瞇)。1.0, CHC13). ，H NMR (600CDCk): S 7.44-7.28 (叫30H), 5.96-5.90 (m, 1H), 5.32 (dd, /= 17.4, 1.8 Hz, 1H), 5.14 (d山 /= 10.8,1.8 Hz, 1H), 4.88-4.62 (m, 11H), 4.54 (d, / - 11.4 Hz, 1H), 429-4.27 (ni, 1H), 4.22-4.12 (m, 3H), 4.0S (br. s, 1H),3.96 (t峰，s, 3H): 3.87-3.83 (m, 3H), 3.68-3.66 (m, 2H), 1.49-1.32 〈m, 2卿,0.94 (t, J- 7.2 Hz, 3H). 13C[ag = + 2.8 (cNMR (150麗z, CDC13): S 138.5-127.2 (m, 36C)， 135.4, U6.2, 79.8, 79.2, 79.0， 78.9, 78.7, 78.38, 78.36， 76.0, 74.6, 74.4, 73.8, 73.17, 73.15, 73.0' 72.18， 72.10, 62.5, 32.0, 29.9, 29.89, 29.80, 29.79， 29.76, 29.4, 27.0, 25.7, 22.7, 14,2. MALDI-MS (正性 模式，DHB): m/z 1110.4 [M + Na]+.C69H87N308 (1085.65)計算值 c， 76.28; H， 8.07; N, 3.87.實測值:C, 7(5.36; H, 8.17; N, 3.95.(d )在OX:下將乙醚(5mL )中的上述(c )產(chǎn)物(650 mg， 0.598 mmol) 滴加到LiAlH4 (46 mg, 1.210 mmol)在乙醚(lOmL)中的懸液中。使反 應(yīng)混合物緩慢升至室溫并回流1小時。將反應(yīng)混合物用甲醇猝滅并以乙 酸乙酯(2xl5mL)和水萃取。將有機層以鹽水洗滌，以MgS04干燥。 除去溶劑，得到粗胺。重復(fù)上述1 (b)的操作，用于將這種胺與羧酸 偶聯(lián)，得到BnQ.OBnR = OAI1(產(chǎn)率65%)。 i f=0.57 ( 15:85,乙酸乙酯:石油醚)。K - + 1.6 (c 1.0,CHC13). 'H NMR (600 MHz, CDC13): 5 7.37-7.17 (m, 30H), 7.04 (d, /- 8.6 Hz, 1H)， 5.96-5.91 (m^ 1H), 5.27 (d4 /= 17.4,1.8 Hz, 1H)， 5.15 (dd, 10.8， 1.8 Hz， 1H), 4.83-4.43 (叫13H，爺基-H' H-l，， 4.33-4.31 (叫1H), 4.23-4.21 (叫1H), 4.19-4.02 (m， 2H， H-4, H-2'), 3,91 (dd， 7= 9-6, 2.4 Hz, H-2)， 3.88-382 (m, 3H, H-3', H-6, H-l), 3.73 (dd， ■/ =9.6， 3.0 Hz, 1H, H-3), 3.70 (dd, /- 10.2, 2.4 Hz, 1H, H-5), 3.66-3.62 (m， H-l'), 3.48-3.44 (m, 1H， H-4')， 2.21-2.17 (m, 2H), 1.57-1.27 (叫72H), 0.91 (t; 7.2取6H). 13C NMR (150 MHz, CDC13): 5 172.8, 139.2-127.2 (m, 36C), 135.1, 117.1， 80.8 (C隱4')， 80.0 (C-1), 79.6 (C-3), 79.44 (C-2), 79.41, 79.3 (C-5, C-6), 78.2 (C-3'), 75.3 (C-4)' 74.6, 74.4， 73.8, 73.8 (C-l'), 73.6， 73.1, 72.8, 72.7， 71.6, 51.0 (C-2')， 36.8， 32.0, 29,9, 29.79， 29.77， 29.72, 29.6, 29.44， 29.43, 26.4, 25.9， 25.8， 22.7， 14.1, MALDI-MS (正性 模式，DHB): m/z 1464.2 [M + Naf. C95Hi39N09 (1438.04):計算值c， 79.29; H， 9.74; N, 0.97,實測值■: C, 79.35; H, 9.81; H 1.09.(e)用DBU (10 nL， 0.065 mmol)和三(三苯基膦)氯4t釕(11) (130 mg, 0.135 mmol)處理上述(d)的化合物(650 mg， 0.452 mmol)為乙醇 (15 mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在90t:加熱至回流30分鐘。蒸發(fā) 溶劑以得到異構(gòu)化的產(chǎn)物(i f = 0.54,15:85，乙酸乙酯:石油醚)，將其溶 于丙酮中的1M鹽酸水溶液(l:9，15ml)中，將反應(yīng)混合物在70匸加熱至回流15分鐘。將混合物冷卻至室溫，以Et3N中和并以乙酸乙酯萃取 (2x20 mL),將;機層以水和鹽水洗滌，以MgS04干燥并蒸發(fā)以得到 粗材料。通過快速層析(18:82,乙酸乙酯:石油瞇)進行純化，得到(655mg,產(chǎn)率78%). i f= 0.2 (15:85，乙酸乙酯:石油醚)。1.0, CHC13). 'H NMR (600 MHz, CDC13): 5 7.37-7.23 (m, 30H)， 7.16 (d, 8.7取 1H), 4.88 (d， 12.0 Hz, 1H), 4.78-4.68 (m, 5H)， 4.59-4.54 (ni， 4H), 4.47-4.42 (m， 3H)， 4.09-4.06 (叫3H), 3.95-3.93 (m, 2H), .76二3.3.73 (m, 2H)，3.66( br.d， J- 8.4取IH)， 3.51-3.46 (ia 2H)， L97-2.14 (m， 2H), V52-1.24 (m， 72H), 0.89 (t, 7.2 Hz, 6H). 13C NMR (150 MHz, CDC13): S 172.9, 138.9-127.3 (m, 36C), 80.7， 80.3, 79.9， 79.3, 79.1, 74.4, 74.2, 74.0, 73.9, 73.5, 73.3, 72.0, 71.7, 70.2， 51.9, 36.9， 31.9， 29.9, 29.77, 29.75, 29.70, 29.5, 29.42, 29,4， 26.3, 25.8， 22.7, 14.1. MALDI-MS ( 正性模式，DHB): m/z 14247 [M + Na]+ Co2H135N09 (1398,01) 計算值 C， 7838; H, 9.73; N， 1.00. 實測值C, 79.08; H， 9.S4; N, 1.13.(f)使用上述(e)的產(chǎn)物，重復(fù)用于還原OH基的6 (a)操作，得到其通過快速層析(2:98,乙酸乙酯甲苯)純化成無色固體(60% )。 J f = 0.57(4:96,乙酸乙酯甲苯)。M " 11.2 (c 1.0, CHC13). 'H NMR (600 MHz, CDC13): S 7.38-7.17 (m, 30H), 6.36 (d, /= 8.6 Hz, 1H, -,， 4.83-4.36 (叫12H,芐基-H)， 4.18-4.14 (m, 2H, H-2', H~4), 4.00 (br. d, J- 9.0 Hz, 1H, H-H,r = oh6.4 (c3,93 (dd, /= 10.0, 3.0 Hz, 1H), H-2), 3.84 (t, /= 4.0 Hz, 1H, H-3')， 3.78 (d, /= 3.0 Hz, 1H, H-l),3.76( br. t, /= 9.0 Hz, 1H, H-5), 3.72 (dd, /= 10.0, 2.0 Hz, 1H, H-3)， 3.66 (寬峰 d, 9.0 Hz, 1H, H-l'), 3.51 (ddd, 12.0, 8.0, 4.0 Hz， 1H, H4'), 1.98-1.94 (m, 1H, H-6), 1.82-1.72 (m, 2H)， 1.63-1.61 (m, 1H, H-(5)， 1.43-1.24 (m, 72H), 0.86 (t， ■/= 6.5 Hz， 6H). 13C NMR (150 MHz, CDC13): 5 173.3， 139-127.2 (m, 36C), 80.2 (C-2, C-3'), 79.8 (C-3, C-4')， 75.9 (C-4), 75.8 (C-1)，力.l (C-5)' 74.0, 73.8, 72.5, 71.9, 71.0 (C-l'), 51.3 (C-2'), 36.6, 31.9, 30.5, 30.2, 29.S, 29.75, 29.73, 29.<59, 29.65, 29.5, 29.4, 29.3, 26.0， 25.7, 22.7, 14丄MALDI-MS (正性模式 ，DHB): m/z 1408.6 [M + Na]+. C92Hi35N08 (1382.02)計算值c, 79,89; H' 9.84; N, 1.01.實測值C, 79.98; H, 9.99; N， 1.18.(g )將上述(f )的產(chǎn)物(150 mg, 0.108 mmol )與MeOH/CH2Cl2/H20 (7.5:7.5:1, 6 mL )中的20% Pd(OH)2/C (150 mg)在112氣氛中于室溫下 攪拌2小時。沉淀產(chǎn)物，并通過加入溶劑甲醇/CH2Cl2/石油醚的混合物 并溫?zé)岫鴮⑵淙芙?。過濾后，將濾液濃縮以得到無色固體(86 mg,產(chǎn)率95% )，以下稱為化合物12 ( "D-myo-肌醇神經(jīng)酰胺類似 物")。NMR (250 MHz^ C5D5N): S S.45 (d, /- 8.5 Hz， 1H), 5.16 (dd, /= 8.0,4.2 Hz， 1H), 4.58-4.43 (m， 4H)， 4.33-4.22(m, 5H), 2.45-2.30 (m, 3H), 1.91-1.77 (m， 3H)， 1.28-1.21 (m, 70H), 0.83 6.7 Hz, 6H). MALDI-MS (正性模式，DHB): m/z 864.4〖M + Na]+. C50H99NO8(841.74)計算值 C, 71.30; H, 11.85; N， 1,66實測值C, 71.41; H, 11.98; N, 1.73.化合物13: D-myo-肌醇神經(jīng)酰胺鹽(a)向攪拌過后的上述12 (e)的產(chǎn)物如R = OH(200 mg， 0.143 mmol)在DMF/THF (1:1, 2 mL )中的溶液中加入 803. ]\163絡(luò)合物(40 mg, 0.287 mmol )，并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌 24小時。反應(yīng)完成后，以CH2C12 (2 x 10 niL)進行萃取，將有機相干燥 并濃縮，通過快速層析純化以得到無色固體。將所述無色固體溶于 MeOH/CH2Cl2( 1:1， 2 mL )中并通過Dowex 50 X 8H+離子交換樹脂(Na+ 型)，以MeOH/CH2Cl2 (1:1， 100 mL)混合物進行洗脫。蒸發(fā)溶劑得到固 體將其通過快速層析進行純化以得到無色固體(203 mg，產(chǎn)率95%)。使 用針對上述化合物12 (f)而描述的類似操作將此化合物去苯曱基化， 得到無色固體以下稱為化合物13 ( "D-myo-肌醇神經(jīng)酰胺")(產(chǎn)率40% )。NMR (400 MHz, C5D5N: CD3OD): S 8.50 (d, /= 8.5 Hz> IH)， 5.10 (dd, 10.0, 2.0 Hz, 1H), 4.584.55 (m, 2H), 4.48-4.42 (m, 2H)， 4.26-4.17 (rn^ 3H), 4.06-3.99 (m， 2H), 3.91-3.88 (m' IH)， 2.31-2.26 (m, 2H)， 1.63-1.10 72H), 0.90 & / - 5.7 Hz, 6H). MALDI-MS (正性模式.，ATT): m/z 938.7 [M - Na]'. Q;(jH訴NNraO12S(959.67)計算值 C， 62.53; H, 10.29; N, 1.46.實測值C, 62.59; H, 10.38; N， 1.51.化合物14: 4-(S)-苯基蘇糖醇神經(jīng)酰胺(a膝照熟知的方法(參見Wagner等J. Chem. Soc. Perkins Trans" 1， 780 (2001); Su等Tetrahedron., 57 2147 (2001); Surivet等Tetrahedron Lett., 39:7249 (1998)和Surivet等Tetrahedron., 55:1311 (1999),所有這些 ^文獻均通過引用并入本文)，將L-(+)-酒石酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的三氟甲 磺酸鹽。這種三氟甲磺酸鹽的合成得到非對映體混合物。按照上述引用 的參考文獻將此混合物分離，得到兩種化合物。= OTBDPS, R2 = H 和R2 = OTBDPS, & = H(b)使用來自上述(a)的三氟甲磺酸酯(其中R = OTBDPS， R2 = H )如Rt = OTBDPS, R2 = H重復(fù)上述l (a)的操作得到R = OTBDPS, R2 = H將其通過快速層析進行純化得到無色液體，產(chǎn)率為84%. i f= 0.62 (1:9， 乙酸乙酯:石油醜)。[《=+ 20'5 (c 1.0, CHC13).'HNMR(250MHz,CDCl3): S 7.71-7.17 (m, 15H)，4.90 (d, J - 4.5 Hz, 1H), 4.27-4.20 (m, 1H), 4.15-4.06 (m, 1H), 3,95 (dd, 8.0, 4.5 Hz, 1H), 3.79-3.70 (m, 2H), 3.52 (dt， / = 8.7,2.0 Hz, 1H), 3,40 (t, 9.0 Hz，印，3.28-3.16 (m， 2H), 1.54-1.20 (hl 26H), 1.42 (s， 3H)， 1.37 (s, 3H), 1.32 (s， 3H)， 1.28 (s, 3H), 1.06 (s, 9H)， 0.88 (t， /= 6.5 Hz, 3H). UC NMR (62.5 MHz, CDQj): 5 140.4， 136.07, 136.02， 133.5, 133.2， 129.5, 129.4， 127.7, 127.4, 127.3, 127.2, 127.0, 109.2, 108.1， 81.1， 77.7, 76.8， 75.7， 75.5, 72.8, 72.(5, 59.7， 31.9, 29.6, 29.59, 29.53， 29.4, 29.3, 28.0, 27.0, 26.88, 26.82, 26.4, 25.6' 22.6, 19.3， 14.1. MALDI-MS (正性模式 ，CHCA): ra/z 865.2 [M + Na]+ C50H75N3O6Si (842. 23)計算值 C, 71.30; H， 8.98; N, 4.99.實測值C, 71.39; H, 9.03; N, 5.07.(C)使用上述(b)的產(chǎn)物，重復(fù)上述l (b)的操作，得到R OTBDPS, R2=H將其通過快速層析(8:9.2，乙酸乙酯:石油醚)進行純化得到無色固體， 產(chǎn)率72%。 i f = 0.52 (1:9,乙酸乙酯:石油瞇)。M = +17.9 (c i.0, CHC13). NMR (250 MHz, CDC13): S 7.69-7.16 (m, 15H),'5.72 (d, /= 8.7 Hz， 1H), 4.84 (d, /= 4.7 Hz, 1H); 4.19-4.08 (m, 4H)， 3.87 (dd, /= 7.6,4.5 Hz, 1H), 3.59 (br. 4 J= 9.2 Hz,lH), 3.33 ( br，d， /= 10.5 Hz, 1H),3.n (br. d， /= 4.5 Hz, 2H), 2.12-2.06 (m， 2H)， 1.56-1.25 (m, 72H), 1.40 (s, 3H), 1.31 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.19 (s, 3H), 1.05 (s, 9H), 0.89 (t， J = 6.7 Hz, 6H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S J70.4> 139.5-127,1 (邁),109.1， 108.1' 80.3, 77.6, 77.1, 75.7, 72.6, 71.7, 65.2, 58.9,.31.—8, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 28.0, 26.9, 2^.6, 26.5, 26.3, 25,5, 22.6, 20.6, 14.0. MALDI-MS (正性 模式，DHB):ra/z 1217.7 [M + Na]+. C76Hi27N07Si (1194. 90):計算值 C, 76.39; H， 10.71;N,. 1.17.實測值C, 76.45; H, 10.81; N, 1.21,(d將THF中的上述(c )的產(chǎn)物(200 mg, 0.169 mmol )與1.0M TBAF (0.2 ml， 0.203 mmol)溶液在室溫下攪拌24小時。然后將反應(yīng)混合物置 于乙酸乙酯中，以水洗滌，然后以飽和鹽水溶液洗滌，然后以無水MgS04 干燥并濃縮。通過快速層析將殘留物純化以得到無色固體HN ,0'C14H:■29= OH, R2 = H(132mg,產(chǎn)率82%)。 Wf = 0.42(4:6，乙酸乙酯:石油醚),[a]- - + 6.7 (c 0,5， CHC13). 'H NMR (250 MHz, CDC13): S 7.41-7.32 (m, 5H), 5.68 (d, >/= 9.0 Hz, 1H), 4.87 (d， /= 5.5 Hz, 1H), 4.32-3.96 5H), 3.60 (dd> J= 10.0， 3.8 Hz, 1H), 3.39 (d4 10.0, 2.5 Hz, 1H), 3.24 (dd, J= 10.5, 5.5 Hz, 1H), 3.14 (dd 10.5' 4.0 Hz, 1H), 2.12 (dt, /= 7.5， 3.5 Hz, 2H), 1.54-1.25 (m, 72H), 1.43 (s, 3H); 1,41 (s' 3H),1.38 (s' 3H), U3 (s, 3印，0.88 (t, J = 6,7 Hz)， 6H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 172.5， 139.5, 128.3， 127.8, 126.1, 109.3， 107.9， 81.0, 77.6, 76.1, 73.0, 72.1, 71.2， 48.1， 36-9, 31.9， 29.6, 29.5, 29.3, 29.0' 27.05， 27.01， 26.4, 25.7, 22.6, 14.1. MALDI-MS (正性模式，CHCA): rn/z 979.4 [M + Naf. Q0H109NO7 (956.51) 計算值 c, 75.34; H, 11.49; N, 1.46.實測值:C， 75.40; H, 11.55; N， 1.51(e)使用上述(d)的產(chǎn)物，重復(fù)上述l (c)的操作，以68%的產(chǎn) 率得到無色固體以下稱為化一^物14 ( "4-(S)-苯基蘇糖醇神經(jīng)酰胺")。、H NMR (600 MHz, C5D5N): S 8.52 (d, 8.5 Hz, 1H), 7.79-7.27 (m， 5H), 5.39 (4 /- 7.8 Hz, 1H), 5.:i 8-4.94 (m， 1H), 4.93-4.91 (m， 1H), 4.30-4.19 (m， 5H), 4.12-4.08 (m, 2H), 2.41 (寬峰,t, /= 7.5 Hz, 2H)，1.92-1.25 (m, 72H), 0.87 (t， 6.5 Hz, 6H).13C NMR (150.9 MHz, C5D5N): S 173.3, 114.4, 128.3, 128.1， 127.2, 76.2， 75.4， 75.2， 74.6， 72S， 71.3, 70.0, 51.8, 36.8, 32.1， 30.3, 30.0， 29.7， 29.6, 26.6， 26.4， 22.9， 14.3. MALDIVES ( 正性模式，CHA):m/z 899.1 [M + Na]+. C54Hu)iN07 (876.38) 計算值 C, 74.01; H， 11.62; N， 1.60.實測值C， 73.98; H, 11.59; N， 1.62.化合物15: 4-(R)-苯基蘇糖醇神經(jīng)酖胺(a)使用上述14 (a)的產(chǎn)物(其中Ri-H, R2 = OTBDPS )如A = OH, R2 - Ph= H, R2 - OTBDP.S重復(fù)上述l (a)的操作，得到Rl - H, R2 = OTBDPS, 86%其通過快速層析(7:9.3，乙酸乙酯:石油醚)純化成無色液體，產(chǎn)率86%。 i f= 0.59 (1:9,乙酸乙酯:石油醚)。15.0(c 1.0， CHOb) HNMR (250 MHz, CDC13):5 7,76-7.14 (m，l5H), 4.82 (d, /= 6.5 Hz, 1H), 4.21-4.06 (m, 3H〉， 3.86 (dd, 9.5， 5.5 Hz, 1H), 3.87-3.68 (m, 3H), 3,51 (dt, /= 9.5， 2.2 ffis， 1H), 3,34 (dd, ■/= 10.0, 8.5 Hz, 1H), 1.58-1.25 (m, 26H)> 1.41 (s, 3H)， 1.36 (s, 3H)> 1.33 (s, 3H), 1.31 (s, 3H), 1.04 (s, 9H)， 0.87 (t, 6.7 Hz). 13C NMR (62.5 MHz, CDCb): S 139.5， 136.1, 135.9, 133.6, 133.3， 129.4, 129.3， 127.88, 127.80, 127.4,127.2,127,1,109.1, 108.1, 80.3, 77.7, 77.5， 77.1， 75.7,72.《71,7, 59.7, 31.8, 29.6, 29.5， 29.55, 29.50， 29.47, 29.41, 29,3,29.2， 28.0, 27.0, 26.6, 26.4, 26.3, 25.5， 25.4, 22,6, 19.3, 14.1. MALDI-MS (正性模式 ，CHCA): m/z 865.4 [M + Na〗+. C50H75N3O6Si (842. 23)計算值C, 71.30; H, 8.98;N, 4.99.實測值C， 71.42; H, 9.07;N, 5.04.(b)重復(fù)上述14 (b)的操作，但其中使用上述(a)的產(chǎn)物，得到將其通過快速層析(1:9，乙酸乙酯:石油醚)進行純化，以69%的產(chǎn)率 得到無色固體形式的純化合物。及f-0.49(l:9，乙酸乙酯:石油醚)7.77-7.18 (m, 15H), 5.88 (4 /- 9.0 Hz, 1H), 4.74 (d, J"= 6.5 Hz, 1H), 4.10-4.07 (m, 3H), 3.97 (dd, 8.0， 6.5 Hz, IH)， 3.77 (dt， J-'5,7, 2.2 Hz, 1H),3.55(寬峰，tU= 9.0 Hz, 1H), 3.27 (寬峰，d, J- 8.5 Hz, 1H); 3.00-2.97 (叫2H),2.16-2.08 (m, 2H), 1,58-1.25 (M, 72H): 1.39 (s, 33ti)7V3J〔s,':iHj;i.29 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (t， 《/= 6.5 Hz， 6H), 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 172.6， 139.6, 136.1, 135.9， 133.6， 133.2' 129.4, 127.9, 127.4,127.3, 127.2,109.2, 107.7, 80.6,77.7,77.1, 76.9,75.7, 72.0， 70.8, 49.4, 36.9, 31.9,- H. R2OTBDPS9 (c 1,0, CHCI3) H NMR (250 MHz, CDC^): S29.7, 29.5, 29.3， 29.2, 28.4, 27.0, 26.6， 26.4， 26.3, 25.5， 25.4, 22.6, 19.3， 14.1. MALDI-MS( 正性模式，DHB):io/z 1217.7 [M + Na]+ C76H127N07Si (1194. 90) 計算值 :C, 76.39; H, 10.71; N, 1.17.實測值C' 76.41; H 10.75; N, 1.22.(c)重復(fù)上述14 (c)的操作，但其中使用上述(b)的產(chǎn)物，得到0,R12，'C14H2gR"l - H, R2 - OH將其通過快速層析(3:7，乙酸乙酯/石油醚)進行純化，以85%的產(chǎn)率 得到無色固體形式的化合物。J f=0.40(4:6，乙酸乙酯:石油醚)。[《- - 3.1 (c 0.5, CHC13). 'H NMR (250 MHz, CDC13): S7.38-7.36 (m, 5H), 5.58 (d, /= 9.0 Hz, 1H), 4.(59 (d> /= 5.2 Hz， 1H), 4.13-3.91 (邁，5H)， 3.60 (dd, 9.7, 3.2 Hz, 1H), 3.33 (dd, 9.7, 2.5 Hz, 1H), 3.21 (dd, /= 10.5, 5.2 Hz， 1H), 3.10 (dd, /- 10.5, 3.5 Hz, 1H), 2.12 (dt, /- 7.5， 3.2 Hz' 2H), 1.58-1.24 (m, 72H)' 1.42 (s,啦，1.39 (s, 3H)， 1.31.(s, 3H), 0.87 (t， J= 6.5 Hz， 6H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): S 172.4, 139.6, 128.5, 128.3, 126.9, 109.9, 107.8, 81.9, 77.7, 77.2， 76,8, 75.9， 74,9, 71.7, 71.1， 48.1, 36.9, 31.9, 29.7, 29.5， 29.3， 28.9, 28.0， 27.3， 27.2, 26.4, 25.8, 25.7, 22.6,14.1. MAJLDI-MS (正性模式，CHCA_): m/z 979.5 [M + Naf. C6oH1(WN07 (956.51)汁算值 C, 75.34; H, 11.49; N, 1.46.實測值C, 75.43; H, 11.48; N, 1.44.(d)重復(fù)上述14 (d)的操作，但其中使用上述(c)的產(chǎn)物，以 60%產(chǎn)率而得到無色固體尺2 O、HO= Ph. R2 = OH以下稱為化合物15 ( "4-(R)-苯基蘇糖醇神經(jīng)耽胺")。'H NMR (600 MHz, CsD5N): S 8.46 (d> 8.5 Hz, 1H), 7.82-7.28 (;m, 5H), 5.46 (d, 5.4 Hz, 1H), 5.14-511 (m. 1H), 4.25-4.00 (叫8H), 2.38 (m, 2H), 1.88-1.25 (m, 72H), 0.86 (t, 6.5 Hz, 6H). 13C NMR (150.9 MHz,C5D5N): S 173.3, 144.4,128.4, 127.7,127.3, 76.6, 76.2, 75.3, 74.4, 72.7， 71.2， 71.0， 51.7， 36.8, 33.8, 32.1, 30,3, 30.1, 30.0， 29.8, 29.7, 29.6, 26.6, 26.3， 22.9, 14.2. MALDI-MS (正性模式 ，CHCA): m/z 899.5 [M + Na]+, C54Hl01NO7 (876.38) 計算值 C, 74.01; H, 11.62; N, 1.60.實測值C, 74.05; H, 11.68; N, 1.65.化合物16: 4-(5)-苯基蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酰胺(a)使用22-(Z)-二十六酸與上述9 (b)的產(chǎn)物如<formula>formula see original document page 71</formula>R = OTBDPS, R2 = H重復(fù)上述i (b)的^Mt，得到 Rl - OTBDPS, R2 = H其通過快速層析(5:9.5,乙酸乙酯:甲苯)純化成無色固體，產(chǎn)率72%。 A = 0.53 (5:9.5,乙酸乙酯:甲苯)。- +24.6(c 1.0, CHC13)。NMR (250 MHz, CDCI3): 5 7.70-7.15 (ra, 15H), 5.65 (d, /= 8.5 Hz, 1H), 5.36-5.31 (m, 2H), 4.83 (4 /= 4.5 Hz, 1H), 4.17-4.06 4H), 3.84 (dd, 7.5,4.5 Hz, 1H), 3.58諷/= 9.2, 2.2 Hz, IH)， 3.38 (dd, 9.7， 2.1 Hz, 1H), 3.16 (br， d， 4.5 Hz, 2H), 2.13-1.94 (m, 6H), 1.61-1.17 (m， 76H), 1.04 (s, 9H), 0.91-0.83 (邁，6H). I3C NMR (62.5 MHz, CDCl3): S 172.2, 140.3-127.0 (m, 17C), 109.2, 107.6, 81.5, 77.7， 76,8,75.8, 75.6, 73.0， 70.9， 60.2, 48.1, 3<5,8， 31.8, 29.7, 29,6, 29.5， 29.4, 29.35， 29.31, 29.2，28.9, 28.0， 27.15, 27.11, 27.0, 26.8， 26.4， 25,7， 25.6, 22.8， 22.(5, 14.1, 13.8. MALDI-MS (正性模式 ，DHB):myz 1214.3 [M + Naf.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物，重復(fù)上述14 (c)的^Ht,并通過快速 層析(4:6，乙酸乙酯:石油醚)進行純化，得到無色固體<formula>formula see original document page 72</formula>(產(chǎn)率98%)。 i f=0.31(3:7，乙酸乙酯:石油醚)。["E=+".9 (cl.0,CHCl3)<formula>formula see original document page 72</formula>正性模式，DHB):m/z 976.7 [M + Naf.(c)使用上述(b)的產(chǎn)物，重復(fù)上述14 (d)的過程，以得到無色(產(chǎn)率67%)，以下稱為化合物16( "4-(S)-苯基蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酖胺")。<formula>formula see original document page 72</formula>(正性模式 ，DHB): m/z 897.1 [M +.Na]+. C54H99N07 (873.74) 計算值 C, 74.18; H， 11.41; N， 1.60.實測值C, 74.16; H, 11.49; N,l應(yīng)'H NMR (250 MHz, CDCb): S 7.40-7.26 (m, 5H), 5.66 (4 J= 9.0固體<formula>formula see original document page 72</formula>化合物17: 4-(及)-苯基蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酰胺(a)使用22-(Z)-二十六酸和上述15 (b)的產(chǎn)物如N3 ,QR) = H. R2 = OTBDPS重復(fù)l (b)的操作，得到Flj - H. R2 - OTBDPS其通過快速層析(5:9.5,乙酸乙酯:甲苯)純化成無色固體(產(chǎn)率75%)。 i f= 0.57 (5:9.5，乙酸乙酯:甲苯)?！?E - -6. o (c 1.0, CHC13)。IH)， 5.40-5.33 (m, 2H), 4.72 (4 6.5 Hz, 1H), 4.12-4.00 (m, 3H), 3.93 (dd, /= 8.0， 6.5 Hz, 1H), 3.79-3.72 (m, 1H), 3.53 (bi'. 4 /- 9.5 Hz, 1H)丄24(寬峰，i, 9.5 Hz, 1H), 3.02-2.91 (in, 2H), 2.16-1.96 (m, 6H), 1.60-1.25 (m, 76H), 1.04 (s， 9H), 0.92-0.85 (m, 6H). 13CNMR (62.5 MHz, CDCI3): S 172.3, 139.6-127.2 (邁，17C)' 109.1, 107.7, 80.~ 77.7, 77.1,76.9, 75,7, 72.1, 70.8, 36.9, 31.9, 29.74, 29.70 29.6, 29.5, 29,39， 29.35， 29.30， 29.2， 29.0,28.0, 27.2, 26.9, 26.7， 26.4， 25.8, 25.7, 22.8， 22.6,14,1, 13.7. MALDI-MS(正性模式 ，DHB):m/zl214:4 pyI + ^^a]+(b) 使用上述 (a) 的產(chǎn)物，重復(fù)15 (c)的操作，并通過快速層析 (4:6，乙酸乙酯:石油醚)進行純化，得到無色固體的純(產(chǎn)率98%)。 i2f=0.32(3:7，乙酸乙酯:石油醚)。["S - ". 5 (",O,CHa)。H NMR (250 MHz, CDC13): 5 7.75-7.18 (ra, 15H), 5.68 (d, 8.0 Hz,Rl = H， R2 = OHS 7.39-7.30 (m， 5H)， 5,56 (d, 9.2Hz， 1H), 5.37-5.32 (m> 2H), 4.68 (t'4,5 Hz, iH)， 4.13-3.94 (邁，5H)， 3.59 (dd， 9.5,3.5 Hz, 1H), 3.32 (dd，9.5, 3.5 Hz, IH)， 3.20 (dd， 10.5, 5.2 Hz, 1H), 3.10 (dd, / = 10.2, 3.8 Hz, 1H), 2.92 (d, /= 4.5 Hz, lH), 2.11 (dt, 10.5, 7.5, 3-5 Hz, 2H)， 2.03-1.95(m, 4H)， 1.60-1.24 (m, 7(5H)， 0.9I-0.S4 (m, 6H). I3C NMR (62.5 MHz， CDC13): S 172.3,139.6， 130.0, 129.5, 128.4, 126.9, 109.8, 107.7， 81.8, 77.6, 76.7, 75.8, 74.9, 71.7, 71.1,48.0, 36.8， 31,8, 29.7, 29.眠29.60, 29.5, 29 38, 29.32, 29.28, 29.27, 29.24, 28.9, 27.9,27.29， 27.22, 27.1, 26.4, 25.7, 25.6, 22.8, 22.6, 14.0, 13.7. MALDI-MS (正性模式 ，DHB): m/z 976.6 [M + Na]+.(c)使用上述(b)的產(chǎn)物，重復(fù)15 (d)的IMt，得到無色固體HOR1=:ph.R2 = OH(產(chǎn)率63% )，以下稱為化合物17( "4-(及)-苯基蘇糖醇-22-(Z)-神經(jīng)酰胺")。'HNMR (250MHz' C5D51SD: S 8.42 (d， /= 8.7 Hz, 1H), 7.73-7.16 (m, 5H), 5.38-5:30 (m, 3H), 5.05-5.00 (m'jH); 4.19-3.98 (取7H), 3.92-3.86(m, 1H)，2.28( br. t, / = 7.5 Hz, 2H), 1.98-1.87 (m， 4H), 1.8(M.65 (m， 4H), I.17-I.12 60H), 0.78-0.71 (m, 6H). MALDI-MS (正性模式 ，DHB): m/z 897.4 [M + Na]+. C54H99N07 (873.74)計算值:C, 74. i8; H, 11.41; N, 1.60.實測值:C, 74.11; H, 11.5i; N,' 1加.合成(19Z，22Z)-二十六碳二烯酸(a)由ll-溴代十一酸開始，重復(fù)上述"合成22-(Z)-二十六酸"操 作的步驟(a)，以得到o(產(chǎn)率97%)，'H NMR (250 MHz, CDC13): S 4.58 & 3.2 Hz, 1H), 3.92-3.83 (m, 1H), 3.78-3.72 (m， 1H), 3.65 (s， 3H), 3.52-3.46 (in, IH)， 3.42-3.36 (m， IH)， 2.30 (t'/= 7.5 Hz, 2H), 1.88-1.15 (m, 10 H)，i.25( br-S， 28H).i3C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 174.2, 98.7, 67.6, 62_2, 51.3, 34.0, 30.7, 29.7, 29.63, 29.60, 29.5, 29.45, 29.40, 29.2, 29.1, 26.2, 25.4, 24.9,19.6. MMDI-MS (正性模式，CHCA): m/z 436,1 [M十Naf.(b )對上述(a)重復(fù)上述"合成M-(Z)-二十六酸"操作的步驟(b )，得到o產(chǎn)率98%，i，'H NMR (250 MHz, CDC13): S 3.67 (s, 3H), 3.63 (t， /- 6.5 Hz， 2H), 2.30 (t， 7.5 Hz， 1H), 1.64-1.51 (in, 4H),1.25( br. s， 26H).I3C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 174.3， 63.0， 51.4， 34,0, 32.7， 29,63， 29.60,29.5, 2S>,58, 29.56, 29.4,29.2， 29.1， 25.7， 24.9. MALDI-MS (正性模式，CHCA): m/z 351.9 [M + Naf.(c)對上述(b )重復(fù)上述"合成M-(Z)-二十六酸"操作的步驟(c )，得到o o .產(chǎn)率卯％，lHNMR (250 MHz, CDC13): S 9.76 (s, 1H), 3.66 (s， 3H)， 2.39 (dt, 14.0， 7.5, 2.0 Hz, 2H)' 2.2S (t, 7.5 Hz, 2H), i.66-1.56 (m， 4H),L25 (寬峰's, 26H).13C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 202.(5, 173.4, 50.7， 43.4, 33.5' 29,29, 29.23, 29.08， 29.01, 28.9, 28.79,28.76, 24.5, 21.6. BSI-MS (正性模式)(326.2): 349.3 [M + Na〗+ .(d )對上述(c)重復(fù)上述"合成22-(Z)-二十六酸"操作的步驟(d )，得到產(chǎn)率98%，'HNMR (250 MHz, CDC13): 5 5.37-5.34 (m'鄰，3.6<S (s, 3H), 2.78 (t, /= 6.2 Hz, 2H), 2.30 (t, 7.5 Hz, 2H), 2.08-1.99 (m, 4H), 1.64^1.58 (ni, 21^), 1.42-1.25 (m 30H), 0.91 (t^ /= 7.5 Hz， 3H). I3C NMR (62.5 MHz, CDCb): S 174rl, 130.0， 129.7， 128.0, 127.8, 51.2， 34.0, 29.64, 29,60, 29.55, 29.51, 29.4， 29.27, 29.22, 29.1, 27.1， 25.5, 24,8, 22.7, 13.7.(e)將THF U0mL)中的上述(d)產(chǎn)物(1.23 g，3.022 mmol)與 2N氫氧化4f (12mL)加熱至回流8小時，并以2N鹽酸( pHl-2)酸 化。以乙醚萃取(2x30mL)，干燥，濃縮以得到無色固體，將所述無色 固體從水乙酸中重結(jié)晶，得到無色晶體(產(chǎn)率52%)，將母液濃縮并通過 快速層析純化以得到無色晶體的(19Z，22Z)-二十六碳二烯酸CDC13): 5 5.37-3.32 (叫4H), 2.76 (t, >/- 6.2 Hz, 2H)， 2.33 (t, 7.5 Hz， 2H)， 2.06-1.98 (m, 4H), 1.67-1.55 (m, 2H)， 1.32-1.23 (m, 30H), 0.90 (t, 7.5 Hz, 3H). I3C NMR (62.5 MHz' CDC13): S 180.1， 130.1, 129.8， 128.1, 127. S>, 34.0, 29.6, 29.59, 29.55, 29.4, 29.3, 29.2,29.0,27.2， 25.6, 24.<5,22.8， 13.8, ESI-MS (負性模式)(392.3): 391.4 [M - H]' 化合物18:蘇糖醇-(19Z，22Z)-神經(jīng)跣胺(a)使用(19Z，22Z)-二十六碳二烯酸和3 (b)的產(chǎn)物如(產(chǎn)率71%),其在靜置時凝固。R產(chǎn)0.24(3:7，乙酸乙酯:石油醚)。(產(chǎn)率42%)，HmiR(250MHz:重復(fù)上述l (b)的操作，得到無色液體[《=+ 13.6 (c 1.0' CHC13). 'I! NMR (250 MHz, CDCI3): &5.73 (d， /-= 9.5 Hz, 1H), 5.43-5.33 (m, 4H)， 4.24-4.15 (m， 1H), 4.08-3.99 (邁，3H), 3.92-3.86 (m, 1H), 3.80-3.65 (m, 5H), 3.60-3.54 (m, 2H), 2.77 (t, ■/= 6.2 Hz, 2H), 2.14 (dt, J=10.5, 7,5， 3.0 Hz, 2H), 2.07-1.99 (na， 4H), 1.61-1.24 (m, 74H), 0.93-0.84 (m, 6H). 13C NMR (62.5 MHz, CDC13): 5 172.5， 130.0, 129.7, 128.0， 127.8, 109.2, 107.9, 79.1, 77.6，76.6, 7(5.1, 71.8' 71.6, 62.3, 48.1, 36.8, 31.8' 29.6, 29.5， 29.4, 29.36， 29.30, 29.26, 29.21, 28.9, 27.8, 27.1， 26,9, 26.4, 25.67, 25.63, 25.5, 22.7， 22.6, 14.0， 13.7. MALDI-MS (正性模式，DHB):m/z899.1[M + Naf.(b)使用上述(a)的產(chǎn)物，進行上述l (c)的操作，得到無色固<formula>formula see original document page 77</formula>
(產(chǎn)率67%),以下稱為化合物18 ("蘇糖醇-(19Z,MZ)-神經(jīng)酰胺")。& :NMR (250 MHz, C5D5N): 5 8.65 (d, /= 8.5 Hz， 1H), 5.66-5.55 (m,4H), 5.30-5.24 (m, IH)， 4.63-4.45 (m, IH)， 4.42-4.32 (m, 9H), 4.18 (d， 5.5 Hz, 2H), 3.01 (t, /= 6.2 Hz, 2H), 2.54 (t, 7.5 Hz, 2H), 2.28-2.]4 (m, 4H), 2.03-1.87 (m， 4H), 1.48-1.3(5 (m, 58H), 1.02-0.97 (m, 6H). MALM-MS (正性模式，Matrix CHCA): m/z 819.8 [M + Na]+
權(quán)利要求
1.式I化合物及其可藥用鹽，其中，R1代表適于占據(jù)人CD1d的C’通道的疏水性部分，R2代表適于占據(jù)人CD1d的A’通道的疏水性部分，從而同人CD1d結(jié)合時，與α-半乳糖神經(jīng)酰胺的鞘氨醇鏈的末端nC14H29所占據(jù)的體積相比，R1充滿C’通道被占據(jù)體積的至少30％；同人CD1d結(jié)合時，與α-半乳糖神經(jīng)酰胺的?；湹哪┒薾C25H51所占據(jù)的體積相比，R2充滿A’通道被占據(jù)體積的至少30％；R3代表氫或OH，Ra和Rb各自代表氫，此外，當(dāng)R3代表氫時，Ra和Rb可一起形成單鍵，X代表-CHA(CHOH)nY或-P(＝O)(O-)OCH2(CHOH)mY，其中Y代表CHB1B2，n代表1至4的整數(shù)，m代表0或1，A代表氫，B1和B2之一代表H、OH或苯基，另一個代表氫；或者B1和B2之一代表羥基，另一個代表苯基；此外，當(dāng)n代表4時，則A與B1和B2之一一起形成單鍵，并且B1和B2中的另一個代表H、OH或OSO3H。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1充滿權(quán)利要求1所定義的C，通 道被占據(jù)體積的至少35%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其中112充滿權(quán)利要求1 所定義A，通道被占據(jù)體積的至少40%。y一xlo
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中RM化鏈中含有5至 14個碳原子的飽和或不飽和直鏈徑鏈。
5. 根據(jù)前*利要求中任一項的化合物，其中W代表鏈中含有11至 14個碳原子的飽和或不飽和直鏈烴鏈。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中W代表鏈中含有8至 25個碳原子的飽和或不飽和直鏈烴鏈。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中W或I^中的一個或兩 個包含一個或多個雙鍵。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求7中任一項的化合物，其中W或R2中的一個或 兩個包含一個、兩個或三個雙鍵。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中任一項的化合物，其中所述雙鍵為 順式(Z)。
10. 根據(jù)前iU3l利要求中任一項的化合物，其中X代表 CHA(CHOH)nCHB!B2。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中X代表 CH2(CHOH)nCHBA。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中n代表l、 2或3,
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中W代表氫。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中Ra和Rb均代表氫。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中Bi和B2之一代表氫， 另 一個^表鞋基。
16. 用作藥物的根據(jù)前a利要求中任一項的化合物。
17. 為哺乳動物受試者提，對病毒、微生物感染、寄生蟲、自身免疫 病、癌癥、變態(tài)反應(yīng)或哞喘的保護或治療的方法，包括對所述受試者施用 藥物有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項的化合物，其中所述化合物具 有對抗或治療這樣的病毒、微生物感染、寄生蟲、自身免疫病、癌癥、變 態(tài)反應(yīng)或孝喘的藥物活性。
18. —種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項的化合物 以及與^目混合的可藥用賦形劑、栽體或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了式I化合物及其可藥用鹽，其中R₁代表適于占據(jù)人CDId的C’通道的疏水性部分，R₂代表適于占據(jù)人CDId的A’通道的疏水性部分，從而與α-半乳糖神經(jīng)酰胺的鞘氨醇鏈的末端nC₁₄H₂₉所占據(jù)的體積相比，R₁在與人CDId結(jié)合時充滿C’通道所占據(jù)體積的至少30％；與α-半乳糖神經(jīng)酰胺的?；湹哪┒薾C₂₅H₅₁所占據(jù)的體積相比，R₂在與人CDId結(jié)合時充滿A’通道所占據(jù)體積的至少30％；R³代表氫或OH，R^a和R^b各自代表氫，此外，當(dāng)R³代表氫時，R^a和R^b可一起形成單鍵，X代表-CHA(CHOH)_nY或-P(＝O)(O-)OCH₂(CHOH)_mY，其中Y代表CHB₁B₂，n代表1～4的整數(shù)，m代表0或1，A代表氫，B₁和B₂之一代表H、OH或苯基，另一個代表氫；或者B₁和B₂之一代表羥基，另一個代表苯基；此外，當(dāng)n代表4時，則A與B₁和B₂之一一起形成單鍵，并且B₁和B₂中的另一個代表H、OH或OSO₃H。式I化合物適用于治療病毒、微生物感染、寄生蟲、自身免疫病、癌癥、變態(tài)反應(yīng)或哮喘。
文檔編號A61K31/70GK101331146SQ200680047094
公開日2008年12月24日 申請日期2006年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日
發(fā)明者喬納森·西爾克, 倫加拉揚·巴拉穆魯甘, 居爾戴爾·貝斯拉, 戈帕爾·雷迪, 格爾德·里特, 溫琴佐·塞倫多洛, 理查德·施密特, 馬里奧利納·薩略 申請人:路德維格癌癥研究院