專利名稱：一種哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒和檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及一種用于在臨床檢驗、公共衛(wèi)生、食品檢查中檢測致病性哈氏弧菌(Vibrio harveyi,VH.)的多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
哈氏弧菌(V. Harveyi)又稱哈維氏弧菌，是一種革蘭氏陰性細菌，兼性厭氧，呼吸和發(fā)酵代謝，具有發(fā)光特性。該菌廣泛分布于海洋環(huán)境及海洋生物中，能引起海水魚類及其它養(yǎng)殖動物發(fā)病，是世界上許多國家和地區(qū)養(yǎng)殖對蝦和魚類的致病菌，也是中國海產(chǎn)經(jīng)濟魚類弧菌病的主要病原菌之一，該致病菌給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

弧菌病一旦暴發(fā)便很難控制，常規(guī)的檢測哈氏弧菌的方法費時費力，要經(jīng)過菌株的擴增、選擇性培養(yǎng)、理化鑒定和血清學反應等一系列復雜的過程，操作十分繁瑣，而且檢出率不高，不利于及時準確診斷哈氏弧菌病。為了彌補哈氏弧菌常規(guī)檢測方法的不足，有必要建立一種高效、快速、簡便的檢測技術(shù)。目前報道的弧菌檢測方法主要有免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法，但是采用這些方法需要有昂貴的儀器設備，而且ELISA法還需要制備特異性抗血清，不易于普及應用。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和哈氏弧菌全基因組序列測定的完成，人們對哈氏弧菌的毒力基因和致病機制有了更加深入細致的了解，為從分子水平上鑒定哈氏弧菌和確定菌株的毒力提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。目前已經(jīng)報道的用于檢測、鑒定哈氏血弧菌的方法有很多，大多是用PCR(聚合酶鏈式反應)技術(shù)，擴增哈氏弧菌的一段保守基因或一種特征性毒力基因，如根據(jù)哈氏弧菌溶血素基因vhh、外膜蛋白OmpK基因以及絲氨酸蛋白酶Serine protease基因的基因序列的特異性，設計相關的特異性較高的引物序列，對其進行PCR檢測。但是，在哈氏弧菌的致病性檢測方面，這些方法的缺陷在于檢測內(nèi)容過于單一，不能全面反應菌株的潛在致病力?，F(xiàn)有研究認為與哈氏弧菌致病力相關的主要毒力因子有溶血素vhh;蛋白酶類，包括外膜蛋白OmpK和OmpU,絲氨酸蛋白酶Serine protease,金屬蛋白酶vhpA等。自然情況下，絕大多數(shù)哈氏弧菌屬于水產(chǎn)動物體內(nèi)和體表的正常菌群，只有極少數(shù)帶有特定毒力基因的菌株才具有致病性，然而，由于毒力基因種類的多樣性、分布的差異性，不同的致病菌株往往攜帶不同種的毒力基因。因此，在做致病性評估時，如何更快速準確對哈氏弧菌(V. Harveyi)的致病性進行評估是急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種更為快速準確的評價哈氏弧菌(V. Harveyi)致病性的哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒。本發(fā)明的哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，包括PCR反應試劑，多基因PCR引物和GeXP多重擴增反應試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括12對多基因PCR引物和一對通用引物，具體為為毒力基因hlyA (Genebank登錄號⑶230682. I)設計的引物，擴增的片段大小約為147bp hIyA-F 5，-AGGTGACACTATAGAATATAGATGATGACAGCACGGGA-3’hIyA-B :5，-GTACGACTCACTATAGGGAGGTTGACCACTCACGGAAAT-3，；為毒力基因Serine (Genebank登錄號NC_009783. I)設計的引物，擴增的片段大小約為157bp Serine-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATACAGAGCAAGTGAAAGATGCG-3’

Serine-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACTGCACGACCAGTTGCTTTA-3’ ；為毒力基因toxR (Genebank登錄號⑶230678. I)設計的引物，擴增的片段大小約為167bp toxR-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATATTTGCATGACTTTGTTTGGC-3’toxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACGGAACCGTTTTGACGTATT-3’ ；為毒力基因chiA (Genebank登錄號U81496. I)設計的引物，擴增的片段大小約為 177bp chiA-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATATGCTCAAAACAACGATGAGC-3’chiA-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTGCTGCTGCGTCAATACTC-3’ ；為毒力基因tdh (Genebank登錄號NC_009784. I)設計的引物，擴增的片段大小約為187bp tdh-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATACGACCTAGTAGGCGAAGACG-3’tdh-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGTTACGCCCATCTTACGAGC-3’ ；為毒力基因ompk (Genebank登錄號DQ279075. I)設計的引物，擴增的片段大小約為197bp ompk-F:5， -AGGTGACACTATAGAATACAGCTCCTGTAATGGCTGCT-3，ompk-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATCGAAGATACCAGAGCGACC-3’ ；為毒力基因vhpA (Genebank登錄號ΑΥ630354· I)設計的引物，擴增的片段大小約為207bp vhpA-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’vhpA-B :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’ ；為毒力基因vhh (Genebank登錄號JN033878. I)設計的引物，擴增的片段大小約為 217bp vhh-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATAGAATGGGCAGAAAATCCAGA-3， vhh-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGAGTTATCGGCTGCAAAGAAGG-3，；為毒力基因flaC (Genebank登錄號EU240947. I)設計的引物，擴增的片段大小約為227bp flaC-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAAACCTAGCAGACGAGATCGG-3，flaC-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATGTCTAGGTTGCTGATTGCG-3’ ；為毒力基因ompU (Genebank登錄號JF439662. I)設計的引物，擴增的片段大小約為237bp ompU-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATAGCGTTTTCGCTTACCG-3’ompU-B :5，-GTACGACTCACTATAGGGAGCGATACCACCAAGGATTTG-3，；為毒力基因VHML (Genebank登錄號NC_004456. I)設計的引物，擴增的片段大小約為247bp VHML-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAATATGCAAAGCACGCACTTG-3’VHML-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTCGATACCCGAGAAATCCA-3’ ；為毒力基因IuxR (Genebank登錄號DQ108980. I)設計的引物，擴增的片段大小約為259bp

IuxR-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGTTTGGTTCGAGTGGAGTGC-3’IuxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATAGCTCGGCTTCGCTCTTAG-3’ ；通用引物對序列TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，。本發(fā)明的第二個目的是提供哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟提取哈氏弧菌的基因組DNA，以其作為模板，用上述12對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產(chǎn)物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對多重PCR反應產(chǎn)物進行檢測分析。如果能擴增到相應的PCR產(chǎn)物，則證明該哈氏弧菌具有相應的毒力基因。所述的以哈氏弧菌的基因組DNA作為模板，用上述12對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產(chǎn)物是以哈氏弧菌的基因組DNA作為模板，用上述12對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為O. 2-2 μ Μ,再加入通用引物對，終濃度為1-20 μ Μ,混合均勻為引物預混液,多重PCR反應體系和程序優(yōu)選為20 50μ L 的 PCR反應體系，包括10XPCR Buffer 2 5 μ L，IOmM dNTP I. 6 4 μ L，5M/μ L的 TaqE O. 2 O. 5 μ L,引物預混液 O. 2 O. 5 μ L,模板 DNA O. 8 2 μ L, ddH20 15 37. 5 μ L ;反應程序為94°C 3min ；94°C 30s、57 60°C 50 60s、72°C 100s，3 10 個循環(huán)；94 °C 30s、52 57。。50 60s、72。。100s, 15 25 個循環(huán)；72°C 7min。本發(fā)明針對已知12種哈氏弧菌(V.Harveyi)的毒力基因，設計特異性引物,利用本發(fā)明的檢測試劑盒，按照本發(fā)明的方法，可以通過單管反應，一次性快速、高效的檢測12種基因，而得知檢測出樣品中是否含有攜帶毒力基因、具有潛在致病能力的哈氏弧菌，其檢測覆蓋面廣，可大大提高哈氏弧菌(V.Harveyi)致病性評價的準確性，為哈氏弧菌(V. Harveyi)致病性評價提供了更為有效的檢測手段，在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢測、流行病學調(diào)查、食品中致病菌檢測、水產(chǎn)品進出口檢測及醫(yī)院感染監(jiān)控等方面有著重要的應用前景。


圖I是實施例I的檢測結(jié)果圖；圖2是實施例2的檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例I :(I)提取哈 氏弧菌基因組DNA首先對樣品中的哈氏弧菌進行純化分離。①在離心管中加入50 μ L 10% (w/v)無菌Chelex-100溶液；②從哈氏弧菌的培養(yǎng)平板上，挑取單菌落至上述Chelex-100溶液中；③將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩10s，沸水浴lOmin，冷卻至室溫，再充分震蕩IOs ；④13000r/min離心2min，上清液即為哈氏弧菌基因組DNA，置于_20°C冰箱備用。(2)多基因PCR引物的設計與合成為毒力基因hlyA設計的引物，擴增的片段大小約為147bp hIyA-F 5，-AGGTGACACTATAGAATATAGATGATGACAGCACGGGA-3’hiyA-B 5，-GTACGACTCACTATAGGGAGGTTGACCACTCACGGAAAT-3，；為毒力基因Serine設計的引物，擴增的片段大小約為157bp Serine-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATACAGAGCAAGTGAAAGATGCG-3’Serine-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACTGCACGACCAGTTGCTTTA-3’ ；為毒力基因toxR (Genebank登錄號⑶230678. I)設計的引物，擴增的片段大小約為167bp toxR-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATATTTGCATGACTTTGTTTGGC-3’toxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACGGAACCGTTTTGACGTATT-3’ ；為毒力基因chiA設計的引物，擴增的片段大小約為177bp chiA-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATATGCTCAAAACAACGATGAGC-3’chiA-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTGCTGCTGCGTCAATACTC-3’ ；為毒力基因tdh設計的引物，擴增的片段大小約為187bp tdh-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATACGACCTAGTAGGCGAAGACG-3’tdh-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGTTACGCCCATCTTACGAGC-3’ ；為毒力基因ompk設計的引物，擴增的片段大小約為197bp ompk-F:5， -AGGTGACACTATAGAATACAGCTCCTGTAATGGCTGCT-3，ompk-B :5，-GTACGACTCACTATAGGGATCGAAGATACCAGAGCGACC-3，；為毒力基因vhpA設計的引物，擴增的片段大小約為207bp vhpA-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’vhpA-B :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’ ；為毒力基因vhh設計的引物，擴增的片段大小約為217bp vhh-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATAGAATGGGCAGAAAATCCAGA-3，vhh-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGAGTTATCGGCTGCAAAGAAGG-3，；為毒力基因flaC設計的引物，擴增的片段大小約為227bp flaC-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAAACCTAGCAGACGAGATCGG-3，flaC-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATGTCTAGGTTGCTGATTGCG-3’ ；
為毒力基因ompU設計的引物，擴增的片段大小約為237bp ompU-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATAGCGTTTTCGCTTACCG-3’ompU-B 5，-GTACGACTCACTATAGGGAGCGATACCACCAAGGATTTG-3，；為毒力基因VHML設計的引物，擴增的片段大小約為247bp VHML-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAATATGCAAAGCACGCACTTG-3’VHML-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTCGATACCCGAGAAATCCA-3’ ；為毒力基因IuxR設計的引物，擴增的片段大小約為259bp IuxR-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGTTTGGTTCGAGTGGAGTGC-3’

IuxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATAGCTCGGCTTCGCTCTTAG-3’ ；通用引物對序列TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，。(3)多重 PCR 擴增(XP-PCR)以哈氏弧菌基因組DNA作為多重PCR反應的模板，用上述12對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為O. 2 μ M，再加入通用引物對，終濃度為I μ Μ，混合均勻為引物預混液，配制 25μ L 的 PCR 反應體系，包括10XPCR Buffer 2. 5 μ L, IOmM dNTP 2μ L,5M/μ L 的 TaqE O. 25 μ L，引物預混液 O. 25 μ L,模板 DNA I μ L, ddH2019 μ L。將反應物混勻后，放置在PCR儀中，按如下反應循環(huán)進行擴增
94 O3min
30s、
60 eC50s >- 3cycles
72V100s j
94V30s
STC50s L· 25 cycles
72V100s ^
IYC7mm得到XP-PCR的產(chǎn)物。(4)產(chǎn)物檢測利用貝克曼GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對XP-PCR的產(chǎn)物進行檢測分析，具體操作如下①GeXP 上樣
a,制備SLS/DSS混合液取DSS 400 (分子量內(nèi)標-400)，加入80倍體積SLS (上樣緩沖液，甲酰胺)，在渦旋震蕩器上震蕩30S或者用槍頭混勻10次備用；b,在每個樣本孔中加入40 μ I SLS/DSS混合液，再加入O. 01 μ I XP-PCR產(chǎn)物至GeXP樣品板(不要出現(xiàn)氣泡)，加一滴石蠟油覆蓋樣品；C，在緩沖液板與樣本板對應孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液；d,進入Set Mp程序，輸入樣品名，對每個樣本指定Freg-3分離方法,指定默認的GeXP分析方法，開始運行樣本。
②GeXP系統(tǒng)操作程序調(diào)整GeXP系統(tǒng)I’安裝毛細管和凝膠。2’將毛細管溫度調(diào)整至50° C。3’按照O. 4ml凝膠，重復3次模式執(zhí)行初級管路沖洗。4’執(zhí)行毛細管充膠，重復3次。5’執(zhí)行光路聚焦。6 ’監(jiān)控儀器基線，低于4000RF M。輸入樣本信息I’輸入樣本名。2’對每個樣本指定Freg-3分離方法,指定默認的GeXP分析方法。3’保存樣本信息。GeXP樣本分析I’使用蒸餾水清洗水槽。2’放入樣本板和緩沖液板。3’開始運行樣本。查看片段分析結(jié)果I’打開片段分析模塊；2’使用分析后結(jié)果(Analyzed Data)建立一個新的分析(St μ dy)。3’在片段列表(Fragments)窗口中設定過濾參數(shù),過濾非D4染料峰及其他非產(chǎn)物峰。4’確認現(xiàn)有分析結(jié)果正確。5’查看片段分析結(jié)果。6’對照標準圖譜可以判讀結(jié)果，每個峰代表一個基因，結(jié)果如圖I所示，圖I中具有12個峰,根據(jù)橫坐標size nt數(shù)值大小判斷基因，從左到右分別為hlyA 147bp, Serine157bp,toxR167bp,chiA 177bp,tdh 187bp,ompkl97bp,vhpA207bp,vhh 217bp,flaC227bp,ompU237bp, VHML 247bp, IuxR 259bp,由此表明樣品哈氏弧菌(V. Harveyi)含有這12個毒性因子，這個結(jié)果與本實施例的樣品哈氏弧菌(V.Harveyi)本來含有的毒性因子相同?？梢姳景l(fā)明所提供的方法能快速準確地檢測哈氏弧菌(V.Harveyi)的12種毒性因子，從而能快速準確的評價哈氏弧菌(V.Harveyi)的致病性。實施例2:(I)哈氏弧菌基因組DNA的制備
首先對樣品中的哈氏弧菌進行純化分離。①在離心管中加入90 μ L 10% (w/v)無菌Chelex-100溶液；②從哈氏弧菌的培養(yǎng)平板上，挑取單菌落至上述Chelex-100溶液中；③將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩15s，沸水浴8min，冷卻至室溫后再充分震蕩IOs ；④8000r/min離心20min，上清液即為哈氏弧菌基因組DNA，置于_20°C冰箱備用。(2)引物的設計與合成為毒力基因hlyA設計的引物，擴增的片段大小約為147bp

hIyA-F 5，-AGGTGACACTATAGAATATAGATGATGACAGCACGGGA-3 ’hiyA-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGGTTGACCACTCACGGAAAT-3’ ；為毒力基因Serine設計的引物，擴增的片段大小約為157bp Serine-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATACAGAGCAAGTGAAAGATGCG-3’Serine-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACTGCACGACCAGTTGCTTTA-3’ ；為毒力基因toxR (Genebank登錄號⑶230678. I)設計的引物，擴增的片段大小約為167bp toxR-F 5，-AGGTGACACTATAGAATATTTGCATGACTTTGTTTGGC-3，toxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACGGAACCGTTTTGACGTATT-3’ ；為毒力基因chiA設計的引物，擴增的片段大小約為177bp chiA-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATATGCTCAAAACAACGATGAGC-3’ch iA-B : 5 ’ -GTACGACTCACTATAGGGATTGCTGCTGCGTCAATACTC-3，；為毒力基因tdh設計的引物，擴增的片段大小約為187bp tdh-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATACGACCTAGTAGGCGAAGACG-3’tdh-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGTTACGCCCATCTTACGAGC-3’ ；為毒力基因ompk設計的引物，擴增的片段大小約為197bp ompk-F:5， -AGGTGACACTATAGAATACAGCTCCTGTAATGGCTGCT-3，ompk-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATCGAAGATACCAGAGCGACC-3’ ；為毒力基因vhpA設計的引物，擴增的片段大小約為207bp vhpA-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’vhpA-B :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’ ；為毒力基因vhh設計的引物，擴增的片段大小約為217bp vhh-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATAGAATGGGCAGAAAATCCAGA-3，vhh-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGAGTTATCGGCTGCAAAGAAGG-3，；為毒力基因flaC設計的引物，擴增的片段大小約為227bp flaC-F:5’ -AGGTGACACTATAGAATAAACCTAGCAGACGAGATCGG-3，flaC-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATGTCTAGGTTGCTGATTGCG-3’ ；為毒力基因ompU設計的引物，擴增的片段大小約為237bp ompU-F 5，-AGGTGACACTATAGAATAGATAGCGTTTTCGCTTACCG-3，ompU-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGCGATACCACCAAGGATTTG-3’ ；為毒力基因VHML設計的引物，擴增的片段大小約為247bp
VHML-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAATATGCAAAGCACGCACTTG-3’VHML-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTCGATACCCGAGAAATCCA-3’ ；為毒力基因IuxR設計的引物，擴增的片段大小約為259bp IuxR-F 5，-AGGTGACACTATAGAATAGTTTGGTTCGAGTGGAGTGC-3，IuxR-B :5，-GTACGACTCACTATAGGGATAGCTCGGCTTCGCTCTTAG-3，；通用引物對序列 TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，。(3)多重 PCR 擴增(XP-PCR)以哈氏弧菌基因組DNA作為多重PCR反應的模板，用上述12對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為2 μ M，再加入通用弓丨物對，終濃度為20 μ Μ，混合均勻為引物預混液，配制 25μ L 的 PCR 反應體系，包括10XPCR Buffer 2. 5 μ L, IOmM dNTP 2μ L,5M/μ L 的 TaqE O. 25 μ L，引物預混液 O. 25 μ L,模板 DNA I μ L, ddH2019 μ L。將反應物混勻后，放置在PCR儀中，按如下反應循環(huán)進行擴增
權(quán)利要求
1.一種哈氏弧菌(Vibrio harveyi)多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，包括PCR反應試劑，多基因PCR引物和GeXP多重擴增反應試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括12對多基因PCR引物和一對通用引物，具體為 為毒力基因hlyA設計的引物hIyA-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATATAGATGATGACAGCACGGGA-3，hIyA-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGGTTGACCACTCACGGAAAT-3’ ； 為毒力基因Serine設計的引物Serine-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATACAGAGCAAGTGAAAGATGCG-3，Serine-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACTGCACGACCAGTTGCTTTA-3’ ； 為毒力基因toxR設計的引物toxR-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATATTTGCATGACTTTGTTTGGC-3’toxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACGGAACCGTTTTGACGTATT-3’ ； 為毒力基因chiA設計的引物chiA-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATATGCTCAAAACAACGATGAGC-3’chiA-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTGCTGCTGCGTCAATACTC-3’ ； 為毒力基因tdh設計的引物tdh-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATACGACCTAGTAGGCGAAGACG-3，tdh-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGTTACGCCCATCTTACGAGC-3’ ； 為毒力基因ompk設計的引物ompk-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATACAGCTCCTGTAATGGCTGCT-3’ompk-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATCGAAGATACCAGAGCGACC-3’ ； 為毒力基因vhpA設計的引物vhpA-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3，vhpA-B :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATGGCTGGGATACCAAGAA-3’ ； 為毒力基因vhh設計的引物vhh-F:5， -AGGTGACACTATAGAATAGAATGGGCAGAAAATCCAGA-3，vhh-B:5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGTTATCGGCTGCAAAGAAGG-3’ ； 為毒力基因flaC設計的引物flaC-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAAACCTAGCAGACGAGATCGG-3，flaC-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATGTCTAGGTTGCTGATTGCG-3’ ； 為毒力基因ompU設計的引物ompU-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGATAGCGTTTTCGCTTACCG-3’ompU-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGAGCGATACCACCAAGGATTTG-3’ ； 為毒力基因VHML設計的引物VHML-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAATATGCAAAGCACGCACTTG-3’VHML-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATTCGATACCCGAGAAATCCA-3’ ； 為毒力基因IuxR設計的引物IuxR-F :5’ -AGGTGACACTATAGAATAGTTTGGTTCGAGTGGAGTGC-3’IuxR-B :5’ -GTACGACTCACTATAGGGATAGCTCGGCTTCGCTCTTAG-3’ ；通用引物對序列TY-F:5， -AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B:5， -GTACGACTCACTATAGGGA-3，。
2.一種哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟提取哈氏弧菌的基因組DNA，以其作為模板，用權(quán)利要求I所述的12對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產(chǎn)物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對多重PCR反應產(chǎn)物進行檢測分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，所述的以哈氏弧菌的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求I所述的12對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產(chǎn)物是以哈氏弧菌的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求I所述的12對多基因PCR引物等比例混合，每個引物終濃度為O. 2-2 μ Μ,再加入通用引物對，終濃度為1-20 μ Μ,混合均勻為引物預混液,多重PCR反應體系和程序為20 50μ L 的 PCR 反應體系，包括10XPCR Buffer 2 5 μ L，IOmM dNTP I. 6^4μ L,5M/μ L 的 TaqE O. 2 O. 5 μ L，引物預混液 O. 2 O. 5 μ L,模板 DNA O. 8 2 μ L, ddH20 15 37. 5 μ L ;反應程序為94°C 3min ；94°C 30s、57 60°C 50 60s、72°C 100s, 3^10 個循環(huán)；94 °C 30s、52 57。。50 60s、72。。100s，15 25 個循環(huán)；72°C 7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種哈氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒和檢測方法。它是先提取哈氏弧菌(V.Harveyi)的基因組DNA，以其作為模板用上述12對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產(chǎn)物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對其進行檢測分析。本發(fā)明針對已知12種哈氏弧菌的毒力基因設計特異性引物，通過單管反應，一次性快速高效的檢測12種基因而得知檢測出樣品中是否含有攜帶毒力基因、具有潛在致病能力的哈氏弧菌，其檢測覆蓋面廣，可大大提高哈氏弧菌致病性評價的準確性，為哈氏弧菌致病性評價提供了更為有效的檢測手段，在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢測、流行病學調(diào)查、食品中致病菌檢測、水產(chǎn)品進出口檢測及醫(yī)院感染監(jiān)控等方面有著重要的應用前景。
文檔編號C12Q1/04GK102787170SQ20121031391
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者任春華, 胡超群, 鄧益琴, 陳償, 高磊 申請人:中國科學院南海海洋研究所