專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8、重組表達(dá)載體和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及水稻葉綠體硫氧還蛋白基因還涉及該基因的重組表達(dá)載體和制備方法。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)廣泛地存在于生物界中，是一種低分子量 (12KD)、有還原雙硫鍵活力的蛋白質(zhì)。硫氧還蛋白都含有高度保守的活性位點(diǎn)，其保守的活性位點(diǎn)為T(mén)rp-Cys-Gly-Pro-Cys,保守活性位點(diǎn)中存在兩個(gè)還原性的Cys殘基。在還原態(tài)， 硫氧還蛋白具有促使目標(biāo)蛋白中_■硫鍵打開(kāi)的作用。植物體中的硫氧還蛋白最初是在葉綠體中發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是光合作用中一些關(guān)鍵酶的活化調(diào)節(jié)蛋白，后來(lái)在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中也發(fā)現(xiàn)了硫氧還蛋白，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上都有所差異。并且植物中包含很多硫氧還蛋白異構(gòu)體，并將這些異構(gòu)體分為不同的亞型，如h型、f■型、m型、c型等。其中，h型硫氧還蛋白被NADPH和NADPH-硫氧還蛋白還原酶所還原；f型和m型為葉綠體硫氧還蛋白，被鐵氧還蛋白依賴(lài)的系統(tǒng)所還原。葉綠體硫氧還蛋白主要調(diào)節(jié)光依賴(lài)酶，在光照條件下，硫氧還蛋白催化目標(biāo)蛋白二硫鍵的打開(kāi)并激活目標(biāo)蛋白；在黑暗條件下，硫氧還蛋白處于氧化態(tài)不具有活性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，水稻基因組中至少含有30個(gè)編碼硫氧還蛋白的基因，按其在染色體上的順序統(tǒng)一命名為OsTrxf 30，分為5個(gè)亞群分別為m型，h型，x型，f型和pdil型。 有報(bào)道稱(chēng)水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrX23，是一種冷脅迫誘導(dǎo)的蛋白，在體外對(duì)絲裂原活化蛋白激酶3 (0sMPK3)和絲裂原活化蛋白激酶6 (0sMPK6)具有負(fù)調(diào)控。水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx29是一種m型葉綠體硫氧還蛋白，利用RNAi抑制0sTrx29基因表達(dá)后，導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常，植株生長(zhǎng)延遲。水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx8屬于m型硫氧還蛋白，但其相關(guān)功能迄今為止尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的核苷酸序列；目的之二在于提供所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達(dá)載體，目的之三在于提供水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的重組表達(dá)載體的制備方法，為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS在水稻中的功能研究提供了有力的工具。I、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因( Ti-xS,所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8 的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。2、含有所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體為重組干擾表達(dá)載體flsT^^-RNAi，所述干擾重組表達(dá)載體是在pENTR/D-TOPO載體的克隆位點(diǎn)中插入水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8, U IOVO-OsTrxS載體，再將所得TOPO-GsT^rS載體與pANDA載體同源重組而得。3、所述重組表達(dá)載體的制備方法，具體步驟如下從水稻中克隆水稻葉綠體硫氧CN 102533810 A
還蛋白基因0sTrx8并連接pENTR/D-T0P0載體，得TOPO-GsT^rS載體，將所得TOPO-GsT^rS 載體與pANDA載體進(jìn)行同源重組，得重組干擾表達(dá)載體ttsT^^-RNAi。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一個(gè)水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS, 為研究水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的功能奠定了基礎(chǔ)，還構(gòu)建了含有水稻葉綠體硫氧還蛋白基因的重組表達(dá)載體，并且該載體為干擾重組表達(dá)載體，在植物細(xì)胞中能夠干擾水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的表達(dá)，因此可以通過(guò)水稻葉綠體硫氧還蛋白基因功能缺失觀察水稻表型的變化，從而得到水稻葉綠體硫氧還蛋白基因
基因在水稻中的功能；還公開(kāi)了水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達(dá)載體的制備方法，其制備方法簡(jiǎn)單，為研究0sTrx8基因在水稻中的功能提供了有力的工具。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖I為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8電泳圖2為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的時(shí)空差異表達(dá)圖。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例中使用的材料使用的水稻品種為水稻日本晴(Oryza Sativa L)由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶pfu、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、PMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、入-Hind III DNA Marker 及 DL2 000 DNA Marker 購(gòu)自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；氨節(jié)青霉素(Ampici 11 in, Amp)和卡拉霉素 (Kanamycin, Kan)為Sigma公司產(chǎn)品；引物合成和DNA測(cè)序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成；pENTR D-T0P0 克隆試劑盒(貨號(hào)為K2400_20)購(gòu)自Invitrogen公司；其它化學(xué)試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大腸桿菌JM109、農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)施例I、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的克隆
以水稻日本晴(fl Sativa L)為材料，取葉片少許，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照 Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。所得水稻葉片總RNA的電泳結(jié)果顯示主帶清晰完整，28S 和18S的條帶亮度比約為2:1，說(shuō)明RNA的濃度和純度符合實(shí)驗(yàn)要求，可以用于合成雙鏈 cDNA。以所得水稻葉片總RNA為模板，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)，使用Oligo (dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。在水稻基因組注釋項(xiàng)目(http://rice.plantbiology.msu.edu/ca/gene_ fams/5_8. shtml)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行假定功能搜索,搜索到43個(gè)與硫氧還蛋白相關(guān)的基因，選擇座位為L(zhǎng)0C_0s09g07570的基因，其描述為編碼具有催化能力的鐵硫氧還蛋白酶基因， 經(jīng)預(yù)測(cè)表明為葉綠體前體。我們把它命名為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS。根據(jù)Genbank中登陸的序列,利用Primer 5. 0和Oligo 6. 0軟件設(shè)計(jì)水稻葉綠體硫氧還蛋白基因 fefnS 特異引物，上游引物 0sTrx8Y :5’ -caccatggcggccttcacctcc-3’ (SEQ ID No. 2), 下劃線部分為接頭序列；下游引物 flsrnSR :5’- caacctccaaagcactctcaatct-3’(SEQ ID No. 3)。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNA為模板，采用水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS特異引物OsTrxS 和OsTrxl并用高保真DNA聚合酶pfu進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性30秒，60°C復(fù)性30秒，72°C延伸2分鐘，共32個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳顯示在500-600bp處有單一的特異性條帶，即水稻葉綠體硫氧還蛋白基因，結(jié)果如圖I所示。檢測(cè)后，按 DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行切膠回收純化；純化的DNA片段與pMD19-T載體在T4 DNA 連接酶作用下于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定片段大小后測(cè)序，得重組載體PMD19T-OsTrxS,菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司，測(cè)序驗(yàn)證片段準(zhǔn)確性。測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的水稻硫氧還蛋白基因0sTrx8為含有507個(gè)核苷酸，編碼169個(gè)氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID No. I 所示。實(shí)施例2、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的時(shí)空差異表達(dá)
分別取幼苗期根、幼苗期莖、幼苗期葉、分蘗期根、分蘗期莖、分蘗期葉和開(kāi)花期穗為材料，分別按照上述總RNA提取方法提取不同時(shí)期不同部位的總RNA，得幼苗期根RNA、幼苗期莖RNA、幼苗期葉RNA、分蘗期根RNA、分蘗期莖RNA、分蘗期葉RNA和開(kāi)花期穗RNA。分別以提取的總RNA為模，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)，使用Oligo (dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈 cDNA，所得第一鏈cDNA用于進(jìn)行半定量RT-PCR分析水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx8基因的時(shí)空差異表達(dá)。以水稻肌動(dòng)蛋白actin為內(nèi)參，上游引物為5’-aggaaggctggaagaggacc_3’ (SEQ ID No. 4),下游引物為 5，-cgggaattgtgagggacat-3，(SEQ ID No. 5),分別取等量的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性35秒，58°C 退火I分鐘，72°C延伸2分鐘，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)，再72°C后延伸7分鐘。取5 y L PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶亮度調(diào)整模板濃度，至各樣本在等量模板條件相同擴(kuò)增所得 actin的PCR產(chǎn)物量一致，此時(shí)的模板用于水稻硫氧還蛋白基因OsTrxS的時(shí)空差異達(dá)分析。 以調(diào)整模板濃度后的第一鏈cDNA為模板，上游引物如SEQ ID No. 2所示，下游引物如SEQ ID No. 3所示，PCR程序如下94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性45秒，59°C退火45秒，72°C延伸I分鐘，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，最后72°C后延伸7分鐘，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，如圖2所示。由圖2可知，actin擴(kuò)增結(jié)果顯示初始模板的拷貝數(shù)基本保持一致，水稻硫氧還蛋白基因OsTrxS擴(kuò)增結(jié)果顯示水稻硫氧還蛋白基因OsTrxS主要在幼苗期葉和分蘗期葉中表達(dá)，在幼苗期根、幼苗期莖、分蘗期根、分蘗期莖和開(kāi)花期穗組織基本不表達(dá)，這就表明0sTrx8基因在葉綠體功能上的發(fā)揮作用。實(shí)施例3、0sTrx8基因重組干擾載體的構(gòu)建
利用實(shí)施例I中PCR擴(kuò)增所得水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8與pENTR/D-T0P0 載體連接，得重組載體，命名為T(mén)OPO-Gs將所得重組載體TOPO-GsT^rS轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即TOPO-GsT^rS質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測(cè)定OD■和OD■的吸光值，計(jì)算重組質(zhì)粒TOPO-的拷貝數(shù)。取10 nglQ Q-0sTrx8 質(zhì)粒加入 10 y L Gateway 系統(tǒng)的 pANDA 載體，TOPO-fe質(zhì)粒與 pANDA 載體利用同源重組原理獲得重組表達(dá)載體，命名為&財(cái)i，獲得的重組表達(dá)載體為干擾重組表達(dá)載體。隨后將重組干擾載體0sTrx8-RNAi采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3103感受態(tài)細(xì)胞，得含重組干擾載體0sTrx8-RNAi的農(nóng)桿菌GV3103，命名為GV3103_tts， 然后于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br> 最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.水稻葉綠體硫氧還蛋白基因( 其特征在于所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因 OsTrxS的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.含有權(quán)利要求I所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為重組干擾表達(dá)載體AsT^rS-RNAi，所述重組干擾表達(dá)載體是在pENTR/D_T0P0載體的多克隆位點(diǎn)中插入水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8，得TOPO-GsT^rS載體，再將所得TOPO-GsT^rS載體與 pANDA載體同源重組而得。
4.權(quán)利要求2或3所述重組表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下從水稻中克隆水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8并連接pENTR/D-T0P0載體，得TOPO-GsT^rS載體，將所得TOPO-Gs載體與pANDA載體進(jìn)行同源重組，得重組表達(dá)載體ttsT^rS-RNAi。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，還公開(kāi)了水稻葉綠體硫氧還蛋白OsTrx8基因的重組表達(dá)載體及其重組表達(dá)載體的制備方法，其制備方法簡(jiǎn)單，為研究水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8在水稻中的功能提供了有力的工具。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102533810SQ20121004946
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者康振輝, 張?bào)憔? 王貴學(xué), 黃俊麗 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)