一種葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtPIC1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了煙草（Nicotianatabacumcv.SR-1）葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtPIC1及其編碼蛋白在葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。該基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；其對應(yīng)的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；它包含849bp的開放閱讀框，編碼282個(gè)氨基酸，預(yù)測的分子量為29.7kDa。其開放閱讀框核苷酸序列在GeneBank上的登錄號(hào)為KF640606。通過GFP融合蛋白細(xì)胞定位分析NtPIC1蛋白定位在葉綠體膜上。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明該基因在酵母中的表達(dá)可有效的轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子。本發(fā)明將所述基因NtPIC1導(dǎo)入到煙草中，獲得了葉綠體高鐵含量的轉(zhuǎn)基因煙草，研究結(jié)果表明NtPIC1基因參與葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)及葉綠體的發(fā)育過程。
【專利說明】-種葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICI及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICI的克隆及其在煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的 應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 鐵是植物正常生命活動(dòng)所必需的微量元素，位居植物必需微量元素的首位。鐵參 與多種生命活動(dòng)代謝過程，包括光合作用，呼吸作用，葉綠素合成，是亞鐵血紅素和鐵硫蛋 白的重要成分。鐵離子具有活躍的二價(jià)與三價(jià)的變化，是細(xì)胞內(nèi)電子傳遞鏈所必需的組分。
[0003] 盡管地殼中的鐵豐度很高，但土壤中可利用的Fe2+由于受土壤溶液pH值及氧分壓 的影響會(huì)形成不可溶的Fe 3+，從而限制了土壤中鐵的有效性，也限制了地球表面的大量金屬 鐵的可利用性。在許多國家的干旱、半干旱地區(qū)的石灰性土壤及鹽堿土壤上廣泛存在著植 物缺鐵問題。植物缺鐵失綠癥是一個(gè)世界性植物營養(yǎng)失調(diào)問題，也是植物營養(yǎng)學(xué)研究的熱 點(diǎn)之一。植物缺鐵會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成減少，光合速率降低，嚴(yán)重缺鐵時(shí)葉綠素合成停止，新 葉變黃，生物量大幅度下降。植物缺鐵不僅影響植物的生長發(fā)育，也造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 而且影響動(dòng)物和人類對鐵的獲取，從而導(dǎo)致許多缺鐵性疾病的發(fā)生。人類鐵營養(yǎng)的缺乏已 經(jīng)成為當(dāng)今世界最為嚴(yán)重的營養(yǎng)缺素癥之一。當(dāng)人體由于某種原因不能攝入足量的鐵營養(yǎng) 時(shí)，就會(huì)引起如Wilson、Pakinson、Menken及貧血病（anemia)等許多生理功能異常疾病，危 及患者智力和體能的發(fā)育及身體健康。
[0004] 在高等植物中葉綠體是光合作用的位點(diǎn)，提供生命所必需的氧和碳。葉綠體含有 葉肉細(xì)胞80%以上的鐵，而類囊體膜上含有葉子中的60%的鐵，葉綠體作為植物細(xì)胞中鐵含 量最豐富的系統(tǒng)，是金屬鐵離子主要的存在部位。因此，葉綠體中鐵的吸收及利用與植物的 生長和發(fā)育息息相關(guān)。第一個(gè)葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 PIC1首先在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，在其他物種 中未見報(bào)道。鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)在鐵代謝過程中起關(guān)鍵作用，對植物生長、發(fā)育和抗逆性具有重要 的意義。煙草（Nicotiana tabacum)作為世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，它的質(zhì)量和產(chǎn)量受到鐵的 嚴(yán)重影響。對于煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因的獲得與研究將為從基因工程培育高效鐵吸收品種 提供重要的理論基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一個(gè)煙草（Nicotiana tabacum cv. SR-1)葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICI及其在煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 本發(fā)明通過RT-PCR的方法從煙草中克隆得到了 NtPICI基因的全長cDNA，該基因的核 苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
[0007] 本發(fā)明所述的基因 NtPICI，其在GeneBank中的登錄號(hào)為KF640606。
[0008] 本發(fā)明提供的NtPICI基因結(jié)構(gòu)特性分析表明：NtPICI基因 cDNA全長為849bp，該 基因編碼282個(gè)氨基酸，蛋白分子量為29. 7kDa，NtPICI是疏水蛋白，含有基本的等電點(diǎn)，有 四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，包含70個(gè)氨基酸的葉綠體定位轉(zhuǎn)運(yùn)肽。經(jīng)Southern blot檢測該基因 在煙草中為單拷貝基因。將其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，發(fā)現(xiàn)與AtPICl (擬南芥， AY057510)相比，氨基酸同源性為60%。采用GFP融合蛋白細(xì)胞定位的方法，分析表明該基 因定位在葉綠體膜上。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明該基因在酵母中的表達(dá)可以有效的轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。
[0009] 將本發(fā)明的煙草NtPICl應(yīng)用于葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，具體為將含有本發(fā)明NtPICl基因 的植物表達(dá)載體導(dǎo)入到煙草中，培育篩選得到NtPICl過表達(dá)植株轉(zhuǎn)基因植物。
[0010] 具體步驟為：1)將煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl核苷酸序列置于CaMV35S啟動(dòng) 子之下，構(gòu)建植物表達(dá)載體；2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞；3)利用2)獲 得的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0011] 通過Real-time PCR方法對NtPICl在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。 結(jié)果顯示，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株中NtPICl的表達(dá)量顯著提高。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行葉 綠體鐵含量和葉綠素含量的測定，經(jīng)分析表明，轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比較，葉綠體鐵含量 和葉綠素含量顯著升高，葉片顏色呈明顯深綠色。并且通過葉綠體亞顯微觀察，NtPICl過 表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的葉綠體中類囊體膜堆疊更加密集且含有大量的淀粉粒，反應(yīng)了更強(qiáng)的光 合作用。綜上所述，本發(fā)明獲得的NtPICl是一個(gè)葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，位于葉綠體膜上，不僅 對鐵在葉綠體中的轉(zhuǎn)運(yùn)及葉綠體的發(fā)育起到重要作用，還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0012] 本發(fā)明首次公開了一種煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl，并獲得了編碼該基因的蛋 白氨基酸序列，同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)證實(shí)了煙草NtPICl參與葉綠體鐵轉(zhuǎn) 運(yùn)及葉綠體的發(fā)育。同時(shí)基于此研究結(jié)果，為通過基因工程或分子育種提高葉綠體鐵吸收 利用和富集提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有較大的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 序列表SEQ ID NO: 1是本發(fā)明克隆的NtPICl基因的核苷酸序列，序列長度為 849bp。
[0014] 序列表SEQ ID NO: 2是NtPICl基因編碼的氨基酸序列。
[0015] 圖1為NtPICl蛋白的葉綠體膜定位結(jié)果。a-d表示GFP空載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體；e-h 表示GFP-NtPICl融合蛋白定位在葉綠體膜上。
[0016] 圖2為表達(dá)NtPICl的酵母轉(zhuǎn)化株的異源功能互補(bǔ)結(jié)果。
[0017] 圖3為qRT-PCR分析過表達(dá)株系的NtPICl表達(dá)量。
[0018] 圖4為轉(zhuǎn)基因煙草表型及葉綠體鐵含量和葉綠素含量的測定。a為轉(zhuǎn)基因植株的 表型；b為轉(zhuǎn)基因植株葉綠體的鐵含量；c為轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量。WT，煙草野生型；0X， 過表達(dá)株系。
[0019] 圖5為轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體透射電鏡顯微觀察。a-c野生型對照；d-f NtPICl過表 達(dá)植株。c，f分別是b，e中矩形部分的放大圖像；S，淀粉顆粒。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0021] 下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022] 實(shí)施例1、一種煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl全長cDNA克隆。
[0023] 從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中（（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)搜索煙草的 EST 序列并保 存，用數(shù)據(jù)庫中已知的擬南芥AtPICl序列在BioEdit軟件中對保存的煙草EST序列文本文 件進(jìn)行Local Blast，這樣就獲得了煙草中PIC1基因 EST序列。利用該序列設(shè)計(jì)引物，引物 為： NtPICl-Fl :5'-CGAACAAAACTAGCTATGCAAAC-3' ； NtPICl-Rl :5'-GACTCCCAATCACTTCATGC-3'。
[0024] 具體流程如下： RNA的提?。豪肨RIZ0L試劑盒提取煙草（Nicotiana tabacum cv. SR-1)幼葉RNA，反 轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此cDNA為模板RT-PCR擴(kuò)增NtPICl全長序列。
[0025] RT-PCR反應(yīng)：用KOD-plus DNA聚合酶（Toyobo)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序： 94°C 預(yù)變性 2min ;94°C 變性 15sec ;57°C 退火 30sec ;68°C 延伸 50sec ;25 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min。將RT-PCR產(chǎn)物5'末端磷酸化，將磷酸化后的片段克隆到pBluescriptll sk+(Stratagene, California, USA)質(zhì)粒載體中的EcoRV位點(diǎn)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5a (Toyobo)中，將插入的核苷酸序列利用 CEQ8000 DNA Sequencer (Beckman Coulter, California, USA)進(jìn)行測序。
[0026] 最終鑒定得到NtPICl基因0RF的全長序列。NtPICl基因 cDNA全長為849bp,該 基因編碼282個(gè)氨基酸，蛋白分子量為29. 7kDa，NtPICl是疏水蛋白，含有基本的等電點(diǎn)， 有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，包含70個(gè)氨基酸的葉綠體定位轉(zhuǎn)運(yùn)肽。經(jīng)Southern blot檢測該基因 在煙草中為單拷貝基因。將其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，發(fā)現(xiàn)與AtPICl (擬南芥， AY057510)相比，氨基酸同源性為60%。
[0027] 實(shí)施例2、煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl亞細(xì)胞定位。
[0028] 一、載體構(gòu)建 首先PCR獲得含NtPICl基因編碼區(qū)全長的序列（不含終止子)，所用引物為含有BamHI 和Sac I酶切位點(diǎn)： NtPICl-BamHI ：CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG ； NtPICl-SacI-1: CGAGCTCTGCAATCCTTGGTAC。
[0029] 將PCR產(chǎn)物用SacI酶切，回收片段進(jìn)行平滑處理：DNA 2WL，K0D 1. 5μ?， 10 XBlunting Buffer 4μ?，Η20 5μ?。平滑反應(yīng)條件：72°C保溫5min，立即4°C冷卻以停止 平滑反應(yīng)。酚氯仿回收平滑產(chǎn)物。然后再用BamHI酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收 酶切產(chǎn)物；PBI221 (Biovector)載體先用Smal酶切，產(chǎn)生平末端，酚氯仿回收酶切產(chǎn)物；再 用BamHI酶切，回收酶切產(chǎn)物。通過T4 DNA連接酶16°C保溫連接PCR酶切產(chǎn)物與載體，過 夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，送去測序，得到NtPICl-GFP 表達(dá)載體。
[0030] 二、原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 1、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化主要試劑如下： 酶解液：纖維素酶 Rl〇〇.2g、離析酶 R10 (YakultHonsha, Tokyo, Japan) 0.015g、甘露 醇 1. 09g、水 7mL、0. 3M KC1 lmL、0. 3M MES lmL (pH 5· 7)，以上藥品混勻 55°C加熱 10min，冷 卻至室溫后加入 〇· 15M CaCl2 lmL、L 5% BSA lmL。
[0031] PEG 溶液（40%，v/v) :PEG4000 (Fluka, #81240) lg、H20 0· 75mL、0. 8M 甘露醇 0· 625mL、1M Ca (N03) 2 或 CaCl2 0· 25mL。
[0032] W5 溶液（pH 5. 8) :NaCl 9. 0g、CaCl2 18. 4g、KC1 0· 37g、葡萄糖 0· 9g、MES 0· 3g，力口 入蒸饋水并用蒸饋水定容至lOOOmL。
[0033] 1&11%溶液（？!15.6):說1%(：121.51^、1^5 0.18、甘露醇7.38，加入蒸餾水并用蒸餾 水定容至lOOmL。
[0034] 2、原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化具體操作如下： MS培養(yǎng)基上萌發(fā)煙草（Nicotiana tabacum cv. SR-1)種子，取4周苗齡煙草的葉片，約 90片，切成1mm寬的長條。準(zhǔn)備好一個(gè)90mm培養(yǎng)皿，稱1. 82g D -甘露醇于20ml雙蒸水 中。培養(yǎng)皿的蓋子用來切葉片。將切好的長條，置于甘露醇溶液中?？梢砸贿吳幸贿厪闹?株上取。將切好的細(xì)條從甘露醇溶液中撈出，置于酶解液中。黑暗，23°C，40-50rpm酶解3 小時(shí)。酶解液過100-200目的篩子，將過濾后的綠色混合物置于15mL離心管(直徑約lcm) 中，均分為兩管。4°C，60g，15min。棄上清，沉淀用冰冷的W5溶液輕柔洗滌，每管4mL。4°C， 100g，lmin。棄上清，沉淀用冰冷的W5溶液輕柔洗滌，每管4mL。冰上放置30min。23°C， 100g，lmin。棄上清，每管沉淀用0. 5mLMaMg重懸，即為得到的原生質(zhì)體溶液。取約10-20ug GFP-NtPICl質(zhì)粒于1. 5mLEP管中，加100uL提取的原生質(zhì)體。用200uL槍頭(剪去前端)輕 柔混勻。加入110uLPEG/Ca2+溶液，輕柔混勻。放置20-30min。加入0. 44mLW5溶液，來回 顛倒混勻。23°C，100g，lmin。棄上清，加 lmL W5,混勻。上述混合液體置于六孔板內(nèi)，23°C， 弱光，孵育6-18小時(shí)。利用激光共聚焦掃描顯微鏡TCS-SP5 (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany)進(jìn)行突光觀察。
[0035] 圖1結(jié)果表明NtPICl-GFP融合蛋白熒光信號(hào)在葉綠體邊緣，說明NtPICl蛋白定 位在葉綠體膜上。
[0036] 實(shí)施例3、煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl功能分析。
[0037] 一、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 利用以下一對引物，在NtPICl 5'和3'端分別引入BamHI，SacI酶切位點(diǎn)： NtPICl-BamHI ：CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG ； NtPICl-SacI-2: CGAGCTCTCATGCAATCCTTGGTAC。
[0038] 將PCR產(chǎn)物用SacI酶切，回收片段進(jìn)行平滑處理：DNA 2WL，K0D 1. 5μ?， 10 XBlunting Buffer 4μ?，Η20 5μ?。平滑反應(yīng)條件：72°C保溫5min，立即4°C冷卻以停止 平滑反應(yīng)。酚氯仿回收平滑產(chǎn)物。再用BamHI酶切，得到的PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳鑒定， 膠回收。酵母表達(dá)載體PYES2. 0 (購自Invitrogen)先用Notl酶切，經(jīng)過平滑處理（同上)， 再用BamHI酶切，膠回收酶切產(chǎn)物。將PCR酶切產(chǎn)物與載體通過T4 DNA連接酶16°C保溫 連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。經(jīng)鑒定，得到含有 NtPICl基因的酵母表達(dá)載體。
[0039] 二、酵母的轉(zhuǎn)化及鑒定。
[0040] 1、酵母轉(zhuǎn)化主要試劑如下： (1) lXPEG/LiAc :50% (w/v)PEG3350 8mL、10XTE buffer lmL、10XLiAc lmL。
[0041] (2) 10XTE Buffer :100mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH=7. 5,121°C高壓滅菌，室溫保 存。
[0042] (3) ΙΧΤΕ/LiAc :10XTE buffer lmL、10XLiAc lmL、ddH20. 8mL。
[0043] (4) YPD培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂 粉。121°C，20min，高壓滅菌。
[0044] 注：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨溶液混合后在高溫下可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng) 基成分變化，所以要分別滅菌后再混合。葡萄糖可以過濾除菌，也可以115°C，15min滅菌。
[0045] (5) SC-minaral medium 培養(yǎng)基：參照 pYES2. 0 user Manual (Invitrogen，Cat. no.V825 - 20)。
[0046] 2、酵母轉(zhuǎn)化使用常規(guī)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法(參照clontech《Yest Protocols Handbook》），構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體pYES-NtPICl轉(zhuǎn)化高親和和低親和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的雙突變體 DEY1453 (由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，左元梅教授惠贈(zèng))，和野生菌株BY4741 (由浙江大學(xué)，鄭紹健教 授惠贈(zèng))。轉(zhuǎn)化子在SC-minaral medium平板上進(jìn)行篩選。28?培養(yǎng)2天，挑取單克隆，進(jìn)行 菌落PCR鑒定。
[0047] 三、異源互補(bǔ)功能驗(yàn)證 具體操作如下：挑DEY1453和BY4741 YPD單菌落到SC培養(yǎng)基中，28°C過夜搖菌。向 20mL新的SC培養(yǎng)基中加適量菌液，調(diào)節(jié)0D600值為0. 2,接著搖4小時(shí)左右，取lmL菌液離 心30S，去上清，加 lmLIO X TE渦旋混勻，離心30S，去上清，重復(fù)2遍后加 lmL滅菌水重復(fù)洗 兩遍，最后加30〇μ?滅菌水渦旋混勻，測定0D600值，用滅菌水將0D600值稀釋調(diào)節(jié)為1，然 后依次稀釋10倍，得到0D600值分別為0. 1，0. 01，0. 001濃度梯度的菌液，然后分別將該菌 液依次點(diǎn)1〇μ?于SC-ura-(分別含有〇μΜ，1〇μΜ，15μΜ，2〇μΜ FeC13)平板，放置30°C培養(yǎng) 室，培養(yǎng)3-4天，比較酵母的生長情況。DEY1453 (fet3fet4)是酵母鐵吸收的低親和系統(tǒng) FET4,以及高親和系統(tǒng)FET3-FTR的基因發(fā)生了突變，但當(dāng)外源相應(yīng)基因 pYES-NtPICl轉(zhuǎn)入 并表達(dá)后可以彌補(bǔ)它們的功能，使得酵母能夠生長。如圖2所示，在不同濃度FeCl3的培養(yǎng) 基中，轉(zhuǎn)入pYES-NtPICl的fet3fet4酵母長勢明顯好于轉(zhuǎn)入空載體pYES的fet3fet4酵母 生長，說明NtPICl能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。
[0048] 實(shí)施例4、NtPICl的應(yīng)用。
[0049] 一、表達(dá)載體的構(gòu)建 重組過表達(dá)載體pBI121-NtPICl的構(gòu)建 利用含有BamHI，SacI酶切位點(diǎn)的引物： NtPICl-BamHI :5'-CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG-3' ； NtPICl-SacI-2 :5'-CGAGCTCTCATGCAATCCTTGGTAC-3' 擴(kuò)增整個(gè)NtPICl蛋白的cDNA片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。PCR產(chǎn)物序列 進(jìn)行鑒定然后用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切上述PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將該 酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切植物表達(dá)載體PBI121得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，送去測序，將該載體命名為 pBI121-NtPICl，得到重組表達(dá)載體。
[0050] 二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定 1、轉(zhuǎn)基因株系的獲得 將重組過表達(dá)載體pBI121-NtPICl經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的圓盤法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入煙草（Nicotiana tabacumcv. SR-1)中。
[0051] 2、轉(zhuǎn)基因煙草株系的NtPICl基因熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測 將上述轉(zhuǎn)基因煙草用qRT-PCR的方法進(jìn)行檢測，所用的引物為： NtPIClup :5'-GCAGCGGCTTTCGTTTCAGT-3' ； NtPICllow :5'-CAGCAGCACCCATTCCCAGA-3'。
[0052] 作為內(nèi)參的GAPDH引物為： GAPDHup :5'-GGAAAGTCCTACCAGCATTG-3' ； GAPDHlow :5'-ATCTATTGTCTCCCACGAAG-3'。
[0053] RNA的提?。河弥参颮NA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司，上海）提取煙草總 RNA，然后利用Revertra Ace (Toyobo)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0054] qRT-PCR 體系：熒光定量 qRT-PCR 利用 7300 Biosystem，根據(jù) SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系：總體積2〇μ?包括SYBRPremix ExTaq II 1〇μ? ;反轉(zhuǎn) 錄 cDNA 2μ? ;1〇μΜ 的引物各 0· 8μ? ;水 6· Ομ? ;R0X Reference Dye (50χ) 0· 4μ?。利用 2-AAct 方法計(jì)算表達(dá)量。
[0055] 結(jié)果如圖3所示，篩選出NtPICl表達(dá)量顯著升高的陽性過表達(dá)NtPICl轉(zhuǎn)基因煙 草植株 6 個(gè)株系分別是 0X1，0X11，0X13, 0X19, 0X30, 0X33。
[0056] 上述株系均為陽性轉(zhuǎn)基因植物。分別選擇其中的三個(gè)株系作為以下實(shí)驗(yàn)材料，過 表達(dá)株系為0X1, 0X13, 0X33。
[0057] 三、轉(zhuǎn)基因株系的葉綠體鐵含量及葉綠素含量的測定 1、 葉綠體鐵含量測定 所用試劑： MCBI (pH 8. 0):0· 3M 甘露糖、50mM HEPES、2mM EDTA*2Na、β -巰基乙醇 348μ?、0· 6% PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、0. 1%BSA。
[0058] MCBII (pH 8. 0) :0· 32M 甘露糖、0· 5mM HEPES、2mM EDTA-2Na。
[0059] 具體操作如下： 取1. 0g新鮮葉片，用剪刀將其剪碎，研磨成勻漿，加入5mL預(yù)冷提取緩沖液MCBI，勻漿 攪拌直到成為均勻的混合物。用4層紗布過濾掉殘?jiān)?，收集濾過液。200g4°C離心lmin，棄 沉淀。轉(zhuǎn)移上清至干凈的管中，3000g離心7min，棄上清。每管加入2mLMCBI重懸，輕輕地 上下顛倒混勻，避免氣泡，可用槍將沉淀吸打混勻。小心地將懸液平鋪在50〇μ? 40% Percoll 溶液上。緩慢貼管壁加入，分層。3000g 4°C離心6min，小心去上清，用槍頭吸凈深綠色物質(zhì) 并將其轉(zhuǎn)移至干凈的管中。加入等體積MCBI，3000g4°C離心lmin。棄上清，向沉淀中加入 lmL MCBII溶液，溶解沉淀，即獲得完整的葉綠體溶液。在獲得的lmL葉綠體溶液里，加入 95%的乙醇4mL，2000r/min處理5min，A652測定其葉綠素含量。然后取lmL加入lmL鄰二 氮雜菲和lmL對苯二酚處理半個(gè)小時(shí)，A510測定總鐵含量。（單位g+ugGhir^FWr 1)。
[0060] Chl=A652* (26/34. 5) *5 葉綠體鐵含量（g+ugGhiri^WrOz (A510+0. 00069)八0· 0975*FW*chl) 注：全部為冰上操作 2、 參照《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，采用丙酮法測定煙草的葉綠素含量： (1)葉綠素提?。悍Q取葉片0. lg，剪碎后液氮研磨，粉末轉(zhuǎn)移至大離心管中，lmL 80%丙 酮洗研缽，重復(fù)2-3次，直至研缽無色，洗液均轉(zhuǎn)至大離心管中，13000rpm，離心3min，取上 清至15mL離心管，避光保存。沉淀再加 lmL 80%丙酮吹打混勻，13000rpm，離心3min，取上 清，重復(fù)此步驟直至沉淀為白色。
[0061] (2)樣品測定：混勻上述上清，測量體積，取3ml，紫外分光光度計(jì)645nm和663nm 下分別測量其吸光值，80%丙酮做空白對照。
[0062] (3)結(jié)果計(jì)算：Ca=12. 72XA663 - 2· 59XA645 ;Cb=22. 88XA645 - 4· 67XA663 ; Ca+b=8. 02XA663+20. 21XA645 葉綠素含量（mg/g*FW) =色素濃度（mg/L) X提取液總量（mL) Χ1(Γ3/樣品鮮重（g) 如圖4所示，過表達(dá)NtPICl轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體鐵含量和葉綠素含量顯著高于野生型。 說明NtPICl參與葉綠體鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。并且從表型上觀察發(fā)現(xiàn)，NtPICl過表達(dá)植株的葉片呈 現(xiàn)深綠色。
[0063] 四、葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)分析 具體操作如下： 分別取野生煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片，切成橫切面為小于0.5mm的細(xì)長條；通過抽 真空浸泡在2. 5 %戊二醛中固定，清洗后，再用1 %鋨酸后固定；經(jīng)常規(guī)方法用系列乙 醇脫水后，用Epon812樹脂包埋，超薄切片；經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色；于Hitachi H7650FA(100kVTEM, http://www.hitachi_hta.com)透射電鏡觀察、拍照。
[0064] 結(jié)果如圖5 :NtPICl過表達(dá)植株的葉肉細(xì)胞中含有大量的葉綠體并且類囊體片層 結(jié)構(gòu)堆疊更加密集，葉綠體中含有大的淀粉顆粒，間接反映了 NtPICl過表達(dá)植株的光合作 用更強(qiáng)。這些說明NtPICl影響了葉綠體的發(fā)育。 〈110>哈爾濱師范大學(xué) 〈120> -種葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl及其應(yīng)用 <130> <160> <210> 1 <211> 849 <212> DNA 〈213> 煙草（Nicotiana tabacum) <400> 1 atgcaaactc tactcttgcc gtcggctcac tccgtcaccg gcagtgcgcc atcagctctt 60 tcctcggccg gaaaaccatg tcggcataat ttccttggac gccaaattac cctaatttct 120 tcgccctcat cattatcttt atctccctta aagacaaagc ctctttcttt gccccagttt 180 agtctcataa acaaacggtc cagaatatta gcttctgctc ccctttctcc accctacact 240 tccccaaatg acgagtctga aaaagctaaa ttagctcagg ttgcgaaaag actacagaat 300 actgcaaggt acttcaagag attgggtagt ctagggtttt ggggacagct ggtatgtacg 360 cttgttgctg cggtgatcct ttcattttct gttgttatta cggggaatat tacatctccc 420 ttcacattct actcaactgc gggtggaatt gcagcggctt tcgtttcagt tttttggtca 480 ttcggctata ttcgcttgtc tgaaaagctt cggaggacag ctaatgagcc ttcaaaggct 540 cctcctcgtg ctgacgttgt gaaaagcttg aagaatggaa tagtggtgaa ccttctggga 600 atgggtgctg ctgtacttgg catgcaagca actgtcggat cgttggtggc taaggctctt 660 accacctcag ctaatccata tagtattact cctggaagta gccccgtgct tgctttggat 720 gtatttctgg ttcaggcatc agcaaatact atcgttgcac actttctagg tctagtattc 780 tcattggagc tgttgcgctc tgtcaccttg ccaccttcag aaggcattcc ggtaccaagg 840 attgcatga 849 〈210〉 2 〈211〉282 〈212〉PRT 〈213> 煙草（Nicotiana tabacum) 〈400〉 2 Met Gin Thr Leu Leu Leu Pro Ser Ala His Ser Val Thr Gly Ser Ala 15 10 15 Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ala Gly Lys Pro Cys Arg His Asn Phe Leu 20 25 30 Gly Arg Gin lie Thr Leu lie Ser Ser Pro Ser Ser Leu Ser Leu Ser 35 40 45 Pro Leu Lys Thr Lys Pro Leu Ser Leu Pro Gin Phe Ser Leu lie Asn 50 55 60 Lys Arg Ser Arg lie Leu Ala Ser Ala Pro Leu Ser Pro Pro Tyr Thr 65 70 75 80 Ser Pro Asn Asp Glu Ser Glu Lys Ala Lys Leu Ala Gin Val Ala Lys 85 90 95 Arg Leu Gin Asn Thr Ala Arg Tyr Phe Lys Arg Leu Gly Ser Leu Gly 100 105 110 Phe Trp Gly Gin Leu Val Cys Thr Leu Val Ala Ala Val lie Leu Ser 115 120 125 Phe Ser Val Val lie Thr Gly Asn lie Thr Ser Pro Phe Thr Phe Tyr 130 135 140 Ser Thr Ala Gly Gly lie Ala Ala Ala Phe Val Ser Val Phe Trp Ser 145 150 155 160 Phe Gly Tyr lie Arg Leu Ser Glu Lys Leu Arg Arg Thr Ala Asn Glu 165 170 175 Pro Ser Lys Ala Pro Pro Arg Ala Asp Val Val Lys Ser Leu Lys Asn 180 185 190 Gly lie Val Val Asn Leu Leu Gly Met Gly Ala Ala Val Leu Gly Met 195 200 205 Gin Ala Thr Val Gly Ser Leu Val Ala Lys Ala Leu Thr Thr Ser Ala 210 215 220 Asn Pro Tyr Ser lie Thr Pro Gly Ser Ser Pro Val Leu Ala Leu Asp 225 230 235 240 Val Phe Leu Val Gin Ala Ser Ala Asn Thr lie Val Ala His Phe Leu 245 250 255 Gly Leu Val Phe Ser Leu Glu Leu Leu Arg Ser Val Thr Leu Pro Pro 260 265 270 Ser Glu Gly lie Pro Val Pro Arg lie Ala 275 280
【權(quán)利要求】
1. 一種煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ ID NO :1所 /_J、1 ο
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因 NtPICl，其特征在于：該核苷酸序列 編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO : 2所不。
3. 含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4. 按照權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于：該表達(dá)載體是植物表達(dá)載體 pBI121-NtPICl及酵母表達(dá)載體pYES2. 0-NtPICl ;其中，所述的NtPICl核苷酸序列為SEQ ID NO :1 所示。
5. 擴(kuò)增權(quán)利要求1所述基因全長或其任意片段的引物對。
6. 權(quán)利要求1所述基因、權(quán)利要求2所述蛋白在煙草葉綠體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于：構(gòu)建所述煙草NtPICl基因的過表達(dá)載體并 轉(zhuǎn)化煙草，獲得葉綠體鐵含量升高的轉(zhuǎn)基因煙草。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述轉(zhuǎn)基因煙草，其特征在于：1)所述轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體鐵含量 多于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量多于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植 物的葉肉細(xì)胞中含有大量葉綠體，類囊體膜堆疊更加緊密并含有大量淀粉顆粒，所述目的 植物具體為野生型煙草。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104120136SQ201410225697
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】郭長虹, 龔勛, 于典司 申請人:哈爾濱師范大學(xué)