專利名稱：一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機械化雜交稻制種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機械化雜交稻制種方法。
背景技術(shù)：
我國現(xiàn)行雜交水稻制種技術(shù)，自播種至收獲完全依靠人工操作。父母本分期播種， 多為先栽父本，后栽母本；母本多行，父本雙行。工序繁雜，整個制種過程需要足夠的勞動力 做保證，只適宜在勞動密集型的農(nóng)村推廣應(yīng)用，大型農(nóng)場因缺少足夠的勞動力而不能制種。 而且，由于父本的因素，減少了制種產(chǎn)量。本發(fā)明將使這種現(xiàn)狀得到根本的改變，不依賴于 勞動力而實現(xiàn)機械化，制種產(chǎn)量也將有大幅度提高，雖然采取了葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)但不是 轉(zhuǎn)基因種子。這種雜交水稻制種技術(shù)，是將葉綠體攜帶發(fā)光蛋白基因的雜交稻父本(恢復(fù)系) 和母本(不育系)按照一定的比例均勻混合，一次播種，能夠像常規(guī)水稻那樣進行育秧和大 田栽培管理，可以拋秧、機插，也可以直播，大大簡化栽插工序。按照常規(guī)田間管理成熟后， 可進行機械化收割。收獲的種子經(jīng)過光電分選，可分選出不發(fā)熒光的雜交種和發(fā)熒光的恢 復(fù)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)機械化生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因雜交稻 種子的方法。將發(fā)光蛋白基因轉(zhuǎn)化到水稻恢復(fù)系的葉綠體中，育成母體遺傳含發(fā)光蛋白的 雜交稻恢復(fù)系，作為機械化制種親本。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是首先，利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得葉綠體攜帶發(fā)光蛋白基因的雜交稻父本(恢 復(fù)系)，利用現(xiàn)有或自行選育與該恢復(fù)系播始歷期相近的三系和兩系不育系，測配強優(yōu)勢組
I=I O制種時含發(fā)光蛋白父本(恢復(fù)系)和母本(不育系)按照一定的比例均勻混合， 一次播種，能夠像常規(guī)水稻那樣進行育秧和大田栽培管理，可以拋秧、機插，也可以直播，大 大簡化栽插工序。按照常規(guī)田間管理成熟后，可進行機械化收割。收獲的種子經(jīng)過光電分 選，可分選出不發(fā)熒光的雜交種和發(fā)熒光的恢復(fù)系。本發(fā)明的技術(shù)效果在于采用本發(fā)明方法利用了葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)，但生產(chǎn)的是 非轉(zhuǎn)基因雜交稻種子；可以減少制種操作程序，可以進行機械化操作，減輕勞動強度，降低 種子生產(chǎn)成本，整體提高水稻種業(yè)的效益；制種時，轉(zhuǎn)基因父本的花粉不含有轉(zhuǎn)基因成分， 不會造成轉(zhuǎn)基因的擴散漂移，有利于生物安全；制種收獲的種子分選后得到的恢復(fù)系，仍然 可以利用。
具體實施例方式實驗過程
1葉綠體轉(zhuǎn)化的綠色熒光蛋白基因載體構(gòu)建根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)序列，分別設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)克隆一系列構(gòu)建水稻質(zhì)體 定點整合表達載體所需的元件質(zhì)體核糖體(16S) RNA操縱元啟動子(Prrn)、質(zhì)體psbA基 因3'端終止子(psbA3')、氨基糖苷3'-腺苷?；D(zhuǎn)移酶基因(aadA)、水稻質(zhì)體基因組 高頻同源重組片段(psbC/trnG，大小3362bp)，以及綠熒光蛋白基因(gfp)。構(gòu)建水稻質(zhì)體 定點整合表達載體(_psbC-Prrn-gfp-aadA-psbA3' -trnG_)。2水稻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化2.1植物材料選擇用于葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的水稻(Oryza sativa L.)品種選擇易于轉(zhuǎn)化的雜交水稻骨 干恢復(fù)系，包括但不限于9311、明恢86、R207。2. 2水稻胚性愈傷組織的誘導(dǎo)取授粉后10-15d的末成熟水稻種子剝?nèi)シN皮，于70%酒精浸泡3min，再于0. 1% 升汞中浸泡15min (或再轉(zhuǎn)入20%的次氯酸鈉溶液中于搖床振蕩滅菌25min)，超凈工作臺 中無菌水清洗3-5次，將消毒后種子的幼胚用鑷子擠出，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個皿約放 35粒，280C暗培養(yǎng)4-5d，切除胚根，繼續(xù)培養(yǎng)12-15d，待愈傷長大后進行繼代培養(yǎng)，每兩周 繼代一次，共繼代2-3次。成熟胚去殼，，經(jīng)上述方法消毒后，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。28°C暗培養(yǎng)至長出愈傷組 織。選用培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)4天的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。(第三代開始可以選擇適當?shù)呐咝?愈傷用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。2. 3愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)取生長旺盛的胚性愈傷組織(從繼代培養(yǎng)上挑選分散狀，顏色鮮黃的2_3mm的胚 性愈傷顆粒)轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，27°C暗培養(yǎng)3-4天。生長旺盛的愈傷用于轉(zhuǎn)化。2. 4粒子轟擊法按照PDS 1100/He型號基因槍的操作手冊進行。2. 4. 1金粉懸浮液的制備稱取60mg金粉于1. 5ml Eppendorf管中，加入Iml純酒精，振蕩2分鐘，然后 10，OOOrpm離心1分鐘沉淀金粉。去上清后再重復(fù)3次。最后1次改用無菌dd H2O0懸浮 金粉于Iml dd H2O,貯存于-20°C備用。2. 4. 2DNA-金粉懸浮液制備取50ul金粉懸浮液，按下列順序依次加入:5ul DNA(lug/ul)，250ul2. 5mol/L CaCl2. 20ul 0. lmol/L亞精胺?；靹蚝笾糜诒蠑?shù)分鐘。振蕩3分鐘后，離心3秒鐘，去上 清，用250ul純酒精洗一遍，最后加入60ul純酒精，混勻后貯存于_20°C備用。2. 4. 3粒子轟擊先將整個裝置用酒精清洗消毒。用酒精棉球擦拭槍體和樣品室，將銅網(wǎng)、載體膜、 可裂膜用70%酒精浸泡15分鐘，于無菌濾紙上晾干。將載體膜安放于載體中，在載體膜中央滴加已制備好的DNA-金粉懸浮液5-lOul， 待其晾干后備用。裝好可裂膜、銅網(wǎng)及載體，放入待轟擊樣品，調(diào)整轟擊距離，根據(jù)我們摸索的結(jié)果， 距離選用6 8cm為佳。打開進氣閥，調(diào)壓至所需值，打開真空泵，抽真空至25 28in. Hg，
4即可進行轟擊。轟擊完成后，解除負壓，取出樣品，用石蠟?zāi)し鈬琅囵B(yǎng)皿。培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基。2. 5抗性愈傷的篩選將愈傷轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷，每兩周轉(zhuǎn)接1次。培養(yǎng)4-8周，多數(shù)愈 傷褐化死亡，有少數(shù)瘤狀抗性愈傷從干癟褐化的愈傷表面長出。挑選這些抗性愈傷繼續(xù)在 選擇培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2次，挑選長大后愈傷的一部分轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上。2. 6抗性愈傷的分化培養(yǎng)經(jīng)抗生素篩選長出的抗性愈傷，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，26°C -28°C，12h光 照，12h黑暗條件下培養(yǎng)。2. 7轉(zhuǎn)基因植株的再生及幼苗移栽轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上的愈傷組織，培養(yǎng)2周后愈傷開始轉(zhuǎn)綠，3周后即可長出幼 芽，隨之根也長出。將幼苗轉(zhuǎn)移到含生根培養(yǎng)基的小三角瓶內(nèi)，每瓶一株，繼續(xù)光照培養(yǎng)，待 苗高7 IOcm時，打開瓶蓋于溫室中煉苗5 7天，待小苗生長健壯后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈 跟上的培養(yǎng)基，移至溫室盆栽(鐵盤中)。注意保濕，以提高移栽成活率。3轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測3. IDNA大規(guī)模抽提水稻DNA抽提采用CTAB法(Murry and Thompson, 1980)。稱取新鮮葉片2-4克，剪 碎后放入-20°C預(yù)冷的研缽中，用液氮磨成粉末，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的磨樣瓶中于-20°C保存?zhèn)溆谩?提取時加入預(yù)熱至100°C的IOml 1. 5X CTAB,迅速攪勻，于56°C水浴保溫搖床振蕩20分鐘， 然后用等體積氯仿異戊醇(24 1)抽提。離心后，上清液再用1/10體積預(yù)熱至56°C的 10% CTAB緩沖液及等體積的氯仿異戊醇(24 1)抽提一次，然后上清加入CTAB沉 淀DNA，離心后加入添加有RNase A的lmol/L NaCl溶解DNA，于56°C過夜完全溶解酒精沉 淀后，溶于適量TE中，用DNA微量測定儀(DNA Fluorometer)測定DNA濃度，平衡DNA濃度 至250ng/ul，存于4°C備用。抽提煙草DNA時，在1. 5X CTAB中加入1 % (V/V)的B-疏基乙醇。其它步驟同水稻。3.2PCR 分析合成了適合引物。PCR 反應(yīng)體系DNA 30_90ng，IOx Buffer 2. Oul, ImM dNTP 1. 8ul,25mM MgCl2 1. 5ul，IOuM primer 兩種各 0. 5ul，Tag 酶 1. 5U，然后加 dd h20 至 20ul反應(yīng)體積。PCR循環(huán)條件94°C，變性3分鐘；94°C，1分鐘，55°C (檢測PSAG12〕或68°C (檢測 NPTII)，1. 5分鐘，72°C，1. 5分鐘，40個循環(huán)；72°C，延伸5分鐘。電泳檢測用1. 4%瓊脂糖凝膠電泳，照相記錄電泳結(jié)果。3. 3Southern 印跡分析取水稻總DNA 2. 5ug(煙草總DNA量略多)，用限制性內(nèi)切酶XbaI 37°C酶解20hr 左右，經(jīng)電泳檢測酶切完全后，用0. 6 0. 8%瓊脂糖(Sigma公司生產(chǎn))凝膠電泳，經(jīng) 12-16hr電泳后，凝膠用0. 2N HCl變性10分鐘，用0. 4N NaOH溶液將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn) 移至尼龍膜Hybond-N+上。轉(zhuǎn)移20小時，將尼龍膜用2X SSC漂洗2次，各5分鐘，膜晾干
5后于80-100°C真空烘烤3hr，取出冷卻后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。預(yù)雜交先將尼龍膜用2X SSC漂洗，涼干后裝入雜交袋中，加入IO-ISml (依膜的 張數(shù)1-6張)預(yù)熱至65°C的雜交緩沖液。趕氣泡后，于65°C空氣搖床中預(yù)雜交6hr左右。探針標記用隨機引物法按下列步驟進行標記。探針DNA lOOng，加入ddH20 至IOul, 100°C變性10分鐘，冰浴5分鐘冷卻后，加入dNTP(A+G+T) 3ul,隨機引物緩沖液 5. Oul，Klenow Fragment酶2U，最后加入a-32P-dCTP10_40uCi (按雜交膜數(shù)量)，混勻后于 25°C保溫3小時以上。雜交加600ul雜交液到標記好的探針溶液中，打開管蓋，100°C變性10分鐘后，倒 入雜交袋中，65 °C雜交6hr。洗膜、壓片雜交完畢后，將膜從雜交袋中取出，用洗膜液IX SSC、0. 2% SDS室溫 漂洗1次，然后再用預(yù)熱至65°c的洗膜液于65°C保溫搖床中熱洗1-2次，每次15分鐘。涼 干后用保鮮膜包膜，壓片后于-20°C放射自顯影約4-7天。探針DNA制備。探針DNA選自質(zhì)粒pSG516上的啟動子Psac12的HinDIII酶切片段。 電泳分離酶切片段后，用S印haglas Band Prep Kit回收瓊脂糖凝膠上所需片段。部分實 驗采用primerSAG12PCR擴增片段作為探針，使用Wizard PCR Preps kit回收擴增片段。3. 4組織化學法檢測報道基因⑶S的表達共培養(yǎng)后愈傷的瞬時表達、抗性愈傷的陽性鑒定、轉(zhuǎn)基因植株的⑶S酶活性測定 以及Psmi2-GUS轉(zhuǎn)基因植株⑶S酶活性的葉片衰老特異性表達都用組織化學法測定。將待 測定的材料，如愈傷或葉片，浸入適量X-Gluc溶液，于37°C保溫過夜后，在體視顯微鏡下觀 察，拍照記錄。若將加有X-Gluc溶液的材料抽真空，染色效果將更好。如材料存在色素干 擾問題，染色后用酒精脫色，使色素的顏色褪掉而使染成的藍色保存。X-Gluc 染色液0. 2mol/L NaPO4 緩沖液，pH7. 0 (0. 2mol/L Na2HPO4,62ml ；0. 2mol/ L NaH2PO4, 38ml) ；0. lmol/L K3 [Fe (CN) 6] ；0. 1Mo1/LK4 [Fe (CN) 6]. 3H20 ； 1. OMol/L Na2EPTA ； 0. 1% X-Gluc ；加水至所需體積。4°C貯存?zhèn)溆谩?. 5葉綠體轉(zhuǎn)化水稻植株的鑒定從轉(zhuǎn)化植株中分離水稻葉綠體并從提取葉綠體基因組DNA。以此為模板，利用設(shè)計 的引物，按常規(guī)反應(yīng)條件在PTC-200PCR熱循環(huán)儀(MJ公司)上進行PCR反應(yīng)，檢測轉(zhuǎn)化植 株中轉(zhuǎn)基因的導(dǎo)入。將從轉(zhuǎn)化植株中的葉綠體基因組DNA進行酶切、電泳、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維 素膜Hybond-N。利用隨機引物標記試劑盒(Promega公司)和[α-32P] dATP (北京亞輝公 司)，隨機引物法制備α -32Ρ標記的轉(zhuǎn)基因片段，作為分子探針，按照Sambrook等分子克隆 方法進行轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交分析。以轉(zhuǎn)化植株中提取的葉綠體基因組DNA為模板， 利用引物進行PCR擴增反應(yīng)，根據(jù)擴增片段的大小鑒定轉(zhuǎn)化植株中轉(zhuǎn)基因的定點整合及同 質(zhì)化程度。4葉綠體轉(zhuǎn)化水稻植株后代的遺傳學分析分別以轉(zhuǎn)基因水稻為母本和父本，與非轉(zhuǎn)基因的野生型水稻雜交，將雜交后代種 子表面消毒、去殼后分別置于含MS抗性培養(yǎng)基(添加相應(yīng)抗生素)的培養(yǎng)皿(Φ9)中萌發(fā)， 轉(zhuǎn)移至12h光照、25°C的光照培養(yǎng)箱中，觀察種子萌發(fā)和幼苗生長狀況。同一培養(yǎng)基中放置 兩種雜交后代種子各16粒，另設(shè)置2皿作為重復(fù)。5恢復(fù)系用于雜交稻制種
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將葉綠體攜帶綠色熒光蛋白基因的恢復(fù)系應(yīng)用于雜交稻制種，父母本按一定比例 進行混播。按照田間常規(guī)管理成熟后，可進行機械化收割，收獲的種子經(jīng)過光電分選，可分 選出不發(fā)熒光的雜交種和發(fā)熒光的恢復(fù)系。
權(quán)利要求
一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機械化雜交稻制種方法，其特征在于將發(fā)光蛋白基因轉(zhuǎn)化到雜交稻恢復(fù)系的葉綠體中，育成母體遺傳特性的含發(fā)光蛋白的水稻恢復(fù)系，雜交稻制種時，父母本按一定比例進行混播，成熟后可進行機械化收割，獲得的是非轉(zhuǎn)基因雜交稻種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機械化雜交稻制種方法，其特 征在于利用綠色熒光蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機械化雜交稻制種方法，其特 征在于利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將發(fā)光蛋白基因轉(zhuǎn)化雜交稻恢復(fù)系葉綠體中，育成母體遺 傳特性的含發(fā)光蛋白的水稻恢復(fù)系。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機械化雜交稻制種方法。將水稻發(fā)光蛋白基因轉(zhuǎn)化到雜交稻恢復(fù)系的葉綠體中，這種恢復(fù)系具有熒光蛋白母體遺傳的特性，并且花粉不攜帶轉(zhuǎn)基因，因此用這種恢復(fù)系配制的雜交種是非轉(zhuǎn)基因的。雜交稻制種時，父母本按一定比例進行混播，按照田間常規(guī)管理成熟后，可進行機械化收割，收獲的種子經(jīng)過光電分選，可分選出不發(fā)熒光的雜交種和發(fā)熒光的恢復(fù)系。這種機械化制種技術(shù)不僅大大減輕了農(nóng)民的勞動強度，減少了操作程序，降低了種子的生產(chǎn)成本，而且利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)出的是非轉(zhuǎn)基因雜交稻種子。
文檔編號A01H1/02GK101928725SQ20091004373
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月20日
發(fā)明者唐麗, 廖翠猛, 曹孟良, 李丁, 袁隆平, 謝靈靈, 趙迎曦, 邢俊杰, 陶小平 申請人:湖南西城雜交水稻基因科技有限公司