專利名稱：一個(gè)控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和植物生物技術(shù)等領(lǐng)域，特別是在分子水平上進(jìn)行植物遺傳育種以及植物生理、基因功能等基礎(chǔ)研究。
背景技術(shù)：
高等植物葉綠體是進(jìn)行光合作用的場所，而葉綠體的發(fā)育受一系列核質(zhì)基因的控制。研究表明控制葉綠體發(fā)育的基因被破壞可導(dǎo)致葉綠體發(fā)育受阻，進(jìn)而使植物葉色發(fā)生異常，甚至使光合作用效率急劇下降。目前，研究工作者們利用物理、化學(xué)、生物等誘變創(chuàng)制水稻葉色突變體，將其應(yīng)用于水稻的遺傳育種、生理及其相關(guān)基因的克隆和功能研究。本研究利用經(jīng)物理誘變創(chuàng)制的水稻早期苗色突變體并通過圖位克隆技術(shù)定位到一個(gè)控制葉綠體發(fā)育的基因，至今尚未有與此基因相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)及這種基因的檢測方法和應(yīng)用。水稻中該控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因若被破壞，即可導(dǎo)致早期水稻植株黃化。這種控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQ ID No. 2所不的氣基酸序列。優(yōu)選的，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示?！獙τ糜跈z測上述基因的特異性引物，序列為上游5'-AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3'下游5'-ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3'即SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 5 所示的序列。檢測這種控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因的方法為，采用上述特異性PCR引物對水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到799bp核苷酸片段，說明含有控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因。優(yōu)選的，799bp核苷酸片段序列如SEQ ID No. 3所示。優(yōu)選的，將所得到的得到799bp片段用Taq I酶切，出現(xiàn)長度為536bp和263bp的特異性片段，說明含有控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因。在本發(fā)明研究中，發(fā)明人設(shè)計(jì)的特異性的PCR引物和檢測方法，能對水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物用Taq I進(jìn)行酶切鑒定，根據(jù)酶切帶型能快速檢測到含有此基因的水稻品種，其檢測的準(zhǔn)確性高，操作簡單，成本低廉。若一個(gè)水稻品種中含有此基因，則用上述引物能夠擴(kuò)增出長度為799bp的特異性片段。然后用Taq I對該片段進(jìn)行酶切，其酶切帶型為出現(xiàn)兩個(gè)特異性片段，長度為536bp和263bp。水稻葉色(黃化)突變體材料是由粳稻“嘉花I號”經(jīng)6tlCo Y射線輻照而來，經(jīng)海南、上海兩地多年自交加代和選擇，已成為各種農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的品系。發(fā)明人在研究中將此突變品系與秈稻“培矮64S”配制正反交組合，構(gòu)建遺傳群體，利用SSR和InDel分子標(biāo)記將控制葉綠體發(fā)育的基因定位在水稻的第2號染色體。本發(fā)明控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因與其啟動子同農(nóng)桿菌表達(dá)載體連接，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將該DNA序列轉(zhuǎn)入黃化突變體后，其后代植株葉色變綠，說明該基因被破壞即可導(dǎo)致早期水稻葉綠體發(fā)育受阻，使植株黃化。通過本發(fā)明得到的控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因可應(yīng)用于雜交水稻制種，可提高雜交水稻不育系自身以及它配制雜交水稻的純度。


圖1為本發(fā)明的特異性PCR引物對該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖2為本發(fā)明對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Taq I酶切檢測結(jié)果。圖中，M代表Marker ；T1 代表擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；T2代表擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物Taq I酶切后的片段。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1水稻DNA提取1、根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊進(jìn)行操作，稱取O. 5g新鮮的苗期水稻葉片(野生型“嘉花I號”)，把葉片剪成O. 5cm長的小段，放到預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，之后轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中，加入Iml 60°C預(yù)熱的2XCTAB，輕輕震蕩后60°C水浴45min，期間震蕩2次。2、取出離心管，冷卻置室溫，12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心5min，吸取上清液，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混合液，充分混勻。3、將含有溶液的離心管進(jìn)行平衡，12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心5min，吸取上清液，加入其2/3體積異丙醇，輕輕混勻使核酸析出。4、12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心5min，使核酸沉淀，棄上清，用70%乙醇洗滌，室溫干燥后溶于10 μ I的無菌水中。5、取2μ I用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)施例2PCR擴(kuò)增和基因檢測(一)獲得控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因1,25μ L PCR 反應(yīng)體系如下100mM Tris-HCl pH9. O ； IOOmMKCl; 20mM MgSO4 ；80mM(NH4)2SO4 ；2. 5mM dNTP; 10 μ M 引物，5U/μ I Taq 酶，I μ I 模板 DNA/10 μ I。引物序列為上游引物5’ -GGGGTACCCACAATGCATCTCGATTCTTA-3’(所用內(nèi)切酶是 KpnI)下游引物5’ -GCTCTAGAGCAGAATGGGGGGATATCTCA-3’(所用內(nèi)切酶是 XbaI)3、PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。溫度和反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸60sec, 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為3. 7kbp，測序結(jié)果如SEQ ID No.1。參照KOME網(wǎng)站上獲得的ORF序列，設(shè)計(jì)特異性RT-PCR引物，上游端和下游端分別為5’ -GAAGATCTATGAGCTACTTCACTTGC-3’5' -GGGGTACCCCAGACTCCTGCGCATGC-3'對所提取的正常植株總cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，其目的片段長度為750bp，并進(jìn)行測序。將測序得到的DNA序列即ORF利用Bioxm軟件翻譯成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。將測序得到的DNA序列即ORF利用Bioxm軟件翻譯成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。(二)檢測控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因 1,25μ L PCR 反應(yīng)體系如下IOOmM Tris-HCl ρΗ9. O; IOOmMKCl; 20mMMgSO4;80mM(NH4)2SO4; 2. 5mM dNTP; 10 μ M 引物，5U/μ I Taq 酶，I μ I 模板 DNA/10 μ I。引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示上游5'-AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3'下游5'-ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3'2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。溫度和反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸60sec, 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸6min。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣于1%瓊脂糖凝膠上并電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像，結(jié)果如圖1，出現(xiàn)799bp條帶，序列如SEQ ID NO. 3所示，是SEQ ID No.1中的一段。3、酶切反應(yīng)體系Ιμ 無菌水，Ιμ IOXTaq Ibuffer, I μ I O. 1%BSA，O. 5 μ I lOU/μΙ TaqI 和6· 5 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(總體積10 μ I )。4、酶切處理將酶切反應(yīng)體系混勻后，放入37 °C恒溫水浴中，溫浴I小時(shí)，每管加入1μ IIOXLoading buffer終止酶切反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣于1%瓊脂糖凝膠上并電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像。結(jié)果如圖2。其酶切帶型為出現(xiàn)兩個(gè)特異性片段，長度為 536bp 和 263bp。實(shí)施例3基因功能驗(yàn)證采用Y射線或者其他物理方法誘變，破壞水稻中SEQ ID No.1的基因序列。經(jīng)測序該基因中的堿基缺失，RNA水平降低，則水稻早期植株黃化。該基因的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含有該正常基因的突變體后代植株葉色呈綠色。水稻葉色突變體材料是由粳稻“嘉花I號”經(jīng)6tlCo Y射線輻照而來，是一種黃化突變體，經(jīng)海南、上海兩地多年自交加代和選擇，已成為各種農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的品系。1、利用SSR和InDel分子標(biāo)記進(jìn)行突變基因的定位，通過測序和半定量RT-PCR技術(shù)，表明該基因序列發(fā)生突變及其RNA水平的表達(dá)量下降。2、將SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接到含有外源啟動子CaMV35S的農(nóng)桿菌表達(dá)載體pCAMBIA1301S上，并經(jīng)過酶切、測序驗(yàn)證為該目的基因序列。3、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將上述重組載體轉(zhuǎn)化受體，受體是黃化突變體的愈傷組織，通過鑒定獲得陽性第一代轉(zhuǎn)基因植株，其葉色呈綠色。4、將第一代轉(zhuǎn)基因植株的種子播種，其葉色出現(xiàn)分離，呈綠色和黃化表型，并符合孟德爾遺傳分離比即3 :1。5、該基因正常表達(dá)是水稻植株葉色呈綠色，而其表達(dá)下調(diào)的突變植株苗期葉色呈
黃化表型，因此可以通過此表型變化來鑒別水稻品種真?zhèn)?，提高純度?br> 權(quán)利要求
1.控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因，其特征在于，具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有SEQID No.2所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
5.一對用于檢測權(quán)利要求1或2所述控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因的特異性PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列為上游5' -AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3'下游5' -ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3'。
6.檢測權(quán)利要求1或2所述控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因的方法，其特征在于，用權(quán)利要求5所述的特異性PCR引物對水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到799bp 核苷酸片段，說明含有控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因。
7.權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的799bp核苷酸片段，序列如SEQID No. 3所示。
8.權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，將所得到的得到799bp片段用TaqI酶切，出現(xiàn)長度為536bp和263bp的特異性片段，說明含有控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因。
9.權(quán)利要求1或2所述控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因用于鑒別水稻品種真?zhèn)巍?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因及其檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開了一個(gè)控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。利用設(shè)計(jì)的如SEQ ID No.4和No.5特異性PCR引物，通過對水稻中所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后經(jīng)Taq I酶切進(jìn)行鑒定，能快速檢測到含有該基因水稻植株，其檢測準(zhǔn)確性高，操作簡單，成本低廉。水稻中該基因被破壞即可導(dǎo)致早期水稻植株黃化。通過本發(fā)明得到的控制早期水稻葉綠體發(fā)育的基因可應(yīng)用于雜交水稻制種，可提高雜交水稻不育系自身以及它配制雜交水稻的純度。
文檔編號C12N15/29GK103014022SQ20121055230
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者馬曉靜, 鞏孝帝, 林冬枝, 董彥君 申請人:上海師范大學(xué)