專利名稱：一種表達(dá)高溫α-淀粉酶的基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)高溫a -淀粉酶的基因工程菌株。
背景技術(shù)：
高溫a-淀粉酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a—l， 4葡萄糖苷鍵的 a-淀粉酶，因?yàn)槠渥钸m反應(yīng)溫度較高， 一般為60攝氏度以上，因此稱為高溫a-淀粉酶。
高溫a-淀粉酶廣泛應(yīng)用于酒類、味精及淀粉糖等工業(yè)生產(chǎn)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝既省工 省廠房設(shè)備，又能提高出品率，降低成本，增加效益。地衣桿菌a-淀粉酶是我國產(chǎn)量 最大用途最廣的一種高效液化型淀粉酶，它是由耐熱性能高的地衣桿菌誘變后逐級擴(kuò) 大培養(yǎng)再經(jīng)提純而獲得的一種酶制劑，主要作用是能將原料中的淀粉質(zhì)液化為糊精。
透明顫菌血紅蛋白(vitreoscilla hemoglobin, VHb)是20世紀(jì)70年代后期發(fā)現(xiàn) 的一種血紅蛋白，該蛋白質(zhì)能使透明顫菌在低氧的環(huán)境下生存，并保持較高的生長速 率。透明顫菌為專性好氧的革蘭氏陰性菌，為貝日阿托氏菌屬(Beggiatoa)，能在貧 氧條件下合成一種可溶性的血紅蛋白以滿足其對氧的需求。1986年Wakabayashi綜合 研究其光譜學(xué)特征、氧結(jié)合特性以及蛋白質(zhì)氨基酸順序，表明該蛋白與真核生物的血 紅蛋白具有相當(dāng)高的同源性和相似性，故將其命名為透明顫菌血紅蛋白 (WakabayashiS， MatsubaraH， WebsterDA. Nature, 1986， 322: 481 483) 。 1988年， 美國IIT和CIT兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別成功地從透明顫菌染色體上克隆了透明顫菌血紅蛋白 的基因(vitreoscillahemoglobingene， vgb)，測定了核苷酸序列并在大腸桿菌中進(jìn) 行了表達(dá)，由于VHb的存在，使細(xì)菌能夠在限氧條件下生存，促進(jìn)了細(xì)胞總蛋白的合 成和外源蛋白的積聚，改善了生長條件(DikshitK L， WebsterD A. Cloning, Gene， 1988， 70: 377 386)。自從VHb在大腸桿菌中成功地進(jìn)行表達(dá)以來，VHb已在假單胞 桿菌、鏈霉菌、霉菌和酵母等多種生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)高溫a -淀粉酶的基因工程菌株。 本發(fā)明所提供的可表達(dá)高溫a-淀粉酶的工程菌，是將表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基 因的重組載體導(dǎo)入地衣芽孢桿菌(^3cWAa h'c力e/ i/o27W'5")中，篩選得到的高溫a -淀粉酶表達(dá)量提高的工程菌株；所述透明顫菌血紅蛋白基因具有GENBANK Accession Number為L21670的5'端第101—541位核苷酸序列。所述表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組載體中所述透明顫菌血紅蛋白基因的5'
端連接有sacB基因啟動子和信號肽編碼基因的DNA片段；所述sacB基因啟動子和 信號肽編碼基因的DNA片段具有Genebank Accession Number為X02730的5'端第 208-463位核苷酸序列。
所述地衣芽孢桿菌(W3c刃2ws ^'c力eyw'/ora7is)為地衣芽孢桿菌0^cj77m "c力朋i/b27W'5") CICC10181。所述可表達(dá)高溫a-淀粉酶的工程菌優(yōu)選為地衣芽孢桿 菌G9sc^/i/s "cize^Yb27W's) WY CGMCC No.2830。
所述地衣芽孢桿菌(5ac/〃w丄/c/zew/w7mX) WY CGMCC No. 2830，已于2008年12 月25日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址 為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCCNo.2830。
本發(fā)明的可表達(dá)高溫a -淀粉酶的工程菌，特別是地衣芽孢桿菌(5fl"7/w "c/z，/o環(huán)&) WY CGMCC No. 2830具有比目前國內(nèi)生產(chǎn)菌株更高的高溫a -淀粉酶產(chǎn) 酶能力，具有獨(dú)特的鑒定標(biāo)簽，是一株極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的高溫a-淀粉酶的地衣芽孢 桿菌生產(chǎn)菌株。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的高溫淀粉酶基因工程菌株與野生型菌株在相同條 件下發(fā)酵誘導(dǎo)后，發(fā)酵菌體生物量比野生菌高1.3倍；高溫淀粉酶酶活比野生菌提高 2. 1倍。


圖1為pAXOI-SacB-vgb的結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、表達(dá)血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌整合載體的構(gòu)建 采用常規(guī)分子生物學(xué)融合PCR技術(shù)，將枯草芽胞桿菌SacB基因(果聚糖蔗糖酶 leva固crase)的啟動子及信號肽部分(Genebank Accession Number為X02730的5' 端第208-463位核苷酸序列)和帶有透明顫菌(Vitreoscilla:)血紅蛋白基因 (VHb) (Genebank Accession Number為L21670的5'端第101 — 541位核苷酸序列)連 接在一起。
以地衣芽孢桿菌G . "c力e/7j7bi7W's-/67) CICC10181基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，上游引物為引物l (5， cgggatcccccgtagtctgcaaatcctt 3，(下劃線標(biāo)注 部分為BamHI酶切位點(diǎn)))和下游引物為引物2 (5， atggtttgctggtctaacatcgttcatgtctcctttttta 3，(下劃線標(biāo)注的20個(gè)堿基對
4與血紅蛋白編碼基因的5，端互補(bǔ)，其余20個(gè)堿基對和SacB啟動子3，互補(bǔ)))。
擴(kuò)增條件預(yù)變性94。C 5分鐘，然后變性94。C l分鐘，退火56。C 一分鐘， 延伸72'C l分30秒。完成30個(gè)循環(huán)后，72"C保溫10分鐘。
擴(kuò)增產(chǎn)物為含sacB基因啟動子和信號肽的DNA序列。將PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物 膠回收試劑盒純化，進(jìn)行測序表明該片段具有Genebank Accession Number為X02730 的5'端第208-463位核苷酸序列為含sacB基因啟動子和信號肽的DNA序列的片段。 將該含sacB基因啟動子和信號肽的DNA序列的基因片段命名為sacB。
以透明顫菌vitreoscilla(由美國ATCC購得，保藏編號為ATCC 15551， Khosla C Mol Gen Genet. 1988 S??；214(1) : 158-61 ，北京中天諾亞體育新技術(shù)發(fā)展有限公 司)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為引物3
(TAAAAAAGGAGACATGAACGATGTTAGACCAGCAAACCAT (下劃線標(biāo)注的20個(gè)堿基對與血紅 蛋白編碼基因的5'端互補(bǔ)，其余20個(gè)堿基對和SacB啟動子3'互補(bǔ))和下游引物為 引物4 (5' tccatccgcggttattcaacctcttg (下劃線部分為SacII酶切位點(diǎn))。
擴(kuò)增條件預(yù)變性94T: 5分鐘，然后變性94t: l分鐘，退火58。C 一分鐘， 延伸72°C 1分鐘。完成30個(gè)循環(huán)后，72r保溫10分鐘。
將PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒純化，將回收得到的基因片段進(jìn)行測序，結(jié)果表明該 基因片段含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb，具有Genebank Accession Number為L21670 的5'端第101 — 541位核苷酸序列，將該片段命名為vgb。
采用融合PCR技術(shù)，將上述得到的sacB和vgb二個(gè)基因片段連接，按照分子比 1: l混勻?yàn)槟０?，以引?和引物4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增條件不加引物僅加模板，dNTP和DNA聚合酶擴(kuò)增循環(huán)預(yù)變性94"C 5 分鐘，再進(jìn)行5個(gè)循環(huán)變性94r l分鐘，退火56i:—分鐘，延伸72"C 1分30 秒。完成5個(gè)循環(huán)后再加引物1和引物4，然后再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增產(chǎn)物為約800bp的DNA片段?；厥债a(chǎn)物后進(jìn)行SacII和BanHI雙酶切回收大 片段，用SacII和BanHI酶切載體pAXOI (從美國俄亥俄州立大學(xué)菌種保存中心 (5^:/〃〃s Genetic Stock Center (BGSC)The Ohio State University購得)，回收載體片 段，然后將兩個(gè)片段采用T4 DNA連接酶在4"C進(jìn)行連接反應(yīng)16小時(shí)，將連接反應(yīng)產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化￡."http://丁0 10(購自北京天根生化科技有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆， 在LB培養(yǎng)基中37r過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和電泳驗(yàn)證，得到含有sacB的啟動 子和信號肽和vgb的地衣芽胞桿菌整合質(zhì)粒，將其進(jìn)行測序驗(yàn)證，將測序表明含有sacB 的啟動子和信號肽和vgb正確的重組載體命名為pAXOl-sacB-vgb (其結(jié)構(gòu)如圖1所 示)。
5實(shí)施例2、表達(dá)高溫a -淀粉酶的工程菌WY的構(gòu)建
將實(shí)施例l構(gòu)建的帶有sacB啟動子、信號肽、vgb的地衣芽胞桿菌整合質(zhì)粒 pAXOI-SacB-vgb以原生質(zhì)體加電穿孔法(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)轉(zhuǎn)化產(chǎn)高溫淀粉的地衣芽孢桿菌CICC10181 (購于 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CICC10181)，具體方法如下所述
采用Romero D地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體制備方纟去(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)獲得地衣芽孢桿菌CICC10181原 生質(zhì)體后，取5ul (2ug)純化后的質(zhì)粒pAXOI-SacB-vgb于一個(gè)1.5 ml的離心管 中，將其和0.2CM的電擊杯放在冰上預(yù)冷，將120ul制備好的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入至上述 裝有pAXOI-SacB-vgb的1. 5 ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min，然后 開啟電轉(zhuǎn)儀，調(diào)電壓到600V;將質(zhì)粒和原生質(zhì)體細(xì)胞混合液移到已經(jīng)預(yù)冷的電 擊杯中，用干濾紙擦干電擊杯，注意混合液中不得有氣泡。將電擊杯放入電轉(zhuǎn) 儀的杯槽中，按下電擊鍵，有放電聲出現(xiàn)后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入lml細(xì)胞復(fù) 蘇緩沖液(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的離心管中。
將上述裝有轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞的離心管放置37°C， lOOrpm搖床培養(yǎng)12-16小 時(shí)，取150ul菌液涂布于含有10ug/ml紅霉素的DM3固體培養(yǎng)基(含8g/L瓊脂， 5g/L水解酪蛋白，5g/L酵母粉，1.5g/LKH2P04， 3.5g/L K2HP04， 45.5g/L山梨醇和 10g/L淀粉的培養(yǎng)基)平板，放入37t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 — 96小時(shí)后出現(xiàn)地衣芽孢桿 菌的單菌落，挑取單菌落即為可在含lOug/ml紅霉素平板上生長的陽性克隆， 將得到的陽性菌株提取基因組基因，用引物3和引物4進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn) 物為約800bp的DNA片段的菌株為陽性菌株，結(jié)果表明得到一株表明正確的導(dǎo) 入pAXOI-SacB-vgb的重組菌株，將該菌株命名為地衣芽孢桿菌(S^///^ "c/zem/orm/力WY。該i也衣芽孢桿菌C8ac/〃w丄/c/^m/w7mX) WY CGMCC No.2830，巳于 2008年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC No.2830。
實(shí)施例3、基因重組地衣芽孢桿菌WY高溫淀粉酶表達(dá)驗(yàn)證
采用500毫升帶檔板的三角瓶，裝培養(yǎng)基的量為50ml，將實(shí)施例2所得地衣芽孢 桿菌WY或地衣芽孢桿菌U Zic力e/^Ybr肌'5-767) CICC10181 (野生菌)分別按照0. Olg 菌體/ral培養(yǎng)基的量接種于一個(gè)三角瓶中，在37。C搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。發(fā) 酵48h時(shí)，向搖瓶內(nèi)加終濃度為20g/L的蔗糖誘導(dǎo)，發(fā)酵96h，終止發(fā)酵。兩組處理 分別設(shè)三個(gè)重復(fù)。所述培養(yǎng)基的組成為豆餅粉26. lg/L，棉籽餅粉21.1g/L，氯化鈣0.46g/L，硫 酸銨5g/L，檸檬酸鈉2g/L，磷酸氫二鉀14g/L，磷酸二氫鉀6g/L，玉米漿21. lg/L， 乳糖105g/L (獨(dú)立滅菌)，pH值為6.7，其余為水。
發(fā)酵過程中，取發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活檢測。高溫淀粉酶活檢測采用中華人民共和 國家標(biāo)準(zhǔn)法測定(QB/T2306-1997);酶活的定義為在7(TC， pH6. 0條件下，1分鐘液 化1毫克可溶性淀粉成為糊精所需的酶量，即為一個(gè)酶活力單位，以U/ml或U/g表 示。
結(jié)果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)96小時(shí)，重組地衣芽孢桿菌WY的酶活達(dá)到9100U/ml發(fā) 酵液，生物量達(dá)到20g菌/L發(fā)酵液，而野生菌地衣芽孢桿菌(及"c力e/^'/b2m^-757) CICC10181酶活為4200U/ml，生物量為12g/L發(fā)酵液。地衣芽孢桿菌WY酶活(9100U/ml 發(fā)酵液)比野生菌提高2. l倍。
權(quán)利要求
1、表達(dá)高溫α-淀粉酶的工程菌，是將表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組載體導(dǎo)入地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis)中，篩選得到的高溫α-淀粉酶表達(dá)量提高的工程菌株；所述透明顫菌血紅蛋白基因具有GENBANK Accession Number為L21670的5′端第101—541位核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組載體中所述透明顫菌血紅蛋白基因的5'端連接有sacB基因啟動子和信號肽 編碼基因的DNA片段；所述sacB基因啟動子和信號肽編碼基因的DNA片段具有 Genebank Accession Number為X02730的5'端第208-463位核昔酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于所述地衣芽孢桿菌(few7勿s /^c力e/wYbraw's)為地衣芽孢桿菌(5sciW"s Zj'c/ e"j'/anoi5) CICC10181 。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌，其特征在于所述表達(dá)高溫a-淀粉酶的工程 菌為地衣芽孢桿菌(ifed'WM Zic力e;w'/ar/w'6") WY CGMCC No.2830。
5、 一種表達(dá)高溫a-淀粉酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的表達(dá) 高溫a -淀粉酶的工程菌，在發(fā)酵過程中加入蔗糖誘導(dǎo)培養(yǎng)得到高溫a -淀粉酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵用培養(yǎng)基為含有26. lg/L 豆餅粉，21. lg/L棉籽餅粉，0.46g/L氯化鈣，5g/L硫酸銨，2g/L檸檬酸鈉，14g/L 磷酸氫二鉀，6g/L磷酸二氫鉀，21. lg/L玉米漿，105g/L乳糖的液體培養(yǎng)基。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述蔗糖加入的質(zhì)量百分比終濃 度為2%-4%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述蔗糖加入的時(shí)間是所述發(fā)酵培 養(yǎng)后40 — 48小時(shí)；所述發(fā)酵的時(shí)間為72 96小時(shí)，所述發(fā)酵的溫度為37°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)高溫α-淀粉酶的基因工程菌株。該工程菌是是將表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組載體導(dǎo)入地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)中，篩選得到的高溫α-淀粉酶表達(dá)量提高的工程菌株；所述透明顫菌血紅蛋白基因具有GENBANK Accession Number為L21670的5′端第101-541位核苷酸序列。該工程具有比目前國內(nèi)生產(chǎn)菌株更高的高溫α-淀粉酶產(chǎn)酶能力，具有獨(dú)特的鑒定標(biāo)簽，是一株極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的高溫α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌生產(chǎn)菌株。
文檔編號C12N1/21GK101451116SQ200810246738
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者楊建國, 兵 汪 申請人:北京中天諾亞體育科技有限公司