專利名稱：：尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：棉花纖維是從胚珠外表皮細(xì)胞分化而來的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。棉花纖維是紡織工業(yè)的重要原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。纖維質(zhì)量決定其最終的長度與強(qiáng)度。同時，棉纖維細(xì)胞也是研究細(xì)胞伸長、分化和細(xì)胞壁合成等重要生物學(xué)現(xiàn)象的理想系統(tǒng)。所以研究纖維伸長有重要的經(jīng)濟(jì)價值和理論意義。棉花纖維細(xì)胞的發(fā)育過程是細(xì)胞超常伸長和細(xì)胞壁超常加厚的過程。陸地棉長度約為3.0cm左右，陸地棉細(xì)胞壁直徑為11-22um，也就是說長寬比為1000-3000。棉花纖維細(xì)胞的形成一般可以分為四個相互有重疊的時期纖維起始，細(xì)胞伸長(初生壁形成)、次生壁沉積和成熟期。細(xì)胞壁是植物區(qū)別與動物的主要器官之一。初生細(xì)胞壁主要由纖維素、果膠、半纖維素等多糖組成。一些特殊細(xì)胞，如棉花纖維、木質(zhì)部和厚壁組織細(xì)胞，會在停止生長之后繼續(xù)在初生壁內(nèi)部淀積次生細(xì)胞壁，主要有纖維素、半纖維素和少量木質(zhì)素組成。細(xì)胞壁的沉積與改變對植物的生長、發(fā)育以及對外界環(huán)境的響應(yīng)都有重要的作用。它最終決定了細(xì)胞的大小與形狀。植物細(xì)胞壁果膠主要由三類多糖混合而成同聚半乳糖醛酸(HGA)、聚鼠李半乳糖醛酸I(RGI)和聚鼠李半乳糖醛酸II(RGII)。同聚半乳糖醛酸是半乳糖醛酸的同聚物。聚鼠李半乳糖醛酸I是重復(fù)的鼠李糖和半乳糖醛酸二糖單元組成的異聚體，其中鼠李糖殘基還連有阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。聚鼠李半乳糖醛酸II是經(jīng)過修飾的同聚半乳糖醛酸，是連接結(jié)構(gòu)多樣化的多糖，它在細(xì)胞壁中的含量很低。植物細(xì)胞壁豐富的多糖是由尿苷二磷酸葡萄糖經(jīng)一系列的轉(zhuǎn)化成各種核苷糖，再經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶合成的，鼠李糖是組成聚鼠李半乳糖醛酸i和聚鼠李半乳糖醛酸n的主要糖單元之一，尿苷二磷酸鼠李糖(UDP-L-Rhamnose)是合成含鼠李糖多糖的活化前體，它是由尿苷二磷酸鼠李糖合酶和尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶(UDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose3,5-印imerase4-reductase，UER)負(fù)責(zé)合成的。2002年，Tokumoto等研究發(fā)現(xiàn)，在纖維伸長期，細(xì)胞壁基質(zhì)多糖(主要是果膠與半纖維素)占細(xì)胞壁糖總量的30-50%，而到次生壁加厚期，該比重迅速下降到3%。1999年，Chanliaud和Gidley等證實，果膠多糖可以通過參與纖維素的淀積而影響細(xì)胞壁的性質(zhì)。同年，Wen等發(fā)現(xiàn)，抑制果膠甲酯酶的表達(dá)可以改變豌豆根部細(xì)胞的性狀，從而使根變短。2003年，Jones等使用阿拉伯聚糖酶水解果膠RGI，使離體鴨跖草葉片氣孔的開閉功能失去。2006年，Moore等研究J6t"A3v^m/7We2^zYbh7/s(經(jīng)過數(shù)次長期干旱失水依然能遇水復(fù)活)的葉子細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，富含阿拉伯聚糖的細(xì)胞壁多糖的存在賦予其多次失水和水化的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。以上研究均表明，果膠多糖對細(xì)胞的伸長和細(xì)胞壁的靈活性非常重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶，是與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)的蛋白，該蛋白命名為GhUERl，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)由a)衍生的蛋白質(zhì)。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。其中，序列表中序列2由300個氨基酸殘基組成。為了使a)的GhUERl蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述b)中的GhUERl蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述b)中的GhUERl蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端第45-947位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白的編碼基因，是如下l)至4)中任一所述的基因；1)其核苷酸序列是序列表中序列l(wèi);2)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第45-947位；3)在嚴(yán)格條件下與l)或2)或3)限定的DNA片段雜交且編碼與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)的蛋白的DNA分子；4)與l)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性，且編碼與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)的蛋白的DNA分子。所述步驟4)中的基因，與l)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1234個核苷酸組成，自5'末端第45-947位為編碼序列，編碼序列表中序列2所示的蛋白。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。含有上述""￡7(7基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌、擴(kuò)增所述基因的全長及其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有^^^7基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。攜帶有本發(fā)明的"汲)W基因的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。使用"汲7i7基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。5為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育高尿苷二磷酸鼠李糖含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育高尿苷二磷酸鼠李糖含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到尿苷二磷酸鼠李糖含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。其中，所述植物具體可為棉花。本發(fā)明的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因可用來培育纖維長度增加的棉花。本發(fā)明的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶編碼基因在纖維快速伸長期(開花后10天)表達(dá)豐度最高，并且快速伸長的纖維初生細(xì)胞壁含有大量的鼠李糖，說明6M^A7是合成果膠多糖中的鼠李糖的關(guān)鍵步驟，對纖維伸長非常重要。將本發(fā)明的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶編碼基因?qū)朊藁ㄖ校瑥亩姑藁ɡw維長度增加，提高棉纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。本發(fā)明的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因具有重大的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景。圖1為"ffi77在棉花不同發(fā)育時期的表達(dá)水平分析。圖2為棉纖維和胚珠的初生壁糖成分的氣相色譜分析。圖3為UDP-鼠李糖對纖維伸長的影響。圖4為乙烯處理對"ffi〗W基因表達(dá)水平的影響。圖5為純化的fMffiW蛋白。圖6為"戰(zhàn)Vf7蛋白的活性。具體實施例方式下述實施例中所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明均為質(zhì)量百分含量。實施例1、尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶編碼基因的克隆一、CMSW基因的克隆選取野生型陸地棉品種徐州142(WT)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的國家中期棉花種子庫)開花后10天的纖維，提取總RNA，總RNA的提取按Promega公司的RNAgentsTotalRNAIsolationSystemkit進(jìn)行。取5g的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的一鏈，反應(yīng)體系如下總RNA10叱(5Pg)、Oligo(dT)(20Wnol/L)1.5叱、10Xbuffer2.5PL、dNTPmix(2.5腸1/U2叱、滅菌水8叱。42。C水浴lmin后向反應(yīng)體系中加入l叱(200U)SuperscriptIIRT，輕輕混合，42。C保溫50min;7(TC水浴15min，終止該反應(yīng)；獲得cDNA的第一鏈。設(shè)計引物進(jìn)行PC財廣增，引物序列如下Pl:5'GCATTTTCAACCAMAAATTCAAA3';P2:5'TCATAACCAGATGAAACCATTTCC3'。PCR擴(kuò)增條件為先94。C3min;然后94。Clmin，57°C45s，72°C2min，30個循環(huán)；最后72。C10min。PCR擴(kuò)增出約1234bp的片段，回收后連接到pGEM-TEasy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-fi^^V，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取酶切鑒定正確的陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，克隆得到的cDNA序列如序列表中序列l(wèi)所示，其編碼序列是序列表中序列l(wèi)自5'末端第45-947位，編碼序列表中序列2所示的蛋白。二、ft^aw表達(dá)水平與纖維伸長的關(guān)系選取不同發(fā)育時期的野生型陸地棉品種徐州142(WT)和無絨無絮突變體(FL)棉花(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的國家中期棉花種子庫)，利用實時定量PCR分析ftM5V7的表達(dá)水平。具體步驟如下RNA的提取根據(jù)操作手冊Micro-TO-MidiTotalRNAPurificationSystem(Invitrogen，USA)從野生型陸地棉品種徐州142開花當(dāng)天以及開花后3天的胚珠、開花后5、10、15、20和25天的纖維，以及無絨無絮突變體和野生型陸地棉品種徐州142開花后10天的胚珠中分別提取總RNA。cDNA模板的制備以5ug的總RNA為模板，用DNA酶I消化基因組DNA，然后根據(jù)操作手冊用SUPERSCRIPTTM第一條鏈合成系統(tǒng)合成cDNA第一條鏈。實時定量PCR:分別設(shè)計6^Z^C7和"促V^基因特異引物，選取看家基因棉花泛素(Ubiquitin，UBQ)作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)DyNAmoSYBRGreenQpcrKit(Finnzymes，USA)操作手冊進(jìn)行實時定量PCR分析"戰(zhàn)7W的表達(dá)。ftW/^7引物5，序列5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3';6M/"。7引物3，序列5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3'。C/您yi7引物5，序列5'-CACTTGAGTCCGACATAGCCAAC-3，；ffl^77引物3，序列5'-TCCTTAAACCCGATACCCGTTC-3'。反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)參數(shù)95。C預(yù)變性20s，42個循環(huán)擴(kuò)增(每個循環(huán)包括94。C變性10s，58°C退火20s，72。C延伸30s)，然后讀取78-80。C采集的熒光數(shù)據(jù)；最后延伸5min。實時定量PCR結(jié)果如圖1所示，^促VW表達(dá)在野生型陸地棉品種徐州142開花后10天的胚珠和無絨無絮突變體開花后10天的胚珠中豐度很低，但是在開花后10天的野生型陸地棉品種徐州142的纖維中豐度最高，這說明ffl^7i7在纖維細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上調(diào)，對纖維的發(fā)育可能具有重要作用。圖1中，WT-F表示野生型陸地棉品種徐州142的纖維，WT-O表示野生型陸地棉品種徐州142胚珠，F(xiàn)L-O表示無絨無絮突變體胚珠，其后的數(shù)字代表開花后的天數(shù)。三、棉纖維和胚珠的初生壁醛酸糖成分的氣相色譜分析具體步驟如下1.多糖分解稱取10mg細(xì)胞壁，加入1.25ml2M的三氟乙酸(TFA)，加入50nl的5mg/ml肌醇作內(nèi)標(biāo)，120°C，2h;離心，上清取250ul轉(zhuǎn)入15ml離心管中，40度水浴條件下氮氣吹干。2.加入245ul2.6M的氨水，再加700ul2%(質(zhì)量百分比)的硼氫化鈉(用二甲亞砜溶解)，40°C水浴，90min。3.加入175ul乙酸，中和。4.加入175wl1-甲基咪唑，2.8ml乙酸酐，室溫反應(yīng)15min。5.加入5.6ml水，1ml二氯甲垸(DCM)，萃取糖衍生物(DCM相)。6.DCM相用氮氣吹干，用200ulDCM重懸，再用lml水萃取雜質(zhì)，離心分層。7.10u1DCM相用于GC-MS分析，HP-5柱，程序110°C，2min，10°C/min升至200°C，保持5min，1(TC/min升至250。C，保持10min，10°C/min升至240。C，保持10min;各糖成分先根據(jù)標(biāo)樣保留時間進(jìn)行鑒定，然后再用質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分析，開花10天的纖維和胚珠((WT-F-IO、FL-0-IO和WT-O-10)的細(xì)胞壁中，開花10天的纖維的細(xì)胞壁中的鼠李糖含量比胚珠中顯著增高。圖2中，WT-F表示野生型陸地棉品種徐州142的纖維，WT-O表示野生型陸地棉品種徐州142胚珠，F(xiàn)L-0表示無絨無絮突變體胚珠，其后的數(shù)字代表開花后的天數(shù)。四、UDP-鼠李糖對纖維伸長的影響胚珠培養(yǎng)液的物質(zhì)組成見表1。開花后1天的棉花胚珠用來進(jìn)行培養(yǎng)實驗，步驟如下1)開花后1天的野生型陸地棉品種徐州142棉桃采摘下來后，用10%次氯酸鈉浸泡10-15分鐘，再用胚珠培養(yǎng)液清洗4次；2)用酒精燈燒過的小鑷子和手術(shù)刀小心將胚珠放入裝有胚珠培養(yǎng)液的50ml三角瓶中，并加入5uM的UDP-鼠李糖；3)將裝有胚珠的三角瓶放到溫箱中暗培養(yǎng)，注意不要晃動三角瓶。以不加UDP-鼠李糖作為對照。結(jié)果如圖3所示，l代表對照，2代表加入5uM的UDP-鼠李糖；說明UDP-鼠李糖可以顯著促進(jìn)纖維的伸長。五、乙烯處理對"力戰(zhàn)VW基因表達(dá)水平的影響野生型陸地棉品種徐州142棉花胚珠在胚珠培養(yǎng)液中培養(yǎng)，加入0.1PM的乙烯并密封，37度恒溫培養(yǎng)。以未加入乙烯在胚珠培養(yǎng)液中培養(yǎng)的胚珠為對照。分別于3、6、12小時收集乙烯處理和對照的胚珠，分別提取總RNA、按照(二)中的方法進(jìn)行實時定量PCR。結(jié)果如圖4所示，說明乙烯可顯著促進(jìn)"汲yy基因的表達(dá)。六、"戰(zhàn)y7的酶活性測定1)原核表達(dá)載體構(gòu)建。以野生型陸地棉品種徐州142cDNA為模板，用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增GhUER1-5，primer:5'-GGATCCATGGGGTTTCCGGCAAATG-3，；GhUERl-3，primer:5，-TCGACCTGATCAAGCTCCACCAGTCTTC-3'。GhRHMl-N369-5，primer:5，-GCTAGCATGTCTTCTTATACCCCTAAGAACATCC-3，；GhRHMl-N369-3，primer:5，-GTCGACTTAMCCACCATTCGGGTCTGATTAG-3，。GhRHMl-N369-5，primer和GhRHMl-N369-3，primer擴(kuò)增出的片段為為棉花R服l的N端369個氨基酸的多肽的編碼基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pET28a連接獲得pET28a-GhUERl和pET28a-GhRHM1-N369。2)GhUERl的誘導(dǎo)表達(dá)將pET28a-GhUERl和pET28a-GhRHM1-N369分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS，陽性菌株在0D6。。0.6-0.8時加入IPTG，誘導(dǎo)4小時后，重組蛋白用Ni離子柱純化，分別獲得純化的GhUERl蛋白和RHM-N369蛋白(圖5)，圖5中，1代表未加入IPTG誘導(dǎo)，2代表加入IPTG誘導(dǎo)，3代表純化后的蛋白。3)活性測定3mMUDP-Glc、3mMNADPH、10ug純化的GhUERl蛋白和RHM-N369蛋白溶于100uL100mM的磷酸鈉緩沖液中(pH7.0)，3(TC反應(yīng)60min;加入100yL氯仿終止反應(yīng)，16,000g離心5min;收集水相，有機(jī)相再用80uL水萃取一次，合并水相。用ZORBAXEclipseXDB-C18柱分析水相，HPLC程序:100%(體積百分比)bufferA(100mM磷酸鉀緩沖液含8mM四丁基硫酸氫銨，pH6.5)持續(xù)5min，27min內(nèi)梯度增加bufferB[70%(體積百分比)bufferA，30%(體積百分比)甲醇，pH6.5]—直到77%(體積百分比)的bufferB，77%(體積百分比)bufferB持續(xù)5min，流速為lmL/min，254nm檢測產(chǎn)物。水相用三甲基硅烷法(TMS)衍生，用GC/MS鑒定反應(yīng)產(chǎn)物，方法如下水相加入2M的三氟乙酸(TFA)，120°C，2h，氮氣吹干；加入含20mg/ml甲氧胺鹽酸鹽(methoxyaminehydrochloride)的吡啶溶液lOOul;37。C反應(yīng)2小時；加入100ul硅烷化試劑[雙(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(BSTFA)+TMS]，37。C反應(yīng)0.5小時；取10u1反應(yīng)液用于GC-MS分析，DB-5MS柱，程序160°C，1min，10°C/min升至172°C，5。C/min升至208°C，10sec降到200。C，保持2min，30sec降到160°C，保持2min。植物細(xì)胞中的UDP-鼠李糖是RHM和UER共同合成的。經(jīng)HPLC和GC/MS分析，以UDP-Glc為底物，RHM-N369蛋白可以產(chǎn)生大量的UDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖，再加入GhUERl蛋白即可轉(zhuǎn)化為UDP-鼠李糖(圖6A和B)，說明GhUERl蛋白能催化UDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-鼠李糖，具有尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶活性。圖6中，A為HPLC檢測UDP-Glc、NADPH、GhUERl蛋白和RHM-N369蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物；B為UDP-Glc、NADPH、GhUERl蛋白和RHM-N369蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物TMS衍生分析。圖6A中，1代表UDP-Glc，2代表NADPH，3代表UDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖，4代表NADP+，5代表UDP-鼠李糖。表l.棉花胚珠組織培養(yǎng)液成分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表<110>北京大學(xué)〈120〉尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因與應(yīng)用<130〉CGGNARW82105〈160〉2<210〉1<211〉1234〈212〉DNA<213>棉屬棉花6OS5y/^.咖5"pp.,〈400〉1gcattttcsaccaa肌aattc犯犯3Eiaa^attct3a^tEi8gtgatggggtttccggcaa60atggctcatcggacaaaccattgaagttcctgatctacggtcgaaccggttggatcggtg120gtttgttaggcaaactctgcgaatcccagggaatcgattacgagtacggctccggccgtt180tggagaaccggatttcacttgagtccgacatagccaacgtgaaaccgacccatgtattca240atgccgccggtgtcaccggtcgtccgaacgtcgattggtgcgaatcccataaggtcgaga300ccatcagaaccaatgtggtcgggacccttaccctcgctgacgtttgcagagacaaaggcc360tcatattgattaattatgctacaggttgtatctttgagtacgatgaggctcatcagatcg420gaacgggtatcgggtttaaggaagaggatactcctaatttcatcggttccttttattcta48012agaccaaagctatggtggaggaattgctcaagaattatgaaaatgtatgtaccttgcgag540ttaggatgcctatttcatcggatttagccaatccccgaaacttcatcacaaaaataactc600ggtacgataaagtggttaacattcctaactcgatgaccatcctcgatgagcttcttccga660tttccatcgagatgggaaagaggaacttgaccggcatttggaactttacaaacccgggag720tggtcagtcacaatgagatattagaaatgtaccgtgactacattgaccctaacttcacct780ggaagaacttcaatctcgaggagcaggccaaagttatcgtagccccgagaagcaacaacg840aacttgatgcgaccaaattgaagacagaattccctgagctcctttcgattaaagagtctc900ttattaagtatgtattcgaaccgaataagaagactggtggagcttgatcagttactttgc恥Octgttaaaaagtttgtcttcaaaggtaaactatgtgagactagttgagcctgagatttta1020ggttacgaattcattgattttcctctctttttttatcatcttttttatgaatttggttcg1080tgtgggtcgatatggatggtgataacctcgggcgatacgcacgcacgcctcttcccagat1140gacttgaaagattgctggtatttcgtatttgaatgttgtattcatatatgaacatttgaa1200taagtcagttggaaatggtttcatctggttatga1234〈210>2〈211〉300〈212〉PRT〈213〉棉屬棉花(^"os5Tpi鵬印p.J13<400〉2MetGlyPheProAlaAsnGlySerSerAspLysProLeuLysPheLeu151015lieTyrGlyArgThrGlyTrplieGlyGlyLeuLeuGlyLysLeuCys202530GluSerGinGlylieAspTyrGluTyrGlySerGlyArgLeuGluAsn354045ArglieSerLeuGluSerAsplieAlaAsnValLysProThrHisVal505560PheAsnAlaAlaGlyValThrGlyArgProAsnValAspTrpCysGlu65707580SerHisLysValGluThrlieArgThrAsnValValGlyThrLeuThr859095LeuAlaAspValCysArgAspLysGlyLeulieLeulieAsnTyrAla100105110ThrGlyCysliePheGluTyrAspGluAlaHisGinlieGlyThrGly115120125lieGlyPheLysGluGluAspThrProAsnPhelieGlySerPheTyr130135140SerLysThrLysAlaMetValGluGluLeuLeuLysAsnTyrGluAsn145150155160ValCysThrLeuArgValArgMetProlieSerSerAspLeuAlaAsn165170175ProArgAsnPhelieThrLyslieThrArgTyrAspLysValValAsn180185190lieProAsnSerMetThrlieLeuAspGluLeuLeuProlieSerlie195200205GluMetGlyLysArgAsnLeuThrGlylieTrpAsnPheThrAsnPro210215220GlyValValSerHisAsnGlulieLeuGluMetTyrArgAspTyrlie225230235240AspProAsnPheThrTrpLysAsnPheAsnLeuGluGluGinAlaLys245250255VallieValAlaProArgSerAsnAsnGluLeuAspAlaThrLysLeu260265270LysThrGluPheProGluLeuLeuSerlieLysGluSerLeulieLys275280285TyrValPheGluProAsnLysLysThrGlyGlyAla290295300權(quán)利要求1、一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與尿苷二磷酸鼠李糖的合成相關(guān)由a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l(wèi);2)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第45-947位；3)在嚴(yán)格條件下與l)或2)或3)限定的DNA片段雜交且編碼與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)的蛋白的DNA分子；4)與l)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性，且編碼與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)的蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6、一種培育高尿苷二磷酸鼠李糖含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到尿苷二磷酸鼠李糖含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述植物為棉花。8、擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長及其任意片段的引物對。9、權(quán)利要求l所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體、權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育纖維長度增加的棉花中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與尿苷二磷酸鼠李糖合成相關(guān)由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了該蛋白的編碼基因。將本發(fā)明的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶編碼基因?qū)朊藁ㄖ?，從而使棉花纖維長度增加，提高棉纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。本發(fā)明的尿苷二磷酸-4-酮-6-脫氧葡萄糖異構(gòu)還原酶及其編碼基因具有重大的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景。文檔編號C12N9/02GK101451126SQ20081024672公開日2009年6月10日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者龐朝友,朱玉賢,慧王,秦詠梅,宇逄,翔靳申請人:北京大學(xué)