一種植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及一種來自 萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)的磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI的分離和克隆 及應用。
【背景技術】
[0002] 轉(zhuǎn)基因技術，是20世紀80年代初發(fā)展起來的一種有效的植物定向改良方法。該 技術主要通過農(nóng)桿菌介導、基因槍轉(zhuǎn)化等方法將目的基因?qū)胧荏w，經(jīng)過標記篩選和分子 檢測，獲得穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)化體，實現(xiàn)目標性狀的快速定向改良，具有可用基因資源廣、改良 效率高等優(yōu)點。轉(zhuǎn)基因技術為農(nóng)作物的產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良和抗性增強提供了新路徑、開拓 了新空間。
[0003] 但現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術，主要使用抗生素抗性基因作為篩選標記，該類基因可能隨食 物進入腸道，存在與腸道微生物基因交換產(chǎn)生耐藥菌株的潛在風險，以致影響抗生素的醫(yī) 用效果。為了替代抗生素抗性基因，其他類型篩選標記基因被陸續(xù)研宄開發(fā)，如除草劑抗性 基因、氨基酸代謝篩選基因、可視標記基因等，但這些篩選標記基因要么存在類似問題，要 么篩選效率和成本不適于規(guī)?；瘧?。
[0004] 而磷酸甘露糖異構酶是一種糖代謝基因。水稻等高等植物細胞雖能將甘露糖轉(zhuǎn)化 為6-磷酸甘露糖，但由于細胞自身缺乏磷酸甘露糖異構酶，不能進一步將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn) 化為6-磷酸果糖，從而進入糖酵解途徑而被利用，因此磷酸甘露糖異構酶可以作為篩選標 記基因。與抗生素、除草劑等負選擇不同，甘露糖是進行正選擇，轉(zhuǎn)化的細胞表達磷酸甘露 糖異構酶，可以利用甘露糖為碳源而正常生長，篩選效率高。
[0005] 但現(xiàn)在廣泛使用的磷酸甘露糖異構酶是從原核生物大腸桿菌中分離而來的，這是 因為目前人們還沒有意識到從原核生物大腸桿菌中分離出的磷酸甘露糖異構酶可能對轉(zhuǎn) 化受體基因組造成不利影響，還可能引發(fā)對其安全性的擔憂，或者是人們對這種從原核生 物大腸桿菌中分離出的PMI的安全性沒有引起足夠的重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于本申請的發(fā)明人在轉(zhuǎn)基因領域多年的研宄經(jīng)驗，意識到從原核生物大腸桿菌 中分離出的磷酸甘露糖異構酶可能對轉(zhuǎn)化受體基因組造成不利影響，還可能引發(fā)對其安全 性的擔憂。
[0007] 針對上述問題，本發(fā)明希望獲得植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因。出于該目的， 本申請的發(fā)明人針對不同可能含有磷酸甘露糖異構酶基因的植物進行了大量植物提取實 驗，并最終從萊茵衣藻中成功提取出了磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI。
[0008] 具體而言，在第一個方面，本發(fā)明提供一種植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因 ChlaPMI，該磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。更具體 而言，該磷酸甘露糖異構酶基因來自萊茵衣藻，本發(fā)明將其命名為ChlaPMI。該序列是以細 菌的磷酸甘露糖異構酶蛋白序列為基準，在可利用甘露糖的衣藻基因組序列中比對同源序 列，獲得與細菌的磷酸甘露糖異構酶具有高度同源性的序列，然后，再以萊茵衣藻RNA反轉(zhuǎn) 錄的cDNA為模板，通過RT-PCR獲得ChlaPMI核苷酸序列。
[0009] 在第二個方面，本發(fā)明還對ChlaPMI蛋白代謝甘露糖活性進行了鑒定，具體而言， 本發(fā)明通過設計ChlaPMI原核表達引物，經(jīng)亞克隆獲得融合GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶， glutathione-S-transferase)片段的原核表達載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21，通過 苯酚紅顏色反應鑒定ChlaPMI的活性。
[0010] 在第三個方面，本發(fā)明提供一種含有所述ChlaPMI基因的植物表達載體。構建方 法是利用XhoI酶切位點，用XhoI酶切pCAMBIA1381載體并回收，由于合成的ChlaPMI序 列兩端加有XhoI酶切位點，可以利用1\連接酶將ChlaPMI連接到pCAMBIA1381載體，得 到植物表達載體pCAMBIA1381-ChlaPMI。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供一種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含上述的 ChlaPMI基因。
[0012] 在另一個方面，本發(fā)明提供一種利用pCAMBIA1381-ChlaPMI表達載體，獲得可以 甘露糖為碳源的水稻轉(zhuǎn)化細胞的方法，包括下述步驟：
[0013] (1)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈 傷組織；
[0014] (2)將次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導培養(yǎng)基預培養(yǎng)；
[0015] (3)將步驟（2)中獲得的愈傷組織與攜帶ChlaPMI篩選標記基因的農(nóng)桿菌接觸15 分鐘；
[0016] (4)將步驟（3)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到上墊上三張無菌濾紙（加入2. 5-3. 5mL農(nóng)桿菌 懸浮培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿中，21-23°C培養(yǎng)48小時；
[0017] (5)將步驟⑷的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天；
[0018] (6)將步驟（5)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有甘露糖的篩選培養(yǎng)基上，以獲得可利用甘 露糖為碳源的水稻抗性愈傷組織（水稻細胞）。
[0019] 其中所述步驟（1)中的種子是水稻成熟種子；所述步驟（1)、（2)中的誘導培養(yǎng)基 是說明書表1所列出的誘導培養(yǎng)基；所述步驟（3)中的與農(nóng)桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在 所述農(nóng)桿菌懸浮液中；所述步驟（4)中的農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基是說明書表1所列出的懸浮培 養(yǎng)基；所述步驟（5)中的前篩選培養(yǎng)基是說明書表1所列出的前篩選培養(yǎng)基；所述步驟（6) 中的篩選培養(yǎng)基是說明書表1所列出的篩選培養(yǎng)基。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供一種上述基因、表達盒或載體的應用，其特征在于，所述應 用包括利用所述ChlaPMI基因作為篩選標記，基于上述方法獲得植物（尤其是水稻）抗性 愈傷組織，然后利用植物抗性愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植物或植物部分。
[0021] 優(yōu)選地，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花丼作物、能源作物。
[0022] 優(yōu)選地，所述植物部分包括：細胞、原生質(zhì)體、細胞組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細胞塊、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種子。
[0023] 在優(yōu)選的實施方案中，其中所述水稻是粳稻，更優(yōu)選地，所述水稻是粳稻品種日本 晴。
[0024] 下面的表1中給出了在一種優(yōu)選實現(xiàn)方式中，本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基的示例性配 方。本領域技術人員應該理解，各培養(yǎng)基除了采用本發(fā)明的特殊配方之外，還可以采用普通 的培養(yǎng)基，其也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的，只是效果上存在一定差異。
[0025]
【主權項】
1. 一種植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI，該磷酸甘露糖異構酶基因 ChlaPMI的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2. -種原核表達載體，其特征在于，所述原核表達載體包含權利要求1所述的磷酸甘 露糖異構酶基因ChlaPMI。
3. 根據(jù)權利要求1所述的磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI或根據(jù)權利要求2所述的原 核表達載體，其特征在于，具有權利要求1所述的ChlaPMI基因或權利要求2所述的原核表 達載體的表達菌株經(jīng)苯酚紅顏色鑒定方法鑒定，具有代謝甘露糖能力。
4. 一種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含權利要求1所述的磷酸甘露糖異構酶 基因 ChlaPMI。
5. -種植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體包含權利要求1所述的磷酸甘 露糖異構酶基因ChlaPMI和/或權利要求4所述的表達盒。
6. -種利用含有權利要求1中所述的磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI的植物表達載體 獲得植物轉(zhuǎn)化細胞的方法，包括下述步驟： (1) 將植物種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈 傷組織； (2) 將所述次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)，獲得能夠用于 轉(zhuǎn)化的愈傷組織； (3) 將步驟（2)中獲得的愈傷組織與農(nóng)桿菌接觸15分鐘，其中，所述農(nóng)桿菌中引入了所 述植物表達載體，所述植物表達載體中攜帶所述的磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI ; (4) 將步驟（3)處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到其上墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在21-23°C培 養(yǎng)48小時； (5) 將步驟（4)處理后的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天； (6) 將步驟（5)處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織，所述篩 選培養(yǎng)基中包含甘露糖，所述抗性愈傷組織為能夠代謝甘露糖的植物轉(zhuǎn)化細胞。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物為水稻，所述植物轉(zhuǎn)化細胞為水 稻轉(zhuǎn)化細胞。
8. -種權利要求1所述磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI、權利要求4所述的表達盒、權 利要求5所述的植物表達載體的應用，其特征在于，所述應用包括利用所述磷酸甘露糖異 構酶基因ChlaPMI作為篩選標記，基于權利要求6所述的方法獲得植物轉(zhuǎn)化細胞，并利用所 述植物轉(zhuǎn)化細胞獲得轉(zhuǎn)基因植物或植物部分。
9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花丼 作物、能源作物。
10. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述植物部分包括：細胞、原生質(zhì)體、細 胞組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和 種子。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI，該磷酸甘露糖異構酶基因ChlaPMI的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明還提供一種含有ChlaPMI的原核表達載體，其可以用于鑒定ChlaPMI蛋白代謝甘露糖活性。基于該原核表達載體，本發(fā)明還對ChlaPMI蛋白代謝甘露糖活性進行了鑒定，以驗證其能夠?qū)Ω事短沁M行代謝。并且本發(fā)明提供一種含有ChlaPMI的表達盒和一種植物表達載體，以及該表達盒和表達載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化方面的應用。本發(fā)明利用ChlaPMI基因構建的植物表達載體，以甘露糖為篩選劑，成功實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化水稻細胞。本發(fā)明成功分離和克隆出植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因，由于該磷酸甘露糖異構酶基因來源于植物(萊茵衣藻)，是環(huán)境友好的天然物質(zhì)，對人類沒有潛在危險。其可以用于替代來自大腸桿菌的磷酸甘露糖異構酶。
【IPC分類】C12N15-63, C12N5-10, A01H5-10, C12N15-61, A01H5-06, C12N9-90, C12N15-82, A01H5-00, A01H5-02
【公開號】CN104531657
【申請?zhí)枴緾N201510002725
【發(fā)明人】李 浩, 楊劍波, 魏鵬程, 李莉, 李娟 , 楊亞春
【申請人】安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月5日