專(zhuān)利名稱(chēng)：尿苷5＇－二磷酸－n－乙酰半乳糖胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為低聚糖合成的重要底物尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)的制備方法。
背景技術(shù)：
用酶合成低聚糖的方法包括利用低聚糖水解酶的逆反應(yīng)的方法和利用轉(zhuǎn)糖基酶的方法這兩種。使用轉(zhuǎn)糖基酶的合成法，從合成收率和用于合成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的低聚糖等方面考慮，比利用水解酶的逆反應(yīng)的方法更好，此外，近年隨著重組DNA技術(shù)的進(jìn)步，各種轉(zhuǎn)糖基酶的大規(guī)模生產(chǎn)也隨該技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展。
但是，在轉(zhuǎn)糖基酶的合成法中所用的糖供體糖核苷酸除了一部分之外，其它的價(jià)格仍較高，目前的供應(yīng)量?jī)H在試劑水平。例如，作為UDP-GalNAc的制備方法，報(bào)道了使用半乳糖胺作為起始材料，將酶法和化學(xué)乙?；M合合成UDP-GalNAc的方法。
但是，由于存在如下問(wèn)題(A)只是實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模反應(yīng)、(B)酶的制備難、(C)半乳糖胺磷酸化時(shí)必需補(bǔ)充ATP再生體系，整個(gè)反應(yīng)工序的收率也低、(D)在反應(yīng)液中殘留UDP-半乳糖胺的情況下，目的物UDP-GalNAc與它的分離存在問(wèn)題，因此未必是實(shí)用的方法(Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)、J.Org.Chem.，57，152-157.(1992))。
此外，已報(bào)道了用尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺4-表異構(gòu)酶(UDP-GlcNAc 4-表異構(gòu)酶)由尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成UDP-GalNAc的方法(WO2002/050267)，由于存在如下問(wèn)題(i)UDP-GlcNAc 4-表異構(gòu)酶在動(dòng)物組織或菌體中的存在量極少、(ii)盡管可以通過(guò)重組DNA法制備UDP-GlcNAc 4-表異構(gòu)酶，但是該酶反應(yīng)是平衡反應(yīng)因此轉(zhuǎn)化率低，并且作為底物的UDP-GlcNAc未完全消耗，大量留在反應(yīng)液中，因此UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的分離非常困難，因此該方法也不是實(shí)用的方法。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1WO2002/05026非專(zhuān)利文獻(xiàn)1Methods Enzymol.，28，271-277，(1972)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2J.Org.Chem.，57，152-157.(1992)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3

J.Biol.Chem.271，23653-23656，(1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996)發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種使用價(jià)廉的底物，有效地酶促制備UDP-GalNAc的實(shí)用的方法。
本發(fā)明者們對(duì)UDP-GalNAc的生物合成路徑進(jìn)行了詳細(xì)探討，發(fā)現(xiàn)結(jié)果如下，從而完成了本發(fā)明。
首先，已報(bào)道病原性金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)來(lái)源于人、豬肝臟的各種尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)，除了具有催化下述(A)固有的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活性之外，還具有催化下述(B)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活性(J.Biol.Chem.234，1822-1827(1959)、J.Biol.Chem.273，27055-27057(1998)、J.Biol.Chem.271，13147-13154(1996))，盡管除了Staphylococcus aureus之外，還沒(méi)有無(wú)病原性的來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的這樣的報(bào)告，然而試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)除了具有下述(A)的活性之外還具有下述(B)的活性。而且，例如如果使用來(lái)源于大腸桿菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由N-乙酰半乳糖胺1-磷酸(GalNAc1-P)和尿苷5′-三磷酸(UTP)合成UDP-GalNAc的話，可以解決UDP-GlcNAc或UDP-半乳糖胺等按照現(xiàn)有方法與其它糖核苷酸分離的問(wèn)題。
(A)UDP-GlcNAc+焦磷酸UTP+GlcNAc1-P(B)UDP-GalNAc+焦磷酸UTP+GalNAc1-P其次，GalNAc1-P昂貴，化學(xué)上也不容易制備，在探討是否能夠?qū)-乙酰半乳糖胺(GalNAc)酶促磷酸化的過(guò)程中，報(bào)道了在人或豬的肝臟或腎臟等組織中存在使GalNAc磷酸化的活性(J.Biol.Chem.271，39.23653-23656，(1996))，通過(guò)該酶可以由GalNAc酶促制備GalNAc1-P。
然而，在采用大腸桿菌等的微生物作為宿主的體系內(nèi)難以生產(chǎn)來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶，因此不可能實(shí)用地提供相應(yīng)的酶，然而將編碼來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶的GALK 2基因與編碼來(lái)源于其它微生物的蛋白質(zhì)(例如，大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)的基因3′末端下游相連，產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，這樣可以在大腸桿菌內(nèi)以活性狀態(tài)制備來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶。
而且，還發(fā)現(xiàn)使用這種來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶和來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶、或者它們的融合蛋白質(zhì)可以由GalNAc和UTP合成UDP-GalNAc，另外通過(guò)酵母菌體進(jìn)行腺苷5′-三磷酸(ATP)生產(chǎn)和尿苷5′-一磷酸(UMP)的磷酸化的同時(shí)使N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶起作用，可以由價(jià)廉的UMP和GalNAc合成UDP-GalNAc，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，它是由UTP和GalNAc1-P酶促制備UDP-GalNAc的方法，其特征在于所述的酶使用來(lái)源于微生物(但是，病原性微生物除外)的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。
此外，本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，其特征在于所述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶是用來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因(glmU)經(jīng)重組DNA法制得的。
另外，本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，其特征在于所述GalNAc1-P是用N-乙酰半乳糖胺激酶，由GalNAc和磷酸供體在反應(yīng)體系內(nèi)制得的。
在本發(fā)明中，所述N-乙酰半乳糖胺激酶可以是使用來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因(GALK 2)經(jīng)重組DNA法制得的，可以是采用重組DNA法以與來(lái)源于微生物的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形式制得的，或者可以使用以與來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)的形式制得的。
此外，在本發(fā)明中，所述磷酸供體可以是腺苷5′-三磷酸(ATP)，所述腺苷5′-三磷酸(ATP)也可以經(jīng)酵母菌體產(chǎn)生。
此外，在本發(fā)明的UDP-GalNAc的制備方法中，取代使用UTP，可以組合使用采用微生物菌體或酶的UTP生成/再生體系，取代使用UTP，也可以組合使用UMP和用酵母菌體由UMP產(chǎn)生UTP的體系。
另外，在本發(fā)明中，所述來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因(glmU)可以是來(lái)源于大腸桿菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因。此外，在由所述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc時(shí)，也可以向反應(yīng)體系內(nèi)添加將生成的焦磷酸分解的酶。
此外，在本發(fā)明中，所述酵母菌體可以使用來(lái)源于選自酵母屬、接合酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬中的一種或多種酵母的菌體，作為所述酵母菌體的一個(gè)實(shí)例，可以使用干燥酵母菌體。在使用所述酵母菌體的反應(yīng)中，添加無(wú)機(jī)磷酸和所需的能量源也是有益的。
另外，在本發(fā)明中，可以添加氟化鈉以防止由所述N-乙酰半乳糖胺激酶制備的GalNAc1-P的分解。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶具有由GalNAc1-P和UTP產(chǎn)生UDP-GalNAc的活性，因此采用該酶和來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶，進(jìn)行GalNAc的磷酸化并交替地添加UDP，首次可以有效地制備UDP-GalNAc。
此外，由于可以將N-乙酰半乳糖胺激酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶作為融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)，首次可以在大腸桿菌內(nèi)制備來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶，并且可以一次生產(chǎn)兩種酶，因此酶制備變得容易。
另外，通過(guò)酵母菌體生產(chǎn)ATP和UMP的磷酸化的同時(shí)使N-乙酰半乳糖胺激酶和來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶作用，可以有效地由價(jià)廉的UMP和GalNAc合成UDP-GalNAc。
再次，本發(fā)明的方法，由于幾乎不產(chǎn)生UDP-GalNAc之外的糖核苷酸，因此可以極其簡(jiǎn)單地進(jìn)行從反應(yīng)液中分離精制目標(biāo)UDP-GalNAc。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明涉及UDP-GalNAc的制備方法，它是由UTP和GalNAcl-P酶促制備UDP-GalNAc的方法，特征在于酶使用來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。
作為向反應(yīng)體系內(nèi)添加的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，可以使用沒(méi)有病原性的來(lái)源于微生物的酶。通過(guò)將各自酶的基因克隆，可以在微生物菌體內(nèi)大量表達(dá)這些酶，也可以采用所謂的重組DNA法制備。作為來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，列舉有來(lái)源于屬于埃希氏桿菌(Escherichia)屬(Journal of Bacteriology，175，6150(1993))、酵母(Saccharomyces)屬(Agricultural Biological Chemistry，40，2275(1976))或鏈孢霉(Neurospoa)屬(Can.J.Microbiology，25，1381(1979))的微生物的酶，特別優(yōu)選來(lái)源于大腸桿菌的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶。
這種UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，只要具有相應(yīng)活性，任何形態(tài)都可以。具體地說(shuō)，可以列舉有微生物菌體、該菌體的處理物或由該處理物獲得的酶制劑等。
作為微生物菌體處理物，可以將上述微生物菌體經(jīng)機(jī)械破碎(利用渦流混合機(jī)、法式壓力機(jī)、均化器、乳缽等)、凍融、自溶、干燥(利用冷凍干燥、風(fēng)干等)、酶處理(利用溶菌酶等)、超聲波處理、化學(xué)處理(利用酸、堿處理等)等普通處理方法而獲得的菌體破壞物或者菌體細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的變性物。
作為酶制劑，可以列舉由對(duì)來(lái)源于上述菌體處理物的具有相應(yīng)酶活性的部分施加常用的酶精制手段(鹽析處理、等電點(diǎn)沉淀處理、有機(jī)溶劑沉淀處理、透析處理、各種層析法處理等)獲得粗酶或精制酶。
對(duì)由微生物菌體制備UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的方法進(jìn)行具體說(shuō)明，對(duì)收集到的菌體進(jìn)行超聲波處理使菌體破碎，然后使菌體破壞液離心，獲得上清液，對(duì)該上清液施加離子交換層析法、凝膠層析法等各種層析法處理，將UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性部分濃縮、脫鹽之后就可以獲得作為目標(biāo)酶制劑。
反應(yīng)所用的UTP和GalNAc1-P，也可以在反應(yīng)體系內(nèi)分別制備。例如，可以使用N-乙酰半乳糖胺激酶，在GalNAc1-P的反應(yīng)體系內(nèi)由GalNAc和磷酸供體進(jìn)行制備。
反應(yīng)所用的N-乙酰半乳糖胺激酶，存在于人、豬、鼠等哺乳類(lèi)腎臟或肝臟、胰臟、肺、心臟、大動(dòng)脈、腦等的組織中，特別是在腎臟或肝臟內(nèi)含有大量的該酶，因此可以由這些組織制得。此外，向反應(yīng)體系中添加的N-乙酰半乳糖胺激酶，只要具有相應(yīng)活性，任何形態(tài)都可以。具體地說(shuō)，可以列舉有豬肝臟處理物或由該處理物獲得的酶制劑等。
但是，從酶制備的簡(jiǎn)便性等的角度，按照常規(guī)方法克隆N-乙酰半乳糖胺激酶基因，可以在微生物菌體內(nèi)大量表達(dá)，最優(yōu)選通過(guò)重組DNA法制備。采用微生物作為宿主，通過(guò)重組DNA法制備來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶時(shí)，按照常規(guī)方法不能制得目標(biāo)酶，即使能夠產(chǎn)生其量也極少，因此不適合實(shí)用。為此，與宿主相同的編碼來(lái)源于微生物的蛋白質(zhì)(例如，大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)的基因的下游相連，以生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)，可以在大腸桿菌等的宿主內(nèi)以具有活性的狀態(tài)制備來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶。
用于生產(chǎn)上述融合蛋白質(zhì)的基因的連接、質(zhì)粒的構(gòu)建、宿主的性狀轉(zhuǎn)變、酶的生產(chǎn)等，已經(jīng)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，如后面實(shí)施例所示，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。
作為反應(yīng)添加的N-乙酰半乳糖胺激酶，與UDP-GlcNAc焦磷酸化酶相同，只要具有相應(yīng)活性，任何形態(tài)都可以。具體地說(shuō)，可以列舉有微生物菌體、該菌體的處理物或由該處理物獲得的酶制劑等。
此外，UTP在反應(yīng)體系內(nèi)的制備，可以組合使用采用微生物菌體或酶的UTP生成/再生體系來(lái)實(shí)施。具體地說(shuō)，可以利用采用UMP和酵母菌體由UMP生產(chǎn)UTP的體系，首先對(duì)此進(jìn)行說(shuō)明(參見(jiàn)

圖1)。
作為使用的酵母菌體，只要可用于糖核苷酸的制備，沒(méi)有特別的限制。具體地說(shuō)，可以列舉有來(lái)源于酵母(Saccharomyces)屬、接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、假絲酵母(Candida)屬、球擬酵母(Torulopsis)屬、漢森酵母(Hansenula)屬、德巴利酵母(Debaryomyces)屬等的酵母的菌體。這種酵母菌體，可以是活酵母菌體、干燥酵母菌體中任意一種，從反應(yīng)收率、獲取的容易性等的角度優(yōu)選使用干燥酵母菌體。
此外，UTP在反應(yīng)體系內(nèi)的制備，并不限于使用上述UMP和酵母菌體由UMP生產(chǎn)UTP的體系，例如，可以利用采用微生物菌體由乳清酸生產(chǎn)UTP的體系(特開(kāi)平5-276974號(hào))、或者同時(shí)使用使用了酶的UTP生成體系和ATP再生體系(具體地說(shuō)，可以利用使多磷酸激酶、腺苷酸激酶及多磷酸作用于腺苷酸(AMP)使ATP再生，同時(shí)尿苷酸激酶，及根據(jù)需要使核苷酸二磷酸激酶作用于UMP生成UTP的體系)等。
使用這種酶和底物制備UDP-GalNAc的條件，隨所用的酶和底物不同而略有不同。
(1)酶使用來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，由UTP和GalNAc1-P酶促制備UDP-GalNAc時(shí)，反應(yīng)所用的UTP和GalNAc1-P可以使用市售品，或者可以按照公知的方法(J.Am.Chem.Soc.，115，2260-2267(1993))制得。作為使用的濃度，沒(méi)有特別的限制?？梢苑謩e適當(dāng)設(shè)定在約1～200mM，優(yōu)選約1～100mM的范圍內(nèi)。
UDP-GalNAc的合成反應(yīng)，例如在pH約6.0～9.0的磷酸緩沖液中添加UTP和GalNAc1-P，然后在該反應(yīng)液中添加共存上述UDP-GlcNAc焦磷酸化酶約0.1U/ml以上，優(yōu)選約0.5～20.0U/ml，在約5～30℃，優(yōu)選約5～25℃下，根據(jù)需要進(jìn)行攪拌使反應(yīng)進(jìn)行1～70小時(shí)左右。
此外，通過(guò)UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc的反應(yīng)，是平衡反應(yīng)，為了提高UDP-GalNAc的合成收率，優(yōu)選向反應(yīng)體系內(nèi)添加0.1U/ml以上的酶分解生成的焦磷酸(例如，焦磷酸酶)。
(2)酶使用來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶、或者它們的融合酶，由UTP和GalNAc酶促制備UDP-GalNAc時(shí)，反應(yīng)所用的UTP和GalNAc可以使用市售品。使用濃度沒(méi)有特別的限制，各自可以適當(dāng)設(shè)定在約1～200mM，優(yōu)選約1～100mM的范圍內(nèi)。
UDP-GalNAc的合成反應(yīng)，例如在pH約6.0～9.0的磷酸緩沖液中添加UTP和GalNAc，然后向該反應(yīng)液中分別添加共存上述兩種酶、或者融合酶約0.1U/ml以上，優(yōu)選約0.5～20.0U/ml，在約5～30℃，優(yōu)選約5～25℃下根據(jù)需要攪拌使反應(yīng)進(jìn)行1～70小時(shí)左右。
另外，與上述(1)相同地，添加分解焦磷酸的酶(例如，焦磷酸酶)0.1U/ml以上，再者為了防止經(jīng)N-乙酰半乳糖胺激酶制得的GalNAc1-P分解，添加1mM以上的氟化鈉是理想的。
(3)酶使用來(lái)源于微生物的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶、或者它們的融合酶，組合使用用酵母菌體由UMP生成UTP的體系，由UMP和GalNAc制備UDP-GalNAc時(shí)，反應(yīng)所用的UMP和GalNAc可以使用市售品。作為使用濃度，沒(méi)有特別的限制，可以分別適當(dāng)設(shè)定在約1～200mM，優(yōu)選約10～50mM的范圍內(nèi)。
UDP-GalNAc的合成反應(yīng)，例如在pH約6.0～9.0的磷酸緩沖液中添加UMP和GalNAc，然后向該反應(yīng)液中分別添加上述兩種酶、或者它們的融合酶約0.1U/ml以上，優(yōu)選約0.5～20.0U/ml，再添加共存酵母菌體1～10％(w/v)，在約5～30℃下根據(jù)需要攪拌使反應(yīng)進(jìn)行1～70小時(shí)左右。
上述反應(yīng)中，優(yōu)選在反應(yīng)體系內(nèi)添加無(wú)機(jī)磷酸和能量源。無(wú)機(jī)磷酸可以直接使用磷酸鉀等，但是優(yōu)選以磷酸緩沖液的形態(tài)使用。作為能量源，可以使用葡萄糖、果糖等糖類(lèi)，乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸。各自的使用濃度，沒(méi)有特別的限制，但是可以適當(dāng)設(shè)定在約10～1000mM，優(yōu)選約100～500mM的范圍內(nèi)。
而且，在上述反應(yīng)體系中，上述(1)和(2)的酶反應(yīng)不同，不必向反應(yīng)體系中加入防止焦磷酸分解的酶和用于防止GalNAc1-P分解的氟化鈉。
如此所得的UDP-GalNAc可以通過(guò)糖核苷酸常用的分離精制手段(離子交換層析法、吸著層析法、鹽析等)進(jìn)行分離精制。
實(shí)施例下面，顯示實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，然而本發(fā)明并不限于此是顯而易見(jiàn)的。而且，實(shí)施例中，采用HPLC法對(duì)反應(yīng)液中的UDP-GalNAc進(jìn)行定量。即，分離時(shí)用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，洗脫液采用0.5M磷酸一鉀溶液。DNA的制備、利用限制性酶進(jìn)行的剪切、利用T4DNA連接酶進(jìn)行的DNA連接、以及大腸桿菌的性狀轉(zhuǎn)變法都參照《分子克隆》(Maniatis等編，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork(1982))進(jìn)行。限制性酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶從タカラバイオ(株)獲得。
實(shí)施例1(1)編碼來(lái)源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶的GALK 2基因的克隆將來(lái)源于人腎臟的c DNA庫(kù)(可以從クロンテツク公司獲得)作為模板，按照常規(guī)方法合成下面所示的兩種引物DNA，通過(guò)PCR法使人腎臟GALK 2基因(提交到國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，登錄號(hào)為NM_002044，(Submitted to NCBI、Accession No.NM_002044))擴(kuò)增。
引物(A)5’-CGGGGATCCATGGCTACAGAGAGCCCTGCT-3’引物(B)5’-TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA-3’利用PCR法使GALK 2基因擴(kuò)增時(shí)，使用タカラバイオ公司制造的DNA熱循環(huán)儀使反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM Tris鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1ng、引物DNA(A)和(B)各自0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5U)分別進(jìn)行熱變性(94℃、1分鐘)、退火(59℃、1分)、延伸反應(yīng)(72℃、2分鐘)的步驟，反復(fù)30次。
基因擴(kuò)增后，按照文獻(xiàn)(分子克隆，前述)的方法，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳使DNA分離，精制相當(dāng)于1.4kb的DNA片段。用限制性酶BamH I及Sal I剪切該DNA，同樣用限制性酶BamH I及Sal I消化質(zhì)粒pMAL-c2x(從New England BioLabs公司獲得)再用T4DNA連接酶連接。使用連接反應(yīng)液使大腸桿菌K12株JM109菌(從タカラバイオ株式會(huì)社獲得)進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，從所得耐氨芐青霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離出質(zhì)粒pMAL-hGLK2。pMAL-hGLK2是在麥芽糖結(jié)合蛋白基因的3′-末端下游的BamH I-Sal I剪切部位插入含有人腎臟GALK 2結(jié)構(gòu)基因的BamH I-Sal I DNA片段的質(zhì)粒。
(2)人腎臟GALK 2基因產(chǎn)物的制備將具有質(zhì)粒pMAL-hGLK2的大腸桿菌JM109菌接種在100ml含有100μg/ml的氨芐青霉素的培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)中，于37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌數(shù)達(dá)到4×108個(gè)/ml時(shí)，添加IPTG使培養(yǎng)液的最終濃度分別達(dá)到0、0.01、0.1或1.0mM，然后在25℃分別繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離(4℃、9000xg，10分鐘)回收菌體，使其懸浮于20ml緩沖液(50mM磷酸鉀(pH7.5))中。使用ブランソン公司制造的超聲波粉碎機(jī)(モデル450ソニフア一)于冰冷下進(jìn)行超聲波處理(50W，2分鐘，3次)，在4℃、12000xg的條件下離心分離20分鐘，回收可溶性部分(上清液)。
將所得上清液部分作為酶樣品，測(cè)定該酶樣品中的N-乙酰半乳糖胺激酶活性。將其結(jié)果示于下表。
表1


另外，N-乙酰半乳糖胺激酶活性是按照下面所示方法測(cè)定由ATP和GalNAc磷酸化為GalNAc1-P的活性而算出的值。即，在100mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)、10mM氯化鎂、5mMGalNAc、5mM ATP·3Na、5mM氟化鈉中添加N-乙酰半乳糖胺激酶酶樣品，于37℃反應(yīng)10分鐘。將反應(yīng)液煮沸5分鐘使反應(yīng)停止，用糖分析儀HPAEC-CD(偶聯(lián)有導(dǎo)電計(jì)檢測(cè)的高效陰離子交換色譜法)進(jìn)行分析。分離時(shí)使用ダイオネクス公司制造的Carbopac PA1柱(4×250mm)，洗脫液采用(A)0.1M NaOH溶液和(B)0.1M NaOH，0.5M乙酸鈉溶液的濃度梯度(0-15分鐘B＝1％-50％、15-20分鐘B＝100％)。從HPAEC-CD分析結(jié)果可以算出反應(yīng)液中的GalNAc1-P生成量，將37℃時(shí)1分鐘內(nèi)生成1μmol的GalNAc1-P的活性計(jì)為1單位(U)。
(3)UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的制備由大腸桿菌(IFO3972＝NBRC3972)的染色體DNA，按照文獻(xiàn)中公知的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392(2000))制得的大腸桿菌JM109[pTrc--glmU]，在含有100μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基(Methods Enzymol.，153，3-11，(1987))10ml中于37℃下培養(yǎng)一晚。將其接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基500ml中。37℃下培養(yǎng)2小時(shí)后，添加IPTG使得終濃度為0.1mM，37℃下連續(xù)培養(yǎng)一夜。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(4℃，9000xg，20分鐘)回收菌體。將回收的菌體懸浮于50mMTris鹽酸(pH7.5)中，使用ブランソン公司制造的超聲波粉碎機(jī)(モデル450ソニフア一)粉碎后(50W，2分鐘，3次)，在4℃、15000rpm的條件下離心分離20分鐘，回收可溶性部分(上清液)。
將由此獲得的上清液部分作為酶樣品，測(cè)定酶樣品中的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性。將其結(jié)果與對(duì)照菌(具有pTrc99A的大腸桿菌JM109菌)一起示于下表2。
表2


另外，UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性是按照Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392(2000))中所示的方法，即測(cè)定由UDP-GlcNAc和焦磷酸分解為N-乙酰葡糖胺1-磷酸和UTP的活性而算出的值。即，在50mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)、5mM氯化鎂、3mM焦磷酸鈉、1mM UDP-GlcNAc中添加UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶樣品，于37℃反應(yīng)5分鐘。此外，使用水替代焦磷酸鈉溶液進(jìn)行同樣的反應(yīng)，依次作為對(duì)照。
將反應(yīng)液煮沸5分鐘使反應(yīng)停止，用HPLC進(jìn)行分析。分離時(shí)使用YMC公司制造的ODS-AQ312柱，洗脫液采用0.5M磷酸鉀溶液。從HPLC分析結(jié)果可以算出反應(yīng)液中產(chǎn)生的UTP量，將37℃時(shí)1分鐘內(nèi)生成1μmol的UTP的活性計(jì)為1單位(U)。
(4)用大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶合成UDP-GalNAc在含有50mMTris鹽酸緩沖液(pH7.5)、5mM氯化鎂、1mM 5′-UTP·3Na、1mM GalNAc1-P的溶液0.5ml中添加上述(3)制得的規(guī)定活性量的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶液(4.8U)，于37℃下進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中從反應(yīng)液中取出適量，煮沸5分鐘后離心分離，將其上清液進(jìn)行HPLC分析。
反應(yīng)開(kāi)始后進(jìn)行反應(yīng)液的分析的結(jié)果證實(shí)，由1mM的UTP和1mM的GalNAc 1-磷酸合成0.33mM的UDP-GalNAc。另外通過(guò)向反應(yīng)液中添加無(wú)機(jī)焦磷酸酶(シグマ公司制造)使平衡向UDP-GalNAc合成側(cè)傾斜，也證實(shí)合成收率提高(提高60％左右)。
實(shí)施例2(1)用人N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc在含有100mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)、10mM氯化鎂、5mM 5′-UTP·3Na、5mM GalNAc、5mM 5′-ATP·3Na、5mM氟化鈉的0.2ml溶液中添加上述實(shí)施例1制得的規(guī)定活性量的N-乙酰半乳糖胺激酶酶液(0.094U)和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶液(4.4U)和無(wú)機(jī)焦磷酸酶(シグマ公司制造、0.5U)，37℃下進(jìn)行反應(yīng)。
在反應(yīng)過(guò)程中從反應(yīng)液中取出適量，煮沸5分鐘后進(jìn)行離心分離，將該上清液進(jìn)行HPLC分析。反應(yīng)開(kāi)始4小時(shí)后進(jìn)行反應(yīng)液的分析的結(jié)果證實(shí)，在有N-乙酰半乳糖胺激酶、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶及無(wú)機(jī)焦磷酸酶的情況下，合成3.2mM的UDP-GalNAc。而且，在沒(méi)有N-乙酰半乳糖胺激酶，僅有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和無(wú)機(jī)焦磷酸酶的反應(yīng)條件下不能生成UDP-GalNAc。
實(shí)施例3(1)使用干燥酵母和人N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶合成UDP-GalNAc在含有200mM葡萄糖、50mM GalNAc、50mM UMP、200mM磷酸鉀(pH8.0)、20mM氯化鎂、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工業(yè))的1ml溶液中，添加實(shí)施例1中制得的重組酶(N-乙酰半乳糖胺激酶；0.32U，UDP-GlcNAc焦磷酸化酶；10.4U)，于26℃下以300rpm的攪拌速度攪拌的同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。而且，在反應(yīng)開(kāi)始后的第16、24、40、48小時(shí)向反應(yīng)液中各自添加2M的葡萄糖溶液0.1ml。不同時(shí)間的反應(yīng)液進(jìn)行分析的結(jié)果于圖2所示。反應(yīng)49小時(shí)時(shí)UDP-GalNAc的蓄積量達(dá)到32mM。
實(shí)施例4實(shí)施例2和3中顯示了使用二種酶的反應(yīng)例，然而這里顯示使用使二種酶以融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)來(lái)進(jìn)行UDP-GalNAc合成反應(yīng)的結(jié)果。
(1)大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶和來(lái)源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶的融合將大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶基因表達(dá)用質(zhì)粒，pTrc-glmU作為模板，使下面所示的兩種引物DNA按照常法合成，利用PCR法使含有g(shù)lmU基因的DNA片段擴(kuò)增。
引物(C)5’-GAGCGGATAACAATTTCAC-3’引物(D)5’-CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG-3’利用PCR法使含有g(shù)lmU基因的DNA片段擴(kuò)增時(shí)，使用タカラバィオ公司制造的DNA熱循環(huán)儀使反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM Tris鹽酸(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、模板DNA0.1ng、引物DNA(A)和(B)各自0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5U)分別進(jìn)行熱變性(94℃、1分鐘)、退火(64℃、1分鐘)、延伸反應(yīng)(72℃、2分鐘)的步驟，反復(fù)30次。
DNA片段擴(kuò)增后，按照文獻(xiàn)(分子克隆，前述)的方法，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳使DNA分離，精制相當(dāng)于1.4kb的DNA片段。用限制性酶EcoR I及BamH I剪切該DNA，同樣用限制性酶EcoR I及BamH I消化質(zhì)粒pTrc99A(從フアルマシア公司獲得)再用T4DNA連接酶連接。使用連接反應(yīng)液使大腸桿菌K12株JM109菌(從タカラバイオ株式會(huì)社獲得)進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，從所得耐氨芐青霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離出質(zhì)粒pTrc-glmU 3。pTrc-glmU 3的glmU基因是，取代缺失的起始密碼子，插入BamH I識(shí)別部位的基因。
接下來(lái)，使pTrc-hGLK2經(jīng)限制性酶BamH I和Sal I消化，分離精制相當(dāng)于1.4kb的DNA片段。同樣用限制性酶BamH I和Sal I對(duì)其消化的質(zhì)粒pTrc-glmU 3和T4DNA連接酶進(jìn)行連接。使用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109菌進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，從所得耐氨芐青霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離質(zhì)粒pTrc-glmU·hGLK2。pTrc-glmU·hGLK2是在glmU基因的3′-末端下游構(gòu)架一致地連接hGLK2基因的質(zhì)粒。接下來(lái)使pTrc-glmU·hGLK2經(jīng)限制性酶Sac I和SalI消化，分離精制相當(dāng)于1.4kb的DNA片段。同樣用限制性酶Sac I和Sal I使其消化的質(zhì)粒pTrc12-6和T4DNA連接酶連接。采用連接反應(yīng)液使大腸桿菌DH1株(ATCC 33849)進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，從得到的耐卡那霉素的性狀轉(zhuǎn)變體中分離質(zhì)粒p12-6-glmU·hGLK2。
另外，質(zhì)粒pTrc12-6是以質(zhì)粒載體πAG1(具有質(zhì)粒載體πAG1的大腸桿菌K-12株TNC111菌的保藏號(hào)FERMBP-6901號(hào)平成11年9月30日保藏)和pTrc99A DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建，pTrc99A的β-內(nèi)酰胺酶基因完全缺失(第567-1816位缺失)，在該缺失部位插入來(lái)源于Tn903的耐卡那霉素的基因的質(zhì)粒(特開(kāi)2001-103973)。
(2)大腸桿菌glmU基因產(chǎn)物和人腎臟GALK 2基因產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)的制備將具有質(zhì)粒p12-6-glmU·hGLK2的大腸桿菌DH1株接種于含有100μg/ml的卡那霉素的培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)50ml中，37℃下振蕩培養(yǎng)。菌數(shù)達(dá)到4×108個(gè)/ml時(shí)向培養(yǎng)液中添加IPTG使得最終濃度為0.1mM，再于25℃下連續(xù)振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(4℃，9000xg，10分鐘)回收菌體，將其懸浮于20ml的緩沖液(50mM磷酸鉀(pH7.5))中。于冰冷下經(jīng)過(guò)超聲波處理將菌體破碎，再離心分離(4℃，12000xg，10分鐘)除去菌體殘?jiān)?br> 將由此獲得的上清液部分作為酶樣品，按照實(shí)施例1中記載的方法測(cè)定酶樣品中的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性和N-乙酰半乳糖胺激酶活性。其結(jié)果示于下表3。
表3


(3)使用融合蛋白質(zhì)的UDP-GalNAc的合成使用上述融合酶樣品進(jìn)行UDP-GalNAc合成。即，在含有200mM葡萄糖、50mM GalNAc、28mM UMP、200mM磷酸鉀(pH8.0)、20mM氯化鎂、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工業(yè))的2.5ml溶液中添加上述重組融合酶液(N-乙酰半乳糖胺激酶；1.75U、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶；88.9U)，于27℃、100rpm下攪拌的同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始后的第14、24、40小時(shí)向反應(yīng)液中添加葡萄糖0.09g。此外，在反應(yīng)開(kāi)始24小時(shí)后向反應(yīng)液中添加0.5M的UMP溶液110μl。
將分析不同時(shí)間的反應(yīng)液的結(jié)果示于圖3。使用融合蛋白質(zhì)與分別將制得的兩種酶混合使用大致相同地合成UDP-GalNAc，反應(yīng)40小時(shí)時(shí)UDP-GalNAc達(dá)到30mM。
(4)大腸桿菌glmU基因產(chǎn)物和人腎臟GALK 2基因產(chǎn)物的融合蛋白質(zhì)的制備(放大試驗(yàn))將具有質(zhì)粒P12-6-glmU·hGLK2的大腸桿菌DH1株接種到含有100μg/ml的卡那霉素的培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母浸膏、0.5％NaCl、0.1％葡萄糖)3mL中，37℃下振蕩培養(yǎng)一夜。將該培養(yǎng)液全部接種到125mL的相同培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)8-11小時(shí)。將該培養(yǎng)液全部接種到5L相同培養(yǎng)基中，在37℃、通氣量1.0vvm、攪拌翼轉(zhuǎn)數(shù)300rpm的條件下培養(yǎng)。菌數(shù)達(dá)到4×108個(gè)/ml時(shí)添加IPTG使得在培養(yǎng)液中的最終濃度為0.1mM，使培養(yǎng)溫度降低至28℃繼續(xù)培養(yǎng)14小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(9000xg，10分鐘)回收菌體，然后將其懸浮于500ml的緩沖液(50mM磷酸鉀(pH7.5))中。于冰冷下經(jīng)超聲波處理將菌體破碎，同時(shí)經(jīng)離心分離(12000xg，10分鐘)除去菌體殘?jiān)?br> 將由此獲得的上清液部分作為酶樣品，以實(shí)施例1中記載的方法測(cè)定UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性。該值是9.50U/mg蛋白質(zhì)。
(5)UDP-GalNAc合成反應(yīng)的放大試驗(yàn)使用融合酶樣品進(jìn)行UDP-GalNAc合成反應(yīng)的放大試驗(yàn)，在發(fā)酵缸中進(jìn)行。即，添加200mM葡萄糖、50mM N-乙酰半乳糖胺、28mM UMP、200mM磷酸鉀(pH8.0)、20mM氯化鎂、3％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母工業(yè))、和上述重組融合酶液(UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性為525000U)加注至1500ml，在27℃、通氣量0.1vvm、攪拌翼轉(zhuǎn)數(shù)150rpm的條件下進(jìn)行反應(yīng)。從反應(yīng)開(kāi)始的第14，24，38小時(shí)向反應(yīng)液中添加葡萄糖54g。此外，在反應(yīng)開(kāi)始24小時(shí)后向反應(yīng)液中添加0.5M的UMP溶液66mL。
將分析不同時(shí)間的反應(yīng)液的結(jié)果示于圖4。即使在發(fā)酵缸中進(jìn)行反應(yīng)合成UDP-GalNAc，反應(yīng)40小時(shí)時(shí)UDP-GalNAc達(dá)到35mM。
保藏證明國(guó)際表格[關(guān)于國(guó)際承認(rèn)的用于專(zhuān)利目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約]本頁(yè)底部簽章的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)根據(jù)7.1條頒發(fā)原始保藏的受理保藏者姓名(名稱(chēng))雅瑪山醬油株式會(huì)社社長(zhǎng)濱口道雄地址千葉縣銚子市新生町2丁目10番地1號(hào)

附圖簡(jiǎn)述圖1圖1是顯示由GalNAc和UTP合成UDP-GalNAc的體系的圖。
圖2圖2是顯示來(lái)源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶共存時(shí)UDP-GalNAc的生成量隨時(shí)間變化的圖。
圖3圖3是顯示使用來(lái)源于人腎臟的N-乙酰半乳糖胺激酶和大腸桿菌UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)時(shí)UDP-GalNAc的生成量隨時(shí)間變化的圖。
圖4圖4是顯示在發(fā)酵缸中的合成反應(yīng)的UDP-GalNAc的生成量隨時(shí)間變化的圖。
序列表<110>YAMASA CORPORATION<120>尿苷5’-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法<130>5043-001PCT<150>JP P2004-306783<151>2004-10-21<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴(kuò)增GALK2基因用的引物<400>1cggggatcca tggctacaga gagccctgct 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴(kuò)增GALK2基因用的引物<400>2tacgtcgact taggcctcaa gcaaaaccaa 30<210>3<211>19<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴(kuò)增glmU基因用的引物
<400>3gagcggataa caatttcac 19<210>4<211>30<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>擴(kuò)增glmU基因用的引物<400>4ccaggatccc tttttcttta ccggacgacg 30
權(quán)利要求
1.一種尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺由尿苷5′-三磷酸和N-乙酰半乳糖胺1-磷酸酶促制備，特征在于，酶使用來(lái)源于除病原性微生物之外的微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶。
2.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶是用來(lái)源于微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因經(jīng)重組DNA法制得的酶。
3.如權(quán)利要求2所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述來(lái)源于微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因是來(lái)源于大腸桿菌的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因。
4.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，通過(guò)所述尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶合成尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺時(shí)，向反應(yīng)體系中添加將生成的焦磷酸分解的酶。
5.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺1-磷酸是使用N-乙酰半乳糖胺激酶，由N-乙酰半乳糖胺和磷酸供體在反應(yīng)體系內(nèi)制得的。
6.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述磷酸供體是腺苷5′-三磷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述腺苷5′-三磷酸是由酵母菌體產(chǎn)生的。
8.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，N-乙酰半乳糖胺激酶是使用來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因經(jīng)重組DNA法制得的。
9.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺激酶是采用重組DNA法，以與來(lái)源于微生物的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形式制得的。
10.如權(quán)利要求9所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，通過(guò)將來(lái)源于動(dòng)物的N-乙酰半乳糖胺激酶基因與其它編碼來(lái)源于微生物的蛋白質(zhì)的基因的3′末端下游連接來(lái)校正所述融合蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺激酶使用以與來(lái)源于微生物的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)的形式制得的。
12.如權(quán)利要求5所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，加入氟化鈉以防由所述N-乙酰半乳糖胺激酶制得的N-乙酰半乳糖胺1-磷酸的分解。
13.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，代替使用所述尿苷5′-三磷酸的一部分或全部，組合使用采用微生物菌體或酶的尿苷5′-三磷酸生成/再生體系。
14.如權(quán)利要求1所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，代替使用所述尿苷5′-三磷酸的一部分或全部，組合使用尿苷5′-一磷酸和采用酵母菌體由尿苷5′-一磷酸產(chǎn)生的尿苷5′-三磷酸的體系。
15.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述酵母菌體使用來(lái)源于選自酵母屬、接合酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬、漢森酵母屬、德巴利酵母屬中的一種或多種的酵母的菌體。
16.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，所述酵母菌體使用干燥酵母菌體。
17.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，在使用所述酵母菌體的反應(yīng)中，添加無(wú)機(jī)磷酸。
18.如權(quán)利要求14所述的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺的制備方法，特征在于，在使用所述酵母菌體的反應(yīng)中，添加所需的能量源。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用價(jià)廉的底物，可以有效地制備尿苷5′－二磷酸－N－乙酰半乳糖胺(UDP－GalNAc)的實(shí)用的方法。涉及UDP－GalNAc的制備方法，其特征在于(1)在由UTP和GalNAc1－P酶促制備UDP－GalNAc的方法中，酶使用來(lái)源于微生物的UDP－GlcNAc焦磷酸化酶、(2)GalNAc1－P是使用N－乙酰半乳糖胺激酶，由N－乙酰半乳糖胺和磷酸供體在反應(yīng)體系內(nèi)制備的、(3)N－乙酰半乳糖胺激酶使用以與UDP－GlcNAc焦磷酸化酶的融合蛋白質(zhì)的形式制備的激酶、和/或(4)組合使用UMP和用酵母菌體由UMP生成UTP的體系代替使用UTP。
文檔編號(hào)C12N9/12GK101052724SQ20058003551
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者奧山潔, 野口利忠 申請(qǐng)人:雅瑪山醬油株式會(huì)社