專利名稱：：應(yīng)用as-pcr檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動(dòng)物疾病檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體屬于一種牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及應(yīng)用AS-PCR檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥的方法。
背景技術(shù)：
：牛尿苷酸合酶缺乏癥(Deficieneyofuridinemonophophatesynthase,DUMPS)是一種常染色體隱性遺傳疾病，會(huì)造成母牛流產(chǎn)、死胎、整個(gè)牛群的繁殖力下降、產(chǎn)奶量下降等。由于人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使DUMPS在全世界流傳，直接影響了奶牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。DUMPS的病因主要是由于編碼尿苷酸合酶的基因，在密碼子405處存在C/T的突變，從而造成原編碼精氨酸的密碼子CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TGA，因而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最終只能翻譯成一段C-末端缺失76個(gè)氨基酸催化亞基的短蛋白，該殘缺蛋白不能催化乳清酸轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)苷酸，故不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸，導(dǎo)致胚胎在妊娠4060d死亡，死亡率高達(dá)100%[1][2]。美國(guó)等國(guó)家根據(jù)DUMPS的致病機(jī)制，建立了DUMPS的分子檢測(cè)方法和育種方案，要求對(duì)荷斯坦種公牛必須進(jìn)行隱性遺傳疾病的檢測(cè)。據(jù)報(bào)道美國(guó)大概有2%的荷斯坦奶牛攜帶DUMPS的致病基因[3]。我國(guó)荷斯坦種公牛主要從美國(guó)、加拿大、德國(guó)、以及澳大利亞和新西蘭等國(guó)進(jìn)口，包括進(jìn)口的活牛和胚胎。以前我國(guó)對(duì)該疾病沒(méi)有足夠的認(rèn)識(shí)和重視，引入了大量潛在的DUMPS攜帶者，同時(shí)引入的大量沒(méi)有系譜資料的荷斯坦母牛，同樣是潛在的攜帶者。這些引進(jìn)的種公牛在我國(guó)的大量使用，使得我國(guó)的DUMPS攜帶者數(shù)目增加，由于沒(méi)有自主產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)技術(shù)，因而無(wú)法公布母牛的檢測(cè)結(jié)果，很難根據(jù)系譜推斷DUMPS的傳播途徑。我國(guó)針對(duì)遺傳性疾病展開(kāi)的工作剛剛起步，在奶牛實(shí)際育種中開(kāi)展的工作還不多，并且僅局限在實(shí)驗(yàn)室中[4]，我們應(yīng)該在生產(chǎn)實(shí)踐中及時(shí)檢測(cè)出冷凍精液及母牛中DUMPS的攜帶者并予以淘汰，以減少經(jīng)濟(jì)效益的損失。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，尋找一種簡(jiǎn)便有效的用于牛尿苷酸合酶缺乏癥的檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)路線如下所示本發(fā)明建立了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥的AS-PCR方法，其具體步驟如下(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank提供的牛UMPS序列(登錄號(hào)NC_007299)，根據(jù)AS-PCR的特性，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件Premier5，設(shè)計(jì)了AS-PCR擴(kuò)增引物。該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。該引物序列詳見(jiàn)具體實(shí)施方式中的實(shí)施例1。(2)AS-PCR:提取牛血樣基因組DNA，根據(jù)PCR擴(kuò)增可直接判斷結(jié)果。若個(gè)體擴(kuò)增出的目的片段為261bp(見(jiàn)SEQIDN0:1)，則為致病純合子；若擴(kuò)增出的目的片段為261bp和90bp，則為雜合子，即DUMPS疾病攜帶者；若擴(kuò)增的目的片段為90bp(見(jiàn)SEQIDNO:2)，則為健康個(gè)體(見(jiàn)序列表SEQIDNO:1和2)。3與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是提供了一種快速準(zhǔn)確篩選分型DUMPS的方法和特異性引物，直接應(yīng)用于牛開(kāi)展DUMPS的致病基因篩選，以利于DUMPS患病個(gè)體的早期淘汰。序列表SEQIDNO:l和SEQIDNO:2是本發(fā)明擴(kuò)增的牛尿苷酸合酶缺乏癥的目的片段，SEQIDNO:3-6是擴(kuò)增牛尿苷酸合酶缺乏癥基因UMPS的特異引物。圖1:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2:用血樣DNA對(duì)UMPS基因進(jìn)行AS-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖檢測(cè)電泳圖。瓊脂糖凝膠濃度為2%。圖中編號(hào)說(shuō)明如下l，2，3，4泳道為健康牛群基因型，擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度為90bp;5為隱性攜帶者牛群基因型，擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度為261bp和90bp;M為Markerl(600bp)。圖3:是本發(fā)明擴(kuò)增的牛尿苷酸合酶缺乏癥的目的片段，圖中下劃線的序列是擴(kuò)增的261bp片段和90bp片段的共用區(qū)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1:牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)基因型鑒定1、奶牛血樣的采集及處理取奶牛血樣約10mL，加入0.5mol/L的EDTA500yL(使終濃度為25mmol/L)抗凝，4t:離心(8000rpm)10min，棄上層清，分離白細(xì)胞，加入蒸餾水，搖勻，使紅細(xì)胞破裂，離心10min，棄上層清液。重復(fù)兩次后，在沉淀中加入1XSETlmL和10%十二烷基硫酸鈉(SDS，終濃度為0.5%)，再緩慢加入蛋白酶K(終濃度為50100iig/mL)，置于55。C水浴鍋消化810h，4。C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、從奶牛血樣中提取NDA(1)取消化后的試樣，加入等體積的平衡酚(pH8.0)，緩慢顛倒離心管10min，4°C離心(8000rpm)10min。(2)小心吸取含有DNA的上清液，移至另一離心管中，再次加入平衡酚，重復(fù)上述操作。(3)吸取的上清液中加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1)，緩慢顛倒離心管10min，4。C離心(8000rpm)10min。(4)吸取上清液后加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24:1)，緩慢顛倒離心管10min，4。C8000rpm離心10min。(5)吸取上清液，加入1/10體積3mol/LNaAC及2倍體積的無(wú)水乙醇，迅速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，可見(jiàn)白色的絮狀物，即DNA，于-20"放置30min。(6)取出冷凍后的樣品，于10000rpm轉(zhuǎn)速離心58min，去掉上層乙醇，加入70X的乙醇lmL洗滌沉淀，離心(80000rpm)58min。(7)加入70%的乙醇重復(fù)洗滌一次，離心(80000rpm)58min。(8)棄去乙醇，在室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA。(9)將DNA樣稀釋成一定的濃度，存放于-2(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?、引物設(shè)計(jì)根據(jù)牛尿苷酸合酶缺乏癥基因UMPS序列(登錄號(hào)NC_007299)，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件Premier5，設(shè)計(jì)AS-PCR擴(kuò)增引物。該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下突變型(產(chǎn)物長(zhǎng)度為261bp):反向引物3'端倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配；IF:5'ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3'(見(jiàn)序列表SEQIDNO:3)，IR:5'TCTGGTTTCATGCTTACGCA3'(見(jiàn)序列表SEQIDNO:4);野生型(產(chǎn)物長(zhǎng)度為90bp):正向引物3'倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配；2F:5'ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3'(見(jiàn)序列表SEQIDNO:5)，2R:5'AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3'(見(jiàn)序列表SEQIDNO:6)。4、AS-PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為20iiL(見(jiàn)表1)。擴(kuò)增程序是94。C預(yù)熱lOmin—94。C變性45s—63.3°C45s—72延伸45s(從第二步94"變性到第四步72延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán))，72。C延伸10min—15°ClOmin。表1PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1F/1R與2F/2R擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，分別取3iiL混合，2X瓊脂糖凝膠電泳(IOOV，電泳20min)，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。5、DUMPS基因型結(jié)果判定牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)基因型鑒定結(jié)果如圖2所示，在基因UMPS的AS-PCR產(chǎn)物電泳圖譜中，若個(gè)體擴(kuò)增出的目的片段為261bp，則為致病純合子；若擴(kuò)增出的目的片段為261bp和90bp，則為雜合子，即DUMPS疾病攜帶者；若擴(kuò)增的目的片段為90bp，則為健康個(gè)體。參考文獻(xiàn)[l]Schober，S.，Simon，D.，Schwenger，B.SequencesofthecDNAencodingbovineuridinemonophosphatesynthase.Gene，1992，124:307—308.[2]Schwenger，B.，Schober，S.，Simon，D.DUMPScattlecarryapointmutationintheuridinemonophosphatesynthasegene.Genomics,1993，16:241—244[3]Shanks,R.D.，Dombrowski，D.B.，Harpestad，G.W.，Robinson,J丄InheritanceofUMPsynthaseindairycattle.J.Hered，1984，75:337-340.[4]李艷華等.中國(guó)荷斯坦牛脊椎畸形綜合征的研究現(xiàn)狀與展望.中國(guó)奶牛2008，6:27-29。序列表〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉應(yīng)用AS-PCR檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥的方法〈130〉〈141>2009-12-01〈160>6〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>261〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈400>13tggg卿3gggg￡itegg￡igttettttegggtcttegtgg3gc3ggtetgtagattcate60tcteagattecctgtttegatetgagttcaatgtgacatg3g朋朋tecatccataagac120agcagagtttcttacgtttggtgtggttaactgctgtcttgtcatctgttgattecattc180cattcaggtgca朋tggctg朋g朋cattctg朋tttgtgattggttttetttctggctc240ccgagteagc3tga朋cc3ga261〈210>2〈211>90〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(90)〈223〉〈400>2attggttttetttctggctcccgagteagcatgaaaccagaatttcttcacttgactcca60ggagttcagttegaagcaggaggteagcct90〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉〈221>primer_bind<222>(1).(20)〈223〉〈400>3Eltggg卿Elgggg￡lt￡lgg￡lg〈210〉4〈211>20〈212>DNA〈213〉牛(Bosprimigenius)<220>〈221>primer—bind〈222〉(1)..(20)<223>〈400>4tctggtttcatgcttacgca<210>5〈211>22<212>DNA〈213〉牛(Bosprimigenius)〈220〉<221>primer—bind〈222〉(1)(22)〈223〉〈400>5attggttttatttctggctacc〈210>6〈211>20〈212〉DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉C0112]〈221〉primer一bind〈222〉(1)(20)〈223〉〈400〉6aggcttacctcctgcttcta說(shuō)明書(shū)5/5頁(yè)20202220權(quán)利要求應(yīng)用AS-PCR檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥的方法的特異性引物，其特征在于，所述引物序列如下所示基因UMPS的擴(kuò)增引物突變型反向引物3’端倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為261bp，1F5′ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3′，1R5′TCTGGTTTCATGCTTACGCA3′；野生型正向引物3’倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為90bp；2F5′ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3′，2R5′AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3′。2.權(quán)利要求1所述的引物在AS-PCR檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于動(dòng)物疾病檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及應(yīng)用AS-PCR檢測(cè)牛尿苷酸合酶缺乏癥的方法。制備了一種用于牛尿苷酸合酶缺乏癥檢測(cè)方法的特異性PCR引物，它包括UMPS基因擴(kuò)增引物突變型反向引物3’端倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為261bp；1F5’ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3’，1R5’TCTGGTTTCATGCTTACGCA3’；野生型正向引物3’倒數(shù)第三位引入錯(cuò)配產(chǎn)物，長(zhǎng)度90bp；2F5’ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3’，2R5’AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3’。本發(fā)明制備的牛尿苷酸合酶缺乏癥的方法的特異性引物，可直接應(yīng)用于開(kāi)展牛尿苷酸合酶缺乏癥的致病基因的篩選，以利于對(duì)患病個(gè)體進(jìn)行早期淘汰。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101705306SQ20091027295公開(kāi)日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年12月1日優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日發(fā)明者何年華,劉耘,吳世欽,周傲,宴幫富,張淑君,楊利國(guó),梁愛(ài)心,滑國(guó)華,熊家軍,王成,黃長(zhǎng)梅申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)