專利名稱：一種水生棒狀桿菌的篩選方法及其在降解草甘膦廢水中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水生棒狀桿菌及其篩選方法，本發(fā)明還涉及該菌種在降解草甘膦
廢水中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草甘膦的化學(xué)名稱為N-膦羧甲基甘氨酸，屬于氨基甲撐膦類含有羧酸基的化合 物。草甘膦廢水具有濃度高、污染嚴(yán)重的特點，廢水所含的污染物主要有甲醇、甲醛、草甘膦 以及鹽類等?，F(xiàn)今，我國草甘膦廢水的處理也是一個急需解決的難題。若不進(jìn)行處理任其 排入環(huán)境中，不可避免地會污染水源、傳播疾病、危害人們的身心健康。 根據(jù)國內(nèi)外廢水處理現(xiàn)已采用的工藝及運行情況，當(dāng)前的環(huán)境處理技術(shù)主要分 為(l)物理處理技術(shù)，包括活性炭處理、活性氧化鋁吸附、加入CaCl2溶液使草甘膦以鈣 鹽的形式沉淀等，該處理技術(shù)主要用于去除水中難溶解的大顆粒污染物。在處理過程中沒 有真正降解廢水，只是進(jìn)行了簡單的吸附作用或物態(tài)的轉(zhuǎn)化；并且處理過程中需要調(diào)節(jié)pH 值，在最適pH下才能達(dá)到最佳處理效果，操作過程復(fù)雜。(2)化學(xué)處理技術(shù)，如Fenton、氧 化_鎂鹽沉淀法、次氯酸鈉氧化、鐵炭微電解法等。雖然目前以Ti02及Fenton為代表熱點 研究的高級氧化技術(shù)具有條件寬松，水污染處理相對簡單等優(yōu)勢，但Fenton及Ti02氧化方 法及技術(shù)對有機物礦化不完全、技術(shù)還處于研究階段，需要進(jìn)一步開發(fā)。(3)生物處理技術(shù)， 是從自然界中選育菌株來處理廢水的原始形式，即利用廢水中的有毒污染物作為唯一碳源 或者主要碳源，從而對廢水進(jìn)行降解。生物處理技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在處理廢水量大，轉(zhuǎn)化率高； 操作管理簡單、處理設(shè)備成本及運行費用低；無二次污染，對環(huán)境友好；該方法尤其對小分 子有機物有良好的降解效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選出能高效降解草甘膦廢水的水生棒狀桿菌的方法 并得到這種水生棒狀桿菌； 本發(fā)明的另一個目的是將這種水生棒狀桿菌用于降解草甘膦廢水。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的 水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001 (Corynebacterium aquaticum CTGU-CGL-001)，保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No :M 209203，保藏日期2009年9月16日。
水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001的篩選方法，包括以下步驟
a菌株的富集步驟 在容器中，加入草甘膦廢水及以體積比計3倍于草甘膦廢水的富集培養(yǎng)基，再加 入曝氣靜置24h的污泥，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)3天；
b菌株的馴化步驟 在無菌條件下加入草甘膦廢水、菌液以及無機鹽培養(yǎng)基，草甘膦廢水的體積逐漸遞增，置于搖床中3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)，4天為一個馴化周期，進(jìn)行三個周期的馴化，每個馴 化周期結(jié)束后，測定每瓶培養(yǎng)液的COD值，計算出降解率，每組取平行樣中草甘膦廢水降解
率最高的培養(yǎng)液作為下一次馴化的接種源；
c菌株的純化步驟 經(jīng)過了三個周期的馴化，在無菌條件下，取廢水降解率最高的培養(yǎng)液在含有草甘 膦廢水的無機鹽平板上涂布，廢水與無機鹽培養(yǎng)液體積比為3 : 2，3(TC恒溫培養(yǎng)，挑取單 菌落，反復(fù)劃線分離純化，得到單一菌落。
所述富集培養(yǎng)基組成是單位g/L，蛋白胨，l.O ;葡萄糖，5.0 ;K2HP04，1.0 ;
KH2P04， 1. 0 ;NaC1，2. 5g ;pH7. 0-7. 2。 所述的無機鹽培養(yǎng)基組成是，單位g/L， KH2P04，0. 5 ;K2HP04，0. 5 ;MgS04 7H20， 0. 2 ;CaCl2，0. 1 ;NaCl，O. 2 ;Mn S04 *!120痕量；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的FeS04溶液1滴；NH4N03， 1. 0g ; 廢水加入作為微生物生長的唯一碳源；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10X的Na0H溶液調(diào)節(jié)pH為7. 0 ;固體 培養(yǎng)基加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5-2. 0%的瓊脂。 培養(yǎng)溫度最適溫度為30°C ;培養(yǎng)方式好氧培養(yǎng)；培養(yǎng)底物濃度300mL L—1 ;pH 值范圍最適pH為9.0。 水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001在降解草甘膦廢水中的應(yīng)用。 本發(fā)明提供的水生棒狀桿菌的篩選方法及其在降解草甘膦廢水中的應(yīng)用，從自然 界的活性污泥中篩選到一株能降解草甘膦廢水的好氧微生物，即在有氧條件下能礦化草甘 膦廢水的微生物，然后經(jīng)過選擇性富集、馴化培養(yǎng)、篩選和純化的過程，最終分離篩選出能 高效降解廢水中高濃度有機物的菌株，得到了一種用于降解草甘膦廢水的水生棒狀桿菌。 本發(fā)明將此水生棒狀桿菌應(yīng)用于降解草甘膦廢水，對預(yù)處理后的草甘膦廢水礦化程度較 高，處理廢水量大，處理設(shè)備成本及運行費用低，不產(chǎn)生二次污染，操作簡單，應(yīng)用廣泛，最 高降解率達(dá)84. 22%。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
圖1是溫度對菌株降解草甘膦廢水的影響曲線圖。 將菌懸液10mL接入濾液體積為15mL (培養(yǎng)液總體積為50mL) 、 pH為7. 0的25mL 無機鹽培養(yǎng)液中，在不同的培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40°C )下恒溫振蕩培養(yǎng)，每個溫度 做兩個平行樣。培養(yǎng)四天后，測定培養(yǎng)液的COD，得出在不同溫度條件下菌株降解廢水的降 解曲線。 圖2是pH對菌株降解草甘膦廢水的影響曲線圖。將菌懸液10mL接入濾液體積為15mL (培養(yǎng)液總體積為50mL)、無機鹽培養(yǎng)液25mL 中，在不同的pH (4、5、6、7、8、9、 10、 11)下恒溫振蕩培養(yǎng)，每個pH做兩個平行樣。30°C培養(yǎng) 四天后，測定培養(yǎng)液的COD，得出在不同pH條件下菌株降解廢水的降解曲線。
圖3是底物濃度對菌株降解草甘膦廢水的影響曲線圖。 將菌懸液lOmL加入不同的濾液體積(5、 10、 15、20、25、30、35、40mL)，再接入液體 無機鹽培養(yǎng)基，pH為7. 0下恒溫振蕩培養(yǎng)(培養(yǎng)液總體積為50mL)，每個底物濃度做兩個平 行樣。3(TC培養(yǎng)四天后，測定培養(yǎng)液的COD，得出在加入不同底物濃度下菌株降解廢水的降解曲線。 圖4是最優(yōu)條件下草甘膦廢水降解曲線(a)和空白實驗(b)。 菌株降解草甘膦廢水的最佳降解條件為溫度3(TC、pH為9.0、當(dāng)?shù)孜餄舛葹?300mL *L—工時，降解比較完全。所以設(shè)定溫度3(TC、pH為9. 0、底物濃度底物濃度為300mL 'L一1 條件下，測定草甘膦生產(chǎn)藥業(yè)廢水的降解曲線。每隔10小時測定培養(yǎng)液C0D。草甘膦廢水 降解率隨時間的變化。
具體實施例方式
本發(fā)明提供的水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001(Corynebacterium aquaticumCTGU-CGL-001)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No :M209203， 保藏日期2009年9月16日。 水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001的制備方法
—、菌株的富集 a、在250mL的錐形瓶中，加入30mL富集培養(yǎng)基，草甘膦廢水10mL，再加入曝氣靜置 24h的污泥10mL(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)3d。
b、菌株的馴化過程 在無菌條件下加入草甘膦廢水、菌液以及無機鹽培養(yǎng)基，草甘膦廢水的體積由 10mL、 15mL逐漸遞增到30mL，培養(yǎng)液總體積均為50mL，置于搖床中3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)，4d為 一個馴化周期，進(jìn)行三個周期的馴化。每個馴化周期結(jié)束后，測定每瓶培養(yǎng)液的COD值，計 算出降解率。每組取平行樣中草甘膦廢水降解率最高的培養(yǎng)液作為下一次馴化的接種源。
C、菌株的純化與鑒定 經(jīng)過了三個周期的馴化，在無菌條件下，取廢水降解率最高的培養(yǎng)液在含有草甘 膦廢水的無機鹽平板(廢水與無機鹽培養(yǎng)液體積比為3 : 2)上涂布，3(TC恒溫培養(yǎng)，挑取 單菌落，反復(fù)劃線分離純化，得到單一菌落。將所得到的菌株接種于牛肉膏蛋白胨平板上， 4t:冰箱保存。菌株的鑒定，采用形態(tài)和顯微觀察相結(jié)合的方法，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行特性鑒定。
二 、培養(yǎng)該菌種采用的培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨，1. 0 ;葡萄糖，5. 0 ;K2HP04， 1. 0 ;KH2P04， 1. 0 ;NaCl， 2. 5g ;pH7. 0-7. 2。 無機鹽培養(yǎng)基(g/L) :KH2P04，0. 5 ;K2HP04，0. 5 ;MgS04 7H20， 0. 2 ;CaCl2，0. 1 ;NaCl，
0. 2 ;MnS04 *H20痕量；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的FeS04溶液1滴；NH4N03， 1. 0g ;廢水按一定體積(10、 15、30mL)加入作為微生物生長的唯一碳源；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10X的Na0H溶液調(diào)節(jié)pH為7. 0 ; 固體培養(yǎng)基加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5-2. 0%的瓊脂。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏，5.0 ;蛋白胨，10 ;NaC1，2.5 ;pH7.0 ;瓊脂
1. 5-2. 0% ;固體培養(yǎng)基加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5-2. 0%的瓊脂。
三、菌種的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度最適溫度為30°C ;
培養(yǎng)方式好氧培養(yǎng)；
培養(yǎng)底物濃度300mL L—1 ;
pH值范圍最適pH為9. 0。
四、該菌種的形態(tài)及生理生化特征 該菌在牛肉膏蛋白胨平板上生長，菌落乳白色，圓整，表面光滑濕潤，不透明，無特 殊氣味； 生理生化特征顯微觀察菌體呈桿狀，革蘭陰性，細(xì)胞單生，不運動，無鞭毛。 利用API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，用API Coryne試條鑒定該菌種為水生棒狀桿菌屬。 API Coryne試條試驗結(jié)果如下NIT呈陽性；PYZ呈陽性；PYRA呈陰性；PAL呈陽
性；aGLU呈陽性;P GUR、 P GUR呈陰性;P NAG呈陰性；ESC呈陽性；URE呈陰性；GEL呈陽性;
GLU、 RIB、 XYL、 MAN、 MAL、 LAC、 SAC、 GLYG均呈陰性。 水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001在降解草甘膦廢水中的應(yīng)用 草甘膦廢水預(yù)處理 將草甘膦廢水原水稀釋5倍并加入一定量的CaCl2溶液，濃度為634g/L，使得草甘
膦以鈣鹽的形式沉淀，充分反應(yīng)后過濾，取草甘膦廢水濾液進(jìn)行生物降解。 實施例1無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入5mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá) 26. 59%。
實施例2無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入10mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá) 57. 04%。
實施例3無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入15mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá) 84. 22%。
實施例4無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入20mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá) 67. 55%。
實施例5無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入25mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá) 59. 58%。
實施例6無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入30mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá) 53. 08%。
實施例7 無菌條件下在250mL的錐形瓶中，加入35mL草甘膦廢水，10mL菌液，及無機鹽培養(yǎng) 基(共計50mL)，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)4天。4天后，菌株對草甘膦廢水降解率達(dá)28. 17%。 本發(fā)明中采用的草甘膦廢水采自湖北宜昌某草甘膦生產(chǎn)集團(tuán)。其廢水主要理化性 質(zhì)為:深黃色、臭雞蛋氣味、堿性、BOD 73. 2mg L—、COD 95800. OOmg L-、
所述污泥采自采?、偃龒{大學(xué)求索溪的池塘污泥；②宜昌草甘膦生產(chǎn)集團(tuán)污水 處理廠次生池污泥；③更正為宜昌草甘膦生產(chǎn)集團(tuán)污水處理廠終生池污泥；④宜昌草甘膦 生產(chǎn)集團(tuán)污水處理廠排污口污泥，作為原始的菌液。將廢水和四處污泥曝氣靜置24小時。
權(quán)利要求
水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001(Corynebacterium aquaticum CTGU-CGL-001)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NoM 209203，保藏日期2009年9月16日。
2. 權(quán)利要求1所述的水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001的篩選方法，其特征在于包括以下 步驟a菌株的富集步驟在容器中，加入草甘膦廢水及以體積比計3倍于草甘膦廢水的富集培養(yǎng)基，再加入曝 氣靜置24h的污泥，置于搖床中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)3天； b菌株的馴化步驟在無菌條件下加入草甘膦廢水、菌液以及無機鹽培養(yǎng)基，草甘膦廢水的體積逐漸遞增， 置于搖床中3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)，4天為一個馴化周期，進(jìn)行三個周期的馴化，每個馴化周期 結(jié)束后，測定每瓶培養(yǎng)液的COD值，計算出降解率，每組取平行樣中草甘膦廢水降解率最高 的培養(yǎng)液作為下一次馴化的接種源；c菌株的純化步驟經(jīng)過了三個周期的馴化，在無菌條件下，取廢水降解率最高的培養(yǎng)液在含有草甘膦廢 水的無機鹽平板上涂布，廢水與無機鹽培養(yǎng)液體積比為3 : 2，3(TC恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落， 反復(fù)劃線分離純化，得到單一菌落。
3. 如權(quán)利要求2所述的水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001的篩選方法，其特征在于所述 富集培養(yǎng)基組成是單位g/L，蛋白胨，1.0 ;葡萄糖，5.0 ;K2HP04，1.0 ;KH2P04，1.0 ;NaCl， 2. 5g ;pH7. 0-7. 2。
4. 如權(quán)利要求2所述的水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001的篩選方法，其特征在于所述 的無機鹽培養(yǎng)基組成是，單位g/L， KH2P04，0. 5 ;K2HP04，0. 5 ;MgS04 7H20，0. 2 ;CaCl2，0. 1 ; NaCl，O. 2 ;MnS04 H20痕量；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的FeS04溶液1滴；NH4N03， 1. 0g ;廢水加入作為 微生物生長的唯一碳源；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10X的Na0H溶液調(diào)節(jié)pH為7. 0 ;固體培養(yǎng)基加質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為1.5-2.0%的瓊脂。
5. 如權(quán)利要求2所述的水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001的篩選方法，其特征在于培養(yǎng)溫 度最適溫度為30°C ;培養(yǎng)方式好氧培養(yǎng)；培養(yǎng)底物濃度300mL L—1 ;pH值范圍最適pH 為9.0。
6. 如權(quán)利要求1所述的水生棒狀桿菌CTGU-CGL-001在降解草甘膦廢水中的應(yīng)用。
全文摘要
一種水生棒狀桿菌的篩選方法及其在降解草甘膦廢水中的應(yīng)用，即以草甘膦廢水為唯一碳源，通過選擇性富集、馴化培養(yǎng)、劃線分離和純化，從自然界活性污泥中分離得到能高效降解草甘膦廢水的工程菌。經(jīng)形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化實驗結(jié)果觀察，鑒定出水生棒狀桿菌對草甘膦廢水有很高降解效果。本發(fā)明的工程菌可應(yīng)用于處理草甘膦廢水及城市生活污水中有機污染物的凈化處理。所述水生棒狀桿菌最適生長條件溫度為30℃，pH為7.0，底物濃度為300ml·l-1。工程菌處于最適生長條件下，其對草甘膦廢水降解率最高可達(dá)84.22％，礦化程度較高，處理設(shè)備成本低，操作簡單，應(yīng)用廣泛。
文檔編號C12N1/20GK101709284SQ200910272949
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者梅朋森, 王曉星, 黃應(yīng)平 申請人:三峽大學(xué)