專利名稱：一種表達(dá)中溫α-淀粉酶的基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)中溫a -淀粉酶的基因工程菌株。
背景技術(shù)：
中溫a-淀粉酶是一種內(nèi)切酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a—l， 4 葡萄糖苷鍵的a-淀粉酶，其一般反應(yīng)溫度為50-70攝氏度，因此稱為中溫a-淀粉酶。
隨著釀造和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展.a-淀粉酶廣泛應(yīng)用于醬油、醬類、食醋、酒類、味 精及糖色等工業(yè)生產(chǎn)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的制曲。應(yīng)用酶制劑與制曲相比，既省工省廠房設(shè)備， 又能提高出品率，降低成本，增加效益。枯草桿菌cx-淀粉酶是我國產(chǎn)量最大用途最廣 的一種高效液化型淀粉酶，它是由耐熱性能高的枯草桿菌誘變后逐級擴(kuò)大培養(yǎng)再經(jīng)提 純而獲得的一種淺灰褐色粉來狀有臭味的酶制劑，主要作用是能將原料中的淀粉質(zhì)液 化為糊精。
我國目前生產(chǎn)的a-淀粉酶所用菌種均是BF7658的變異種，如BF7658-209、 8a5、 86315、 K211。目前國內(nèi)工業(yè)用a-淀粉酶，是將發(fā)酵液加入硫酸銨，使淀粉酶連同菌絲 體等一起析出，經(jīng)過濾、干燥和粉碎即得工業(yè)用a-淀粉酶酶粉。也有將發(fā)酵液加穩(wěn)定 劑，直接噴霧干燥制成工業(yè)酶粉[谷軍生物技術(shù)4 (3) : 1-5.1994]。
我國對cx-淀粉酶菌種的選育、研究和生產(chǎn)做了大量的工作，1957年陳琦等報(bào)導(dǎo)了 產(chǎn)生淀粉酶能力強(qiáng)的枯草桿菌Sn和S56 [陳琦等:微生物學(xué)報(bào)5 (3): 256-261. 1957]， 1965年我國開始應(yīng)用解淀粉芽孢桿菌BF7658生產(chǎn)a-淀粉酶，以前曾誤稱為枯草芽孢 桿菌BF7658 ot-淀粉酶，王桂芬證明了原稱為枯草芽孢桿菌G^^7^As 6^力""s)BF7658產(chǎn)生的a-淀粉酶與解淀粉芽孢桿菌的液化型a-淀粉酶完全一樣[王 桂芬微生物通報(bào)29 (2) : 124-126. 1989]。 70年代，無錫酶制劑廠與中科院遺傳 所等單位合作，以枯草桿菌06-11為出發(fā)株經(jīng)熱處理、UV照射，亞硝基胍處理和Co60、 Y射線、誘變育種得苗株209。在10噸及20噸罐擴(kuò)試中，發(fā)酵單位提高一倍，產(chǎn)品穩(wěn) 定在300U/ml，最高可達(dá)400U/ml。高定華等利用x射線、Y射線及激光等物理因素誘 變，獲得BF7658的變異株K2n，酶活力由原來的260U/ml提高到500-600U/ml， 20升 發(fā)酵罐酶活力達(dá)420U/ml[高定華食品與發(fā)酵工業(yè)(6) . 1986]。鄔顯章等從BF7658 變異株209出發(fā)，經(jīng)硫酸二乙酯和5-氟尿嘧啶、亞硝基胍等誘變選育出796變異株， 在麥芽糖培養(yǎng)基中可獲得較高的a-淀粉酶活性，達(dá)477U/ml[鄔顯章生物工程學(xué)報(bào)4(2) . 115-126. 1985]。
通過對a-淀粉酶菌種進(jìn)行傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變已經(jīng)取得了很大的成就，但是若想 再進(jìn)一步提高其產(chǎn)淀粉酶水平就變得非常困難。伴隨著分子生物學(xué)理論和基因改造技 術(shù)的飛速發(fā)展，使對菌株進(jìn)行基因方面的改造成為可能。但是國內(nèi)對枯草芽孢桿菌 (Bacillus Subtilis)BF7658的改造主要還是停留在技術(shù)水平上，有人將帶有淀粉酶 基因的克隆片段，在枯草桿菌中表達(dá)[蔡恒等食品與發(fā)酵工業(yè)31(10): 33-35. 2005]， 或者將枯草桿菌a-淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)。而對BF7658直接進(jìn)行基因改造， 使其淀粉酶產(chǎn)酶效率提升則沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)中溫a -淀粉酶的基因工程菌株。 本發(fā)明所提供的表達(dá)中溫a-淀粉酶的工程菌，是將表達(dá)中溫a-淀粉酶基因的重
組載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌(&"7/^^to'to)中，篩選得到的中溫a-淀粉酶表達(dá)量提
高的工程菌株；所述中溫a -淀粉酶基因具有具有GENBANK ACCESSION Number為
AM409180的5'端第7-1551位核苷酸序列。
所述枯草芽孢桿菌(Sac/〃M^to'fc)為枯草芽孢桿菌(5ac7'〃www^7W 264
CICC10264。
所述表達(dá)中溫a-淀粉酶的工程菌為枯草芽孢桿菌(Bac說M^Mfo) ZHWY CGMCCNo.2829。
所述枯草芽孢桿菌(Sac///^ to7&) ZHWY CGMCC No. 2829，已于2008年12月 25日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為 中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC No.2829。
本發(fā)明所提供的一種表達(dá)中溫a -淀粉酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1-3中任意一 項(xiàng)所述的表達(dá)中溫a -淀粉酶的工程菌，得到中溫a -淀粉酶。
所述發(fā)酵用培養(yǎng)基為含75-86 g/L的玉米粉，35-45 g/L的豆餅粉，1-3g/L的氯 化鈣，6. 5-8. 5 g/L的磷酸氫二鈉，3. 5-5. 5 g/L的硫酸銨的液體培養(yǎng)基。
所述發(fā)酵的溫度為36.0-38.5。C，優(yōu)選為37'C。
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建帶有中溫淀粉基因的整合載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后得到增加 了一個(gè)中溫淀粉基因拷貝工程菌，即本發(fā)明的表達(dá)中溫a-淀粉酶的工程菌。本發(fā)明 的表達(dá)中溫a -淀粉酶的工程菌特別是枯草芽孢桿菌CSacz7/iw w^/fc) ZHWY CGMCC No. 2829具有比目前國內(nèi)生產(chǎn)菌株更高的中溫a -淀粉酶產(chǎn)酶能力，具有獨(dú)特的鑒定標(biāo)簽，是一株極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的中溫a-淀粉酶的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株。本發(fā)明的工
程菌，發(fā)酵表達(dá)量高，相同條件下發(fā)酵，較野生菌酶活提高了 83%。


圖1為pAXOI-amyl的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、表達(dá)中溫a-淀粉酶的攜帶LacA整合臂穿梭載體pAXOI-amyl的構(gòu)建 以枯草芽孢桿菌(^^7/^^^7/力264 (購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏 號(hào)為CICC10264，是一株目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中溫a-淀粉酶的枯草芽孢桿菌)的 總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增中溫a-淀粉酶的基因(amyl)(具有GENBANK ACCESSION Number為AM409180的5'端第7—1551位核苷酸序列)。擴(kuò)增引物為上游引物5' cgggatccATGATTCAAAAACGAAAGC 3'(下劃線標(biāo)注部分為BamHI酶切位點(diǎn))和 下游引物5' tccatccgcggTTATTTCTGAACATAAATG 3' (下劃線標(biāo)注部分為SacII,酶 切位點(diǎn))。
上述擴(kuò)增得到1545bp的片段，經(jīng)過測序表明，該片段具有GENBANK ACCESSION Number為AM409180的5'端第7—1551位核苷酸序列，該片段包括中 溫a-淀粉酶基因(amyl)的啟動(dòng)子、信號(hào)肽編碼序列和結(jié)構(gòu)基因，將該片段命名為amyl。
分別用BamHI和SacII雙酶切PCR產(chǎn)物amyl和穿梭整合質(zhì)粒pAXOI(購自從美 國俄亥俄州立大學(xué)菌種保存中心，5flc〃/w Genetic Stock Center (BGSC)The Ohio State University),將酶切產(chǎn)物分別用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化后，在4°C采用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)16小時(shí)。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化宿主菌￡.^//1\^10(購自北京天根 生化科技有限公司)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板(Amp+),挑選陽性克隆，進(jìn)行搖瓶培 養(yǎng)16小時(shí)。收獲細(xì)胞，提取小量質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的穿梭質(zhì)粒 即攜帶中溫淀粉酶的啟動(dòng)子、信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)穿梭整合質(zhì)粒命名為 pAXOI-amyl(結(jié)構(gòu)圖如圖1所示)。
實(shí)施例2、表達(dá)中溫a-淀粉酶重組枯草芽胞桿菌(ZHWY)的構(gòu)建 將實(shí)施例1構(gòu)建的攜帶中溫淀粉酶的啟動(dòng)子、信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)穿梭整合 質(zhì)粒pAX01-amyl以原生質(zhì)體加電穿孔法(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)轉(zhuǎn)化野生菌枯草芽孢桿菌(5ac/〃w wto7/力264 (購自 中國工業(yè)微生物菌種保藏中，保藏號(hào)為CICC10264，是一株目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn) 中溫a-淀粉酶的枯草芽孢桿菌)，具體方法如下所述
5采用Romero D枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體制備方法(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556_559)獲得枯草芽孢桿菌C6ac/〃us s"6似^) 264 CICC10264原生質(zhì)體后，取5ul純化后的質(zhì)粒于一個(gè)1. 5 ml的離心管中，將其和0. 2CM 的電擊杯放在冰上預(yù)冷，將120ul制備好的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入至1.5 ml的離心管中，小 心混勻，冰上放置10min，然后開啟電轉(zhuǎn)儀，調(diào)電壓到600V;將質(zhì)粒和原生質(zhì)體細(xì)胞 混合液移到已經(jīng)預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，用干濾紙擦干電轉(zhuǎn)杯，注意混合液中不得有氣泡。 將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀的杯槽中，按下電擊鍵，有放電聲出現(xiàn)后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入 lml細(xì)胞復(fù)蘇緩沖液(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的離心管中。放置37。C， 100rpra搖床培養(yǎng) 12-16小時(shí)，取150ul菌液涂布于含有10ug/ml紅霉素的DM3固體培養(yǎng)基平板(含8g/L 瓊脂，5g/L水解酪蛋白，5g/L酵母粉，1.5g/LKH2P04， 3.5g/L K2HP04， 45.5g/L山梨 醇和10g/L淀粉的培養(yǎng)基)，放入37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 — 96小時(shí)后，挑取出現(xiàn)枯草芽 孢桿菌的單菌落，提取基因組基因，用實(shí)施例l所述的擴(kuò)增中溫a-淀粉酶的基閔(a町l) 的上下游引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增得到1545bp的片段的菌株即為陽性菌株，結(jié)果得 到一株驗(yàn)證表明正確的導(dǎo)入pAX0I-amyl得到基因重組菌，將該菌株命名為枯草芽孢桿 菌(^^7/m wto'fo) ZHWY。該枯草芽孢桿菌(&c"/m wto7/力ZHWY，巳于2008年12月 25日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為 中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2829。
實(shí)施例3、基因重組枯草芽孢桿菌(5ac"/w ZHWY中溫a-淀粉酶表達(dá)效果
驗(yàn)證
將實(shí)施例2所得重組枯草芽孢桿菌CSa"7/iw raZ)"7/力ZHWY CGMCC No. 2829和 枯草芽孢桿菌(^^///^ w^/fo) 264 CICC10264 (野生菌)活化做種子。活化條件為將重 組枯草芽孢桿菌ZHWY或枯草芽孢桿菌(^"c///^ 264 CICC10264 (野生菌)分別
接種于裝有25ml活化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37°C ， 200rpm搖床培養(yǎng)16小時(shí)得 到重組枯草芽孢桿菌(^]^7/^ ZHWY CGMCC No. 2829或枯草芽孢桿菌
CBa"'〃"s 264 CICC10264 (野生菌)種于液。
活化培養(yǎng)基組分為蛋白胨10g/L，酵母粉5/L，氯化鈉10g/L， pH7.0-7.2，其余 為水。
將上述獲得的重組枯草芽孢桿菌CSad//^犯^/fo) ZHWY CGMCC No. 2829或枯 草芽孢桿菌(5ac///^ wto'fc) 264 CICC10264 (野生菌)種子液分別按照體積百分含量為 2-4% (請將該數(shù)值范圍替換成具體實(shí)施的數(shù)據(jù))的接種量接種于裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)
6基的500毫升帶帶檔板的三角瓶中，37°C， 200rpra搖床培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)76小時(shí)，終 止發(fā)酵。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為玉米粉85g/L，豆餅粉40g/L，氯化鈣2/L，磷酸氫二 鈉8g/L，硫酸銨4g/L， pH7.0， 其余為水。
發(fā)酵過程中，取樣發(fā)酵液離心(12000r/min， 5min)，取上清液進(jìn)行檢測酶活， 中溫淀粉酶活檢測采用中華人民共和國家標(biāo)準(zhǔn)法測定(QB/T2306-1997)，酶活的定 義lg酶粉或lml酶液于60°C， p朋.0條件下，以lh液化可溶性淀粉的克數(shù)來表示(克 可溶性淀粉/克.小時(shí)或克可溶性淀粉/毫升.小時(shí))(中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)， GB8275-87)。
結(jié)果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)76小時(shí)，重組菌枯草芽孢桿菌CSa"7/w wto7/力ZHWY的酶 活達(dá)到731U/毫升發(fā)酵液，而野生菌酶活為400U/毫升發(fā)酵液，重組菌枯草芽孢桿菌 CSac/〃w w6afo) ZHWY CGMCC No. 2829酶活(731 U /毫升)比野生菌提高83 % 。
權(quán)利要求
1、表達(dá)中溫α-淀粉酶的工程菌，是將表達(dá)中溫α-淀粉酶基因的重組載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)中，篩選得到的中溫α-淀粉酶表達(dá)量提高的工程菌株；所述中溫α-淀粉酶基因具有具有GENBANK ACCESSION Number為AM409180的5′端第7—1551位核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌(Ba"7/M ^to'fo)為枯草芽孢桿菌(^flc/〃z^w^/fc) 264 CICC10264。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于所述表達(dá)中溫a-淀粉酶的工程 菌為枯草芽孢桿菌CBac/〃ws w6"fo) ZHWY CGMCC No. 2829。
4、 一種表達(dá)中溫a-淀粉酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的表達(dá) 中溫a-淀粉酶的工程菌，得到中溫a-淀粉酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵用培養(yǎng)基為含75-86 g/L 的玉米粉，35-45 g/L的豆餅粉，l-3g/L的氯化鈣，6.5-8.5 g/L的磷酸氫二鈉， 3.5-5.5 g/L的硫酸銨的液體培養(yǎng)基。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為36.0-38.5。C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為37。C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)中溫α-淀粉酶的基因工程菌株。該工程菌是表達(dá)中溫α-淀粉酶的工程菌，是將表達(dá)中溫α-淀粉酶基因的重組載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)中，篩選得到的中溫α-淀粉酶表達(dá)量提高的工程菌株；所述中溫α-淀粉酶基因具有具有GENBANK ACCESSION Number為AM409180的5′端第7-1551位核苷酸序列。本發(fā)明的方法，是發(fā)酵所述的表達(dá)中溫α-淀粉酶的工程菌，得到中溫α-淀粉酶。該工程菌具有比目前國內(nèi)生產(chǎn)菌株更高的中溫α-淀粉酶產(chǎn)酶能力，具有獨(dú)特的鑒定標(biāo)簽，是一株極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的中溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101451115SQ20081024673
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者楊建國, 兵 汪, 趙仁國 申請人:北京中天諾亞體育科技有限公司