專利名稱：利用家畜乳腺高效生產(chǎn)人溶菌酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種乳腺特異性表達融合基因，以 及一種制備乳汁中可高效表達溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家畜的方法，以及一種高效的去除標記基因的 轉(zhuǎn)基因家畜制備方法。
背景技術(shù)：
天然的溶菌酶是一種在動物界和植物界中廣泛存在的多肽類糖苷酶。1922年Alexander Flemin發(fā)現(xiàn)多種粘液組織和分泌物以及雞蛋清中存在能夠溶解多種革蘭氏陽性細菌的物質(zhì)。 他把這種溶解因子稱為溶菌酶。Flerain發(fā)現(xiàn)溶菌酶在軟骨組織和胃的勻漿液、淚液、唾液、 痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、血清和淋巴細胞中都有存在，但在健康的尿液、腦脊髓液 或汗液中沒有溶菌酶。1963年Jolles和Canfield各自獨立闡明了雞蛋清來源的溶菌酶的一 級結(jié)構(gòu)。1965年P(guān)hillips基于X-射線結(jié)晶學描繪了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)。
溶菌酶可分為三種類型源于雞蛋卵清的c型、源于鵝蛋卵清的g型和源于噬菌體的溶 菌酶。三者有相似的三維結(jié)構(gòu)，但氨基酸序列不同。目前已知溶菌酶發(fā)揮生物學活性主要通 過兩種方式 一種是直接作用，即通過降解細菌細胞壁肽聚糖(polyp印tidoglycan)中N — 乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)間的 e (1—4)糖苷鍵的連接，破壞肽聚糖支架，引起細菌裂解。由于革蘭氏陽性細菌(G+細菌)的 細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而革蘭氏陰性細菌(G-細菌)只有內(nèi)壁層為肽聚糖，因此，溶 菌酶可高效破壞G+細菌的細胞壁，而對G-細菌的作用不大。間接作用就是通過降解細菌細 胞膜中的粘多糖片段引發(fā)一些尚未明確的免疫激活，刺激巨噬細胞的噬菌活性。這種間接作 用已在大鼠中得到證明，完整的細菌不引發(fā)巨噬細胞的噬菌作用，相反經(jīng)溶菌酶處理過的細 菌能夠被迅速吞噬。另外溶菌酶分子本身的陽離子和疏水的特性也有助于其殺菌活性的發(fā) 揮。人和動物細胞無細胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，因此溶菌酶對人體細胞無毒性作用。
目前已知的溶菌酶的主要作用有l(wèi))抗菌消炎作用。溶菌酶的溶菌活性使其在預防和治 療多種細菌性疾病中具有重要作用，如由鏈球菌家族微生物引起的耳炎、竇炎、腺炎、尿道 炎、陰道炎等。它還可結(jié)合并失活各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)，能增強抗生素和其它藥物的療 效等。2)抗病毒作用。溶菌酶的正離子特性使其可結(jié)合帶負電荷的病毒蛋白使其失活。3)增 強免疫力。溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，可以改善和 增強巨噬細胞的吞噬和消化能力，激活白細胞的吞噬功能，并改善細胞抑制劑所導致的白細 胞減少等。4)止血、鎮(zhèn)痛等作用。
上述溶菌酶的廣泛作用表明了其藥用的廣闊前景，具有極大的市場。但是目前溶菌酶在 用于臨床時受到了三大因素的制約l)天然人溶菌酶很難大量獲得。目前人乳汁和胎盤是獲 得天然人溶菌酶(hLYZ)的唯一來源，但這些材料相當有限，使產(chǎn)品的價格過于昂貴。2)來源于其它物種的溶菌酶會引起許多副作用，如蛋清來源的可引起過敏反應，牛源的具有傳染瘋 牛病的威脅。3)其它動物來源的溶菌酶不適合用于人用藥物，因它們與人溶菌酶間的同源性 較低，如雞蛋清源的為56. 8%，大鼠的為76. 4%，奶牛的為82. 3%，馬的為50. 8%。
基因工程技術(shù)的發(fā)展為克服上述限制提供了有效途徑。1986年，Jigami等人利用酵母 表達了人溶菌酶，但不具有抑菌活性。Castanon和Yoshimura也做了類似的工作，沒有取得 突破。1990年，Archer等人在米曲霉中表達了 12mg/l的雞蛋清溶菌酶Tsuchiya等人在米 曲霉中表達了 1.2mg/l的人溶菌酶，但均沒有生物活性?？梢?，酵母和米曲霉并非表達溶 菌酶的理想宿主。
近年來，利用植物表達溶菌瞎的研究取得了可喜進展。1997年，Nakaiima等人在煙草 葉中低水平表達的溶菌酶可以提高植物抗真菌和細菌能力。2000年，Takaichi和Oeda在胡 蘿卜中表達了人溶菌酶。Ahreholta等人在馬鈴薯里中表達的T4溶菌酶具有不依賴于植物的 年齡和生長環(huán)境影響的溶菌活性。2002年，經(jīng)密碼子優(yōu)化的人工合成的溶菌酶基因在轉(zhuǎn)基因 的水稻懸浮培養(yǎng)的細胞里得到了表達，表達量達到可溶性蛋白的4%，并具有同人溶菌酶相似 的生物活性。由此可見，植物可以表達有活性的人溶菌酶。但是植物與動物間蛋白修飾、剪 接等方面的差異將可能影響這種重組蛋白的臨床應用。
哺乳動物乳汁中蛋白的表達水平高，成本低、無污然，而人溶菌酶自身就可在人乳中有 相當量的高活性表達(O. 4-0. 7mg/ml)。 1994年Mapa等人利用牛的alpha sl-casein啟動子 調(diào)控人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中獲得了表達，表達量為0.2g 0.7g/L。 1998年，他們進 一步的研究表明這種人溶菌酶具有同標準溶菌酶相同的活性。由于大型乳用家畜(牛和羊等) 乳腺的蛋白產(chǎn)量大(每頭奶?？赡戤a(chǎn)250 300kg乳蛋白， 一只綿羊或山羊可年產(chǎn)25 30KG 乳蛋白)，因此是大量生產(chǎn)人溶菌酶的理想場所。李寧等在CN 16699405A中公開報道獲得了 整合有以PBC1(—種商業(yè)化載體，調(diào)控序列為山羊的P-酪蛋白)指導人溶菌酶乳腺特異表達 框架的轉(zhuǎn)基因奶牛，但沒有檢測表達情況。
此外，還應當注意到，在利用核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的過程中，不可避免的要使用 篩選標記基因(如細菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)和單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因 (HSVtk)等)，以富集整合有外源基因的單克隆細胞株。這些標記基因大多要求使用可組成性 表達的強啟動子，如源于巨細胞病毒(CMV)和單純皰疹病毒(HSV)等的強啟動子。盡管標記基 因和啟動子本身并無直接毒性，但是當抗性基因整合入受體動物基因組中后往往會帶來的復 雜的生物學效應。根據(jù)研究表明，抗性基因插入基因組后容易導致相鄰基因的失活；其強啟 動子可干擾相鄰基因的啟動子表達。有報道指出，在抗性基因插入位點100kb遠處的基因都 可受到其影響；抗性基因的表達產(chǎn)物也會對受體動物造成多方面效應，如直接的毒性效應、 過敏效應、因蛋白的催化功能而產(chǎn)生的副作用或產(chǎn)生對人類及其他生物體有害的物質(zhì)等。有 研究報道抗性基因的表達產(chǎn)物能夠在宿主細胞中引起免疫反應，例如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 B(hph)的產(chǎn)物曾發(fā)現(xiàn)引起T-細胞應答反應。另外抗性基因?qū)τ谙噜從康幕虻谋磉_水平也會 產(chǎn)生不良影響，有實驗表明不含有抗性基因的載體中目的蛋白的表達要高于含有抗性基因 的；且如果抗性基因與目的蛋白選取相近的啟動子或者其蛋白性質(zhì)相似，抗性基因的表達產(chǎn) 物還可能會污染目的蛋白。鑒于以上情況，刪除轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的標記基因和病毒、細菌的調(diào)控序列是優(yōu)化目的蛋白的表達水平、減少可能的副作用以及加速轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應 器產(chǎn)業(yè)化進程所迫切需要解決的問題。
目前，Cre/loxp重組酶系統(tǒng)已被用于體內(nèi)和體外的DNA分子修飾，包括條件性基因刪除、 轉(zhuǎn)基因激活或滅活以及染色體間的轉(zhuǎn)座等。Cre/loxp技術(shù)在小鼠胚胎干細胞的同源重組體篩 選中去除抗性基因是其一個最重要和直接的應用。Cre重組酶屬于入整合酶家族，分子量為 38kDa,能催化兩個34bp的loxP位點間發(fā)生高效重組，產(chǎn)生的重組結(jié)果有①單條DNA鏈 上，同向loxP位點間DNA序列的剔除；②單條DNA鏈上，反向loxP位點間DNA序列的顛 倒；③兩條DNA鏈上間，同向loxP位點間DNA序列的移位或交叉。
刪除抗性基因可以在體外細胞內(nèi)進行，也可以當抗性基因已被傳遞到生殖系后在體內(nèi)進 行。體內(nèi)刪除是通過與表達Cre酶的轉(zhuǎn)基因動物雜交后，誘導Cre酶在胚胎發(fā)育的早期表達， 從而使后代體內(nèi)的標記基因被刪除。但是，最近許多研究表明這種持續(xù)表達的Cre重組酶能 夠引起毒性。例如Cre重組酶引起了轉(zhuǎn)基因小鼠精子細胞內(nèi)染色體重排的混亂，而且這種方 法無疑會在動物體內(nèi)額外引入了新的Cre表達框架。
體外刪除的方法主要是通過cre重組酶在受體細胞內(nèi)的瞬間表達，然后基于負篩選基因 (如7"的敏感性篩選出標記基因被刪除的細胞。但是，僅有50%被轉(zhuǎn)染的人ES細胞中能夠 檢測到Cre-介導的重組發(fā)生，而且刪除類型的重組和整合類型的重組效率在不同細胞類型中 也存在差異。Co卯oolse等的研究還發(fā)現(xiàn)，Cre/loxp系統(tǒng)在體細胞內(nèi)的刪除效率與刪除片斷 的大小相關(guān)，片段越大效率越低，而且經(jīng)過生殖系傳遞后的刪除效率又有了進一步降低。因 此，Cre介導的DNA重組效率受到了構(gòu)件、細胞類型以及整合狀態(tài)等因素的影響。
蛋白轉(zhuǎn)導技術(shù)可以高效的將有活性的蛋白直接轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞中，其原理是通過重組 的方法改變目的蛋白的生物特性，例如，加入與細胞滲透性有關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)域，即所謂的蛋 白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域(protein transduction domains, PTDs)，如TAT(來源于HIV) ， FGF(疏水多 肽)，NLS(核定位序列)等。但該方法能否用于家畜細胞、會不會影響供核細胞的狀態(tài)，如核 相、增殖性能、染色體倍性等，進而會大大影響克隆的成功率、導致克隆動物生理生化功能 異常甚至無法獲得成活克隆動物等，這些問題目前尚無報道。
綜上所述，盡管目前己經(jīng)有人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因調(diào)控技術(shù)來使動物產(chǎn)生溶菌酶。但 是仍然沒有找到可有效使動物高產(chǎn)溶菌酶的基因調(diào)控方法。因此，現(xiàn)有技術(shù)迫切需要尋找到 合適的基因調(diào)控區(qū)域和調(diào)控方法，以最終獲得高產(chǎn)溶菌酶的轉(zhuǎn)基因動物。為提高轉(zhuǎn)基因動物 的安全性，減少因外源基因?qū)胍鹗荏w動物傷害或?qū)е聦Νh(huán)境的威脅，目前也迫切需要獲 得一種高效安全地刪除抗性標記基因的轉(zhuǎn)基因動物制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種乳汁中高表達人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因動物及其制備方法。 本發(fā)明的另一目的在于提供高效安全地從轉(zhuǎn)基因動物細胞內(nèi)刪除抗性標記基因的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種乳腺特異性表達融合基因，該融合基因從5'至3'依 次包含以下可操作性相連的元件牛P-乳球蛋白基因的5'側(cè)翼序列，人溶菌酶基因，和牛生長激素基因3'側(cè)翼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的人溶菌酶基因選自
(a) 具有SEQ ID NO: 5中1267-6067位的核苷酸序列；或
(b) 與(a)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或 所述的牛e-乳球蛋白基因的5'側(cè)翼序列選自
(al)具有SEQ ID NO: 5中1-1260位的核苷酸序列；或 (bl)與(al)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或
所述的牛生長激素基因3'側(cè)翼序列選自
(a2)具有SEQ ID NO: 5中6074-6304位的核苷酸序列；或 (b2)與(a2)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的牛e-乳球蛋白基因的5'側(cè)翼序列具有牛e-乳球蛋白基因上
游-1215 + 45 bp位序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的牛e-乳球蛋白基因的5'側(cè)翼序列如下制備以SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2為引物，以?；蚪MDNA為模板PCR擴增獲得。
在另一優(yōu)選例中，所述的牛e-乳球蛋白的3'側(cè)翼序列獲自重組質(zhì)粒pTA-BGH;更佳 的，通過XhoI+SacII雙切重組質(zhì)粒pTA-BGH獲得。
在另一優(yōu)選例中，所述的融合基因
(i) 具有SEQ ID NO: 5中1-1260位、1267-6067位和6074-6304位依次連接獲得的核 苷酸序列；
(ii) 具有SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；或 (Hi)與(i)或(ii)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括以下步驟
(a) 將所述的融合基因轉(zhuǎn)染體細胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉(zhuǎn)基因細胞；
(b) 將所獲得的轉(zhuǎn)基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得可高產(chǎn)人溶菌酶的動物。 在另一優(yōu)選例中，采用抗性標記基因作為篩選工具，獲得基因組中整合有融合基因的轉(zhuǎn)
基因細胞，所述的抗性標記基因獲自雙標記選擇載體。優(yōu)選的雙標記選擇載體為pLNK。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，在將所述的融合基因轉(zhuǎn)染體細胞的同時，還包括將一 用于抗性篩選的基因轉(zhuǎn)染體細胞，獲得基因組中整合有所述融合基因以及抗性標記基因的轉(zhuǎn) 基因細胞；
并且，所述的用于抗性篩選的基因從5'至3'依次包含以下元件Loxp,新霉素抗性 基因(Neo)，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSVtk,簡稱TK)， Loxp。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)與(b)之間，還包括步驟(al):用細胞穿透型Cre重組酶處 理所述的轉(zhuǎn)基因細胞，從而獲得刪除了所述抗性標記基因的轉(zhuǎn)基因細胞；所述的細胞穿透型 Cre重組酶是細胞穿透肽和Cre重組酶的融合蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞穿透型Cre重組酶是反式激活蛋白(TAT)與Cre重組酶的 融合蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞穿透型Cre重組酶從N端至C端依次為TAT和Cre重組酶。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，去除抗性基因的供核細胞的體細胞克隆效率較未處理 組提高了 4倍以上。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述的細胞為動物胎兒成纖維細胞。 在另一優(yōu)選例中，所述的動物選自牛、山羊、綿羊、兔、豬。優(yōu)選的，所述的動物為山羊。
在本發(fā)明的第三方面，提供高產(chǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因克隆動物的細胞(優(yōu)選非生殖細胞)， 來自采用前述的方法獲得的乳腺高效表達人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因動物。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞中不含有抗性基因。 在本發(fā)明的第四方面，提供一種生產(chǎn)人溶菌酶的方法，包括步驟培養(yǎng)用前述方法制 得的轉(zhuǎn)基因動物，從動物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達的人溶菌酶。
在另一方面，還提供一種重組載體，該載體含有所述的融合基因。
另一方面，還提供一種乳汁，它含有濃度10-8000pg/ral的人溶菌酶。更佳的，所述的 乳汁中含有濃度50-1000 u g/ml的人溶菌酶。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1: pbLGLyz的構(gòu)建流程示意圖以?；蚪MDNA為模板，用PCR法擴增BLG5'側(cè)翼 序列(-1215 +45bp),將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T-easy載體'得質(zhì)粒pKBLGR。 XhoI+SacII 雙切重組質(zhì)粒pTA-BGH獲得300bp大小的牛生長素基因3' UTR(PolyA序列)(bGH-pA)，將其 回收，克隆到質(zhì)粒pbLG5'中成pRBLGpA。最后再用Xhol將人的溶菌酶基因從pcDNA-LYZ切 出后克隆到pRBLGpA的Xhol位點，最終成pbLGLyz。
圖2: pLNK的結(jié)構(gòu)示意圖。neo和TK基因兩端各有一個同向排列的loxp位點，這一框 架可通過SalI單切出，大小3.8kb。
圖3:抗性細胞株的PCR和Southern-blot的檢測結(jié)果。圖3A為PCR檢測結(jié)果，1、 2、
4、 5、 6、 21、 26、 27、 28號克隆可擴增出陽性條帶；圖3B為Southern-blot的檢測結(jié)果，
5、 6和21號有3. 2kb的清晰雜交條帶。
圖4:存活的5頭人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆山羊。
圖5:人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆山羊的PCR(A)和Southern-blot (B)的檢測結(jié)果。 圖6:轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中人溶菌酶表達的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)檢測。 圖7:轉(zhuǎn)基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量，其中A為SDS-PAGE檢測結(jié)果，B為Western blot檢測結(jié)果。
圖8:轉(zhuǎn)基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量，采用Western blot法。 圖9:SP-S印harose陽離子交換介質(zhì)純化轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中的rhLYZ。 A為SP-S印harose 分離純化轉(zhuǎn)基因羊乳中重組人溶菌酶的梯度洗脫結(jié)果，表明使用這種純化方法在 0. 145-lmol/L NaCl線形梯度范圍無雜峰出現(xiàn)，純化效果好。B為純化過程各步驟的SDS-PAGE 效果檢驗結(jié)果。M為低分子量蛋白marker; 1為脫脂奶；2為酸沉淀去酪蛋白后乳清；3為上 樣液；4為流穿液；5為洗脫峰純化產(chǎn)物。C為純化產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果。D為圖B中各樣品的Western-Blot的檢測結(jié)果。
圖10:轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量是通過倍比關(guān) 系較好的稀釋度計算出的活性單位。可見BLG1、 BLG2和含2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山 羊乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml、 846400U/ml和308800U/m。
圖ll:載體pAAlyzc、 pBClyzc、 pBClyzg、 pINS-CN的圖譜。
圖12:純化的CreT" SDS-PAGE電泳圖。l為Marker， 2為緩沖液替換后的Cre"T， 3為濃縮 后的Cre"T。
圖13:蛋白轉(zhuǎn)導后細胞克隆的抗性基因PCR鑒定。l為陽性對照，2為陰性對照，3為81號 細胞克隆，4為87號細胞克隆，5為Marker， 6至16依次為88， 98, 100， 102， 111, 116, 125， 128， 129， 130， 132號細胞克隆。
圖14:蛋白轉(zhuǎn)導后細胞克隆的Southern-blot雜交。1至4依次為18， 19， 82， 98號細胞 克隆，5為BLG-l細胞，6為BLG-2細胞，7為正常山羊細胞，8為Marker。
圖15 :在細胞株GEF-BLG-2中瞬間表達cre酶的western檢測。l為轉(zhuǎn)染后一天的細胞樣 品，2為轉(zhuǎn)染后二天的細胞樣品，3為轉(zhuǎn)染后三天的細胞樣品，4為轉(zhuǎn)染后四天的細胞樣品，5 為轉(zhuǎn)染后五天的細胞樣品，6為轉(zhuǎn)染后六天的細胞樣品，7為轉(zhuǎn)染后七天的細胞樣品。 一抗為 anti-ere antibody, 二抗為Anti Rb IgG(H+U/HRP。
圖16: NF1， NF2轉(zhuǎn)基因山羊。
圖17: NF1， NF2轉(zhuǎn)基因山羊中抗性基因PCR鑒定。l為Marker, 2為NF1， 3為NF2， 4為ddH20， 5為野生型山羊，6為BLG-2轉(zhuǎn)基因山羊。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)將的牛e-乳球蛋白5'側(cè)翼序列，人溶菌
酶基因組DNA序列或cDNA序列，以及牛生長激素基因3'側(cè)翼序列三者的融合基因轉(zhuǎn)染到細 胞中，將該轉(zhuǎn)基因細胞作為核供體制備轉(zhuǎn)基因動物，可獲得乳汁中高表達人溶菌酶(〉lmg/ml) 的轉(zhuǎn)基因動物。進一步地，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)利用細胞穿透型的Cre重組酶結(jié)合體細胞克隆技 術(shù)可安全高效地刪除轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的標記基因。
如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性 的空間排列。例如乳球蛋白的5'側(cè)翼序列和牛生長激素基因3'側(cè)翼序列被置于相對 于目的基因核酸序列的特定位置，使得目的基因的轉(zhuǎn)錄或表達受到該區(qū)域的調(diào)控。
如本文所用，所述的"高表達溶菌酶"或"高產(chǎn)溶菌酶"是指轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中溶 菌酶的含量高于一般的動物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的"高表達溶菌酶"是指乳汁中 溶菌酶的含量高于lmg/ml。
如本文所用，術(shù)語"含有"、"具有"或"包括"包括了 "包含"、"主要由......構(gòu)
成"、"基本上由......構(gòu)成"、禾tl "由......構(gòu)成"。
為獲得乳汁中高效表達hLYZ的轉(zhuǎn)基因山羊，本發(fā)明人反復比較了各種預計可用于調(diào)節(jié)人溶菌酶表達的功能性元件，最終找到了較佳的元件組合，該組合包含奶牛e乳球蛋白基因
的5'調(diào)控序列、人溶菌酶基因組DNA序列或cDNA序列和牛生長激素基因3'側(cè)翼序列，這 些元件被可操作性地相連接。
為方便整合細胞的篩選以及將抗性基因從細胞或個體中刪除，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中， 本發(fā)明人使用了一種雙標記表達框架，該框架的兩端各包含一個同向loxp序列；loxp位點 中間是可獨立表達的新霉素(neomycin)和TK兩個篩選標記基因。其作用為Neo基因提供細 胞轉(zhuǎn)染過程中的抗性篩選標記，loxp位點和TK基因提供了利用Cre/loxp重組酶系統(tǒng)將雙標 記表達框架從細胞中刪除的工具和篩選標記。
為了獲得整合有hLYZ的細胞，本發(fā)明人將所述的融合基因與用于抗性篩選的基因按適 當?shù)谋壤旌?，電穿孔方法共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，篩選出抗性單克隆細胞株，經(jīng)鑒定 獲得人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因細胞。
為獲得人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊，用前述轉(zhuǎn)基因細胞作為供核細胞，山羊的卵母細胞作為 供質(zhì)，進行體細胞克隆。最終獲得了 5頭成活克隆羊，經(jīng)PCR和Southern-blot分析，表明 該5頭羊均為人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊，整合率100%,這5頭羊分別命名為BLG1、BLG2、BLG3、 BLG4禾口 BLG5。
對BLG1和BLG2兩頭轉(zhuǎn)基因山羊做人工激素誘導泌乳，結(jié)果人溶菌酶在這兩頭山羊的乳 汁都獲得了高效表達，分子量與天然人溶菌酶的分子量相當。定量分析表明，BLG1的乳汁中 人溶菌酶的表達量約為3mg/ml， BLG2的表達量超過了 4mg/ml。經(jīng)溶壁微球菌懸浮液的溶壁 活性分析表明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml和846400U/ral，添 加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性為308800U/ml。
本發(fā)明人從BLG1泌乳第8天獲得的20ml乳汁中純化了約19. 6mg的重組人溶菌酶，分 析表明其純度約90%。 N-末段測序表明，這種溶菌酶與天然人的溶菌酶N-末段的10個氨基 酸序列完全相同。
本發(fā)明還提供了一種從整合有融合基因以及抗性標記基因的轉(zhuǎn)基因細胞中刪除抗性標 記基因的方法，所述方法包括用細胞穿透型Cre重組酶處理所述的轉(zhuǎn)基因細胞，從而獲得 刪除了抗性標記基因的轉(zhuǎn)基因細胞。
所述的細胞穿透型的Cre重組酶可以是Cre重組酶經(jīng)化學交聯(lián)或融合表達等手段，標記 了TAT、 Penetratin、基于信號序列的肽(Signal sequence-based p印tides) 、 pVEC、轉(zhuǎn)座 子(Transportan) 、 Amphiphilic model peptide或Arg9等細胞穿透肽(eel 1-penetrating peptides, CPPs)。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，TAT與Cre重組酶形成的融合蛋白可良好地被轉(zhuǎn)入 到細胞內(nèi)，并且發(fā)揮良好的刪除抗性篩選基因的作用，抗性篩選基因的刪除效率很高。因此， 所述的細胞穿透型Cre重組酶優(yōu)選的是TAT(反式激活蛋白)與Cre重組酶的融合蛋白(N端至C 端依次為TAT和Cre)。所述的TAT例如具有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞為動物胎兒成纖維細胞。所述的動物可以為山羊、 綿羊、牛、豬、兔；優(yōu)選的是山羊。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，首先建立了細胞內(nèi)含有抗性標記基因的動物；為刪除動物細胞 內(nèi)的標記基因，分離出動物的成纖維細胞，并表達純化了細胞穿透型的TAT-Cre。將TAT-Cre 與成纖維細胞在體外共孵育2小時后，進行克隆化培養(yǎng)。經(jīng)試驗表明，抗性基因的刪除效率 達到42%。
為了獲得標記基因刪除的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊并評估蛋白轉(zhuǎn)導處理對核移植效率的影 響，本發(fā)明的優(yōu)選例中，分別對未刪除抗性標記基因的山羊耳成纖維細胞和刪除了抗性標記 基因的山羊耳成纖維細胞進行了體細胞克隆，結(jié)果表明，兩種類型細胞在核移植過程中的融 合率、桑椹囊胚發(fā)育率和妊娠率分別為64. 1%和87. 5%、 27. 8%與38. 3%、 24. 0%與29. 7%，最 終的克隆成功率未處理組為5.8 %。(獲1頭成活山羊)，處理組為27 %。(獲2頭成活山羊)。 可見經(jīng)TAT-Cre處理的細胞的體細胞克隆的成功率較未處理組提高了 4. 7倍。
在有效地將抗性基因刪除后，獲得的轉(zhuǎn)基因羊乳汁的安全性更高，雜蛋白更少，更有利 于溶菌酶的分離和純化。特別是當用于制藥時，溶菌酶蛋白的純度是非常重要的，如含有Neo 或TK這類耐藥性基因?qū)τ谥扑幨呛懿焕?，而本發(fā)明的方法有效有效克服了該缺陷。并且， 由于去除了來源于病毒的TK基因，去除了其對附近基因表達的影響，因此使得轉(zhuǎn)基因羊的 乳汁中溶菌酶的表達量可顯著提高。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(1) 本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中高表達人溶菌酶，并具有與天然人乳中溶 菌酶相同或相似的生物學活性。
(2) 選擇到較佳的抗性標記基因刪除方法，抗性標記基因的去除效率高，去除了標記基 因的家畜細胞的核移植效率較未處理的對照組有明顯提高。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例 如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
I.試驗材料 l.l質(zhì)粒載體
pGEM-T vector載體購自Promega公司。pBS185質(zhì)粒購自Gibco公司。PLNK獲自中國科 學院遺傳與發(fā)育生物學研究所。質(zhì)粒pET-ere獲自Howard Hughes Medical Laboratories。 1. 2主要試劑材料
各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶購自NEB公司，尼龍膜購自Minipole 公司，QIAquick膠回收試劑盒、QIAfilter質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸訯IAGEN公司，Ready-to-go 同位素標記試劑盒購自Amersham Pharmacia Biotech公司，a -32P-dCTP禾卩Probe Quant探 針純化試劑盒同為Amershara Biosciences公司產(chǎn)品。GMEM購于Gibco公司，F(xiàn)BS、 bFGF、 NEAA、G418、 GANC、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、0. 25% trypsin/0. 02% EDTA溶液均購于Sigma公司，hLIF 購于Chemicon公司，F(xiàn)BS購于Biochrom公司，各類細胞培養(yǎng)板(瓶)是Nunc和Costar公司 的產(chǎn)品。蛋白酶K購于Promega公司，LA PCR試劑盒購于TAKARA公司，秋水仙素購于Gibco 公司，氯前列烯醇(PG)購于上海計劃生育研究所；促卵泡生成素(FSH)購于寧波激素制品廠； 促黃體生成釋放激素(LRH)購于上海東風制藥廠；2%靜松靈購于長春農(nóng)牧大學獸醫(yī)研究所； F-10粉劑購于Gibco公司；離子酶素、細胞松弛素B(CB)、 6-二甲基氨基嘌呤 (6-diethylaminopurine， 6-DMAP)、透明脂酸酶、DL-乳酸鈉、青霉素、鏈霉素、DMEM粉劑、 M16粉劑及所用NaHCU等化學試劑均為Sigma公司胚胎培養(yǎng)用產(chǎn)品。Micrococcus lysodeikticus bacterial凍干粉購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司，其他試劑均為 國產(chǎn)分析純。引物合成和測序工作由上海申友生物工程公司合成；蛋白N末端測序工作由中國科學院 上海生化與細胞研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心進行；人溶菌酶在乳汁中的表達定量的部分工作由復旦 大學人類遺傳研究中心完成。 1.3主要儀器設(shè)備Power PAC1000型電泳儀 BIO-RAD5154D型離心機 EppendorfGENE PULSERII型電轉(zhuǎn)化儀 BIO-RAD4520 S/N型恒溫搖床 Forma ScientificT-Gradient型PCR儀 BiometraAX80型顯微操作儀 OLYMPUSCO2培養(yǎng)箱 Medcenter Einrichtungen GmbHSZ-PT型解剖鏡 OLYMPUSEG-40型拉針器 NARISHIGEP-30型磨針器 NARISHIGECE-450型電融合儀 KEFAK400型倒置顯微鏡 LeicaBCM-1000A型超凈工作臺 蘇州安泰MCO-15A型C02培養(yǎng)箱 SANYOPTC-100 Peltier The醒l Cycler MJ Research. 吸卵針、鎢絲、移卵針、方杯、集卵器、手術(shù)器械等。1.4主要試劑的配制 LB培養(yǎng)基ly。(w/v)蛋白胨，0. 5X(w/v)酵母抽提物，1% NaCl。 TE緩沖液(pH8. 0):10mmol/l Tris-Cl(pH8. 0)， lmmol/1 EDTA(pH8. 0)。 10XTAE: 0.04mol/l Tris-乙酸，lmmol/1 EDTA。質(zhì)粒抽提溶液I : 50mmol/l葡萄糖，25 mmol/1 Tris-CI (pH8. 0) ， 10 mmol/1 EDTA(pH8. 0)。 質(zhì)粒抽提溶液II: 0. 2mol/l NaOH， l%(w/v)SDS。 質(zhì)粒抽提溶液III: 5mol/l乙酸鉀(pH4. 8)。IOXPBS(無Ca2+、 Mg2'): NaC180. Og, KC1 2. Og, Na2HP04 14. 4g， KH2P04 2. 4g，調(diào)pH7. 2, 終體積1000ml 。封閉液含2%(w/v)BSA的PBS緩沖溶液。 PBST:含0. 5%(v/v)Tween-20的PBS緩沖溶液。 IOX底物緩沖液:檸檬酸36. 6g， K2跳113. 5g， p服.0。底物反應液OPD 0. 2mg, 30%H202 10X底物緩沖液10ml,加水至lOOml。GEF完全培養(yǎng)液GMEM, 10%(v/v)FBS， 1XNEAA, 10 ng/mL bFGF， 1000 u/ml hLIF。GEF選擇培養(yǎng)液GMEM, 10%(v/v)FBS， IXNEAA， 10 ng/ml bFGF' 1000 u/ral hLIF， 500 mg/ml G418, 2師1/L GANC。細胞裂解液10mol/L TrisCl(pH8. 0) , 100國1/L NaCl ， 25mol/L EDTA(pH8.0), 0. 5%(w/v)SDS, 100 mg/ml蛋白酶K。變性液0.5 mol/L NaOH, 1.5 mol/L NaCl。中和液1.5 mol/L NaCl, 0.5 raol/L TrisHCl (pH7. 4)。洗滌液2XSSC。預洗液:5XSSC, 0. 5%SDS， lmol/L EDTA(pH8. 0)。預雜交液5XSSC， 5XDenhard' s, 0, 5%SDS， 100Hg/ml鮭精DNA。洗膜液I : 2XSSC, 0. 5%SDS。洗膜液II: 0. 2XSSC， 0. 5°/。SDS。固定液甲醇冰醋酸體積比為1: 3。沖卵液PBS， l%FBS(Hyclone)。饑餓液10ml: 50W FBS， P/S(100X)， 100W L-GW(IOOX)， 9.75ml DMEM。M16: 1.65g M16粉劑，0. 035gNa跳,0.33ml乳酸鈉(60%) ， 0. 006g青霉素，0. 005g 鏈霉素，定溶至lOOml。M2: 1. 15g F-IO粉劑，0.2101 Na跳，0. 33ml乳酸鈉(60%) ， 0. 006g青霉素,0. 005g 鏈霉素，定溶至100ml 。融合液0. 3mol/L甘露醇、0. lramol/L MgS04 、 0. 05mmol/LCaCl2。激活液M16， CB，離子霉素，M16， CB， 6-DMAP。包埋瓊脂糖液含1%瓊脂糖的PBS液。透明質(zhì)酸酶液M2， 0. 2%透明質(zhì)酸酶。 5X轉(zhuǎn)移存貯液將36. 3g Tris-堿和44. 26g CAPS溶解在1L水中。 陽極緩沖液(100ml): 20ml 5 X存貯液+15ml甲醇+65ml水。陰極緩沖液(100ml): 20ml 5X存貯液+lml 10%SDS+79ml水。n.具體實施例實施例i薩能奶山羊胎兒成纖維細胞株的分離公、母薩能奶山羊(上海轉(zhuǎn)基因研究中心實驗牧場)配種35天后用外科手術(shù)法取出母羊 子宮，將包有胎兒的子宮放入滅菌生理鹽水。從子宮中分離出山羊胎兒用PBS液洗兩遍，用70%的乙醇進行消毒，再用PBS洗兩遍。用手術(shù)剪在PBS中剝除胎膜，去除頭與肝臟，用組 織剪剪碎胎兒組織，平鋪于100mm細胞培養(yǎng)皿上。使用加有含10WFBS、青鏈霉素和非必需 氨基酸的GMEM培養(yǎng)液于37'C、 5%C02、飽和濕度情況下培養(yǎng)，觀察細胞貼壁情況，期間更 換培養(yǎng)液，去除組織塊。結(jié)果，原代細胞培養(yǎng)至細胞80%匯合時，在顯微鏡下觀察，可見細 胞透明度大、折光性強、輪廓似梭形、有偽足、邊緣清晰整齊、貼壁生長、生長速度快、未 見到上皮細胞生長，所建立的山羊胎兒成纖維細胞系標記為88弁GEF。細胞計數(shù)后冷凍保存， 用于基因轉(zhuǎn)染受體細胞。實施例2人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體的構(gòu)建按照圖1的流程最終獲得了人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體pbLGLyz，構(gòu)建方法如下 根據(jù)GENBANK登錄號X14710中的序列設(shè)計并合成如下引物 5' -cggccgggggtctgctcc -3' (SEQ ID N0: 1)，禾口 5' -ctcgagggctgcagctggggtcac -3' (SEQ ID NO: 2)。以?；蚪MDNA為模板，用PCR法(94。C， 5min; 94°C， lmin; 60°C ， 45s; 72'C90s， 30個循環(huán))擴增牛P乳球蛋白5'側(cè)翼序列(BLG-5' UTR) (-1215 + 45 bp),將PCR產(chǎn)物 克隆入pGEM-T-easy載體，得質(zhì)粒pRBLGR。 XhoI+SacII雙切重組質(zhì)粒pTA-BGH獲得300bp 大小的牛生長素基因3' UTR (PolyA序列)(bGH-PA)，將其回收，克隆到質(zhì)粒pRBLGR中成 pRBLGpA。最后再用Xhol將人的溶菌酶基因(h-Lyz)從pcDNA-LYZ切出后克隆到pRBLGpA的 Xhol位點，最終獲得pbLGLyz表達載體。獲得的人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體pbLGLyz見圖1。包含1. 3kb的牛p-乳球蛋白 的5'側(cè)翼序列(-1215 + 45 bp),人溶菌酶的完整基因組編碼基因(四個外顯子和三個內(nèi) 含子)和300bp的牛生長激素的polyA信號序列，具體如SEQ ID NO: 5 (注1-1260位為牛 P-乳球蛋白的調(diào)控序列；1267-6067位為人溶菌酶的基因組編碼序列；6074-6304位為牛生 長激素的polyA加尾序列；1261-1266、 6068-6073位為Xhol的酶切位點)。實施例3共轉(zhuǎn)染山羊的胎兒成纖維細胞以及抗性克隆的篩選鑒定pbLGlyz用Notl酶將表達框架切出，用限制性內(nèi)切酶Sal I將雙標記選擇載體pLNK (圖 2)的表達框架切出，按pbLGlyz:pLNK = 5:l的比例(摩爾比)混合后，電穿孔方法共轉(zhuǎn)染胎兒 成纖維細胞，電擊參數(shù)0.4kV， 500uF。電擊后，靜置10分鐘，用GEF完全培養(yǎng)液洗出細 胞，均勻接種在10個100mm細胞培養(yǎng)皿中，置于37'C、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染48小時 后更換選擇培養(yǎng)液(含G418)，此后每隔兩天更換選擇培養(yǎng)液一次，直至形成明顯的細胞克隆。在細胞克隆形成后，用克隆環(huán)挑取克隆，按照從96孔板到48孔、24孔、12孔和6孔 板順序依次傳代，當細胞在6孔板長滿后凍。存其中的一半(凍存密度5乂105細胞/0. 5ral)， 另一半接入60mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用于抽提基因組DNA。當細胞在60mra培養(yǎng)板長滿后(約2Xl()6細胞以上)，收集細胞，PBS洗兩遍，加細胞裂解 液500W, 37'C裂解過夜，酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加1/10體積的NaAC(pH5.2)后用等 體積無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌一次，稍稍干燥即用40W含有20Pg/ral RNase的TE緩沖液溶解，37'C溫育過夜，4'C保存以備用于陽性克隆的篩選。用如下引物測定轉(zhuǎn)基因的整合情況，擴增片段為人溶菌酶基因組內(nèi)一段大小為429bp的 序列，退火溫度為60'C。Lyz983: TACATTTGAGGACCTGGCAGAGC (SEQ ID NO: 3),和Lyzl412: TCCTACCACTTTGGGAGGCTGA(SEQ ID NO: 4)。用完整的4. 8kb的人溶菌酶的基因組DNA為探針，EcoR I酶切基因組，Southern-blot 分析?？色@得3. 2kb的雜交條帶的為正確整合克隆。將正確克隆于液氮中保存?zhèn)溆?。Southern-blot實驗操作步驟主要參照《分子克隆試驗指南》實驗方法進行，瓊脂糖凝 膠濃度為1%，電泳液為1XTAE，電泳條件為30V,過夜(16h)。 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上， 轉(zhuǎn)移液6XSSC，轉(zhuǎn)移過夜20小時；DNA固定-雜交80'C烤膜，2小時；預雜交42°C， 4 小時；雜交42'C，過夜(20小時)；洗膜、放射自顯影壓片后，-80°C, 72小時；洗片，分 析結(jié)果。共挑取了 34個分隔良好的細胞株，PCR檢測表明其中有IO個為陽性(I、 2、 4、 5、 6、 21、 26、 27、 28)，見圖3A;進一步Southern-blot分析表明有3個可獲得陽性雜交條帶， 分別是5、 6和21號，見圖3B。實施例4體細胞核移植1. 卵母細胞制備與受體羊的同步 挑選出作為卵母細胞供體的母羊肌注PG 0. lmg/頭，間隔10 14天后注射第二次PG，在第二次注射PG 10 13天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，分6次，2次/日，用量為每 天100IU， 80IU， 80IU。在最后一次注射FSH的同時，注射一次PG (0. lmg/頭)，間隔24小 時后時注射LRH， 25化/次，注射LRH后26 28小時回收卵母細胞。為與提供卵母細胞的供體羊同步，受體羊間隔9 11天分兩次肌肉注射PG，在供體羊超 排注射PG后24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。手術(shù)暴露輸卵管，用F-10營養(yǎng)液沖卵、體視鏡下檢卵。透明質(zhì)酸酶消化顆粒細胞，M16 洗4 5次，置M16方杯中培養(yǎng)，備用。2. 供核細胞的饑餓處理把待饑餓的細胞接種于35irnn平皿內(nèi)。待細胞豐度達70% 75%左右時，吸去培養(yǎng)液，加 入含O. 5%FCS的DMEM液，饑餓5天后，常規(guī)法消化收集細胞。然后放于-85'C冰箱內(nèi)保存。 在核移植實驗前6天，取出2小管復蘇并接種于4孔板內(nèi)。再培養(yǎng)2天或3天后饑餓，饑餓 方法同前。3. 重構(gòu)卵的制備與激活卵母細胞在M16-H印es (含H印es 2. 8mg/ml ， CB 7. 5ng/ml)液中洗滌3次，在M16-H印es (含 7.5 ug/ml CB)中處理10min;同時將培養(yǎng)的細胞用胰酶消化、分散成單個細胞。將卵母細 胞與供核體細胞同時移入置于滅菌玻片上的lml M16-H印es(含CB)中，在顯微鏡下去核并吸 入供核細胞，將之從原來的切口注射到卵周隙內(nèi)，使其緊貼于胞質(zhì)膜，采用電刺激的方法進 行融合，融合基質(zhì)為含0. 3 iT)M甘露醇、0. 05mM氯化鈣、0. lmM硫酸鎂、0. 5y。BSA的溶液，融合條件為DC600-610 v/cm，脈沖持續(xù)時間80 P s,連續(xù)剌激3次。融合后的胚胎于M16 中培養(yǎng)5小時后，在含5 uM離子霉素(ionomycin)、 7. 5 u g/ml CB的M16液中處理5 min, 再在含2 mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7. 5ug/ml CB的M16液中處理5小時后移到 M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待包埋或移植。4.重構(gòu)卵的包埋、回收與發(fā)育胚胎的移植用1%的Agarose包埋重構(gòu)卵，并移植入輸卵管內(nèi)，體內(nèi)培養(yǎng)5天后將膠條沖出，將膠 條內(nèi)的胚胎剝離出來，選擇發(fā)育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受體羊子宮內(nèi)。移植后的受體 在胚胎發(fā)育至1 2月齡時用B超進行妊娠檢查，出現(xiàn)孕囊的判定為懷孕，妊娠足月分娩， 獲得子代山羊。取子代山羊的耳尖組織，組織勻漿機勻漿，加入500W 1X裂解液，50W蛋白酶K， 37 'C恒溫過夜。次日加入500W鼢，緩慢顛倒混勻5分鐘，使其充分乳化。13000g離心5分鐘， 用1000W去尖槍頭小心吸取上清至一 1.5ml離心管。用等體積酚氯仿(l: l)反復抽提幾 次。最后加入2倍體積的無水乙醇，緩慢混勻，靜置10分鐘。13000g， 4'C離心10分鐘， 沉淀DNA。傾除上清，倒置離心管至溶液揮發(fā)干，加入適量300WTE(pH8.0)溶解，保存于4°C 備用。基因組DNA的PCR和Southern-blot檢測方法同實施例3。經(jīng)PCR和Southern-blot分析表明獲得了 5頭轉(zhuǎn)基因山羊(圖4),圖5A為PCR檢測結(jié)果， N1 N3為正常山羊，1 5分別為BLG1 BLG5， +為陽性質(zhì)粒對照，M為lkb的分子量標準， 可見BLG1 BLG5都可擴增獲得陽性條帶；圖5B為Southern-blot的檢測結(jié)果，1 5分別為 BLG1 BLG5， M為lkb的分子量標準，可見BLG1 BLG5都可擴增獲得陽性條帶，也都可雜交 出3.2kb的陽性條帶。實施例5轉(zhuǎn)基因山羊的誘導泌乳和重組人溶菌酶的表達檢測選取轉(zhuǎn)基因山羊BLG1和BLG2，待BLG1和BLG2生長至5月齡時進行誘導泌乳，獲得乳 汁。每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(2mg)及黃體酮(20mg)二次，共7天。然后分別于第8， 10， 12， 14天肌肉注射利血平0. 5rag。于第12天收集乳汁，乳汁保存于-2(TC備用。將羊乳汁(羊奶)用蒸餾水稀釋10倍，加入等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液，于65'C 溫育15分鐘。取5^1做SDS-PAGE凝膠電泳，積層膠為4%膠濃度，分離膠為7. 5%膠濃度， 100V恒壓。Western-blot分析SDS-PAGE凝膠電泳后，80mA恒流2小時，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素 膜上。10%脫脂奶粉過夜封閉轉(zhuǎn)印膜，以1:3000的濃度加入第一抗體(兔抗人溶菌酶多抗)， 室溫雜交1小時；雜交結(jié)束，用PBST溶液漂洗濾膜3次，每次10分鐘；以1:3000的濃度 加入酶聯(lián)二級抗體，室溫雜交l小時；雜交結(jié)束，用PBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。用 DAB和雙氧水顯色5分鐘。估量乳汁中重組人溶菌酶的表達水平將轉(zhuǎn)基因山羊的奶樣和人的標準品分別做梯度 稀釋后，通過SDS-PAGE和Western-blot檢測，對檢測信號進行對比，以此對奶中人溶菌酶 的表達水平進行估計。奶樣經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，表明BLG1和BLG2的乳汁中都可獲得強的雜 交信號。乳汁中rhLYZ的估量表明BLG1初乳中大約為3mg/ml; BLG2初乳中的表達量在 4mg/ral。上述雜交分析也表明山羊乳汁中表達的重組人溶菌酶與天然人的溶菌酶有相同的抗 原性，分子量也相當，約14.6kD。圖6顯示了轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中人溶菌酶的表達檢測。圖6A為SDS-PAGE電泳結(jié)果，PAA1、 PBC1和PBC2是與BLG1和BLG2同一批次制備的不同調(diào)控區(qū)指導人溶菌酶乳腺特異表達的轉(zhuǎn) 基因克隆山羊，正常山羊與轉(zhuǎn)基因山羊催乳同步，M為蛋白分子量標準，SDS-PAGE結(jié)果表明 BLG1和BLG2的奶樣在14.6kD處都有一明顯蛋白條帶，其他樣品無；圖6B為圖6A所述樣品 的Western-blot檢測結(jié)果，圖中可看出BLG1和BLG2都有強的雜交信號，PBC1、 PBC2以及 人乳汁有相應的雜交條帶，但較弱。圖7是轉(zhuǎn)基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量。1、 2、 3、 4、 5為人LYZ的標準品， 上樣中標準人溶菌酶的量分別為0. 4ug、 0. 2ug、 0. lyg、 0. 05ug、 0. 025 ug; A、 B、 C、 D為BLG2山羊乳汁，上樣量分別為0. lu 1、 0. 05y 1、 0. 025 u 1、 0. 0125u 1為原乳。圖 7A為SDS-PAGE檢測結(jié)果，圖7B為相應的Western-blot檢測結(jié)果，從兩種結(jié)果可見D與4 的信號強度相當，由此估算出的乳汁中人溶菌酶的表達量約為4mg/ml(0. 05y g/0. 0125u 1)。圖8是轉(zhuǎn)基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量。1、 2、 3、 4、 5為人LYZ的標準品， 上樣中標準人溶菌酶的量分別為O.lug、 0.2ug、 0.3ug、 0.4yg、 0.5"g， A、 B、 C、 D 為BLG2山羊乳汁，上樣量分別為0. 25ul、 0. 2ul、 0. 15ul、 0. lul、 0. 05ul為原乳。 從結(jié)果可見D與3的信號強度相當，由此估算出的乳汁中人溶菌酶的表達量約為3mg/ml (0. 3 tig/0, lu 1)。實施例6重組人溶菌酶的純化將收集后冷凍的rhLYZ轉(zhuǎn)基因羊BLG2的乳汁置于4'C溶解，然后10000g離心30分鐘，去除 脂肪。將去脂后的乳汁用4N的鹽酸調(diào)pH到4.7,然后加熱到4(TC、 30分鐘使酪蛋白沉淀，最 后10000g，離心30分鐘后將乳清輕輕倒出。脫脂和脫酪蛋白乳清隨后經(jīng)三種層析技術(shù)進行了 分離純化。將脫脂和脫酪蛋白乳清用稀釋液[O. lmol/L NaCl; 50mmol/L甘氨酸；pH9.2]倍比稀釋 后.過濾除雜。用5倍柱體積的平衡液
平衡層 析柱，上樣后，再以O(shè). 05—lM的NaCl線性梯度進行洗脫，流速均是2 ml/min。收集各洗脫峰。 用Western-blot檢測各峰，確定重組溶菌酶的洗脫峰。含酶的洗脫峰真空濃縮后，上S印hadex G-75柱進行凝膠過濾，洗脫液為O. 1 M醋酸鈉緩沖液(pH 6.5),流速20 ml/h，收集包含重 組溶菌酶的組分。結(jié)果純化約20ml自然泌乳的BLG2轉(zhuǎn)基因山羊的奶樣，共收集24ml溶菌酶洗脫液，DC 法檢測蛋白濃度為0.8mg/ml，總計19.2rag，其中大約有94%的組分為重組人溶菌酶。圖9為SP-S印harose陽離子交換介質(zhì)純化轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中的rhLYZ。 A為SP-S印harose 分離純化轉(zhuǎn)基因羊乳中重組人溶菌酶的梯度洗脫結(jié)果，表明使用這種純化方法在 0. 145-lmol/L NaCl線形梯度范圍無雜峰出現(xiàn)，純化效果好。B為純化過程各步驟的SDS-PAGE效果檢驗結(jié)果。M為低分子量蛋白raarker; l為脫脂奶；2為酸沉淀去酪蛋白后乳清；3為上樣 液；4為流穿液；5為洗脫峰純化產(chǎn)物。C為純化產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果。D為圖B中各樣品的 Western-Blot的檢測結(jié)果。實施例7溶菌酶的活性檢測活性分析通過測定A柳條件下，溶壁微球菌(必^;t^s)懸浮液濁度的變化來測定。 1個酶活單位定義為在室溫(20.8'C)條件下，在O. 18M的醋酸鈉，pH5. 5的緩沖液中，每分 鐘懸浮液的A棚降低值為0. 001。首先用0. 18M的醋酸鈉(pH5. 5)的緩沖液將溶壁微球菌配置成0. 8mg/ml的懸浮液(A， 0.6-1.0)。將天然人溶菌酶加入正常山羊的乳汁中，濃度達到2mg/ml，作為標準品，正常 山羊的乳汁為陰性對照，正常乳汁與轉(zhuǎn)基因乳汁泌乳期相同。將標準品、陰性對照和轉(zhuǎn)基因 羊奶用0. 18M的醋酸鈉(pH5. 5)做50、 100、 200、 400、 800、 1600倍稀釋。將20tU樣品和 180 ul的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)的懸浮液，迅速讀取混合液 的A，光吸收值，5分鐘后再測定一次，計算出A，/min的降低值。整個實驗均在室溫(20. 8 'C)下完成。選擇倍比關(guān)系好的稀釋度計算乳汁中溶菌酶的活性單位。經(jīng)溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)懸浮液的溶壁活性分析表明， BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml和846400U/ml,添加2mg/ml天然人 乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性為308800U/m。圖10為轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量是通過倍比 關(guān)系較好的稀釋度計算出的活性單位?？梢夿LG1、 BLG2和含2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常 山羊乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml、 846400U/ml和308800U/ml。實施例8重組人溶菌酶的N-端氨基酸測序?qū)⒓兓玫膔hLYZ經(jīng)SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移緩沖液為CAPS液， 操作方法簡述如下剪PVDF膜大小同凝膠，100%甲醇浸潤，用陽極緩沖液體平衡30分鐘； 同時兩張3關(guān)濾紙也在陽極緩沖液中平衡。陰極緩沖液體中平衡凝膠和兩張3mm濾紙。由下 至上組裝轉(zhuǎn)移夾心裝置，依次為濾紙(+)， PVDF膜，凝膠，濾紙(-)。恒流，1.5mA/cm2， 30-60分鐘。將膜用0. 1%考馬斯亮藍R250(溶解于40%甲醇，1%冰醋酸)，染色30-50秒(不 可超過1分鐘)，用50%甲醇脫色后用去離子水充分清洗，濾紙上涼干。切下目的條帶，將 PVDF膜保存于兩張濾紙之間，送中國科學院上海生化與細胞研究所進行N-端序列測定。請中國科學院上海生化與細胞研究所蛋白組研究中心的N-端測序表明了重組人溶菌酶 的N-端10個氨基酸序列為KVFERCELAR，與天然人的溶菌酶序列完全相同。表明了重組人 溶菌酶在山羊乳汁中進行了正確拼接和翻譯。實施例9多種乳蛋白調(diào)控區(qū)指導人溶菌酶表達的比較本發(fā)明人還做了4種乳蛋白調(diào)區(qū)指導人溶菌酶的5種乳腺特異表達框架(包括基因組 DNA和cDNA)，將分別來源于人的a-乳白蛋白、山羊的e-酪蛋白、牛的a-乳球蛋白和牛的aSl-酪蛋白的調(diào)控區(qū)與功能基因來接，構(gòu)建用于調(diào)控的元件，各調(diào)控構(gòu)件的結(jié)構(gòu)可見圖ll。通過共轉(zhuǎn)染的方法，本發(fā)明人獲得了上述構(gòu)件的包含人溶菌酶的整合細胞株，并將其 用于體細胞克隆，情況如下pBClyzc整合細胞株為ll和26的細胞；pAAlyzc整合細胞株為6、 13、 43和45的細胞；pbLGlyz整合細胞株為編號為5、 6B和21的細胞；pBClyzg整合細胞株為 編號為8、 9和10的細胞；pINS-CNlyz整合細胞株編號為25、 B6和B7細胞。利用上述整合細胞，本發(fā)明人都獲得了成活的體細胞克隆羊，出生羊情況為pBClyzc 存活4頭，pAAlyzc存活4頭，pbLGlyz存活5頭，pBClyzg存活5頭，pINS-Cnlyz存活3頭。本發(fā)明人選擇了來源于pBClyzc (PBC1和PBC2) 、 pAAlyzc (PAA1和PAA2)和pbLGlyz (BLG1 和BLG2)構(gòu)件的各2頭羊進行催乳，另外選擇一只相同年齡的山羊做對照。另兩個構(gòu)件的羊因 年齡尚小沒進行催乳。對獲得乳汁(PAA1沒能獲得乳汁)，迸行了表達分析。檢測結(jié)果表明，PAA1羊乳汁中沒 有hLYZ的表達，PBC1和PBC2兩只羊的乳汁中僅有很微量的表達(表達水平相似)，而BLG1和 BLG2兩只羊的乳汁中hLYZ都有了高水平表達，正常羊乳汁中沒有檢測到雜交信號，見圖6。因此本發(fā)明人很幸運的找到了在乳汁中高效表達hLYZ的最佳調(diào)控組合牛 BLG5' -hLYZ-bGHpA。實施例IO純化細胞穿透型Cre重組酶——CreTAT將含有細胞穿透型Cre重組酶(CreT'"，或稱TAT-Cre)的原核表達質(zhì)粒pET-cre轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)菌株，挑取轉(zhuǎn)化入所述質(zhì)粒的菌落接種于20ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C, 250rptn搖菌過夜。按照1:100接種過夜的含有目的質(zhì)粒的菌液于2L含卡那霉素的LB培養(yǎng) 基，37°C， 250rpm， 3h。加入IPTG，使其終濃度為lmM， 37°C, 250rpm搖菌3h。 3000g， 10min 離心，收獲菌體。用100ml預冷PBS重懸菌體，3000g， 10min離心，收獲菌體，如此重復三 遍。用預冷的菌體裂解液重懸菌體，渦旋震蕩。將裂解的菌體放置在冰上，超聲，強度20， 超聲lmin。 15000g， 30min，離心，取上清，置于冰上備用。用30%SB平衡SP s印haroseTM 柱子，4ml/min, 30min。取菌體上清用0. 22 u m的過濾器過濾后上樣，上樣速度4ml/min。 上樣結(jié)束后，用30%SB， 4ml/min洗柱子，直至紫外吸收值平穩(wěn)，不再下降。從30-100%SB 梯度洗脫，2ml/min，洗脫總體積為100ml，自動收液器收集所有洗脫液。100%SB繼續(xù)洗脫 直至紫外吸收值降到100niAU，合并大于250mAU的所有收集的洗脫液，其中即含有目的蛋白。 將收集的含有目的蛋白的洗脫液與二倍體積的SA在冰上小心混勻，出現(xiàn)少量沉淀，用 0. 22um的過濾器過濾后，置于冰上備用。用30XSB平衡source 15s柱子，4ml/min， 30min。 將過濾所得的上清上樣，上樣速度4ml/min。用30-100%SB梯度洗脫柱子，直至出峰，收集 大于250mAU的所有洗脫液，其中即含有目的蛋白。最后將目的蛋白2ml/次上樣HiPr印TM 26/10 Desalting柱子，緩沖替換液10 ml/min洗脫，收集洗脫蛋白峰。將收集蛋白放入 millipore MWCO 30000的超濾管中3000g離心30min，管內(nèi)約余1-2ml蛋白溶液后，吸出蛋 白溶液，-8(TC保存。蛋白鑒定結(jié)果見圖12。實施例11 CKE"T轉(zhuǎn)導GEF-BLG-2細胞以及抗性基因刪除克隆的篩選鑒定將CREm加入正常山羊胎兒成纖維細胞培養(yǎng)基內(nèi)(CRETAT培養(yǎng)基)，終濃度為 2nM(0. 08mg/ml)，在細胞間超凈工作臺上，0. 22 " m的過濾器過濾除菌。復蘇GEF-BLG-2 細胞(BLG2山羊的耳成纖維細胞)長至50-60%滿，PBS洗三遍后，加入CRE"T培養(yǎng)基。37°C， 5%C02 孵育3h。3h后去除含有CRET"的培養(yǎng)基，用PBS洗三遍，加入正常的細胞培養(yǎng)基，37°C， 5%C02 培養(yǎng)。轉(zhuǎn)導48小時后更換一次培養(yǎng)液，100個/100mm細胞培養(yǎng)板鋪板，此后每隔兩天更換 培養(yǎng)液一次，直至形成明顯的細胞克隆。在細胞克隆形成后，用克隆環(huán)挑取克隆，放入96孔板，細胞長至80%滿時傳代，依次為 48孔板，24孔板，12孔板，6孔板，60扁板，凍存。細胞于48孔板長滿傳代時平均分為三 份， 一份傳至24孔板， 一份留于原孔， 一份放于另外一個48孔板，做好標記，以便于相互 對照。留于原孔的細胞加入含有800u g/ml G418的GEF選擇培養(yǎng)基，另外一孔加入正常的 GEF完全培養(yǎng)基，G418培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞死亡既為抗性基因刪除的細胞克隆。當細胞在6孔 板長滿后凍存其中的一半(凍存密度5X105細胞A). 5ml)，另一半接入60mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培 養(yǎng)，用于抽提基因組DNA。當細胞在60mm培養(yǎng)板長滿后(約2X1(T細胞以上)，收集細胞，PBS洗兩遍，加細胞裂解 液500m， 37'C裂解過夜，酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加1/10體積的NaAC(pH5.2)后用等 體積無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌一次，稍稍干燥即用40W含有20Pg/ml RNase的TE緩沖 液溶解，37X:溫育過夜，4'C保存。用如下引物測定抗性基因刪除情況，擴增片段為pLNK中1.2kb的片段，退火溫度為62 'C。無條帶的為抗性基因刪除的細胞克隆，結(jié)果見圖13。Neo735: 5' -gctcctgccgagaaagtatcca-3' (SEQ ID NO: 6); 禾口tkl908: 5' -ccagcacccgccagtaagtc-3'(SEQ ID NO: 7)。用完整的4. 8kb的人溶菌酶的基因組DNA為探針，EcoR I酶切基因組，Southern-blot 分析?？色@得3.2kb的雜交條帶的為抗性基因刪除且原融合基因保留的細胞克隆。將正確克 隆置于液氮中保存?zhèn)溆?。Southern-blot實驗操作步驟主要參照《分子克隆試驗指南》實驗方法進行，瓊脂糖凝 膠濃度為1%，電泳液為1XTAE，電泳條件為30V，過夜(16h)。 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上， 轉(zhuǎn)移液6XSSC，轉(zhuǎn)移過夜20小時；DNA固定_雜交80'C烤膜，2小時；預雜交42°C, 4 小時；雜交42'C，過夜(20小時)；洗膜、放射自顯影壓片后，-8(TC， 72小時；洗片，分 析結(jié)果。共挑取了 165個分隔良好的細胞株，PCR檢測和G418敏感性實驗表明其中有70個為抗 性基因刪除的克隆，進一步Southern-blot分析其中19 (GEF-BLG-; eo 19)和98號 (GEF-BLG-98)兩個克隆(見圖14)有陽性雜交條帶。實施例12利用Cre酶瞬間表達刪除山羊體細胞內(nèi)抗性篩選基因電穿孔法質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞取對數(shù)生長期的GEF-BLG-2細胞，用PBS洗滌兩邊后，用胰酶 消化成單個細胞。電傳孔參數(shù)為細胞濃度為107個/1111，兩極寬度為O. 4cm，加入細胞體積為O. 3ml， PBS185質(zhì)粒 10-20 u g,電壓為220V，電容為950 y F，放電時間為30msec。電傳孔后室溫靜置10min, 隨后加入lmlGEF培養(yǎng)基分別放入2個100mni培養(yǎng)板中，置于37'C， 5%(302培養(yǎng)箱培養(yǎng)。脂質(zhì)體法質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞待24孔板內(nèi)細胞張至60-70%豐度，在25 u 1無血清的GMEM中 加入O. 4ug DNA， 4ul Plus reagent,室溫15min。在25 u 1無血清的GMEM中加入1 u 1 lipofectamine?；靹?，室溫靜置15min。細胞用PBS洗兩遍后，加入O. 2ml無血清GMEM，再加 入混合物。3h后去除培養(yǎng)基，PBS洗兩遍細胞后，更換正常的含有血清的GEF培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)兩天后，按50個/板鋪100mm細胞培養(yǎng)板。三天換液一次，大約6-7天長 出細胞克隆，挑取細胞克隆，轉(zhuǎn)移至96孔板。之后，依次為48孔板，24孔板，12孔板，6孔 板，60mra板，凍存。在48孔板長滿時，均分為三份， 一份傳至24孔板，長滿后凍存； 一份留 于原孔，并加入800 ug/ral G418的GEF培養(yǎng)基，進行G418敏感性殺傷試驗；再一份放于新孔 內(nèi)，加入正常GEF培養(yǎng)基作為對照。培養(yǎng)三天后，分別從G418殺傷、抗性篩選基因整合兩方 面驗證抗性基因是否被刪除?？剐曰蛲ㄟ^PCR鑒定，所用引物為TK5: 5' -tctgcgttcgaccaggct-3'(SEQ ID NO: 8);禾口TK35: 5' -cggtcgatgtgtctgtcctcc-3，(SEQ ID NO: 9)。PCR條件為94'C 3min， 94°C 45s， 57°C 45s， 72°C 50s， 72'C7min。同時鑒定共人溶菌 酶基因的存在情況，鑒定方法同前。同時通過western-blot檢測Cre酶的瞬間表達情況。實驗結(jié)果如表l，電轉(zhuǎn)沒能獲得刪除克隆，僅脂質(zhì)體法獲得了4株刪除克隆，效率只有 1.25%，總體效率明顯低于蛋白轉(zhuǎn)導方法。表l Cre酶瞬間表達后抗性基因的刪除情況轉(zhuǎn)染方案鋪板總數(shù) (板)挑克隆數(shù)PCR檢測 克隆數(shù)G418殺傷 克隆數(shù)抗性基因刪除 克隆數(shù)電轉(zhuǎn)1011285850電轉(zhuǎn)108265650脂質(zhì)體141681171173脂質(zhì)體101531031031圖15是GEF-BLG-2瞬間表達Cre酶的Western檢測，可見，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后Cre酶在第 一天至第五天均有表達，其中第二、三天的Cre酶含量最高，第三、四天的含量較低，第一 天的cre酶分子量明顯小于其它四天所表達，分析其可能為表達不完全的Cre酶。因此，利 用Cre酶瞬間表達刪除山羊體細胞內(nèi)抗性篩選基因無法獲得所需的結(jié)果。實施例13抗性基因刪除細胞的體細胞核移植1.卵母細胞制備與受體羊的同步 挑選出作為卵母細胞供體的母羊肌注PG 0. lmg/頭，間隔10 14天后注射第二次PG， 在第二次注射PG 10 13天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，分6次，2次/日，用量為每 天IOOIU， 80IU。在最后一次注射FSH的同時，注射一次PG(O. lmg/頭)，間隔24小時后時注射LRH， 25化/次，注射LRH后26 28小時回收卵母細胞。為與提供卵母細胞的供體羊同步，受體羊間隔9 11天分兩次肌肉注射PG，在供體羊超 排注射PG后24小時，受體也同時注射PG,受體注射LRH的時間及劑量同供體。手術(shù)暴露輸卵管，用F-10營養(yǎng)液沖卵、體視鏡下檢卵。透明質(zhì)酸酶消化顆粒細胞，M16 洗4 5次，置M16方杯中培養(yǎng)，備用。2. 供核細胞的饑餓處理把待饑餓的GEF-BLG-"eo 98細胞接種于35mm平皿內(nèi)。待細胞豐度達70% 75%左右時， 吸去培養(yǎng)液，加入含O. 5%FCS的DMEM液，饑餓5天后，常規(guī)法消化收集細胞。然后放于-85 'C冰箱內(nèi)保存。在核移植實驗前6天，取出2小管復蘇并接種于4孔板內(nèi)。再培養(yǎng)2天或3 天后饑餓，饑餓方法同前。3. 重構(gòu)卵的制備與激活卵母細胞在M16-H印es(含H印es 2. 8mg/ml，CB 7. 5叫/ml)液中洗滌3次，在M16-H印es (含 7.5 ug/ml CB)中處理10min;同時將培養(yǎng)的細胞用胰酶消化、分散成單個細胞。將卵母細 胞與供核體細胞同時移入置于滅菌玻片上的lral M16-H印es(含CB)中，在顯微鏡下去核并吸 入供核細胞，將之從原來的切口注射到卵周隙內(nèi)，使其緊貼于胞質(zhì)膜，采用電刺激的方法進 行融合，融合基質(zhì)為含0. 3 mM甘露醇、0. 05mM氯化鈣、0. lmM硫酸鎂、0. 5% BSA的溶液， 融合條件為DC600-610 v/cm，脈沖持續(xù)時間80 u s，連續(xù)刺激3次。融合后的胚胎于M16 中培養(yǎng)5小時后，在含5 uM離子霉素(ionomycin)、 7. 5 y g/ml CB的M16液中處理5 min， 再在含2 mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7. 5 u g/ml CB的M16液中處理5小時后移到 M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待包埋或移植。4. 重構(gòu)卵的包埋、回收與發(fā)育胚胎的移植用1%的Agarose包埋重構(gòu)卵，并移植入輸卵管內(nèi)，體內(nèi)培養(yǎng)5天后將膠條沖出，將膠 條內(nèi)的胚胎剝離出來，選擇發(fā)育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受體羊子宮內(nèi)。移植后的受體 在胚胎發(fā)育至1 2月齡時用B超進行妊娠檢查，出現(xiàn)孕囊的判定為懷孕，妊娠足月分娩。最終結(jié)果如表2。表2階段GEF-BLG-2GEF-BLG-細98回收的卵母細胞總數(shù)1190248融合的重構(gòu)卵數(shù)(融合率)763(64. 1%)217(87. 5%)植入臨時受體羊的移入卵數(shù)687200回收獲得的包埋后卵數(shù)619193發(fā)育到囊胚的卵數(shù)(囊胚發(fā)育率)172 (27. 8%)74(38. 3%)移植受體羊數(shù)10037妊娠(妊娠率)24(24%)11(29%)獲得成活的山羊數(shù)12克隆成功率5, 8 °;27 %。[(成活克隆羊數(shù)+移植卵數(shù))X 1000%。]最終獲得的2頭克隆羊，命名為NF1， NF2，見圖16。實施例14 NF1， NF2山羊的基因型鑒定取NF1克隆山羊的耳尖組織，原代培養(yǎng)獲得耳成纖維細胞，G418敏感性實驗同實施例 11。 G418敏感性實驗發(fā)現(xiàn)NF1山羊不含有neo，為抗性基因刪除的細胞?；蚪MDNA的PCR同實施例3，結(jié)果見圖17。 PCR結(jié)果表明NF1， NF2山羊不含有抗性基因。根據(jù)基因組步移試劑盒說明設(shè)計neo， tk兩側(cè)的特異性引物spl， sp2， sp3， tpl, tp2， tp3擴增出neo外側(cè)序列，與tk外側(cè)序列，引物與neo, tk外側(cè)序列如下 Sp3:5' -GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAG-3' (SEQ ID NO: 10); sp2:5' -TGCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3' (SEQ ID NO: 11); spl:5' -TTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTT-3' (SEQ ID NO: 12); tpl:5' -GTTTACGGGCTACTTGCCAATACG-3' (SEQ ID NO: 13); tp2:5' -CCTCCGTTCCATGCACGTCTTTAT-3' (SEQ ID NO: 14); tp3:5， -GACGCCCTGCTGCAACTTACCT-3' (SEQ ID NO: 15)。 neo外側(cè)序列見SEQ ID NO: 16; tk外側(cè)序列見SEQ ID NO: 17。根據(jù)這些序列設(shè)計引物 neoR(5-TAGGTCACGAAGCACAGGCACGAA-3) 和 tkL(5-TGTCAGCATCTCCCCTCTGCCAAA-3)鑒定NF1、 NF2，得到O. 7kb片段(圖17),對NF1片段 進行測序，測序結(jié)果證明原抗性基因整合位點僅僅保留一個loxP位點，NF1, NF2山羊為抗性基因刪除的細胞。刪除后保留的loxp位點序列見以下序列(SEQ ID NO: 18)中黑斜體部分。CTCAATGCCCAAAA經(jīng)驗證，刪除了抗性基因的溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中無抗性篩選蛋白Neo和TK表達， 且含有的溶菌酶比BLG1和BLG2有顯著的提高。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作 為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本 發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<110>上海杰隆生物工程股份有限公司; <120〉利用家畜乳腺高效生產(chǎn)人溶菌酶<130> 080356<160> 13<170〉 Patentln version 3.3〈210〉 1<211〉 18〈212〉 DMA〈213〉 人工序列<221> misc—feature<223> 引物<400> 1cggccggggg tctgctcc<210> 2<211> 24<212> DNA <213>人工序列<221> misc—feature<223> 引物〈400> 2ctcgagggct gcagctgggg tcac〈210〉 3〈211〉 23<212> DNA <213>人工序列<221> misc—feature<223〉 引物<400> 3tacatttgag gacctggcag agc<210〉 4〈211〉 22<212> 腿〈213〉 人工序列<221〉 misc—feature〈223〉 引物<400> 4tcctaccact ttgggaggct ga<210> 5<211> 6304<212> DNA <213>人工序列序列表 上海轉(zhuǎn)基因研究中心182423<221> misc—feature 〈223〉融合i因 <400〉 5cggccggggg tctgctcccg tgggtgggct ctttctggta cagtcaccaa cagtctctcc 60ggga鄉(xiāng)aaaccagaggccag3gsgcaagccagagctagtCt3gg3g3tCcctgagcctc120cacccaagatgccgaccaggccagcgggccccctggaaagaccctacagtCt3ggggggg180aacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttc240CCCt3CCCC3gtacgcccacCCg3CCCCtg卿tgagtggt"ttacttgctt3gaatgtca300attga3ggcttttgtaccccctttgccagtggcac鄉(xiāng)gc3CCC3CagCCcgctgggtsc360tgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccct420ccatactcagCg3C3C3CCCagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggceigc480tcgctgtggtctgagcggtgCgg3ggg犯gtgCCCtggg3gtgagaggtg540哪ggtggg3ggttgggtcctgtaggccttCCC3tCCC3Cgtgcctgcacggagccctag600tgctsctcagtcatgcccccgC3gC3ggggtcaggtcactttCCC3tXCtgggggttatt6603tg3Ctgttgtcattgttgttgccatttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgca720gagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccct780cgccccagcctgcagagggtggggtgactgcagagatccctttacccaaggccac3gtC3840CEltggtttggaggagatggtgcccaaggceigaagccaccctccaggacacacctgccccc卿agtgctggctctgscctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctg960gcagccagcctggacccagagcctggac3ccccctgcgcccccacttc"tggggcgtacca1020ggaaccgtccaggcccagagggggccttcctgcttggcctcg3atggaagaaggcctcct10808ttg"tCC"tCgt8gagg33gCaaccccagggCCC33gg3t3gg固gggggg3ttCgggg31140accgcgtggctgggggcccggcccgggctggctggctggccctcctcctgtataaggccc1200cgsgcccgctgtctcsgccctccactccctgcagagctcagaagcgtgaccccagctgca1260ctcgag￡itg3aggctctcattgttctggggcttgtcctcct"ttctgttacggtccagggc1320aaggtctttggttggccagaactctgaaaag3ttggg組ggatggctac13803gggg33tC3gcctagcaaactgtaagtctactctccata3ttCC3gag3attagctacg1440城ggsacagacactaggagagaagaaggggctttgagtgaatagatgtt1500ttatttctttg"tgggtUg"ttggctaaaa3catcagtttggttctttata1560accagagatacccgataaaggaatacgggc3tggcaggggaaaattccattctaagtaaa16203C3gg3CCtgttgtac"tgttctagtgctaggaagtttgctgggtgcctg3gattcaatgg1680cacatgtaagctgac"tgaiaagatacatttgaggacctggcagagctctctcaag"tccttg1740gt3tgtg3Ctccagttatttcccattttga3CttgggCtCtgagagcctagagtgatgca1800gtatttttcttgtcttcaagtcccctgccgtgatgtgggatttttat;ttttatttttatt1860ttat"tttat"tttatttttaa3gacagtctc3CtgtgtggCCC3ggCtgg3gtgcagtggc1920atgatctcagctcactgc犯cctctgccttctgggctcaagtg3ttctcgtgcttcagcc1980ttctgagtagctg"tgactacaggtgtgtacC3CC3C3CCCagctaattttttgtattttc2040agtagagatggggtttxaccatgttggccaagctggtcttgaactxctgg2100tCtgCCC3CC"tcagcctccca卿tggtaggattacaggtgtgaaccactgcacccagcc2160gacatgggatttttaacagtgatgtttttatgaat"tccct3c3caagagc22203gt3gg33CCtagttcccttcagtcactctttgtataggatcccagaaactcagcatgaa2280atgttttattatttttatctactctacttgattaactatctttcattttc2340ttC犯g6ltgtgccatgaggaaaagttattttatagtttagtacatagttgtcgatgtaat2400aatctctgtagttttcagattga3ttc3gaC3tttCCCCtttttgaatga2460ggatgaaatcacggaatagtcttgttttcaagattctaacttgatatcca2520aattc3cctttagatat"tatctatcagaaaatccttatgtttttctgatt2580tttttccatcagcctatgtatctgctatgaat11acaaaatctactcaac2640agctctg"ttgatttttctgttcttggctgaatgttgcctg3ggg3tgggagcacggg卿2700ggt朋aagcaatggaagaa3cstgtatttt33tatttt3atattgttcgt2760tggtgtt3C33g3tg3tttgggattctctt3C33gtCCCtteitcttaaca2820ctaaagtgctaagatattttctttatactttcagtaaaat2880agaagtagctaagtagaactgattttgctagtcacttagtgttgctgttt2940ataagttcttttcagggatgtgtttggCC333tgggagagtggttacaac3000acscgagctatgctggagacagaagcactgattatgggat3tttcagatc3060aatagccgctactggtgtaaaccccaggagcagttaatgcctgtcattta3120tcctgcagtgg"taagacaagctaatatttgaccaatctggttatacttac犯g犯ttgag3180actcaatacaccttgaaaggttcatgagggactacatctc3240犯CttCC3g3aagtcattattattttcctcataattcccttttaaagaag3300tggtatcataaaaggttgatgttttttaatatacagaagtttctggaatgEicctattaat3360ttactgtcaatggccttactgatgctttgtccagaac3atgccattgctcctgcttactt3420tggggaggttttgggataatttag"ttgtstgg"tcctttttcaattgtttt3ctttttttl:3480ttatgaastgttc"taaatg"t3tagaaeia"ttagagacattagta"t犯"taaacagccatatg3540cccattatgctttmtmcaagtgatca cctggcaaat 犯ctcctgag gttagcactg ttccatttct ttgtetaataa aactcataaa tgcaaagttg tatttctaaa ataaaaatta tataaccatg aatgttaaat tttgcaaaaa attatttgcatgaatattct tttccctcst tcttttggat acagtgtcta gactttggta agttttcccc ccacagccta tttttattccgCttgtgC33agaccaaagt attacctaca tcctcaattt ttgtcatatc cctgtaatcc agaccagcct ggtgtggtgc g朋cccggga gtgagactct ctgctgtacatttgggt3gggtctatctta tgtatattac ggtggcatgg agtgtaactc ctgttgtttg tttcctaata ggggtggggt gggaactttaaaagmutttttctcctgtccc tccc3ccac3ttttg犯3"ttttcaagcaat tacctggcta aaattcttta caaattaact aatagaaata atattattaa atccagttaa gaawtacaa ggtaaattct tatatcatac tt肌attgta tgtcagcaaaataatttact asattgctat aaattttcaa gtgcaaagaa 犯tg犯gaa3 aacaattacattaccacctg agagggttgt aaaactatct atgctaatga tccttgaaga3tttt3ggggttgaaattct cagcactttg gcctaacatg aggtgcctgt ggtggaggtt gtctcaaata acgcacatta agtgaagtat ctattttatcagaaatcgtt gagtagagct cccctcccccggggC3gg3Cttgttaacat tgctgagagt caggctgtag gcctcccaag ttt3gtac3g cttcccacct ctgctgsgag gtttacatctccatgtggaa attgttaaat ttaaaaaaatggtstatatt acatataaac ttatacacac tacaaatcgg tgtstcatca gatxc肌ttg gaatsgcttt taatag犯ct gacctttaat 383atgcttc catatatgga gctggctaaa tcttt.csgctCCgtg3tCC3tactctactgC3CCtC3333ascaatctac atttctagag ttttagaata ggagsccgaggC3333CCCCaatcccagcc gc卿ggatt aatagcataa ctcaatcttt tttgtataca tattgataaa tgttttaacc gtc犯aacag cgctgatcag gtgccttcct attgcatcgctttgCC3t3gUtttgUtgtC3gtggC3Ctagctgggac gcaaattctg cagcctcctt acttttaagt tcaaaaaata ttte1tttgg3 tcctcagtgttt3"t3tt3"t3taacacccat cttccagaatggCttt3C33tttttaatga ttttaaaaga ttactattga ttgtatacatgCtg3gt333cattttgtta atttcatgct ct;catagaaa cctaaattta ttgctgcaag ca3ggc8tt3 ttgatatata ttgcagcttt tttaactgat ttttaagatggc柳tggat atctccacta actcgggagg gcgccattgt aeiaataaacg atgttcggca "tatcttcatt atattttgtt tttcaccatt agatgtccgt cctcgactgt tgaccctgga attgtctgag aggattggga"ttgcttcttc gtUtgtttt catcacagct tacaggtgtg tgttgcccag 卿ctgctgg gaattaggaa cagttcctgtcaaaaatatt cc朋taaaga taataatatt aatcttacta gtatatcaattttgcttctt tcttttgctc atgactagaa gcacttaggt ctttgggtgc atatcactag atacttccagg33tggg卿ataatstctt aaataaaata ataacatcgc g3gcatggta c犯tgag3gc tggcttatgc ccagaatctt cttcacactc ggccgggcsc cacctgaggtctgaggcagg acttcagcct tggaattcac ttctatgctc taataaatag tccccaagga tgcttcatct csgtatgttc gccttctagt aggtgccact taggtgtcat sgacaatagctatgcctttt gttttatttt cactgcagct caccaccatg gctggtcttg aattacaggc catgatgata agaattatta tattttactg gcagaaatct acattaatct tggtcattaa cccagaggtt catgtgtatg sctgtgtgctcattttccag ttttaatata tgtttccatt atttcttatt gtgttttttt agcttccaataccattcttt tctattaaag tgatgctgta tgttttaagt 3g3cttttaa taaatgatgt actcttttac tatcagttxc agtgctcacg C3ggagttcg aaMtagctg agacttgctt gggcgsc柳UtgC3gttgtactgagaaa caatagctgg gtgcgaagta ttttctacag aaggttgtgg "tgccagccat cccsctgtcc tctat"tctgg aggcatgctg3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6304〈210〉 <211> <212〉 <213〉622 DNA人工序列〈221> <223> <400>misc_feature引物—6gctcctgccg agaaagtatc ca22<210〉 7<211> 20<212> DNA <213〉人工序列<221> misc—feature <223> 引物 <400> 7ccagcacccgccagtaagtc 20<210〉 8<211〉 18<212> DNA 〈213〉人工序列<221> misc—feature <223〉 引物 <400〉 8tctgcgttcg accaggct 18<210〉 9<211〉 21<212〉 DNA <213>人工序列<221〉 misc—feature <223> 引物 <400〉 9cggtcgatgtgtctgtcctcc 21<210> 10<211〉 25<212> 醒<213〉 人工序列<221> misc—feature <223> 引物 <400〉 10gattgtctgt tgtgcccagt catag 25〈210〉 11<211> 22<212> 腿 〈213〉人工序列<221> misc一feature <223> 引物 <400〉 11tgcctcgtcc tgcagttcat tc<210> 12<211> 25<212> 瞧 <213>人工序列<221〉 misc—feature <223〉 引物 <400> 1227ttcgcccaat agcagccagt ccctt25〈210〉 13<211> 24<212> 腿 <213>人工序列<221> misc—feature 〈223〉 引物 <400> 13gtttacgggc tacttgccaat3Cg24<210> 14<211> 24<212〉 DNA<213〉 人工序列〈221> misc—feature <223> 引物 <■> 14cctccgttcc atgcacgtctttat24<210〉 15<211〉 22<212〉 腿<213〉 人工序列<221> misc—feature 〈223〉 引物 〈400> 15gacgccctgc tgcaacttacct22<210〉 16〈211〉 700<212> 腿 <213>人工序列<400> 16ggcgcccctgcgctgacagcCgg33C3CggCggC3tC3g3gcagccgattgtctgUgtg60cccagtcatagccgaatagcCtctCC3CCC犯gcggccgg agaacctgcgtgcaatccat120cttgttcaatggccgstcccatattggctgcagggtcgctcggtgttcgaggccacacgc180gtcaccttaatatgcgaagtggacctggg3ccgcgccgccccgactgcatctgcgtgttc240gaattcgccaatgacaagacgctgggcggggtttgctcgaC3ttgggtggaaacattcca300ggcctgggtgg柳ggctttttgcttcctcttgcaaaaccacactgctcg acattgggtg360gaaacattccaggcctgggtgg卿ggctttttgcttcctcttgaaaaccacactgctcg420acctgcagcca3gctagcttggctggacgtaaactcctcttcEigacctaEitaacttcgta480tagcatacattatacgaaaggtggg鄉(xiāng)gg aactsaUtatcaggagcatgctttatcag540tacactgtatgacaagacctcctt"taagccttacaaaagagtctttcatatatgatgccc6003CCt3gCt83ctggttaggaaccatgaggctcagtgaggttaggtggcttgcctgagatc660tcttggctggtgaagggtggtgccagattagattaaaacc700<210〉 17 〈211〉 877 〈212〉 腿 <213〉人工序列 〈400> 17cgacgatatg cgacctggcg cgg朋ggaga caataccgga gacgtgcatg gaacggaggtcgcacgtt.tg cccgggagat gggggaggct aactgaaaca 60 agga3cccgc gctatgacgg castaaaaag 3c3gaataaa 120 gtgtttttgc aggcggtcat cattccccgg gcagggactc 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glCCCC3CCCCccaagttcgggtgaaggccc鄉(xiāng)gctcgcagccaacgtcg gggcggc鄉(xiāng)300
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C33gC33C3Cggcatcctag3Ctgtgtg33tgcccac877
<210〉 18
〈211〉 747
<212〉 醒
<213〉人工序列
<400〉 18
gtcctgggcctgtaagtgcaatcacttctctcagaatgaa3CtgtggggC60
tgggc兆ggtcagtgggcattcacacagtct3gg3tgCCgtgctgcttggggcccccacc120
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gttcgggcctgtgctcaatg747
〈210〉 19
〈211〉 8
〈212> PRT
〈213>人免疫缺陷病毒
<400〉 19
Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 1 權(quán)利要求
1.一種乳腺特異性表達融合基因，其特征在于，該融合基因從5’至3’依次包含以下可操作性相連的元件牛β-乳球蛋白基因的5’側(cè)翼序列，人溶菌酶基因，和牛生長激素基因3’側(cè)翼序列。
2. 如權(quán)利要求l所述的融合基因，其特征在于，所述的人溶菌酶基因選自(a) 具有SEQ ID NO: 5中1267-6067位的核苷酸序列；或(b) 與(a)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或 所述的牛e-乳球蛋白基因的5'側(cè)翼序列選自(al)具有SEQ ID NO: 5中1-1260位的核苷酸序列；或 (bl)與(al)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或所述的牛生長激素基因3'側(cè)翼序列選自(a2)具有SEQ ID NO: 5中6074-6304位的核苷酸序列；或 (b2)與(a2)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
3. —種制備轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征在于，包括以下步驟(a) 將權(quán)利要求l或2所述的融合基因轉(zhuǎn)染體細胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉(zhuǎn) 基因細胞；(b) 將所獲得的轉(zhuǎn)基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得可高產(chǎn)人溶菌酶的動物。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，在將權(quán)利要求l所述的融合基 因轉(zhuǎn)染體細胞的同時，還包括將一用于抗性篩選的基因轉(zhuǎn)染體細胞，獲得基因組中整合有 所述融合基因以及抗性標記基因的轉(zhuǎn)基因細胞；并且，所述的用于抗性篩選的基因從5'至3'依次包含以下元件Loxp，新霉素抗性 基因，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，Loxp。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(a)與(b)之間，還包括步驟(al)用細胞穿透型Cre重組酶處理所述的轉(zhuǎn)基因細胞，從而獲得刪除了所述抗性標記 基因的轉(zhuǎn)基因細胞；其中，所述的細胞穿透型Cre重組酶是細胞穿透肽和Cre重組酶的融合蛋白。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的細胞穿透型Cre重組酶是反式激活 蛋白與Cre重組酶的融合蛋白。較佳的，所述的細胞穿透型Cre重組酶從N端至C端依次為TAT和Cre重組酶。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述的細胞為動物胎兒成纖 維細胞。
8. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的動物選自牛、山羊、綿羊、兔或豬。
9. 高產(chǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因克隆動物的細胞，其特征在于，來自采用權(quán)利要求3-8任一 所述的方法獲得的乳腺高效表達人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因動物。
10. —種生產(chǎn)人溶菌酶的方法，其特征在于，它包括步驟 培養(yǎng)用權(quán)利要求3-8任一所述方法制得的轉(zhuǎn)基因動物； 從動物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達的人溶菌酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用家畜乳腺高效生產(chǎn)人溶菌酶，公開了一種乳腺特異性表達的融合基因，該融合基因從5’至3’依次包含以下元件牛β-乳球蛋白基因的5’側(cè)翼序列，人溶菌酶基因，和牛生長激素基因3’側(cè)翼序列。本發(fā)明還公開了一種制備轉(zhuǎn)基因動物的方法。本發(fā)明還公開了一種高效安全的去除標記基因的轉(zhuǎn)基因家畜制備方法。
文檔編號C12N15/62GK101603045SQ20081003884
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者俞慧清, 劉思國, 張愛民, 成國祥, 陳建泉 申請人:上海杰隆生物工程股份有限公司;上海轉(zhuǎn)基因研究中心