專利名稱：紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分子鑒別方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學領域的分子鑒別方法，具體地，涉及一種紅豆杉 中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分子鑒別方法。
背景技術：
紫杉醇(Pacitaxel，商品名taxel)是繼阿霉素、順鉑之后最有前途的抗 癌藥物，它是以A， B， C和D四個環(huán)為核心骨架的二萜類化合物，是一種高效的 細胞毒素。目前紫杉醇主要來源于紅豆杉植物(Taxus)的樹皮，其含量僅為 0.01%-0.05%。因過度的采伐，紅豆杉資源日趨減少，已被國家列為保護植物， 因此尋求紫杉醇或其替代品的新資源已成為目前研究的重點。根據(jù)資料報道蒙大 拿州立大學植物病理學家Strobel和化學家Stierle等在1993年首次報道了
從太平洋紅豆杉樹皮中分離出一種可產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，這種真菌被命名為 安得列亞菌(Taxomyces andreanae)，其紫杉醇含量為24-50ng/L。這一發(fā)現(xiàn)具 有重大的科學意義和潛在的商業(yè)價值，為人們展示了一個可生產(chǎn)紫杉醇的新途 徑。在過去的十多年里，國內(nèi)外科學工作者從紅豆杉及近緣植物分離內(nèi)生真菌的 工作已有陸續(xù)的報道。
植物中紫杉醇的合成由兩條截然不同的途徑完成 一是經(jīng)典的甲瓦龍酸 (MVA)途徑，另一是新近發(fā)現(xiàn)的5-磷酸脫氧木酮糖(DXP)途徑，MVA途徑位 于細胞質(zhì)，DXP途徑位于質(zhì)體中。在MVA途徑中牴牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(gerany geranyl pyrophosphate, GGPP)是所有二萜類化合物的共同前體，紫杉二烯合 成酶，又稱二萜烯環(huán)化酶，它是紫杉醇生物合成途徑上的一個質(zhì)體酶，它催化 GGPP的環(huán)化而生成紫杉二烯(taxa-4(5)， ll(12)-diene)，由于這一步反應是生 成紫杉烷類化合物獨特的骨架結(jié)構(gòu)而成為整個紫杉醇生物合成途徑中的關鍵步 驟，因此紫杉二烯合成酶成為紫杉醇生物合成途徑上的第一個限速酶。前人的研 究證明，紫杉二烯合成酶能催化GGPP環(huán)化成taxa-4(5), 11 (12)- diene，在紫杉醇生物合成過程中的起著限速酶的作用，是紫杉醇合成的關鍵酶。也就是說無 論在真菌還是植物中，紫杉醇的合成由GGPP環(huán)化成taxa-4(5),ll(12) -diene 是一個必需的通路。也就是說，在生物體內(nèi)只要有這一代謝途徑關鍵酶基因的存 在，就一定會有紫杉醇的產(chǎn)生。
經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，多數(shù)文獻大都采取同樣的分離方法和鑒定技 術分離并鑒定產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，如東北紅豆杉內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)紫杉醇菌 的鑒定(金濤，王偉,劉軍等，中草藥，2007， 38(5) :770-772)，其技術流程為① 內(nèi)生真菌的分離采用無菌操作技術從紅豆杉中分離并純化出內(nèi)生真菌；②發(fā)酵 培養(yǎng)內(nèi)生真菌菌絲體的液體發(fā)酵， 一般需要500-1000mL體積的量；③樣品中紫
杉醇的提取將內(nèi)生真菌發(fā)酵液濾過，得到的菌絲體研磨破壁，按菌絲體質(zhì)量與
萃取液體積比為i:5的比例用乙酸乙酯萃取，濾去菌絲的澄清濾液用同等體積
的乙酸乙酯萃取3次，將乙酸乙酯萃取液合并，50 'C減壓蒸干，用5mL甲醇溶解 再濃縮至0.5 mL，獲得樣品液；④樣品中紫杉醇的初步鑒定通過薄層層析 (Thin-Layer Chromatography, TLC)觀察紫杉醇特征性藍點出現(xiàn)的有無，即可 初步判定是否為產(chǎn)紫杉醇菌株；⑤分析和確認通過高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, HPLC-MS)等手段進 一步判斷是否為產(chǎn)紫杉醇的菌株，即通過與紫杉醇標準品比較，在內(nèi)生真菌發(fā)酵 提取物中能檢測出紫杉醇的則分離的樣品為紫杉醇產(chǎn)生菌。但是在上述采用TLC 方法對紫杉醇產(chǎn)生菌的初步確認的工作流程仍然存在一些缺陷亟待克服，比如 發(fā)酵體積大；紫杉醇抽提過程復雜；溶劑抽提使用試劑多；同時工作量大要經(jīng) 過抽提、減壓濃縮等多項步驟；而且TLC檢測的靈敏度較低，在菌株中紫杉醇含 量較少的情況下，TLC不易檢測到等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生 真菌的分子鑒別方法，使其利用紫杉醇合成途徑中的特異基因-紫杉二烯合成酶 (Taxa-4(5), 11(12)-diene Synthase, TS)基因的編碼序列對分離到的內(nèi)生真 菌進行鑒別的分子生物學方法。本發(fā)明對內(nèi)生真菌的檢測包括來自不同種的紅豆杉、或紅豆杉不同部位(種子、樹枝、樹干)中分離到的內(nèi)生真菌，比背景技術 在初步篩選紫杉醇產(chǎn)生菌方面更加高效、準確，節(jié)約了成本，簡化了中間處理過 程，且靈敏度高，使用該方法對分離到的內(nèi)生真菌進行初步篩選，可以避免最后 的檢測過程中對人力、物力和財力的浪費 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的(1) 紅豆杉內(nèi)生真菌的分離、純化采用常規(guī)分離真菌的方法對內(nèi)生真菌 進行分離，采用菌絲尖端切割法進行純化。(2) 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)將斜面菌株放至28'C活化24h，挑取斜面試管菌種的菌絲接至馬鈴薯綜合培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar, PDA)平板上，28。C恒 溫培養(yǎng)7天(d)。將lcm2左右的平板菌種接至酵母蛋白胨蔗糖培養(yǎng)基(Yeast extract P印tone Sucrose, YPS)，在25-28。C、 120rpm條件下培養(yǎng)36-48h。(3) 內(nèi)生真菌DNA的提取和檢測將培養(yǎng)好的菌絲體10, 000g離心lOmin， 去上清，加入PBS緩沖液洗滌沉淀三次，用液氮將洗滌好的菌絲體研磨成粉末狀。 采用高鹽低pH法進行DNA的提取和純化。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法對 提取出的DNA進行檢測。(4) 內(nèi)生真菌的PCR擴增和電泳檢測；根據(jù)GenBank (http:〃麗w. ncbi. nlm. nih. gov/)上登錄的加拿大紅豆杉(TaxusCanadensis)紫杉二烯合成酶基因(ts)(GenBank: AY364469)的保守序列設計一對引物，進行PCR擴增，通過電泳檢 測，發(fā)現(xiàn)差異(僅能從產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌絲中擴增出650bp的特異性條帶)， 利用差異進行鑒別，判定篩選結(jié)果。(5) 紫杉二烯合成酶基因的克隆和鑒定使用膠回收試劑盒回收DNA片斷， 然后用T-A系統(tǒng)將DNA片斷與載體連接，之后采用常規(guī)的生物學方法進行轉(zhuǎn)化， 最后對陽性菌落進行序列測定。所述步驟(1)中采用常規(guī)分離真菌的方法對內(nèi)生真菌進行分離，包括如下 步驟將野外采集的樹干分割成lcm3見方的小塊，樹枝分割成1cm長的小段， 種子直接用于分離，其分離程序因消毒劑的不同分為三種，可以任取其中一種①紅豆杉樹皮切成小塊，用無菌水清洗3次，然后用75%酒精浸泡3到5min， 再用無菌水沖洗3次，種植在培養(yǎng)基上；② 樹皮切成小塊，用無菌水清洗3次，用75%酒精浸泡100sec，在用 0. 1。/。HgCL浸泡2min，然后無菌水沖洗3次，種植在培養(yǎng)基上；③ 樹皮切成小塊，用無菌水清洗3次，75%酒精浸泡lmin、NaC10浸泡10min、 75X酒精浸泡lmin，種植在培養(yǎng)基上。種植材料放置在25-28。C條件下培養(yǎng)3-5 天后，內(nèi)生真菌開始萌發(fā)。所述步驟(1)中的紅豆杉內(nèi)生真菌的分離采用菌絲尖端切割法進行純化， 該方法是指切取培養(yǎng)菌絲的尖端，移入一新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，切割3-5次即可得 到較純的菌絲。所述步驟(3)中的采用高鹽低pH法提取基因組DNA，包括以下步驟①將 lg左右經(jīng)液氮研磨的樣品放入65'C預熱的提取緩沖液，放入65'C水浴保溫 30min，緩慢振搖，室溫下10, OOOXg離心10min;②在上清液中加入2/3體積 的2. 5mol/L的KAc高鹽溶液，混勻后置于(TC保持30min沉淀蛋白質(zhì)；③在4°C 下10， OOOXg離心lOmin，棄蛋白質(zhì)沉淀。上清液加入由氯仿和異戊醇按照24:1 的體積比配成的等體積的氯仿和異戊醇的混合物抽提，在6， OOOXg離心10min， 取出水相轉(zhuǎn)入另一離心管，如果中間層仍有白色沉淀，則再用由氯仿和異戊醇按 照24:1的體積比配成的氯仿和異戊醇的混合物抽提一次；④在上清液中加入三 分之二體積的預冷異丙醇，混勻后置于-2(TC靜置30min，以沉淀核酸，重復一 次，用體積比為70%乙醇清洗沉淀，在空氣中干燥50min，將DNA沉淀溶解在 TE緩沖液中，分裝存放于-2(TC或4'C冰箱中保存。所述步驟(3)中的內(nèi)生真菌DNA的檢測，采用瓊脂糖凝膠電泳以及紫外光 譜法進行檢測。包括以下步驟①瓊脂糖凝膠電泳測定法取10uLDNA溶液， 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電泳成像系統(tǒng)分析結(jié)果及攝取圖像。②紫外光 譜法測定提取的DNA經(jīng)50倍稀釋后，于紫外可見分光光度計上測定其濃度和 純度。所述步驟(4)中的內(nèi)生真菌的PCR擴增和電泳檢測，是通過以下步驟來實 現(xiàn)的①引物的設計上游引物為TsF: 5' -CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG-3，; 下游引物為TsR: 5' -CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT-3，;②PCR擴增PCR擴增 的總反應體系如下，總體積50iiL，包括0. 25uL的TagEx DNA polymerase(TaKaRa)， 5uL的IO,XPCR Buffer, 2. 0uL的dNTP Mix (2.5 mM)， l.OyL 的DNA， 0. 5 y L的TsF (10 u M) ， 0. 5 u L的TsR (10 u M)和40. 75 u L的PCR-Grade Water; PCR擴增程序:94。C變性5min， (94 °C 50sec， 55 °C lmin， 72 °C 80sec) 32個循環(huán)，72'C延伸5min，反應結(jié)束后取5 y L產(chǎn)物用質(zhì)量百分比為1%瓊脂糖 凝膠電泳檢測，EB染色觀察。所述步驟(5)中的紫杉二烯合成酶基因的克隆和鑒定，是通過以下步驟來 實現(xiàn)的①PCR擴增片段的回收，使用膠回收試劑盒回收片段，按膠回收試劑盒 的步驟操作。②連接采用T-A系統(tǒng)將DNA片段與pMD18-T載體連接，反應體系 如下，總體積10yL，包括1 ii L的pMD18-T Vector DNA， luL的回收片斷，5uL 的連接溶液I和3wL的無菌水；反應條件16°C， 30min以上。連接好的片段 可用于轉(zhuǎn)化。③轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備在工作平板上挑取DH5cc單菌落接種 到20-30mL無抗生素的LB培養(yǎng)基中，在240-260 rpm搖床中37。C搖菌至0D6。。=0. 5 (約6-8h);取出菌液與0.1 mol/L CaCl2同時置于冰浴中15-30 min;然后在 滅菌的超凈臺上取1. 5mL菌液于1. 5mLEP管中，4'C 5000-8000 rpm離心5 min 收集菌體；用移液器吸去上清，并用500nL冰冷的0. 1 mol/L CaCl2重懸菌體； 離心后用移液器吸去上清，用200uL冰冷的0.1 mol/L CaCl2重懸菌體，最后 置冰浴過夜備用。采用如下方法進行轉(zhuǎn)化將10u L連接片段與100 ii L感受態(tài) 細胞混合；放置冰上，30min; 42。C水浴放置90sec;放置冰上1-2min;加入800 u L LB培養(yǎng)液，在搖床(37°C， 200rpm)中培養(yǎng)lh;取100 u L溶液均勻涂在LB平 板上(含Amp， X-gal， IPTG); 37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。 陽性菌落的鑒定 取白色菌落用菌落PCR法或轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酶切鑒定陽性菌落。⑤序列測定。所述步驟(4)中"僅能從產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌絲中可擴增出650bp的 特異性條帶，利用差異進行鑒別，判定篩選結(jié)果"是指產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌中能 擴增出一條650bp左右的條帶，擴增片斷經(jīng)回收、克隆和測序后，與GenBank 上的TS基因序列(GenBank: AY364469)比對，同源性較高。不能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi) 生真菌則不能擴增出此條帶。本發(fā)明嘗試了利用TS基因保守序列PCR擴增的方法，對紫杉醇產(chǎn)生菌進行 初步篩選，初次篩選使用發(fā)酵量小(50ml即可)，并且省去了初篩中化學溶劑提的步驟，因此克服了背景技術中，利用TLC或HPLC方法初篩紫杉醇產(chǎn)生菌， 其工作程序繁瑣、工作量大、試劑消耗多、檢測水平低等一系列缺陷。在深入了 解紫杉醇代謝途徑的分子生物學基礎上，結(jié)合其它生物化學的檢測手段，試圖從分子水平上尋找新的標記手段，從而實現(xiàn)從大分子水平上揭示小分子藥用成份的 分布規(guī)律，使有效成份分析更加科學化和現(xiàn)代化，把對紫杉醇產(chǎn)生菌的檢測由原 來的化學檢測水平提高到現(xiàn)在的分子檢測水平。同時，本發(fā)明利用特異基因序列 對內(nèi)生真菌是否產(chǎn)紫杉醇進行簡單、快速、準確的初步鑒別，為進一步研發(fā)和使 用奠定了基礎。本發(fā)明中所涉及的菌株已在參考文獻(金濤,王偉，劉軍,平文祥,周東坡.東 北紅豆杉內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)紫杉醇菌的鑒定，中草藥，2007, 38(5) :770- 772) 中公開。


圖1 內(nèi)生真菌的PCR擴增和電泳檢測結(jié)果示意圖。 圖2 擴增片斷與ts基因序列對比示意圖；其中TS-Tc為GenBank登陸的ts基因的序列；TS-1為本次克隆的序列，灰色背景為兩者不同的堿基。圖3 分離菌的發(fā)酵提取物的和紫杉醇標準品的HPLC測定結(jié)果示意圖； 其中圖3A是分離菌的發(fā)酵提取物的HPLC測定結(jié)果示意圖；圖3B是紫杉醇標準品的HPLC測定結(jié)果示意圖。圖4 分離菌的發(fā)酵提取物的和紫杉醇標準品溶液的質(zhì)譜分析示意圖； 圖中所示為相關化合物分子量的信息，其中圖4A是檢測到的紫杉醇加鈉和加氫的離子峰值示意圖；圖4B是檢測到的樣品加鈉和加氫的離子峰值示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案 為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于 下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實施例1:檢測分離于曼地亞紅豆杉(Taxus media)的內(nèi)生真菌是否產(chǎn)紫杉醇的PCR檢測1. 菌絲體的培養(yǎng)將分離并純化放在4t:冰箱保藏的內(nèi)生真菌斜面菌株放至28'C活化24h，挑 取斜面試管菌種的菌絲接至PDA固體培養(yǎng)基平板上，28'C恒溫培養(yǎng)2-3d。用接 種鏟將lcW左右的平板菌種接至YPS液體培養(yǎng)基，并搗碎。28°C， 120rpm震蕩培養(yǎng)。2. 菌絲體的準備將培養(yǎng)好的菌絲體10, OOOXg離心10min，去上清，然后加入PBS緩沖液洗 滌沉淀3次，最后用液氮將洗滌好的菌絲體研磨成粉末狀。3. 菌絲體基因組DNA提取在lg材料中加入65。C預熱的提取緩沖液，65'C水浴保溫30min，緩慢振搖； 在室溫下10， OOOXg離心10min;然后在上清液中加入2/3體積的KAc高鹽溶液， 混勻后置于O'C保持30min以沉淀蛋白質(zhì)；然后在4°C 10， OOOXg離心10min， 棄蛋白質(zhì)沉淀；上清液加入等體積的氯仿和異戊醇混合物(體積比24:1)抽提， 在6，000Xg離心lOmin使分層，取出水相轉(zhuǎn)入另一離心管；然后在上清液中加 入三分之二體積的預冷的異丙醇，混勻后置于-20'C過夜以沉淀核酸；用70%乙 醇洗滌沉淀，在空氣中干燥5min;最后將DNA沉淀溶解在TE緩沖液或超純水中， 放置于-2(TC保存?zhèn)溆谩?. DNA的檢測(1) 取10uL DNA溶液，經(jīng)質(zhì)量比為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電 泳成像系統(tǒng)分析結(jié)果及攝取圖像；(2) 紫外光譜法測定DNA經(jīng)50倍稀釋后，于紫外可見分光光度計上測定 其濃度和純度。5. 引物設計根據(jù)GenBank (AY364469)上登錄的紫杉二烯合成酶(Taxa-4(5)， 11(12) -diene Synthase, TS)基因的保守序列設計一對引物 上游引物TsF: 5， -CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG-3，下游引物TsR: 5， -CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT-3， 引物由上海生工生物工程有限公司合成。6. PCR反應PCR反應體系包括5叱的10Xbuffer， 2hL dNTP (25mmol/L)，引物2叱， Taq酶0. 25叱(TaKaRa)， DNA模板lpL，無菌去離子水補足50叱。PCR擴增程 序94。C變性5min， (94 。C 50sec， 55 。C lmin， 72 。C 80sec) 32個循環(huán)，72°C 5min。 PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色觀察。結(jié)果如圖1所示， 能擴增出大約650左右的條帶的樣品說明該內(nèi)生真菌中有ts基因的存在。7. 膠回收把擴增特異的DNA譜帶用割膠鏟從瓊脂糖凝膠中割下，采用上海華舜生物工 程有限公司的柱離心式小量膠回收試劑盒進行DNA回收純化。具體操作細節(jié)詳見 說明書。8. 克隆和鑒定采用T-A系統(tǒng)將DNA片段與pMD18-T載體連接，反應體系如下，總體積10 y L， 包括1 y L的pMD18-T Vector DNA， 1 ii L的回收片斷，5 y 1的連接溶液I和3 u L 的無菌水；反應條件16°C， 30min以上。連接好的片段可用于轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化將 10 u L連接片段與100 w L感受態(tài)細胞混合，放置冰上30min，在42'C水浴放置 90sec后放置冰上l-2min，然后加入800 u L LB培養(yǎng)液，在37°C， 200rpm的搖 床中培養(yǎng)lh，最后取100uL溶液均勻涂在含Amp、 X-gal、 IPTG的LB平板上 在37'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，取白色菌落用菌落PCR法或轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酶切鑒定 陽性菌落。9. 測序在上海Invotrogen公司對陽性克隆進行測序。10. 序列分析 測定的序列結(jié)構(gòu)如下CCTGACGAAG GAGCTATGGA CGATGCTAGA AAATTTGCAG AACCATATCT TAGAGACGCA 61 CTTGCAACGA AAATCTCAAC CAATACAAAA CTATACAAAG AGATTGAGTA CGTGGTGGAG 121TACCCTTGGC ACATGAGTAT CCCACGCCTA GAAGCTAGAA GTTATATTGA TTCGTATGAC 181 GACGATTATG TATGGCAGAG GAAGATTCTA TACAGAATGC CATCTTTGAG TAATTCAAAA 241 TGTTTAGAAT TGGCAAAATT GGACTTCAAT ATCGTACAAT CTTTGCATCA AGAGGAGTTG 301 AAGCTTCTAA CAAGATGGTG GAAGGAATCC GGCATGGCAG ATATAAATTT CACTCGACAC 361 CGAGTGGCGG AGGTTTATTT TTCATCAGCT ACATTTGAAC CTGAATATTC TGCCACTAGA 421 ATTGCCTTCA CAAAAATTGG TTGTTTACAA GTCCTTTTTG ATGATATGGC TGACATCTTT 481 GCAACACTAG ATGAATTGAA AAGTTTCACT GAGGGAGTAA AGAGATGGGA TACATCTTTG 541 CTACATGAGA TTCCAGAGTG TATGCAAACT TG 601 11.結(jié)果分析
把擴增出的650bp條帶的擴增片斷經(jīng)回收、克隆和測序后，與GenBank上 ts序列比對，結(jié)果如圖2所示擴增片段與GenBank上登陸的ts基因相比，僅
有幾個堿基對的差別。
結(jié)果顯示，從內(nèi)生真菌中克隆出來的ts基因的核心片斷和GenBank上登陸 的序列具有高度的同源性，說明該內(nèi)生真菌中有ts基因的存在，這從分子水平 上則說明該內(nèi)生真菌是產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。
實施例2:
利用HPLC-MS進一步分析內(nèi)生真菌是否產(chǎn)紫杉醇
1.實驗方法 (1)紫杉醇及紫杉垸類化合物提取和分離
分別將分離自紅豆杉的內(nèi)生真菌(PDA斜面保藏)接種于250 mL三角瓶種 子液中，25。C振蕩培養(yǎng)3d后，按10X的接種量轉(zhuǎn)接至500mL三角瓶發(fā)酵液中， 25'C振蕩培養(yǎng)15d，通過離心得到菌絲體和上清液。發(fā)酵液離心，上清55'C旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至十分之一體積后，加入等體積的乙酸乙酯萃取3到5h;沉淀后再加入等 體積的乙酸乙酯浸提3到5h;再將上清和沉淀各提取3次，分別合并酯層。將 酯層在45'C分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入0. 5 mL乙醇溶解。沉淀的菌絲體經(jīng)低溫反 復凍融2次后，加入一定量的乙醇超聲波提取lh，重復2次，合并上述三種乙 醇提取液，45。C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入0.5mL乙醇溶解。合并上清液和菌絲體的 乙醇提取物，用于HPLC-MS檢測。(2) HPLC-MS檢測 ①色譜分離條件色譜分離按二元梯度方式進行。條件如下:
時間(min)甲醇(％)水(％)
0.011000
105050
206040
231000
301000
355050
流速為0. 6mL/min。進樣量為10 y L，柱后流出物依次經(jīng)UV和MSD檢測。UV 檢測波長為230nm，經(jīng)UV檢測器流出的流分進入電噴霧離子化(ESI)噴霧室。
②質(zhì)譜檢測參數(shù)檢測模式為Scan模式，離子極性Pos (正離子)，離子化 方式ESI， m/z掃描范圍50-2300,檢測離子分別為H+、Na+、K+，干燥氣溫度350°C， 霧化器流量為10L/min， CID電壓70 V，毛細管電壓3.0KV。
2.實驗結(jié)果
從分離菌株發(fā)酵提取物和紫杉醇標準品的HPLC測定結(jié)果可以看出，在相同 色譜條件下，紫杉醇標準品的保留時間為17.202 min (圖3B)， PCR檢測能擴增 出650bp的分離菌的發(fā)酵提取物在相同保留時間處，有一對應峰出現(xiàn)(圖3A)， 則證明該菌株能夠產(chǎn)紫杉醇，進一步在高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用中通過質(zhì)譜分析獲得 相關化合物分子量以及與結(jié)構(gòu)相關的碎片離子的信息(圖4)。
4.結(jié)果分析
如圖4A中，標準品紫杉醇加鈉離子的離子峰值為876. 2，圖4B樣品中同樣 也能找到質(zhì)譜的離子峰為876.5;再之圖4A中標準品加氫離子的離子峰值為 854.3，圖4B樣品中同樣也能找到離子峰值854.5。這就說明該樣品中檢測到了 紫杉醇的存在，從而證明分離出能夠擴增出650bp條帶的真菌是產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生 真菌。序列表
〈110〉上海交通大學
〈120>紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分子鑒別方法
<160〉3
〈170〉Patentln version 3.1
〈210>1
〈211〉632
〈212>腿
〈213>真菌
〈400〉1
caaacccatg tcgaattgag aagcgtggtg aatcttttca gagcttccga ccttgcattt 1 cctgacgaag gagctatgga cgatgctaga a犯tttgcag aaccatatct tagagacgca 61 cttgcaacga aaatctcaac caatacaaaa ctatacaaag agattgagta cgtggtggag 121 tacccttggc acatgagtat cccacgccta gaagctagaa gttatattga ttcgtatgac 181 gacgattatg tatggcagag gaagattcta tacagaatgc catctttgag taattcaaaa 241 tgtttagaat tggcaaaatt ggacttcaat atcgtacaat ctttgcatca agaggagttg 301 aagcttctaa caagatggtg gaaggaatcc ggcatggcag a.tataaattt cactcgacac 361 cgagtggcgg aggtttattt ttcatcagct acatttgaac ctga^tattc tgccactaga 421 attgccttca caaaaattgg ttgtttacaa gtcctttttg atgatatggc tgacatcttt 481 gcaacactag atgaattgaa aagtttcact gagggagtaa agagatggga tac已tctttg 541 ctacatgaga ttccagagtg tatgcaaact tg 60權利要求
1、一種利用特異基因序列初步篩選產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)紅豆杉內(nèi)生真菌的分離、純化分離內(nèi)生真菌并且采用菌絲尖端切割法進行純化；(2)內(nèi)生真菌的培養(yǎng)將斜面菌株放至28℃活化24h，挑取菌絲接至固體培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)7天后將菌種接至液體培養(yǎng)基，在25-28℃、120rpm條件下培養(yǎng)36-48h；(3)內(nèi)生真菌DNA的提取和檢測將培養(yǎng)好的菌絲體離心后去上清，加入緩沖液洗滌沉淀3次，將洗滌好的菌絲體研磨成粉末狀，然后提取和純化DNA，最后對提取出的DNA進行檢測；(4)內(nèi)生真菌的PCR擴增和電泳檢測；根據(jù)GenBank上登錄的紫杉二烯合成酶基因的保守序列設計一對引物，進行PCR擴增，通過電泳檢測，僅能從產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌絲中擴增出650bp的特異性條帶，利用差異進行鑒別，判定篩選結(jié)果；(5)紫杉二烯合成酶基因的克隆和鑒定回收DNA片斷，然后用T-A系統(tǒng)將DNA片斷與載體連接，轉(zhuǎn)化后對陽性菌落進行序列測定。
2、根據(jù)權利要求l所述的利用特異基因序列初步篩選產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的 方法，其特征是，步驟(3)中所述的內(nèi)生真菌菌絲體DNA的提取和純化，采用 高鹽低pH提取法提取基因組DNA，該提取方法包括以下步驟① 經(jīng)研磨的樣品放入65。C預熱的提取緩沖液，放入65'C水浴保溫30min， 室溫下10, OOOXg離心10min;② 在上清液中加入三分之二體積的2. 5mol/L的KAc高鹽溶液，混勻后置于 (TC保持30min以沉淀蛋白質(zhì)；③ 在4'C下10,000Xg離心10min，棄蛋白質(zhì)沉淀，上清液加入等體積的體 積比為24:1的氯仿和異戊醇的混合物抽提，在6， OOOXg離心10min，取出水相 轉(zhuǎn)入另一離心管，如果中間層仍有白色沉淀，則再用體積比為24:1的氯仿和異戊醇的混合物抽提一次；④在上清液中加入三分之二體積的預冷異丙醇，混勻后置于-2(TC靜置 30min，以沉淀核酸，重復一次，用體積比為70%的乙醇清洗沉淀，在空氣中干 燥50min，將DNA沉淀溶解在TE緩沖液中，分裝存放于-2(TC或4'C冰箱中保存。
3、根據(jù)權利要求l所述的利用特異基因序列初步篩選產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的 方法，其特征是，步驟(4)中所述的設計的一對特異引物的序列為引物l， TsF: 5， -CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG-3，；引物2， TsR: 5' -CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT-3'。
全文摘要
一種分子生物學技術領域的分子鑒別方法。該檢測方法包括如下步驟從紅豆杉中分離內(nèi)生真菌并進行保藏和培養(yǎng)；將培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌絲體洗滌沉淀，研磨成粉末狀；內(nèi)生真菌DNA的提取和純化；PCR擴增、PCR產(chǎn)物的電泳檢測和特異基因序列的測定；通過從內(nèi)生真菌中能否擴增出650bp大小的特異性條帶來區(qū)分該菌株是否產(chǎn)紫杉醇；通過化學檢測程序進一步確定結(jié)果的可靠性。本發(fā)明利用特異基因序列對內(nèi)生真菌是否產(chǎn)紫杉醇進行簡單、快速、準確的初步鑒別，為進一步研發(fā)和使用奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/04GK101302555SQ20081003883
公開日2008年11月12日 申請日期2008年6月12日 優(yōu)先權日2008年6月12日
發(fā)明者周選圍, 唐克軒, 娟 林, 魏雅敏 申請人:上海交通大學