專利名稱::特異性結(jié)合蛋白及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及抗表皮生長因子受體突變體III(EGFRvIII)的特異性單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明的抗體可與EGFRvIII有效結(jié)合或與細(xì)胞過量表達(dá)的表皮生長因子受體(EGFR)部分結(jié)合,該抗體與細(xì)胞正常表達(dá)的EGFR沒有結(jié)合作用。本發(fā)明抗體可用于治療表達(dá)EGFRvIII的腫瘤細(xì)胞系。
背景技術(shù):
:表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因c-erbB的170千道爾頓(Kilodalton)膜糖蛋白產(chǎn)物")。EGFR基因是最初在鳥類紅細(xì)胞增多癥病毒中識別的erbB致癌基因的細(xì)胞同系物"'"。已在各種人類腫瘤中觀察到這種致癌基因通過基因放大的活化(:"6)。己有文獻(xiàn)表明,EGFR在多種類型的人類實(shí)體瘤中過表達(dá)")。這些腫瘤包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤、卵巢癌、腎癌和前列腺癌(7)。v-erbB致癌基因和正常EGFR基因之間的一個(gè)主要區(qū)別在于病毒致癌基因是正常受體截?cái)喟被淖冃?;它們?nèi)鄙俅蟛糠旨?xì)胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域,但保留了跨膜和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(8—'')。這導(dǎo)致了它不能結(jié)合表皮生長因子(EGF),們,仍可以磷酸化其它蛋白質(zhì)"1—'5)。各種基因變化都可以發(fā)生于病毒性erbB致癌基因中,例如,基因的羧基末端中發(fā)生氨基酸的取代和缺失。其中氨基端缺失對于致癌作用尤為關(guān)鍵。氨基端缺失是大多v-erbB致癌基因的一個(gè)特征,包括由啟動(dòng)子的插入或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的那些氨基端缺失('3'16)。相反,羧基末端缺失似乎只與逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的腫瘤有關(guān),而且似乎決定于宿主范圍和腫瘤類型的特異性m'l5)。以氨基端缺失的鳥類c-erbB基因或人EGF受體的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明該缺失nf以使細(xì)胞轉(zhuǎn)化^71。EGFR基因的放大發(fā)生于40%的惡性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中"'7),受體基因的重排在許多具有基因放大的腫瘤中較為明顯。重排似乎更多地影響基因的氨基末端w'1迄今已發(fā)現(xiàn)至少有八種EGFR變體(圖5):l)EGFRvI缺少EGFR的大部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。2)EGFRvI1由EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的83aa框內(nèi)缺失組成。3)EGFRvI11由EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的267aa框內(nèi)缺失組成。4)EGFRvIV含有EGFR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的缺失。5)EGFRvV含有EGFR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的缺失。6)EGFR.TDM/2-7含有EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的外顯子2-7的重復(fù)。7)EGFR.TDM/18-26含有EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的外顯子18-26的重復(fù)。8)另外,存在第二種更為罕見的具有在外顯子11和14之間的連接點(diǎn)引入新穎組氨酸殘基的缺失的EGFRvIII突變體(EGFRvIII/A12-13)(24)。EGFRvIII是在人類癌癥中表皮生長因子(EGF)受體最常見發(fā)生的變體(M)。在基因放大的過程中,在胞外區(qū)發(fā)生267個(gè)氨基酸缺失,產(chǎn)生新的連接點(diǎn)(甘氨酸)。己知EGFRvIII未表達(dá)十任何正常組織('"加。然而,EGFRvIII在許多腫瘤細(xì)胞中有表達(dá),例如,27-76%乳腺癌活檢組織檢查表達(dá)EGFRvIII"11,50-70%神經(jīng)膠質(zhì)瘤表達(dá)EGFRvIII'13'"),16%非小細(xì)胞肺癌表達(dá)EGFRvIII咖,75%卵巢癌表達(dá)EGFRvIII咖。一種治療過量表達(dá)EGFRvIII的癌癥的方法涉及使用特異性靶向至未分離正常EGFR的變體受體的腫瘤特異性核酶。發(fā)現(xiàn)核酶在無胸腺裸鼠中顯著抑制乳腺癌生長(25)。此外,缺失267個(gè)氨基酸并替換為甘氨酸所產(chǎn)生的獨(dú)特連接可以用于制備抗EGFRvIII的特異性單抗。此外,鑒于EGFRvIII在某些腫瘤中的表達(dá)及其在正常組織中的表達(dá)缺乏,EGFRvIII是腫瘤藥物的理想靶點(diǎn)。具體地說,EGFRvIII可作為腫瘤免疫偶聯(lián)物治療的理想候選物??笶GFRvIII的單克隆抗體(或其與抗腫瘤劑或毒素偶聯(lián)的形成的偶聯(lián)物)在體內(nèi)能夠?qū)е驴贵w依賴性地溶胞或殺細(xì)胞作用,從而清除表達(dá)EGFRvIII的腫瘤細(xì)胞。冃前,雖然國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種抗EGFR抗原的抗體,但是這些抗體往往不夠理想,例如無或較低的針對EGFRvIII的特異性。因此,本領(lǐng)域還迫切需要研制識別EGFRvIII的特異性更高且不識別野生型EGFR的、以及具有其他優(yōu)良特性的抗EGFRvIII單克降抗體,從而開發(fā)出治療效果更顯著的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的M的提供一種特異性抗EGFRvIII單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是提供一種所述特異性抗EGFRvIII單克隆抗體的制備方5法。本發(fā)明的另一目的是提供一種含所述抗EGFRvIII單克隆抗體的藥物組合物。在本發(fā)明的第一方面,提供了一種單克隆抗體VH鏈,所述重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQIDNO:5所示的CDRl,SEQIDNO:6所示的CDR2,SEQIDNO:7所示的CDR3。在另一優(yōu)選例中,所述的VH鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面,提供了一種單克隆抗體VH鏈,所述輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SE()IDNO:8所不的CDRl,SEQIDNO:9所示的CDR2,SEQIDNO:10所示的CDR3。在另一優(yōu)選例中,所述的Vj連具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第三方面,提供了一種單克隆抗體或其偶聯(lián)物,所述抗體的Vw鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列,且其V^鏈分別具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中,所述的抗體結(jié)合十人表皮生長因子受體突變體(EGFRvIII)、并與細(xì)胞過量表達(dá)的EGFR部分結(jié)合,但該抗體與細(xì)胞正常表達(dá)的EGFR沒有結(jié)合作用。更佳地,所述的抗體結(jié)合于A431細(xì)胞和U87-EGFRvIII細(xì)胞,但不結(jié)合于U87細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中,所述的抗體是鼠源抗體、人源化抗體、或嵌合抗體。在另一優(yōu)選例中,所述的偶聯(lián)物是抗體與抗腫瘤劑或毒素(如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素)的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的第四方面,提供了一種核酸分子(如DNA分子),所述分子編碼選自下組的蛋白質(zhì)本發(fā)明第一方面中所述的單克隆抗體VH鏈;本發(fā)明第二方面中所述的單克隆抗體VL鏈;本發(fā)明第二方面中所述的單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中,所述的核酸分子具有選自下組的DNA序列SEQIDNO:1、3、11或13。在本發(fā)明的第五方面,提供了--種藥物組合物,它含有單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體,所述單克隆抗體的VH鏈和VL鏈分別具有SEQIDNO:5-7和SEQIDNO:8-10所示的互補(bǔ)決定區(qū)。在另一優(yōu)選例中,所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列,且其VL鏈分別具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第六方面,提供了一種本發(fā)明所述的單克隆抗體或其偶聯(lián)物的用途,其中它們被用于制備組合物,所述的組合物用于(a)抑制或殺滅表達(dá)表皮生K因子受體突變體m的細(xì)胞的生K;或(b)抑制與過量表達(dá)表皮生ll因子受體的細(xì)胞生長。在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞,如肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞。圖l顯示了重組質(zhì)粒pET28a-EGFRvIIIex經(jīng)BglII和SalI酶切鑒定。其中各泳道如下1-4為質(zhì)粒雙酶切;M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)AHindIII。圖2顯示了EGFRvIII胞外區(qū)蛋白的純化結(jié)果。其中各泳道如下l,ll:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);2:未誘導(dǎo)的細(xì)菌沉淀;3:流出液;4~6:緩沖液C的洗滌液;7-10:緩沖液D的洗脫液;12-16:緩沖液E的洗脫液。圖3顯示了復(fù)性蛋白的SDS-PAGE圖。其中,各泳道如下1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);2:復(fù)性蛋白。圖4顯示了復(fù)性蛋白的Western印跡。其中,各泳道如下1:復(fù)性蛋白;2:BL21(DE3)-RP菌液總蛋白。圖5顯示了野生型EGFR及其各種突變體。圖6顯示了12H23抗體亞型的ELISA分析。圖7顯示了本發(fā)明抗體12H23和對照抗體C225分別與A431細(xì)胞(過量表達(dá)EGFR)、U87-EGFRvIII細(xì)胞(穩(wěn)定高表達(dá)EGFRvIII)和U87細(xì)胞(正常表達(dá)EGFR)的流式細(xì)胞分析圖。其中,各圖如下A:C225與A431細(xì)胞的結(jié)合圖;B:12H23與A431細(xì)胞的結(jié)合C:C225與U87-EGFRvIII細(xì)胞系的結(jié)合D:12H23與U87-EGFRvI^細(xì)胞系的結(jié)合圖;E:C225與U87細(xì)胞的結(jié)合F:12H23與U87細(xì)胞的結(jié)合圖。圖8顯示了12H23與抗原rEGFRvIIIex蛋白的親和力測定。圖9顯示了各重組蛋白的序列結(jié)構(gòu)示意圖。圖10顯示了重組蛋白的SDS-PAGE分析。其中,各泳道如下M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品;1:rN12-Sl;2:rN12-S2;3:rEGFRvIIIex;4:rN12-VK21。圖11顯示了E1ISA法測定12H23結(jié)合表位的結(jié)果。其中,Sl:rN12-Sl;S2:rN12-S2;EGFRvIII:重組的EGFRvII工胞外蛋G;VK21:rN12-VK21Neg:空白對照。圖12顯示了12H23申.抗對裸小鼠種植瘤的抑制作用。圖13顯示了12H23單抗重鏈的核苷酸編碼序列和氨基酸序列(下劃線為CDR)。圖14顯示了12H23單抗輕鏈的核苷酸編碼序列和氨基酸序列(下劃線為CDR)。圖15顯示質(zhì)粒pH和pK的示意圖。圖16顯示了人鼠嵌合抗體CH12與重組的EGFRvIII胞外蛋白的結(jié)合。圖中,l-5分別表示表達(dá)CH12的各個(gè)細(xì)胞克隆株。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究,成功獲得了對EGFRvIII高特異性的單克隆抗體,該單克隆抗體可與EGFRvIII有效結(jié)合或與細(xì)胞過量表達(dá)的EGFR部分結(jié)合,但與細(xì)胞正常表達(dá)的EGFR沒有結(jié)合作用。此外,木發(fā)明抗體對表達(dá)EGFRvIII的腫瘤細(xì)胞系有明顯的治療作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種重組抗EGFRvIII單克隆抗體。所述的抗體可以是鼠源的、人源的或嵌合的。例如,人源化的抗體可包括人源恒區(qū)(如人源恒區(qū)IgGl-Fc),本發(fā)明的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明還提供了抗EGFRvIII單克隆抗體的氨基酸序列及其其可變區(qū)鏈,以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地,本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū),CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋G質(zhì)或蛋O質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物),只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性,較佳地至少95%同源性。8抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來描述,稱為超變區(qū)域(CDR),將該段間隔成4個(gè)框架區(qū)域(FR),4個(gè)FR的氨基酸序列相對比較保守,不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),通過其間的FR形成的13折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近,重鏈上的CDR和相應(yīng)輕鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)??梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了FR或CDR區(qū)域。此外,最近還發(fā)現(xiàn)由輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的相關(guān)結(jié)構(gòu),^相應(yīng)的重鏈可變區(qū)相比,其結(jié)合的動(dòng)力學(xué)比較小,分離的重鏈可變區(qū)域自身具有抗原結(jié)合活性。此處鑒定的V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion,CDR)特別令人感興趣,因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此,本發(fā)明包括那些具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變鏈的分子,只要其CDR與此處鑒定的CDR具有90。/。以上(較佳地95y。以上,最佳地98%以上)的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體,還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab或(Fab')2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv分了;或嵌合抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列,尤其是片段長度較短時(shí)。通常,通過先合成多個(gè)小片段,然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。此外,還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起,形成單鏈抗體。一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。冃前,匕經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋A(或其片段,或其衍牛物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外,還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這勝載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞,以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞,如細(xì)菌細(xì)胞;或是低等真核細(xì)胞,如酵母細(xì)胞;或是高等真核細(xì)胞,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌,鏈霉菌屬;鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞;真菌細(xì)胞如酵母;果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)9胞;CH0、C0S7、293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核牛物如大腸桿菌時(shí),能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲,用CaCl2法處理,所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要,轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物,可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法,常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔,脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng),表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞,培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生L々的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生K到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后,用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子,將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要,可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離于交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明還提供了一種組合物。在優(yōu)選例中,所述的組合物是藥物組合物,它含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物,以及藥學(xué)上可接受的載體。通常,可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中,其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括(但并不限于)瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明的藥物組合物可直接用于預(yù)防和治療腫瘤。此外,還可同時(shí)使用其他治療劑。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,較佳地0.Ol-90wt%,更佧地O.1-80wt。/。)的本發(fā)明上述的單克隆抗體(或其偶聯(lián)物)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?;钚猿煞值慕o藥量是治療有效量,例如每天約l微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外,本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時(shí),是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動(dòng)物,其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重,而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重,較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然,具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明的單克隆抗體的特異性和生理活性有顯著的提高。該單克隆抗體可與EGFRvIII有效結(jié)合,并且與細(xì)胞過量表達(dá)的EGFR部分結(jié)合,但與細(xì)胞正常表達(dá)的EGFR沒有結(jié)合作用。(b)本發(fā)明的單抗的親和力高于現(xiàn)有的抗體(如CH806抗體)并且抗體氨基酸序列組成也不一樣。因此,本發(fā)明的高親和力、高特異性的單克隆抗體在臨床上具有重要的價(jià)值。下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l抗原的制備1.1EGFRvIII蛋白胞外區(qū)的原核表達(dá)及純化1.1.1載體構(gòu)建及鑒定以pLNRNL(編碼全長EGFRvIII,購自LudwigInstitute,SanDiego,CA)為模板,用PCR方法獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)BamHI和SalI的EGFRvIIIex擴(kuò)增產(chǎn)物,用BamHI和SalI雙酶切,得到目的片斷。用BglII和SalI酶切市售的載體pET28a(可購自Novagen公司),瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片斷,在T4連接酶的作用下連接,形成載體pET28a-EGFRvIIIex,然后轉(zhuǎn)化市售的大腸桿菌T0P10(可購自Invitrogen公司),經(jīng)卡那抗性進(jìn)行篩選,經(jīng)BglII和Sai:[酶切鑒定含插入片斷的陽性克隆。1.1.2表達(dá)細(xì)菌的篩選用鑒定正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌B121(DE3)、B121(DE3)-RP、HMS174(DE3)(可購自Novagen公司),并平鋪于卡那抗性的平皿上37t:倒置培養(yǎng)過夜,挑取單克隆后振蕩培養(yǎng)至0D為0.6-0.8,加入終濃度為1mMIPTG,3(TC誘導(dǎo)4h后收集菌液,離心取沉淀行SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達(dá)量。1.1.3融合蛋白誘導(dǎo)條件的分析為了提高目的基因原核表達(dá)水平,試驗(yàn)摸索了一系列表達(dá)誘導(dǎo)條件。(1)誘導(dǎo)時(shí)間將菌種接種于LB培養(yǎng)基中,37。C振蕩培養(yǎng)至0D為0.6-0.8,加入終濃度為1mMIPTG,3(TC振蕩培養(yǎng),分別在1、2、3、4、5、6h時(shí)間點(diǎn)收集菌液。(2)誘導(dǎo)濃度將表達(dá)菌株培養(yǎng)至OD0.6-0.8,分別加入終濃度為0.2、0.5、0.8、lmM的IPTG,30。C振搖4h,收獲細(xì)菌。(3)誘導(dǎo)溫度振蕩培養(yǎng)表達(dá)細(xì)菌至0D0.6-0.8時(shí),加入終濃度為1mMIPTG,分別在37°C、30°C、25'C下誘導(dǎo)4小時(shí),收集細(xì)菌。。1.1.4融合蛋白的表達(dá)形式按上述條件大量誘導(dǎo)后,收集沉淀加入1/10體積的緩沖液A(50mMNaH2P0.,,300nMNaCl,10mMImidozole(咪唑),pH8.0))重懸,加PMSF(終濃度為1mM)置冰上超聲(超聲3秒,間隔10秒,一輪99次,共4輪),離心(4。C,12000g)15min,分別收集上清和沉淀,進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳,0.25%考馬斯亮藍(lán)染色3小時(shí)后脫色觀察。1.1.5包涵體的洗滌和變性經(jīng)超聲裂解、離心后的沉淀充分重懸于洗液I(lOOmMNaH2P(^,lOmMTris.Cl,2M尿素(urea),pH8.0),4°C攪拌30min后,離心(4。C,12000g)15分鐘收集沉淀;加入洗液II(100mMNa&PC^lOmMTris.Cl,2MGuHCl,pH8.0),重復(fù)上次操作,獲得純化的包涵體沉淀。最后將包涵體用含8M的尿素溶液(100mMNaH2P0"10mMTris.Cl,8M尿素,pH8.O)重懸,冰上超聲,離心(4。C,12000g)15min,棄沉淀,保留上清。1.1.6融合蛋白的純化上清與Ni-NTAAgarose4。C混勻1小時(shí)(或過夜),上親和色譜柱收集流出液,用4ml緩沖液C(100raMNaH2P04,10mMTris.Cl,2M尿素,pH6.3)洗滌3次,接著用0.5ml緩沖液D(100mMNaH2P04,10mMTris.Cl,2M尿素,pH15.9)洗脫4次,最后用0.5ml緩沖液E(100mMNaH2P04,10mMTris.Cl,2M尿素,pH4.5)洗脫4次;分別收集洗脫液并行12%SDS-PAGE分析純度,測A280檢測其1.1.7融合蛋白的復(fù)性將純化后的蛋白逐滴加入10倍體積預(yù)冷的復(fù)性緩沖液(25mMTris-cl,0.l麗aCl,10%甘油,1.OM尿素,0.01M精氨酸,lmM還原性谷胱甘肽,0.5mM氧化性谷胱甘肽pH8.0),^C孵育24h后;加到透析袋中,分別在含有0.5M、0.25M、0.125M尿素緩沖液(PBS,pH7.4)中4。C透析4h以上;最后在大體積的PBS中4r透析24h,離心,取上清。1.3.8復(fù)性蛋白的Western印跡鑒定以B121(DE3)-RP菌中總蛋白為陰性對照,對復(fù)性后的融合蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)移至NC膜上。依次滴加1:1000的單克隆的兔抗EGFRvIII(可購自Zymed公司)(4。C孵育過夜,PBST洗膜3次,每次10min)及l(fā):5000的HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG(37。C孵育lh,洗膜同上)。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的試劑顯影,并在暗室用X光片感光。結(jié)果1.pET28a-EGFRvIIIex重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒pET28a-EGFRvIIIex經(jīng)經(jīng)BglII和Sail酶切后分別出現(xiàn)1292bp、5147bp的電泳條帶(見圖l),與預(yù)期大小相符,說明載體構(gòu)建正確。2.EGFRvIII胞外區(qū)蛋白的純化如圖2所示,獲得了純化的EGFRv111胞外區(qū)蛋白。3.EGFRvIlI蛋白復(fù)性后的鑒定如圖3和圖4所示,結(jié)果表明EGFRvIII胞外區(qū)蛋白純度非常高。實(shí)施例2.抗原免疫及雜交瘤篩選2.1免疫(l)重組蛋白免疫EGFRvIII胞外區(qū)重組蛋白與等量完全弗氏佐劑(Sigma)充分乳化混合皮下免疫6周齡BALB/c小鼠,100yg每只小鼠。4周后重組抗原與不完全弗氏佐劑乳化混合,腹腔注射免疫小鼠,50ug每只小鼠,其后間隔2周,繼續(xù)腹腔加強(qiáng)免疫。在第4次加強(qiáng)免疫1周后,以重組抗原包被,ELISA法檢測小鼠抗血清效價(jià)〉105。(3)脾內(nèi)注射加強(qiáng)免疫最后一次加強(qiáng)3周后,脾內(nèi)免疫20lig重組抗原。2.2雜交瘤細(xì)胞株建立小鼠經(jīng)脾內(nèi)加強(qiáng)免疫后4天,在無菌情況下取脾,HI100S濾M濾過分離淋巴細(xì)胞,與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0融合,經(jīng)次黃嘌呤、氨基蝶呤與胸卄(hypoxathine,aminopt.erinandthymidine,HAT)選擇性培養(yǎng)3天后,補(bǔ)加HT培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1周。以重組抗原包被,ELISA篩選陽性克隆,以有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆,繼續(xù)連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月,最后獲得穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞系。結(jié)果,獲得了多個(gè)陽性克隆,其中活性最高為12H23。2.3抗體的純化2.3.1辛酸/硫酸銨沉淀方法初步純化取腹水100ml用2倍體積的0.06MpH4.0的乙酸鈉緩沖液稀釋,緩慢滴入4%辛酸,邊滴邊攪拌。攪拌30min然后將混濁液于10000g下離心30min。棄去沉淀,上清液0.OIM,pH7.4的磷酸緩沖液透析過夜。取出透析液,緩慢加入等體積的飽和硫銨,靜置2小時(shí)。將混濁液于10000g離心lOmin。棄上清液,用0.OIM,pH7.4的PBS溶解。將溶解后的溶液用0.01M,pH7.4的PBS透析,其間換液兩次,兩次換液時(shí)間不得少于5小時(shí)。將透析溶液于10000g離心10min,棄去沉淀,收集h清液。2.3.2蛋白G親和純化取出蛋白G親和柱回復(fù)室溫,用PBS平衡5個(gè)柱體積。將上述單抗溶液上柱,PBS洗5個(gè)柱體積。以pH2.3,0.1M甘氨酸鹽酸溶液洗脫,洗脫液加入1/10體積1M磷酸氫二鈉溶液pH9.0中和。將溶液用0.01M,pH7.4的PBS透析,其間換液兩次,兩次換液時(shí)間大于5小時(shí)。將透析溶液于10000g離心lOmin,上清0.22um濾膜過濾保存,即為單抗溶液。經(jīng)過上次純化從而獲得了純度〉95%的抗體。2.412H23單克隆抗體亞型鑒定rEGFRvIIIex以包被緩沖液(NaHCO:,pH9.6)稀釋為1.0mg/L,加入ELISA微孔板中,每孔50uL。4'C包被24小時(shí);加入含5%脫脂奶粉PBS350uL封閉過夜;PBS洗2次;加入初始濃度為lrag/L的12H23單抗50uL,37。C結(jié)合1小時(shí);PBS洗3次,分別加入羊抗鼠亞型多抗(1:1000稀釋)100uL,37。C結(jié)合1小時(shí);PBS洗3次;加服P標(biāo)記的驢抗羊多抗,37°C結(jié)合1/2小時(shí),PBS洗5次;加ABTS底物顯色15分鐘,酶標(biāo)儀測定405nm吸光度值。結(jié)果如圖6所示,表明該抗體12H23的亞型為IgGl型。實(shí)施例3單克隆抗體的結(jié)合能力檢測3.112H23的受體結(jié)合特異性FACS分析載體構(gòu)建細(xì)胞U87細(xì)胞(腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,正常表達(dá)EGFR,可購自ATCC細(xì)胞庫)、U87-EGFRvIII細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了pLERNL載體的U87細(xì)胞系)和A431細(xì)胞(人表皮鱗狀細(xì)胞癌,過量表達(dá)EGFR,可購自ATCC細(xì)胞庫)抗體實(shí)施例2中準(zhǔn)備的抗體12H23,以及市售的C225單克隆抗體(作為對照)??贵w濃度均為2mg/ml,按1:100稀釋。1)取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到6孔板內(nèi),接種細(xì)胞密度約為90%,37°C孵箱過夜培養(yǎng)。2)次日,使用10mM的EDTA消化細(xì)胞,5000rpmX3min,離心收集細(xì)胞于2mlEppendorf管中。3)0.5lmlPBS重懸細(xì)胞,4%多聚甲醛固定細(xì)胞,37°〇孵育10min。4)將細(xì)胞置于冰上,冷卻lmin。5)5000rpraX3min,離心,棄.卜.清。6)將細(xì)胞重懸于預(yù)冰冷的90%甲醇中,冰上放置30min。7)5000rpmX3min,離心,棄上清。8)加入0.5%BSA(PBS配制)重懸細(xì)胞,5000rpmX3min離心,洗三次。9)分裝細(xì)胞于各EP管中,0.51乂106細(xì)胞/管(每個(gè)細(xì)胞共分為8管,其中一管為空白細(xì)胞,其余2管只加二抗)10)每管加入0.5%BSA(PBS配制),室溫封閉10min。11)離5000rpmX3rain心,棄去封閉液。12)加100y1相應(yīng)的一抗于各細(xì)胞中,室溫孵育3060min。13)離心,棄掉一抗孵育液。14)加入0.5%BSA(PBS配制)重懸細(xì)胞,5000rpmX3min離心,洗三次。15)加lOOulFITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(12H23)或驢抗人二抗(C225)于各細(xì)胞中,室溫孵育30min。16)離心,棄掉二抗孵育液。17)加入0.5%BSA(PBS配制)重懸細(xì)胞,5000rpmX3min離心,洗三次。18)最后用O.5lmlPBS重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至流式專用試管中。19)流式細(xì)胞儀檢測分析。結(jié)果如圖7A-7F所示,抗體12H23可以與EGFRvIII高表達(dá)的細(xì)胞系高效結(jié)合,與過量表達(dá)EGFR的A431細(xì)胞也有部分結(jié)合,但與僅正常表達(dá)EGFR的細(xì)胞系U87幾乎沒有結(jié)合。與之相反,而商品化抗體C225(Erbitux)不僅能與EGFRvIII高表達(dá)的細(xì)胞系結(jié)合,與正常表達(dá)EGFR的細(xì)胞系U87也能結(jié)合。這表明,本發(fā)明抗體12H23具有更好的特異性。3.2非競爭法測定12H23親和力rEGFRvIIIex以包被緩沖液(NaHC03pH9.6)稀釋為5.Omg/L、2.5mg/L、1.25mg/L和0.625mg/L,依次加入ELISA微孔板中,每孔100yL。4°C包被24小時(shí)。棄包被液,PBS洗一次,加入含5%脫脂奶粉PBS350uL封閉過夜;PBS洗2次。往包好不同濃度抗原的微孔板,加入初始濃度為lmg/L的12H23單抗,倍比稀釋(含5%脫脂奶粉PBS為稀釋液)到12個(gè)梯度。37。C結(jié)合1小時(shí),PBS洗3次,力nHRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100uL,37。C結(jié)合1小時(shí),PBS洗5次,加ABTS底物顯色15分鐘,酶標(biāo)儀測定405nm吸光度值。根據(jù)吸光度值結(jié)果繪制結(jié)合反應(yīng)曲線,通過作圖法取其最大OD值一半(g卩OD50%)的抗體濃度。結(jié)果如圖8所示。12H23在5.Omg/L包被曲線OD50。/。抗體濃度3ug/L(2Xl(T'mol/L);在2.5mg/L包被曲線OD50。/o抗體濃度2.g/L(1.7X10—"mol/U;在l.25mgZL包被曲線0D50。/??贵w濃度2.3ug/L(1.5X10—'W/L);在O.625mg/L包被曲線OD50。/o抗體濃度2ug/L(1.5XlO"mol/L)。代入公式P(n—l)/2(nAb'-Ab)計(jì)算親和常數(shù),式巾Ab'和Ab分別表示當(dāng)抗原濃度為Ag'和Ag吋,產(chǎn)生0D50。/??贵w濃度(mo1/L),n=Ag/Ag'。然后兩兩比較,得出6個(gè)K值,計(jì)算6個(gè)K值的均數(shù)為最終結(jié)果。經(jīng)計(jì)算得出12H23的親和常數(shù)為3.8X10'"L/m。1,解離常數(shù)Kd值為2.6X10—"mol/L。實(shí)施例4:單克隆抗體的結(jié)合表位分析4.1重組蛋白制備用常規(guī)方法,分別構(gòu)建EGFR胞外區(qū)的S1結(jié)構(gòu)域,S2結(jié)構(gòu)域以及S1結(jié)構(gòu)域其中的VK21多肽與M13噬菌體的pIII蛋白的N12蛋白結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)(按照方法同l.l進(jìn)行),同時(shí)以EGFRvIII胞外區(qū)重組蛋白作為陽性對照(圖9)。電泳結(jié)果表明,制得了各重組蛋白rN12-Sl,rN12-S2,EGFRvIIIex,rN12-VK21(圖10)。4.2ELISA法測定12H23結(jié)合表位重組蛋白rN12-Sl,rN12-S2,EGFRvIIIex,rN12-VK21分別用包被緩沖液(Na.HCO,pH9.6)稀釋為1.0mg/L,依次加入ELISA微孔板中,每孔100uL,4'C包被24小時(shí),棄去包被液,PBS洗一次,加入含5%脫脂奶粉PBS350wL封閉過夜,PBS洗2次;分別加入初始濃度為lmg/L的12H23單抗,37'C結(jié)合1小吋,PBS洗3次,力PHRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100ixL,37t:結(jié)合l小時(shí),PBS洗5次,加ABTS底物顯色15分鐘,酶標(biāo)儀測定405nm吸光度值。結(jié)果ELISA結(jié)果如圖11所示。抗體12H23能夠與EGFRvIII,rN12-Sl及rN12-VK21結(jié)合。根據(jù)結(jié)構(gòu)及序列推斷,12H23結(jié)合的區(qū)域應(yīng)為這些蛋白的共有區(qū)域即VK21。VK21的多肽序列為VRACGADSYEMEEDGVRKCKK(SEQIDNO:11)。實(shí)施例5:單克隆抗體的體內(nèi)抑制腫瘤生長能力1)將3Xl(/'個(gè)常規(guī)的Huh7-EGFRvIII腫瘤細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了pLRNL的HuH-7肝癌細(xì)胞系,Huh-7可購自美國ATCC細(xì)胞庫)分別注射在18只Balb/c裸鼠右側(cè)肩胛皮下。2)數(shù)天后,當(dāng)皮下成瘤體積約80100mni3時(shí),腹腔分別注射C225抗體和12H23抗體,每只裸鼠注射抗體劑量為0.5mg,同時(shí)注射PBS作為陰性對照,每組6只裸鼠。3)之后每隔一天腹腔注射抗體一次,共持續(xù)2周。4)注射抗體的同時(shí),測量腫瘤體積的大小,每隔一天測量一次,抗體注射停止后繼續(xù)測量腫瘤體積2周。腫瘤體積的大小按以下公式來計(jì)算腫瘤體積-瘤長X瘤寬725)觀察腫瘤的生長情況。結(jié)果12H23對Huh-EGFRvIII的裸小鼠種植瘤有明顯的抑制作用(達(dá)約70%,而且,其抑制率也比C225抗體強(qiáng)(圖12)。實(shí)施例6單克隆抗體的序列確定川5'RACE法克隆5'序列未知的基因,其步驟簡單如下(具體操作按Takara5'-fullRACEKit說明書)1)用堿性磷酸酶(CIAP)對總RNA中暴露的5'磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸反應(yīng)??俁NA用量為2ug,反應(yīng)后酚氯仿抽提回收。2)用TobaccoAcidPyrophosphatase(TAP)去掉mRNA白勺5'巾冒子結(jié)構(gòu),保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。3)用T4RNA連接酶把5'RACEAdaptor連接到mRNA上,反應(yīng)后酚氯仿抽提回收。4)用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),所用引物為Kit提供的隨機(jī)9聚體引物。5)以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,用高保真酶擴(kuò)增目的基因。所用引物為5,5'RACEOuterPrimer(CATGGCTACATGCTGACAGCCTA)(SEQIDNO:12)3':重鏈CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT(SEQIDNO:13)輕鏈ACACGACTGAGGCACCTCCA(SEQIDNO:14)6)以上述PCR產(chǎn)物為模板,進(jìn)行巢式PCR。所用引物為5':5'RACEInnerPrimer(CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG)(SEQIDNO:15)3':重鏈CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT(SEQIDNO:16)輕鏈TGGATGGTGGGAAGATGGATACA(SEQIDNO:17)7)TA克隆,測序。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例71.含抗體可變區(qū)編碼序列的人鼠嵌合抗體表達(dá)載體的克隆構(gòu)建抗體重鏈表達(dá)載體pH,分別包含hCMV啟動(dòng)子,重鏈可變區(qū)克隆位點(diǎn)NheI和ApaI和人IgGl的重鏈穩(wěn)定區(qū),IRES核糖體插入位點(diǎn),二氫葉酸還原酶基因(DHFR)以及氨節(jié)抗性基因(見圖15A)。構(gòu)建抗體輕鏈表達(dá)載體pK,分別包含hCMV啟動(dòng)子,輕鏈可變區(qū)克隆位點(diǎn)EcoRV和BsiWI和人IgGl的輕鏈穩(wěn)定區(qū),IRES核糖體插入位點(diǎn),二氫葉酸還原酶基因(DHFR)以及氨芐抗性基因(見圖15B)?;趯?shí)施例6測定的輕鏈和重鏈序列,人工合成重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列,并且在重鏈編碼序列兩端添加Nhe工和ApaI酶切位點(diǎn),在輕鏈編碼序列的兩端添加EcoRV和BsiWI酶切位點(diǎn)。用Nhel和Apal酶切重鏈可變區(qū)編碼序列,用EcoRV和BsiW工酶切輕鏈可變區(qū)編碼序列。然后將上述重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列插入到表達(dá)載體pH和pK中構(gòu)建嵌合抗EGFRvIII的抗體基因的表達(dá)載體。2.CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選上述構(gòu)建的帶有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入在大腸桿菌DH5a菌株,然后接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增,用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒(UltrapurePlasmidDNAPurificationKit)抽提純化質(zhì)粒DNA。將上述純化的質(zhì)粒DNA采用Irwitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,操作參照廠家的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的CH0細(xì)胞在濃度逐步提高的MTX選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)9周的培養(yǎng),最后在96孔板上進(jìn)行梯度稀釋培養(yǎng),連續(xù)進(jìn)行3次,進(jìn)行單克隆化。挑出的單克隆細(xì)胞系在RPM1640培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),對上清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn),根據(jù)顯色反應(yīng)判斷表達(dá)結(jié)合強(qiáng)度,經(jīng)測定這些克隆也具有與rEGFRvIII抗原特異結(jié)合活性(見圖16),挑選出多個(gè)表達(dá)強(qiáng)的克隆作為候選細(xì)胞株,從而制備嵌合抗體,所獲得抗體命名為CH12。實(shí)施例8偶聯(lián)物的制備將嵌合單抗CH12直接與G喉毒素(購自武漢生物制品研究所)以共價(jià)鍵結(jié)合。一旦向Huh7-EGFRvIII的細(xì)胞中加入結(jié)合物,便觀察到特異的細(xì)胞毒性。不表達(dá)EGFRvIII的Huh7細(xì)胞僅在當(dāng)暴露于非常高濃度的抗體時(shí)才被殺傷。實(shí)施例9注射液的制備取實(shí)施例5制備的抗體12H23或?qū)嵤├?制備嵌合單抗CH12,加入注射用生理鹽水,混勻后用0.22uM的無菌過濾器除菌,將注射液分裝在小瓶中(50ral/瓶),包裝好備用,其中每50ml注射溶液含單抗50mg。應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。參考文獻(xiàn)1)UllrichA.etal.HumanEpidermalGrowthFactorReceptorcDNASequenceandAberrantExpressionoftheAmplifiedGeneinA431EpidermoidCarcinomaCells.Nature,1984,309:418-4252)Downwardetal.ClosesimilarityofEpidermalGrowthFactorReceptorandv-erbBoncogeneProteinSequence.Nature1984,307:521-527,3)Libermannetal.Amplification,EnhancedExpressionandPossibleRearrangementofEGFReceptorGeneinPrimaryHumanBrainTumorsofGlialOrigin.Nature1985,313:144-1474)Wongetal.IncreasedExpressionoftheEpidermalGrowthFactorReceptorGeneinMalignantGliomasisInvariablyAssociatedwithGeneAmplification.Proc.Natl.Acad.Sci,USA.1987,84:6899-6卯3.5)Yamazakietal.AmplificationoftheStructurallyandFunctionallyAlteredEpidermalGrowthFactorReceptorGene(c-erbB)inHumanBrainTumors.MolecularandCellularBiology1988,8:1816-1820.6)Maidenetal.SelectiveAmplificationoftheCytoplasmicDomainoftheEpidermalGrowthFactorReceptorGeneinGlioblastomaMultifome.CancerResearch1988(4):2711-2714。7)ModjtahediH,andDeanC.ThereceptorforEGFanditsligandsExpression,prognosticvalueandtargetfortherapyincancer.InternationalJournalofOncology1994(4):277-296。8)FungYKT,etal.ActivationoftheCellularOncogenec-erbBbyLTRInsertion:MolecularBasisforInductionofErythroblastosisbyAvianLeukosisVims.Cell1983,33:357-3689)Yamamotoetal.ANewAvianErythroblastosisVirus,AEV-HCarrieserbBGeneResponsiblefortheInductionofBothErythroblastosisandSarcoma,Cell1983,34:225-23210)Nilsenetal.c-erbBActivationinALV-InducedErythroblastosis:NovelRNAProcessingandPromoterInsertionResultsinExpressionofanAmino-TruncatedEGFReceptor.Cell1985,41:719-72611)Gammettetal.DifferencesinSequencesEncodingtheCarboxy-TerminalDomainoftheEpidermalGrowthFactorReceptorCorrelatewithDifferencesintheDiseasePotentialofViralerbBGenes,"Proc.Natl,Acad,Sci.USA83:6053-6057(1986)12)Gilmoreetal.ProteinPhosphorylationatTyrosineisInducedbythev-erbBGeneProductinVivoandinVitro.Cell,1985,40:609-618,(1985)13)Krisetal.AntibodiesAgainstaSyntheticPeptideasaProbefortheKinaseActivityoftheAvianEGFReceptorandv-erbBProtein.Cell,40:619-625(1985;)14)Nilsenetal.c-erbBActivationinALV-InducedErythroblastosis:NovelRNAProcessingandPromoterInsertionResultsinExpressionofanAmino-TruncatedEGRReceptor.Cell,1985,41:719-72615)Rainesetal.c-erbBActivationinAvianLeukosisVirus-InducedErythroblastosis:ClusteredIntegrationSitesandtheArrangementofProvirusinthec-erbBAlleles.Proc.Natl.Acad,Sci.USA,1985,82:2287-229116)Pelleyetal.Proviral-Activatedc-erbBisLeukemogenicbutnotSarcomagenic:CharacterizationofaReplication-CompetentRetrovirusContainingtheActivatedc-erbB,JournalofVirology1988,62:1840-184417)Wellsetal.GeneticDeterminantofNeoplasticTransformationbytheRetroviralOncogenev-erbB.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988,85:7597-760118)Yamazakietal.Amplification,EnhancedExpressionandPossibleRearrangementofEGFReceptorGeneinPrimaryHumanBrainTumoursofGlialOrigin,Nature1985,313:144-147;19)WikstrandCJ,etal.MonoclonalantibodiesagainstEGFRvIIIaretumorspecificandreactwithbreastandlungcarcinomasmalignantgliomas.CancerResearch1995,55(14):3140-314820)Olapade-OlaopaEO,etal.EvidenceforthedifferentialexpressionofavariantEGFreceptorproteininhumanprostatecancer,BrJCancer,2000,82(1):186-9421)GeH,etal.EvidenceofHighincidenceofEGFRvIIIexpressionandcoexpressionwithEGFRinhumaninvasivebreastcancerbylasercapturemicrodissectionandim則nohistochemicalanalysis,IntJcancer.2002,98(3》357-6122)MoscatelloG.,etal.Frequentexpressionofamutantepidermalgrowthfactorreceptorinmultiplehumantumors.CancerRes.55(23》5536-9(l,995)23)Gar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ttt<400〉17tggatggtgggaagatggataca<210〉<211〉〈212〉〈213〉權(quán)利要求1.一種單克隆抗體VH鏈,其特征在于,它的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQIDNO5所示的CDR1,SEQIDNO6所示的CDR2,SEQIDNO7所示的CDR3。2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體VH鏈,其特征在于,它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.—種單克隆抗體VJ連,其特征在于,它的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列-SEQIDN0:8所示的CDR1,SEQIDNO:9所示的CDR2,SEQIDNO:10所示的CDR3。4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體V,.鏈,其特征在于,它具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。5.—種單克隆抗體或其偶聯(lián)物,其特征在丁,其VH鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列,且其VJ連分別具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。6.如權(quán)利要求5所述的單克隆抗體,其特征在于,所述的抗體是鼠源抗體、人源化抗體、或嵌合抗體。7.—種DNA分子,其特征在于,它編碼選自下組的蛋白質(zhì)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體VH鏈;權(quán)利要求3所述的單克隆抗體VL鏈;權(quán)利要求5所述的單克隆抗體。8.如權(quán)利要求7所述的DNA分子,其特征在于,它具有選自下組的DNA序歹ij:SEQIDNO:1、3、11或13。9.一種藥物組合物,其特征在于,它含有單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體,所述單克隆抗體的VH鏈和VL鏈分別具有SEQIDNO:5-7和SEQIDNO:8-10所不的互補(bǔ)決定區(qū);更佳地,所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列,且其V,J連分別具有SEQIDNO:4所不的氨基酸序列。10.—種權(quán)利要求5所述的單克隆抗體或其偶聯(lián)物的用途,其特征在于,用于制備組合物,所述的組合物用于(a)抑制或殺滅表達(dá)表皮生長因子受體突變體III的細(xì)胞的生長;或(b)抑制與過量表達(dá)表皮生長因子受體的細(xì)胞生長。全文摘要本發(fā)明涉及特異性結(jié)合蛋白及其使用。具體地,本發(fā)明提供了一種單克隆抗體,該單克隆抗體可與表皮生長因子受體突變體III(EGFRvIII)有效結(jié)合或與細(xì)胞過量表達(dá)的表皮生長因子受體(EGFR)部分結(jié)合,但與細(xì)胞正常表達(dá)的EGFR沒有結(jié)合作用。此外,本發(fā)明抗體對表達(dá)EGFRvIII的腫瘤細(xì)胞系有明顯的治療作用。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體的制備方法以及含有所述單克隆抗體的藥物組合物。文檔編號C12N15/13GK101602808SQ200810038848公開日2009年12月16日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日發(fā)明者李宗海,楊勝利,王華茂,石必枝,華蔣,顧健人申請人:上海市腫瘤研究所