專(zhuān)利名稱(chēng)：靶核苷酸序列的檢測(cè)方法、檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)及制法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法、通過(guò)該方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)、使用該結(jié)構(gòu)的靶核苷酸序列檢測(cè)方法、檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒、以及靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒。
背景技術(shù)：
為了檢測(cè)含有特定核酸序列的核酸鏈，一般都采用以下那樣的手段。那樣的方法，例如使用與檢測(cè)對(duì)象的核酸鏈互補(bǔ)的1對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增后，通過(guò)電泳檢測(cè)其存在的檢測(cè)方法、使用與檢測(cè)對(duì)象互補(bǔ)的靶核苷酸序列的核酸鏈作為核酸探針固定化的基體，進(jìn)行雜交的方法。另外，一般來(lái)說(shuō)，在這些檢測(cè)中使用的引物或核酸探針是具有15個(gè)堿基左右以上連續(xù)的特異序列的寡核苷酸。然而，那樣的寡核苷酸即使利用已有的引物或核酸探針設(shè)計(jì)軟件等可以進(jìn)行設(shè)計(jì)，但在反應(yīng)體系中在靶核苷酸序列中存在高級(jí)結(jié)構(gòu)，或存在部分類(lèi)似的序列的情況多。這樣的場(chǎng)合下，會(huì)引起錯(cuò)誤退火、自雜交等。象這樣的以往方法，要高精度、高效率地檢測(cè)目的靶核苷酸序列是不容易的。另外，為了設(shè)定最適檢測(cè)條件，必須要花費(fèi)許多時(shí)間和費(fèi)用。
例如，作為高靈敏度而且高效率地檢測(cè)核酸序列的方法，到目前為止提出了“雜交法”(參照特開(kāi)平6-70799號(hào)公報(bào))和“利用部分雙鏈DNA的DNA檢測(cè)方法”(參照特開(kāi)平11-332566號(hào)公報(bào))等。這些方法是在使含有與要檢測(cè)的靶核酸一部分區(qū)域互補(bǔ)的序列的核酸探針和該靶核酸進(jìn)行雜交時(shí)，在該雜交反應(yīng)前和雜交反應(yīng)時(shí)，添加與上述核酸探針的結(jié)合部位以外的靶核酸的序列互補(bǔ)的核酸鏈，退火后在一部分形成雙鏈的方法。這些方法目的在于通過(guò)在任一個(gè)靶核酸的序一部分形成雙鏈的方法。這些方法目的在于通過(guò)在任一個(gè)靶核酸的序列上，將核酸探針識(shí)別的區(qū)域做為一條鏈，而將剩下的區(qū)域做成雙鏈，防止非特異的雜交。
然而，在上述方法中，實(shí)際使用時(shí)還存在很多要解決的問(wèn)題點(diǎn)。那樣的一些問(wèn)題就象下面所示的那樣。
(1)由于必須要以單鏈狀態(tài)制備“靶核酸”和“保護(hù)鏈”兩種分子，所以工序數(shù)變多；(2)靶核苷酸序列的設(shè)計(jì)被限定。為了避免非特異性雜交，在雜交反應(yīng)液中希望除了核酸探針之外只存在游離的單鏈核酸分子。然而，在對(duì)靶核酸和保護(hù)鏈進(jìn)行退火時(shí)，由于在液體中依靠分子運(yùn)動(dòng)使得長(zhǎng)的核酸之間結(jié)合，受到分子內(nèi)高級(jí)結(jié)構(gòu)等影響，不能進(jìn)行理想的雜交，所以雜交的效率顯著低下的情形很多。為了防止這種現(xiàn)象，靶核苷酸序列的設(shè)計(jì)就受到限定了；(3)靶核酸作出需要花費(fèi)很多時(shí)間。這是由于例如從使保護(hù)鏈和靶核酸之間形成正確堿基對(duì)的目的考慮，就必須花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行退火反應(yīng)的工序；(4)特別是“利用部分雙鏈DNA的DNA檢測(cè)方法”(參照特開(kāi)平11-332566號(hào)公報(bào))，需要使用非對(duì)稱(chēng)PCR作出靶鏈和保護(hù)鏈。因此，即使解決了上述(2)的問(wèn)題可以做到定性分析，也不能適應(yīng)社會(huì)需要的高定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法、通過(guò)該方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)、使用該結(jié)構(gòu)的靶核苷酸序列檢測(cè)方法、檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒、以及靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒。
本發(fā)明為了解決上述課題，發(fā)現(xiàn)了以下手段。
如果按照本發(fā)明的第1個(gè)方面，作為對(duì)靶核苷酸序列檢測(cè)有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法，提供包括在可獲得的適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下使與位于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)的序列互補(bǔ)的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與其互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
如果按照本發(fā)明的第2個(gè)方面，作為對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法，提供包括在可獲得的適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下使與位于靶核酸的5’端附近的靶核苷酸序列3’端以外的3’側(cè)的序列互補(bǔ)，而且在3’末端含有不可延伸的修飾的終止核酸，與靶核酸的3’端附近的序列互補(bǔ)的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與該靶核酸互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
如果按照本發(fā)明的第3個(gè)方面，作為對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法，提供包括在可獲得的適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下使與位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)的序列互補(bǔ)的第1引物，與位于第1靶核酸互補(bǔ)的第2靶核苷酸序列的5’端附近的第2靶核苷酸序列的3’端以外的3’側(cè)的序列互補(bǔ)、而且在3’末端含有不可延伸的修飾的終止核酸，與第2靶核酸的3’端附近的序列互補(bǔ)的第2引物，具有核苷酸延伸活性的酶和第1以及第2靶核酸反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與其互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
如果按照本發(fā)明的第4個(gè)方面，作為對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法，提供包括在可獲得的適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下使與位于靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)的序列互補(bǔ)的第1引物，與位于上述靶核酸的5’端附近的第2靶核苷酸序列3’端以外的3’側(cè)的序列互補(bǔ)，而且在3’末端含有不可延伸的修飾的終止核酸，具有核苷酸延伸活性的酶和前述靶核酸反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與其互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
如果按照本發(fā)明的第5個(gè)方面，作為對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法提供包括在可獲得的適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下使含有3’端附近的第1靶核苷酸序列、存在于第1靶核苷酸序列以外的5’側(cè)的第2靶核苷酸序列、存在于第2靶核苷酸序列以外的5’側(cè)的第3靶核苷酸序列、5’端附近的第4靶核苷酸序列的靶核酸中的、第1、第2以及第3靶核苷酸序列的各個(gè)5’端以外的5’側(cè)的各個(gè)序列互補(bǔ)的第1、第2以及第3引物，與存在于第2、第3以及第4靶核苷酸序列的3’端以外的3’側(cè)的各個(gè)序列具有互補(bǔ)性、而且在3’末端含有不可延伸的修飾的第1、第2以及第3的終止核酸，具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分、在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與其互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
如果按照本發(fā)明的第6個(gè)方面，作為對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法提供(1)包括在可獲得的適當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下使至少含有由與處于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列、以及由與上述靶核酸的5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列的第1引物；與上述靶核酸的5’端附近的序列具有同源性，在5’端含有核酸分解酶抗性核酸的第2引物；具有核苷酸延伸活性的酶；由該靶核酸和其互補(bǔ)鏈構(gòu)成的雙鏈核酸核酸反應(yīng)，(2)利用能夠分解上述分解酶非抗性核酸的核酸分解酶對(duì)通過(guò)上述(1)反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，通過(guò)上述反應(yīng)，獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與其互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
如果按照本發(fā)明的第7個(gè)方面，作為對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法提供(1)包括在可獲得的適當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使至少含有由與位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列互補(bǔ)、而且核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列，以及與位于第1靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列的第1引物，至少含有與處于第2靶核酸的3’端附近的第2靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列、以及由與第2靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列的第2引物，具有核苷酸延伸活性的酶和由該第1靶核酸和第2靶核酸構(gòu)成的雙鏈核酸反應(yīng)，(2)利用核酸分解酶對(duì)通過(guò)上述(1)反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，通過(guò)上述反應(yīng)獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與其互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
按照本發(fā)明的第8個(gè)方面，作為檢測(cè)靶核苷酸序列的方法，提供具備如下工序的方法(1)通過(guò)使用前述第1至7任一方面的方法，根據(jù)樣品中的靶核酸制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，(2)在可獲得的適當(dāng)雜交條件下，使與上述靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸探針與上述(1)制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)反應(yīng)，(3)通過(guò)對(duì)利用上述(2)中反應(yīng)產(chǎn)生的雜交進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)上述靶核苷酸序列的存在。
如果按照本發(fā)明的第9個(gè)方面，提供通過(guò)第1至7任一方面的方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。
如果按照本發(fā)明的第10個(gè)方面，提供靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒，該試劑盒為了實(shí)施上述第8個(gè)方面所述的檢測(cè)方法，具備引物、具有核苷酸延伸活性的酶、終止核酸、核酸擴(kuò)增用酶、核酸分解酶以及由第9方面的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)中選擇出來(lái)的至少一種構(gòu)成要素。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是表示本發(fā)明概要的圖。
圖2是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第1例的圖。
圖3是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第2例的圖。
圖4是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第3例的圖。
圖5是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第4例的圖。
圖6是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第5例的圖。
圖7是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第6例的圖。
圖8是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第7例的圖。
圖9是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第8例的圖。
圖10是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第9例的圖。
圖11是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第10例的圖。
圖12是表示本發(fā)明一個(gè)方式的第11例的圖。
圖13是表示在實(shí)施例1中，使用基于本發(fā)明的方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的圖。
圖14是表示在實(shí)施例2中，使用基于本發(fā)明的方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的圖。
圖15是表示在實(shí)施例5中使用的本發(fā)明的一個(gè)例子的圖。
圖16是表示在實(shí)施例6中使用的本發(fā)明的一個(gè)例子的圖。
圖17是表示在實(shí)施例7中，使用基于本發(fā)明的方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
1.發(fā)明的簡(jiǎn)要說(shuō)明如果按照本發(fā)明的方式，可以提供由圖1所示那樣的靶核酸1制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。靶核酸1在其一部分含有靶核苷酸序列2(圖1A)。具體來(lái)說(shuō)，如果按照本發(fā)明的方法，使用引物進(jìn)行核酸的延伸，制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)4(圖1B)，使得靶核酸(1)的靶核苷酸序列2以外的部分形成雙鏈。即基于本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法基本來(lái)說(shuō)是具備使用以含有靶核苷酸序列2的靶核酸作為模板，進(jìn)行延伸反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)的方法。通過(guò)基于這樣的本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)4也是本發(fā)明的另一種方式。另外，利用基于本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。這樣的檢測(cè)方法例如就象圖1C所示那樣，可以利用與檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)4的靶核苷酸序列2互補(bǔ)的核酸探針5，使探針與靶核苷酸序列2反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)生成的雜交，可以檢測(cè)例如樣品中靶核苷酸序列存在，或含有靶核苷酸序列的靶核酸的存在。這樣的靶核苷酸序列的檢測(cè)方法也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
2.用語(yǔ)說(shuō)明這里使用的“樣品”只要是含有核酸的樣品，可以根據(jù)需要通過(guò)根據(jù)需要提取、擴(kuò)增以及純化等眾所周知的任何手段從含有包括人在內(nèi)的真核生物探取的組織以及細(xì)胞、原核生物、病毒、類(lèi)病毒等檢體制備，也可以是人工合成的核酸分子。
這里使用的“靶核苷酸序列”用語(yǔ)指的是要檢測(cè)的一個(gè)連續(xù)的序列。“靶核酸”指含有靶核苷酸序列的核酸，在一個(gè)靶核酸中也可以含有1個(gè)以上的靶核苷酸序列。這里使用的“核酸”用語(yǔ)是概括表示DNA、RNA、S-寡核苷酸、甲基磷酸酯寡核苷酸、PNA(即，肽核酸)和LNA(即，鎖定核酸)等核酸以及核酸類(lèi)似物、同時(shí)含有上述幾個(gè)核酸的核酸和核酸類(lèi)似物、以及他們的混合物等，是概括地表示一般可以用堿基序列表示其一部分結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的用語(yǔ)。而在本發(fā)明中使用的核酸既可以是天然存在的，也可以是人工合成的，或他們的混合物。這里使用的“核苷酸”指的是與構(gòu)成上述那樣核酸的一個(gè)堿基對(duì)應(yīng)的單位。另外，“寡核苷酸”指上述那樣人工合成的核酸片段，“寡DNA”指其中的DNA片段。
本發(fā)明中的“檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)”指的是在利用靶核苷酸序列和與其對(duì)應(yīng)的核酸探針的雜交進(jìn)行的靶核苷酸序列的檢測(cè)方法中，為了實(shí)際上使核酸探針結(jié)合，是指以樣品中含有的原靶核酸為基礎(chǔ)制造的制造物。特別是通過(guò)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列區(qū)域的靶核酸和與該靶核酸互補(bǔ)的保護(hù)鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。即所謂由本發(fā)明方法所提供的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)是具有含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分的特定結(jié)構(gòu)的核酸。另外，該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)也可以稱(chēng)之為“檢測(cè)用靶結(jié)構(gòu)核酸”和“靶結(jié)構(gòu)核酸”。
本發(fā)明中的“進(jìn)行延伸”和“進(jìn)行延伸反應(yīng)”同義，指的是在對(duì)模板核酸合適的條件下，使用引物和核酸合成酶，使核酸延伸之后形成模板核酸的互補(bǔ)鏈。另外，本發(fā)明中的“進(jìn)行擴(kuò)增”和“進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)”是同義，指的是具備在對(duì)模板核酸合適的條件下，使用引物和核酸合成酶，使核酸延伸之后形成模板核酸的互補(bǔ)鏈，生成雙鏈；和通過(guò)對(duì)得到的雙鏈進(jìn)行變性或鏈的置換反應(yīng)等給出單鏈；和用得到的單鏈為模板，在適當(dāng)條件下使用引物和核酸合成酶，再度進(jìn)行核酸延伸形成模板核酸的互補(bǔ)鏈后生成雙鏈的反應(yīng)。換言之，所謂“擴(kuò)增”指的是在前后的延伸反應(yīng)之間向單鏈變換時(shí)，重復(fù)進(jìn)行2次以上的延伸反應(yīng)。
這里使用的“可獲得的適當(dāng)延伸條件”指的是存在要延伸的核酸和引物、具有核苷酸延伸活性的酶、延伸時(shí)可整合的核酸合成底物以及延伸反應(yīng)必需的輔酶等，而且適當(dāng)控制溫度以及pH等諸條件，目的核酸可延伸的條件。另外，這里使用的“可獲得的適當(dāng)擴(kuò)增條件”指的是存在要延伸的核酸和引物、具有核苷酸延伸活性的酶、延伸時(shí)可整合的核酸合成底物以及延伸反應(yīng)必需的輔酶等，而且適當(dāng)控制溫度以及pH等諸條件的條件下延伸反應(yīng)至少重復(fù)進(jìn)行2次以上，目的核酸可擴(kuò)增的條件。
本發(fā)明中的“保護(hù)鏈”是在基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法中，是以靶核酸作為模板形成的核酸，是與靶核苷酸序列不同的部分靶核酸的序列互補(bǔ)的序列。由于該保護(hù)鏈的存在，可以防止由于核酸探針或其他核酸或其靶核酸本身結(jié)合靶核苷酸序列以外的部位引起沒(méi)有預(yù)料的雙鏈或立體結(jié)構(gòu)的形成。
這里使用的“對(duì)雜化體進(jìn)行檢測(cè)”和“對(duì)結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)”是同義，表示在可獲得的適當(dāng)雜交條件下，就多個(gè)核酸進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，如果在這多個(gè)核酸中存在至少1組互補(bǔ)鏈，對(duì)得到的雜交體或結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。這樣的雜化體或結(jié)合通過(guò)對(duì)在該互補(bǔ)鏈中的預(yù)先附加的至少某一個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，也可以完成檢測(cè)，利用對(duì)存在于雜化體中的結(jié)合有選擇結(jié)合的插入劑也可以進(jìn)行檢測(cè)。另外，即使是在可獲得的適當(dāng)雜交條件下就多個(gè)核酸進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，如果在該多個(gè)核酸中不存在互補(bǔ)鏈，就不能得到雜化體。這里使用的“可獲得的適當(dāng)雜交條件”指的是在某一個(gè)反應(yīng)體系中如果存在相互具有互補(bǔ)性的核酸鏈，通過(guò)進(jìn)行反應(yīng)可得到雜交的條件，例如，只要是嚴(yán)格的條件就可以。
3.檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(I)通過(guò)調(diào)節(jié)引物的結(jié)合位置，制造所期望的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法以下的第1例至第3例是以在3’端附近含有的靶核苷酸序列的靶核酸為基礎(chǔ)制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。這些例子是對(duì)引物與靶核酸的結(jié)合位置進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法。
(1)第1例利用圖2對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第1例進(jìn)行說(shuō)明。靶核酸21在3’端附近含有靶核苷酸序列22(圖2A)。使引物23與靶核酸21中的靶核苷酸序列22的位置以外的5’側(cè)(即，靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè))的序列結(jié)合，在可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下對(duì)核酸進(jìn)行延伸(圖2B)。通過(guò)延伸反應(yīng)形成與靶核酸21互補(bǔ)的保護(hù)鏈24，得到具有雙鏈核酸部分和含有靶核苷酸序列的單鏈核酸部分的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)25(圖2B)。
通過(guò)基于這樣的本發(fā)明方式的反應(yīng)得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)25就象圖2C表示的那樣，可以在使用核酸探針26的靶核苷酸序列的檢測(cè)中利用。通過(guò)核酸探針26與靶核苷酸序列22的結(jié)合可以進(jìn)行靶核苷酸序列22或靶核酸21的檢測(cè)。
這里使用的引物可以是任一種核酸，其長(zhǎng)度為了獲得對(duì)實(shí)施者選擇的引物特異的雜交要有充分的長(zhǎng)度。例如，獲得這樣特異雜交的長(zhǎng)度的例子為5個(gè)堿基長(zhǎng)度以上就可以，優(yōu)選是9個(gè)堿基以上。
這里可使用的延伸反應(yīng)只要是引物23在以靶核酸21為模板合成核酸之后可以形成含有保護(hù)鏈24的雙鏈的條件下進(jìn)行就可以。這樣的條件只要是有具有核苷酸延伸活性的酶、延伸時(shí)整合的核酸合成底物、以及延伸反應(yīng)所必需的輔酶等存在，而且溫度以及pH等諸條件被適當(dāng)控制的條件就可以。在本發(fā)明中可以使用的酶，例如只要是具有由5’向3’方向?qū)⒑怂徭溠由斓幕钚缘拿妇涂梢浴Ｔ诒菊f(shuō)明書(shū)中有時(shí)將「將核酸鏈延伸的活性”略稱(chēng)為「核苷酸延伸活性”。例如，只要是核酸合成酶就可以，無(wú)論是DNA聚合酶和RNA聚合酶等聚合酶，還是逆轉(zhuǎn)錄酶都可以。而適當(dāng)?shù)臏囟鹊目刂瓶梢酝ㄟ^(guò)加熱器等其本身眾所周知的手段，對(duì)實(shí)施者以靶核酸21和引物23的序列、酶種類(lèi)等為基礎(chǔ)選擇的溫度控制。而，pH的控制可以利用pH控制等眾所周知的手段通過(guò)鹽的種類(lèi)、鹽的組合和濃度等控制。而延伸時(shí)整合的核酸合成底物可以是一般使用的眾所周知的核酸合成底物類(lèi)。詳細(xì)的條件實(shí)施者可以根據(jù)使用的酶、序列以及核酸的種類(lèi)等進(jìn)行選擇。
本發(fā)明中使用的靶核苷酸序列22只要是實(shí)施者想要檢測(cè)的序列就可以，長(zhǎng)度可以為5堿基～300堿基、優(yōu)選是9堿基～50堿基。
另外，在本說(shuō)明書(shū)中使用的所謂“3’端附近”表示從位于靶核酸最3’端的堿基到大約第A位的堿基，下面敘述中使用的所謂「5’端附近”表示從位于5’端的堿基到大約第A位的堿基。例如，當(dāng)靶核苷酸序列存在于3’端附近時(shí)，既可以含有位于最3’端的堿基，也可以不含有該堿基。這里的“A”是作為問(wèn)題的靶核苷酸序列的堿基數(shù)的二分之一的長(zhǎng)度。即A＝(靶核苷酸序列的堿基數(shù))/2優(yōu)選基于以上那樣本發(fā)明方式的方法可以象以下那樣進(jìn)行。即，將具有與存在于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列的5’側(cè)鄰接或存在于靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)的9堿基以上的序列互補(bǔ)的序列的核酸構(gòu)成的引物、核酸合成酶添加到含有該靶核酸的樣品中，以靶核酸作為模板進(jìn)行延伸反應(yīng)。通過(guò)該反應(yīng)制造含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。
在制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)時(shí)，該樣品必需含有靶核酸，但也未必只含有靶核酸，也可以還含有其他核酸。為了進(jìn)行基于本發(fā)明方式的反應(yīng)，樣品中的靶核酸的量為樣品中含有的核酸整體量的約3％以上，更優(yōu)選10％以上，最優(yōu)選是在20％以上。另外根據(jù)需要，在實(shí)施本發(fā)明的方法之前，也可以通過(guò)其本身公知的任一擴(kuò)增手段對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增手段的例子可以是PCR擴(kuò)增、以及Nucleic acid strandamplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacementamplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic acids(ICANN)和Rolling circleamplification(RCA)法、Loop mediated amplification(LAMP)法等。
在上述那樣的本發(fā)明的方式中，通過(guò)靶核酸中的引物結(jié)合部位可以決定作為結(jié)果得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分的邊界。在該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)中，雖然在靶核苷酸序列的兩側(cè)可以存在直至大約100堿基的單鏈的核苷酸，但優(yōu)選是只有靶核苷酸序列為單鏈。
通過(guò)基于上述那樣本發(fā)明方式的方法，可以通過(guò)很少工序自由進(jìn)行靶核苷酸序列的設(shè)計(jì)，而且可以在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。因此，經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(2)第2例利用圖3對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第2例進(jìn)行說(shuō)明。在上述的第1例中，靶核酸是單鏈，但在第2例中，給出了使用雙鏈靶核酸的例子。
參照?qǐng)D3。首先準(zhǔn)備雙鏈靶核酸31。靶核酸31包括第1靶核酸31a和在3’端附近含有靶核苷酸序列32的第2靶核酸31b(圖3A)。
在獲得的適當(dāng)延伸條件下，向靶核酸31中添加第1引物33a和第2引物33b，進(jìn)行延伸反應(yīng)(圖3B和C)。結(jié)果得到第1延伸產(chǎn)物雙鏈36(圖3B)和第2延伸產(chǎn)物檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)35(圖3C)。得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)35包含含有靶核苷酸序列32的單鏈核酸部分以及不含有靶核苷酸序列的第2靶核酸31b和保護(hù)鏈34b的雙鏈核酸部分。
而在第2例中所謂可獲得的適當(dāng)延伸條件還具備引物33a和b對(duì)靶核酸31進(jìn)行適當(dāng)結(jié)合。例如，在進(jìn)行延伸之前，也可以通過(guò)眾所周知的變性手段、例如熱、堿和添加鹽等手段使雙鏈的靶核酸31解離為單鏈。
基于以上本發(fā)明方式的第2例除了靶核酸是雙鏈以外，其他可以與第1例同樣實(shí)施。而第2例中使用的反應(yīng)條件以及靶核酸、引物和檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的各個(gè)條件也可以根據(jù)第1例進(jìn)行變更。
在使用核酸探針37的靶核苷酸序列的檢測(cè)中可以利用通過(guò)上述延伸反應(yīng)得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)35(圖3D)。例如，與第1例所述的方法同樣，通過(guò)核酸探針36對(duì)靶核苷酸序列32的結(jié)合可以進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。因此，經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(3)第3例利用圖4對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第3例進(jìn)行說(shuō)明。在第2例中，由雙鏈靶核酸31得到了一個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)35，而在第3例中可以由雙鏈靶核酸41得到2個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)45a和45b。除此之外，可以通過(guò)與第2例同樣的步驟實(shí)施第3例。
參照?qǐng)D4。雙鏈靶核酸41包括在3’端附近含有第1靶核苷酸序列42a的第1靶核酸41a和在3’端附近含有第2靶核苷酸序列42b的第2靶核酸41b(圖4A)。
在可獲得的適當(dāng)延伸條件下，向靶核酸41添加第1引物43a和第2引物43b，進(jìn)行延伸反應(yīng)(圖4B)。結(jié)果得到作為第1延伸產(chǎn)物的第1檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)45a和作為第2延伸產(chǎn)物的第2檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)45b(圖4B)。各個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)45a和b包含含有靶核苷酸序列42a或b的單鏈核酸部分以及含有靶核酸41a或b的一部分和與他們互補(bǔ)的保護(hù)鏈44a或b的雙鏈核酸部分。
基于以上那樣本發(fā)明方式的第3例除了由雙鏈靶核酸得到2個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)以外，其他可以與第2例同樣實(shí)施。因此，在第3例中可獲得的適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件、其他的在第3例可使用的反應(yīng)條件以及有關(guān)靶核酸、引物和檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的條件也可以是與上述的第2例中所述的條件同樣的條件，另外也可以與第2例同樣進(jìn)行種種變更。
通過(guò)該延伸反應(yīng)得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)45a和/或檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)45b可以在使用核酸探針46a和/或核酸探針46b的靶核苷酸序列的檢測(cè)中利用(圖4C)。例如可以與第1例所述的那樣方法同樣通過(guò)對(duì)核酸探針46a和/或b與靶核苷酸序列42a和/或b的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。因此，經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。另外根據(jù)第3例可以同時(shí)對(duì)2處的靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)。
(II)使用終止核酸的方法以下第4例至第6例是以5’端附近含有的靶核苷酸序列為基礎(chǔ)制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
(4)第4例利用圖5對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第4例進(jìn)行說(shuō)明。靶核酸51在5’端附近含有靶核苷酸序列52(圖5A)。首先在靶核酸51的3’端附近選擇用于引物53結(jié)合的序列。另外在靶核酸51中靶核苷酸序列52位置的3’側(cè)選擇用于結(jié)合終止核酸55的序列。終止核酸55的3’末端進(jìn)行了不能延伸的修飾，使得在3’側(cè)不能再進(jìn)行延伸。
終止核酸55在與靶核酸51的靶核苷酸序列52以外的3’側(cè)的部位結(jié)合存在的狀態(tài)下，使用與靶核酸51的3’端附近的序列結(jié)合的引物53，在可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下，由5’向3’方向使核酸延伸。結(jié)果形成保護(hù)鏈54(圖5B)。象上述那樣，終止核酸55的3’末端實(shí)施了使得不能接受進(jìn)一步延伸反應(yīng)的修飾。因此，從終止核酸55開(kāi)始不能再向前進(jìn)行延伸反應(yīng)。因此靶核酸51含有的靶核苷酸序列52維持著原來(lái)的單鏈。
這里使用的引物53可以是任一種核酸，其長(zhǎng)度為了獲得對(duì)實(shí)施者選擇的引物特異雜交要有充分的長(zhǎng)度。例如，獲得這樣特異雜交的長(zhǎng)度的例子可以象上述第1例所述的那樣。
這里可使用的終止核酸可以是任一種類(lèi)的核酸，為了特異結(jié)合于所希望的位置的序列，只要有充分長(zhǎng)度就可以。例如獲得這樣特異雜交的長(zhǎng)度的例子可以在5堿基長(zhǎng)度以上，優(yōu)選是9堿基長(zhǎng)度以上。終止核酸的3’末端的修飾只要是在3’側(cè)不能進(jìn)一步進(jìn)行延伸反應(yīng)的那樣修飾，可以實(shí)施任一種修飾。對(duì)此沒(méi)有限定，例如，可以使用3’末端的磷酸化和雙脫氧核苷酸等手段。另外也可以根據(jù)使用的具有核苷酸延伸活性的酶的種類(lèi)，選擇那些修飾的種類(lèi)。在圖5中，作為這樣修飾的一個(gè)例子，給出了終止核酸55的3’末端被磷酸化的例子。圖中這樣的修飾用圓圈標(biāo)記中“P”表示。
這里可使用的延伸反應(yīng)可以在引物53以靶核酸51為模板開(kāi)始核酸的延伸，形成含有保護(hù)鏈52的雙鏈的條件下進(jìn)行。這樣的條件只要是存在具有核苷酸延伸活性的酶、延伸時(shí)可整合的核酸合成底物以及延伸反應(yīng)必需的輔酶等，而且適當(dāng)控制溫度以及pH等諸條件就可以。本發(fā)明中使用的酶可以象上述第1例所述的那樣的酶。另外適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂埔约皃H的控制也可以象上述第1例所述那樣。
本發(fā)明中使用的靶核苷酸序列52只要是實(shí)施者要檢測(cè)的序列就可以，長(zhǎng)度可以為5堿基～300堿基、優(yōu)選是9堿基～50堿基。而靶核苷酸序列52存在于靶核酸51的5’端附近，無(wú)論是包含5’末端的堿基，還是不包含5’末端的堿基都可以。
基于以上那樣本發(fā)明方式的方法最好是象以下那樣進(jìn)行。即，將具有與存在于靶核酸的5’端附近的靶核苷酸序列的3’側(cè)鄰接或存在于靶核苷酸序列3’端以外的3’側(cè)的9堿基以上的序列互補(bǔ)的序列，而且該3’末端被修飾成羥基(-OH)以外官能團(tuán)的核酸終止核酸、與靶核酸3’端附近配列互補(bǔ)核酸的引物、核酸合成酶添加到含有該靶核酸的樣品中，以靶核酸作為模板進(jìn)行延伸反應(yīng)。通過(guò)該反應(yīng)可以制造具備單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。
而在上述的方法中，對(duì)該引物的延伸反應(yīng)合成與在靶核苷酸序列的檢測(cè)方法中使用的靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸探針序列同樣極性的保護(hù)鏈。
可以在使用核酸探針56的靶核苷酸序列的檢測(cè)中利用通過(guò)基于上述那樣本發(fā)明方式的反應(yīng)得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)57(圖5C)。核酸探針56與靶核苷酸序列52的結(jié)合可以通過(guò)上述第1例所述的手段進(jìn)行。
在上述那樣的本發(fā)明方式中，給出了用靶核酸作為模板，使用引物和終止核酸對(duì)核酸進(jìn)行延伸的方法。即，檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)中含有的單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分的邊界可以由通過(guò)選擇終止核酸的結(jié)合部位控制延伸反應(yīng)的停止位置來(lái)決定。通過(guò)這樣操作得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)靶核酸上的靶核苷酸序列的區(qū)域是單鏈，而其他區(qū)域變成雙鏈。
通過(guò)基于上述那樣本發(fā)明方式的方法，可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。因此，經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(5)第5例利用圖6對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第5例進(jìn)行說(shuō)明。在上述的第4例中，靶核酸51是單鏈，但在第5例中，使用雙鏈靶核酸。
參照?qǐng)D6。準(zhǔn)備雙鏈靶核酸61。靶核酸61包括在5’端附近含有靶核苷酸序列62的第1靶核酸61a和第2靶核酸61b(圖6A)。
首先，在靶核酸61a的3’端附近設(shè)定用于引物63結(jié)合的序列。另外在靶核酸61a的靶核苷酸序列62的3’端以外的3’側(cè)設(shè)定用于終止核酸65結(jié)合的序列。終止核酸65的3’末端被修飾，使得3’側(cè)不能進(jìn)一步向3’進(jìn)行延伸反應(yīng)。
終止核酸65處于與靶核酸61a的靶核苷酸序列62以外的3’側(cè)的序列結(jié)合存在的狀態(tài)，使用與靶核酸61a的3’端附近的序列結(jié)合的引物63a，與靶核酸61b的3’端附近的序列結(jié)合的引物63b，在可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下，由5’向3’方向使核酸延伸(圖6B)。通過(guò)延伸形成保護(hù)鏈64a和64b。
該延伸反應(yīng)后，得到以第1靶核酸61a為基礎(chǔ)的第1延伸產(chǎn)物檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)67，第2靶核酸61b為基礎(chǔ)的第2延伸產(chǎn)物雙鏈68。
第5例中的所謂可獲得的核酸適當(dāng)延伸條件還具備對(duì)于靶核酸61a和b，引物63a和b可進(jìn)行適當(dāng)結(jié)合。例如，在進(jìn)行延伸之前，也可以通過(guò)眾所周知的變性手段、例如熱、堿和添加鹽等手段使雙鏈的靶核酸61解離為單鏈。
基于以上本發(fā)明方式的第5例除了靶核酸是雙鏈以外，其他可以與第4例同樣實(shí)施。而第5例中使用的反應(yīng)條件、以及有關(guān)靶核酸、終止核酸、引物和檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的條件也可以根據(jù)第4例進(jìn)行變更。
在使用核酸探針69的靶核苷酸序列的檢測(cè)中可以利用通過(guò)上述延伸反應(yīng)得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)67(圖6C)。通過(guò)對(duì)與靶核苷酸序列62互補(bǔ)的核酸探針69與靶核苷酸序列62的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，可以進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。該結(jié)合的檢測(cè)可以通過(guò)與上述第1例同樣的方法進(jìn)行。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。因此，經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(6)第6例利用圖7對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第6例進(jìn)行說(shuō)明。在上述的第5例中，由雙鏈靶核酸61可以得到一個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)67，而在以下所述的第6例中由雙鏈靶核酸71含有的各個(gè)核酸71a和71b可以分別得到檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)76a和76b。除此之外，可以與第5例所述方法同樣實(shí)施第6例。
參照?qǐng)D7。雙鏈靶核酸71包括在5’端附近含有第1靶核苷酸序列72a的第1靶核酸71a和在5’端附近含有第2靶核苷酸序列72b的第2靶核酸71b。
首先，在靶核酸71a的3’端附近設(shè)定用于引物73a結(jié)合的序列。另外在靶核酸71a的靶核苷酸序列72a以外的3’側(cè)設(shè)定用于終止核酸75a結(jié)合的序列。終止核酸75a的3’末端被修飾，3’側(cè)不能進(jìn)一步進(jìn)行延伸反應(yīng)。同樣，在靶核酸71b的3’端附近設(shè)定用于引物73b結(jié)合的序列。另外在靶核酸71b的靶核苷酸序列72b的3’端以外的3’側(cè)設(shè)定用于終止核酸75b結(jié)合的序列。終止核酸75b的3’末端被修飾，不能向3’側(cè)進(jìn)一步進(jìn)行延伸反應(yīng)。在圖7中，終止核酸75a和b的3’末端用圓圈標(biāo)記表示被修飾，不能向3’側(cè)進(jìn)一步進(jìn)行延伸反應(yīng)。
終止核酸75a和75b處于與靶核酸71a和71b的靶核苷酸序列72a和72b的3’端以外的3’側(cè)的序列結(jié)合存在的狀態(tài)，使用與靶核酸71a和71b的3’端附近的序列結(jié)合的引物73a和73b，在可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下，由5’向3’方向使核酸延伸。結(jié)果形成保護(hù)鏈74a和b，得到第1延伸產(chǎn)物檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)76a，和第2延伸產(chǎn)物檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)76b。靶核苷酸序列72a和b的部分兩者都維持單鏈狀態(tài)。各個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)76a和b分別包含含有靶核苷酸序列72a和b的單鏈核酸部分以及含有靶核酸71a和b的一部分和與這部分互補(bǔ)的保護(hù)鏈74a和b的雙鏈核酸部分。
基于以上本發(fā)明方式的第6例除了由作為靶核酸的雙鏈，得到2個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)之外，其他可以與第5例的方法同樣實(shí)施。而第6例中可獲得的適當(dāng)延伸條件、有關(guān)其他可使用的反應(yīng)條件、靶核酸、終止核酸、引物和檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的條件可以是與第5例的條件同樣的條件，也可以與第5例同樣進(jìn)行各種各樣的變更。
在使用核酸探針77a和核酸探針77b的靶核苷酸序列的檢測(cè)中可以利用通過(guò)上述延伸反應(yīng)得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)76a和檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)76b。例如，與上述任一個(gè)例子同樣，通過(guò)對(duì)核酸探針77a和b與靶核苷酸序列72a與b的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，可以進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。因此，經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。另外，根據(jù)第6例，可以對(duì)2處的靶核苷酸序列同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
(III)通過(guò)對(duì)引物的結(jié)合位置進(jìn)行調(diào)節(jié)和使用終止核酸，形成核酸探針結(jié)合部位的方法通過(guò)將上述(I)和(II)所述方法組合，可以更自由地設(shè)計(jì)各種靶核苷酸序列。以下第7例至第9例給出了這樣的例子。
(7)第7例利用圖8對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第7例進(jìn)行說(shuō)明。在上述的第6例中，第1靶核酸和第2靶核酸無(wú)論哪一個(gè)在其5’端附近都有靶核苷酸序列。而與第6例對(duì)照，在以下所述的第7例中，在第1靶核酸中3’端附近存在靶核苷酸序列，在第2靶核酸5’端附近存在靶核苷酸序列。
參照?qǐng)D8。作為雙鏈的靶核酸81包括第1靶核酸81a和第2靶核酸81b。在第1靶核酸81a的3’端附近存在第1靶核苷酸序列82a。在第2靶核酸81b的5’端附近存在第2靶核苷酸序列82b。第1靶核酸82a和第2靶核苷酸序列82b相互可以互補(bǔ)，也可以不互補(bǔ)。
由第1靶核酸制造第1檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)86a可以通過(guò)與上述第1例所述方法同樣的方法進(jìn)行。即，使用具有與第1靶核酸中的靶核苷酸序列82a的5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的序列的引物83a，在可獲得的適當(dāng)延伸條件下進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成保護(hù)鏈84a，可以制作檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)86a。另外可以象第1例所述那樣進(jìn)行各種各樣的變更。
由第2靶核酸制造第2檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)86b可以通過(guò)與上述第5例所述方法同樣的方法進(jìn)行。即，使用具有與第2靶核酸的3’端附近的一部分序列互補(bǔ)的引物83b，在終止核酸85存在條件下，于可獲得的適當(dāng)延伸條件下進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成保護(hù)鏈84b，可以制作檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)86b。其中終止核酸85含有與靶核酸81b的靶核苷酸序列82b以外的3’側(cè)的序列互補(bǔ)的序列。由這樣的第2靶核酸進(jìn)行檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制作可以象上述第5例所述那樣進(jìn)行種種變更。在圖8中用圓圈標(biāo)記表示用于抑制向3’側(cè)方向進(jìn)行延伸反應(yīng)的終止核酸85的3’末端處的修飾。
對(duì)上述第1靶核酸的延伸和對(duì)第2靶核酸的延伸也可以同時(shí)進(jìn)行，或依次進(jìn)行。例如，同時(shí)進(jìn)行時(shí)，與使用上述的雙鏈作為靶核酸的其他例子同樣，可以在第1靶核酸和第2靶核酸兩者在可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下都可以進(jìn)行延伸反應(yīng)。
而第1靶核苷酸序列和第2靶核苷酸序列可以是同樣長(zhǎng)度，具有100％的互補(bǔ)性，也可以是一方比另一方長(zhǎng)，也可以是同等長(zhǎng)度，但兩末端多少錯(cuò)開(kāi)一點(diǎn)。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，由于可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，所以經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。另外，根據(jù)第7例，可以就兩條互補(bǔ)鏈對(duì)1處的靶核苷酸序列同時(shí)或依次進(jìn)行檢測(cè)。因此，可以確實(shí)進(jìn)行末端靶核苷酸序列的檢測(cè)，使判定精度提高。例如，對(duì)檢測(cè)單核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism、以下記為SNP)時(shí)特別有利。
另外，使用該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的靶核苷酸序列檢測(cè)與上述的其他例子同樣，可以通過(guò)使用對(duì)第1靶核苷酸序列82a互補(bǔ)的核酸探針87a和對(duì)第2靶核苷酸序列82b互補(bǔ)的核酸探針87b，對(duì)他們與靶核酸的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行。
(8)第8例利用圖9對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第8例進(jìn)行說(shuō)明。參照?qǐng)D9。單鏈靶核酸91在3’端附近含有第1靶核苷酸序列92，在5’端含有第2靶核苷酸序列93(圖9A)。由這樣的靶核酸91制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)97(圖9B)。在有與靶核酸91中的第1靶核苷酸序列92的5’端以外的5’側(cè)的一部分序列互補(bǔ)的引物94和與靶核酸91中的第2靶核苷酸序列93以外的3’側(cè)的一部分序列互補(bǔ)的引物95存在下，于可獲得的適當(dāng)伸反應(yīng)的條件下進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成保護(hù)鏈96，可以制作檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)97。在圖9中用圓圈標(biāo)記表示終止核酸95的3’末端處的修飾，用于抑制向3’側(cè)方向延伸反應(yīng)。
檢測(cè)可以使用與第1靶核苷酸序列92互補(bǔ)的第1核酸探針98和與第1靶核苷酸序列93互補(bǔ)的第2核酸探針99，通過(guò)與上述其他例子同樣的方法對(duì)核酸探針與各個(gè)靶核苷酸序列的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
在上述第8例中，作為靶核酸可以使用單鏈，但對(duì)于雙鏈靶核酸也同樣可應(yīng)用第8例的方法。另外，第8例根據(jù)上述的第1例、第2例、第4例和第5例的方法，象那些方法的變更同樣也可以進(jìn)行所希望的變更。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，由于可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，所以經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(9)第9例利用圖10，對(duì)制造有關(guān)含有3個(gè)以上的靶核苷酸序列的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法的例子進(jìn)行說(shuō)明。參照?qǐng)D10。單鏈靶核酸101含有3’側(cè)，即3’端附近的第1靶核苷酸序列102a、第2靶核苷酸序列102b、第3靶核苷酸序列102c、緊靠5’側(cè)、即5’端附近的第4靶核苷酸序列102d(圖10A)。由這樣的靶核酸101制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。首先準(zhǔn)備與靶核酸101中的第1靶核苷酸序列102a以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的第1引物103a、與第2靶核苷酸序列102b 5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的第2引物103b以及與第3靶核苷酸序列102c 5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的第3引物103c。另外準(zhǔn)備3個(gè)終止核酸。第1終止核酸105a含有與靶核酸101中的第2靶核苷酸序列3’端以外的3’側(cè)序列互補(bǔ)的序列。第2終止核酸105b含有與第3靶核苷酸序列3’端以外的3’側(cè)序列互補(bǔ)的序列。第3終止核酸105c含有與第3靶核苷酸序列3’端以外的3’側(cè)的序列互補(bǔ)的序列。
在有第1引物103a、第2引物103b、第3引物103c，以及第1終止核酸105a、第2終止核酸105b、第3終止核酸105c存在下，于可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成第1保護(hù)鏈106a、第2保護(hù)鏈106b以及第3保護(hù)鏈106c，制作檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)107(圖10B)。
這樣制作的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)107一次可以檢測(cè)4處靶核苷酸序列的存在。這樣的檢測(cè)象上述任一個(gè)例子那樣，通過(guò)對(duì)核酸探針108a、108b、108c、108d與第1靶核苷酸序列102a、第2靶核苷酸序列102b、第3靶核苷酸序列102c以及第4靶核苷酸序列102d檢測(cè)的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行。
在上述第9例中，給出了在一個(gè)靶核酸上存在4個(gè)靶核苷酸序列的例子，對(duì)于靶核苷酸序列數(shù)3個(gè)以上的情形也應(yīng)用第9例的方法。另外，靶核苷酸序列可以不必與靶核酸的5’和/或3’端連接存在，可以存在于留出幾個(gè)殘基的任一端，也可以只存在于靶核酸的中央附近。另外，在圖10中用圓圈標(biāo)記表示用于抑制向3’側(cè)方向延伸反應(yīng)的終止核酸105a、b和c的各個(gè)3’末端處的修飾。
在上述第9例中，作為靶核酸可以使用單鏈，但對(duì)于雙鏈靶核酸也同樣可應(yīng)用第9例的方法。此時(shí)，由雙鏈可以得到一個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，也可以得到2個(gè)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。另外，第9例根據(jù)上述的第1例、第2例、第4例和第5例的方法可以與那些例中的變更同樣進(jìn)行所希望的變更。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，由于可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，所以經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(IV)通過(guò)酶形成核酸探針結(jié)合部分的方法以下的第10例和11例是一旦對(duì)靶核酸的全長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)制做成雙鏈后，只將所希望的靶核苷酸序列部分做成單鏈的方法的例子。具體來(lái)說(shuō)，預(yù)先將核酸擴(kuò)增中使用的引物的至少一部分序列修飾成核酸分解酶抗性，使用該引物對(duì)樣品進(jìn)行延伸或擴(kuò)增，將延伸或擴(kuò)增后得到的雙鏈核酸用核酸外切酶一直消化到修飾部分。通過(guò)該反應(yīng)可以作出含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。
(10)第10例利用圖11，對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第10例進(jìn)行說(shuō)明。作為檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的靶核酸111是由第1靶核酸111a和第2靶核酸111b構(gòu)成的雙鏈靶核酸111。在第1靶核酸111a的3’端附近存在靶核苷酸序列112。使用這樣的靶核酸111和第1引物113a和第2引物113b，進(jìn)行保護(hù)鏈114a和b延伸。
這里第1引物113a是與第1靶核酸113a的3’端附近的序列互補(bǔ)的引物，含有與靶核苷酸序列112互補(bǔ)的序列和與該靶核苷酸序列開(kāi)始的5’側(cè)的靶核酸上的序列互補(bǔ)的序列。另外，與第1引物113a含有的靶核苷酸序列互補(bǔ)的序列部分由核酸分解酶非抗性的核苷酸構(gòu)成。至少含有與該靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)的序列互補(bǔ)的一部分、優(yōu)選是與靶核苷酸序列鄰接的序列的一部分序列是核酸分解酶抗性核酸。另外，第2引物113b是與第2靶核酸111b的3’端附近的序列互補(bǔ)的引物。第2引物113b由于至少5’端是核酸分解酶抗性，所以不會(huì)被核酸分解酶消化。
在上述那樣的靶核酸111和第1引物113a和第2引物113b存在下，于可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下，進(jìn)行核酸延伸(圖11A)。然后對(duì)得到的雙鏈進(jìn)行變性，分成為單鏈。再以得到的單鏈作為模板，與上述同樣使用第1引物113a和第2引物113b，于可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下，進(jìn)行核酸延伸(圖11B)。然后在可獲得的適當(dāng)分解酶活性的條件下使可以從5’末端分解核酸的核酸分解酶反應(yīng)(圖11C)。存在于該反應(yīng)體系的核酸中，在露出的5’末端不含有核酸分解酶抗性核苷酸的核酸被該核酸分解酶分解。通過(guò)分解得到具備保護(hù)鏈114a’和保護(hù)鏈114b的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)116(圖11C)。
使核酸探針115與上述那樣得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)116雜交，與上述其他例子同樣可以通過(guò)檢測(cè)該結(jié)合對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)(圖11D)。
這里使用的核酸分解酶只要是從5’末端分解核酸的外切酶等核酸酶就可以，最好使用例如T7 Gene6核酸外切酶等。
象上述那樣可在本發(fā)明中使用的靶核苷酸序列只要是實(shí)施者要檢測(cè)的序列就可以，長(zhǎng)度可以為5堿基～300堿基、優(yōu)選是9堿基～50堿基。另外，靶核苷酸序列112存在于靶核酸的3’端附近，也可以與上述其他例子同樣也可以配置在含有3’末端的位置，或不含有3’末端，離開(kāi)該末端的位置。
這里使用的第1引物象上述那樣，特定位置對(duì)核酸分解酶抗性，與靶核苷酸序列對(duì)應(yīng)的部分是核酸分解酶非抗性的核酸。第1引物只要是獲得那樣的條件可以是任一種核酸。其長(zhǎng)度為了獲得對(duì)實(shí)施者選擇的第1引物特異雜交，要有充分的長(zhǎng)度，而且也可以是比上述那樣的靶核苷酸序列堿基長(zhǎng)度更長(zhǎng)的堿基長(zhǎng)度。例如，在本例中使用的第1引物的長(zhǎng)度的例子可以是6堿基長(zhǎng)度以上，優(yōu)選是10堿基長(zhǎng)度以上。另外，就象上述那樣，在本例中使用的第1引物與存在于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)鄰接或存在于更遠(yuǎn)5’側(cè)的核苷酸互補(bǔ)的部分是核酸分解酶抗性。核酸分解酶抗性核苷酸數(shù)可以是1至300堿基，優(yōu)選1至50堿基，更優(yōu)選1至30堿基。與第1引物結(jié)合的靶核苷酸序列互補(bǔ)的部分由核酸分解酶非抗性的核苷酸構(gòu)成。另外，第1引物也可以在比該核酸分解酶抗性核苷酸3’端進(jìn)一步的3’側(cè)含有核酸分解酶非抗性核苷酸。
這里使用的第2引物至少在該5’末端含有對(duì)核酸分解酶是抗性的核苷酸，其他部分可以含有核酸分解酶非抗性的核苷酸。第2引物的全長(zhǎng)可以是5至100堿基，優(yōu)選6至50堿基比較好，更優(yōu)選10至35堿基。另外，第2引物的核酸分解酶非抗性核酸可以是從約4堿基至約99堿基，優(yōu)選從約5堿基至49堿基，更優(yōu)選9至34堿基。
在本例中為了將所希望的核苷酸做成核酸分解酶抗性，可以使用這方面眾所周知的任一種核酸分解酶抗性化手段對(duì)核苷酸進(jìn)行修飾。例如，那樣的手段可以是對(duì)磷酸二酯鍵部分進(jìn)行硫代磷酸酯(phosphorothioate)修飾等，但并不限定于這樣作法。
而所謂可獲得適當(dāng)延伸反應(yīng)的條件下，例如可以是在具有核苷酸延伸活性的酶、延伸時(shí)可整合的核酸合成底物以及延伸反應(yīng)必需的輔酶等存在下，而且對(duì)溫度以及pH等諸條件進(jìn)行適當(dāng)控制的條件。本發(fā)明中使用的酶可以是上述第1例中使用的酶。另外適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂坪蚿H控制等條件也可以使用上述第1例所述的條件。
另外在上述的例子中，在圖11的(A)后可以再進(jìn)行一次延伸，也可以再反復(fù)進(jìn)行該操作。即，在基于本例那樣的本發(fā)明方式的方法中，也可以具備包括進(jìn)行2次以上延伸的擴(kuò)增反應(yīng)。這樣的擴(kuò)增可以通過(guò)這方面眾所周知的任一個(gè)擴(kuò)增手段進(jìn)行。擴(kuò)增手段的例子可以是PCR擴(kuò)增、以及Nucleic acid strand amplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chainreaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification ofNucleic acids(ICANN)和Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediated amplification(LAMP)法等。在本例中通過(guò)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可以同時(shí)制造更多的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。
使用樣品中含有的靶核酸，利用上述第10例制造基于本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)時(shí)，這里的樣品可以含有靶核酸，但不一定只含有靶核酸，也可以同時(shí)含有其他核酸。然而，最好是為了進(jìn)行基于本發(fā)明方式的反應(yīng)，樣品中的靶核酸的量約為樣品中含有的核酸整體的約3％以上，更優(yōu)選10％以上，進(jìn)一步優(yōu)選20％以上。另外，根據(jù)需要，在實(shí)施基于本發(fā)明的方法之前可以通過(guò)這方面眾所周知的任一個(gè)擴(kuò)增手段對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增手段的例子可以是PCR擴(kuò)增、以及Nucleicacid strand amplification(NASBA)、Transcription mediatedamplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Stranddisplacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)和Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediatedamplification(LAMP)法等。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，由于可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，所以經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
(11)第11例利用圖12，對(duì)基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的第11例進(jìn)行說(shuō)明。作為檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的靶核酸121是由第1靶核酸121a和第2靶核酸121b構(gòu)成的雙鏈靶核酸121(圖12A)。第11例是在第1和第2靶核酸兩者的3’端附近存在靶核苷酸序列122a和b時(shí)的例子。因此是上述第10例的變形例子。
使用具有與第靶核酸121a 3’端附近的第1靶核苷酸序列122a互補(bǔ)的序列的第1引物123a和具有與第2靶核苷酸序列112b互補(bǔ)的序列的第2引物123b，進(jìn)行延伸反應(yīng)(圖12A)。然后對(duì)得到的雙鏈進(jìn)行變性，對(duì)得到的單鏈?zhǔn)褂猛瑯拥牡?引物123a和第2引物123b，和具有核苷酸延伸活性的酶，再次進(jìn)行延伸(圖12B)。然后通過(guò)核酸分解酶從5’末端對(duì)核酸分解酶非抗性核酸進(jìn)行分解。通過(guò)該反應(yīng)得到具備由以單鏈核酸部分存在的靶核苷酸序列122a和b以及互補(bǔ)鏈124a’和b’構(gòu)成的雙鏈核酸部分的點(diǎn)對(duì)稱(chēng)的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)126(圖12C)。
其中，引物123a和b在各個(gè)5’端一側(cè)含有核酸分解酶非抗性核苷酸，該核酸分解酶非抗性核苷酸可以存在于與靶核苷酸序列122a和b對(duì)應(yīng)的部分。另外在與各個(gè)靶核酸中的靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)區(qū)域互補(bǔ)的序列中存在核酸分解酶抗性核苷酸部分。
在本第11例中，該延伸反應(yīng)后，通過(guò)核酸分解酶將存在于各個(gè)保護(hù)鏈124a和b的5’端的核酸分解酶非抗性核苷酸分解。因此，在本第11例中使用的第1引物123a和第2引物123b兩者基本結(jié)構(gòu)都可以與第10例中所述的第1引物同樣。即，在作為與靶核苷酸序列互補(bǔ)的序列的部分中含有對(duì)核酸分解酶非抗性的核苷酸，存在于該非抗性核苷酸3’端以外的3’側(cè)的序列的一部分，優(yōu)選是與靶核苷酸序列互補(bǔ)的序列鄰接部分的序列是核酸分解酶抗性核苷酸。除了這樣的第1引物123a和第2引物123b的構(gòu)成以外、本第11例可以通過(guò)與上述第10例同樣的方法進(jìn)行，也可以與第10例的變更同樣進(jìn)行所希望的變更。
對(duì)于這樣得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)126可以使核酸探針125a和b同時(shí)、或依次雜交，利用與上述的其他例子同樣的方法，可以通過(guò)檢測(cè)該結(jié)合對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)(圖12D)。
通過(guò)上述那樣的基于本發(fā)明方式的方法，由于可以通過(guò)很少工序、自由設(shè)計(jì)靶核苷酸序列、而且在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，所以經(jīng)濟(jì)性以及操作性都提高了。
對(duì)于通過(guò)以上說(shuō)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法的各種方式(I)～(IV)得到的效果可以給出如下更具體的例子。
在雜交操作中使用以·NAT基因、MDR基因、CYP2D6基因等為首的各種人代謝酶基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(I)、(II)、(III)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·Cytb基因、D-Loop區(qū)域等為首的各種人線粒體基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(I)、(II)、(III)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·Aspergillus屬、Candida屬、Trichomonas屬、Cryptosporidium屬為首的各種真核生物的r-RNA基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(I)、(II)、(III)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·Aspergillus屬、Candida屬、Trichomonas屬、Cryptosporidium屬為首的各種真核生物的r-RNA基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(V)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·Helicobacter屬、Bacillus屬、Clostridium屬為首的各種真核生物的r-RNA基因序列以及病原性相關(guān)基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(I)、(II)、(III)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·Helicobacter屬、Bacillus屬、Clostridium屬為首的各種真核生物的r-RNA基因序列以及病原性相關(guān)基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(IV)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·MHV、HPV、HCV、HBV、HIV、HEV為首的各種病毒基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(I)、(II)、(III)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
在雜交操作中使用以·MHV、HPV、HCV、HBV、HIV、HEV為首的各種病毒基因序列作為對(duì)象，依據(jù)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法(IV)做成的樣品時(shí)，可以有效而且經(jīng)濟(jì)地對(duì)該基因序列中含有的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
4.檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)依據(jù)上述那樣的本發(fā)明方法制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)也包括在本發(fā)明中。另外基于這樣的本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)在靶核苷酸序列或含有該序列的靶核酸的檢測(cè)中使用很理想。另外依據(jù)本發(fā)明制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)可以以在溶液中游離的狀態(tài)使用，也可以以被固定在顆粒和基板等基體上的狀態(tài)使用。即，游離型的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)和固定于基體的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)任一個(gè)都可作為本發(fā)明提供。
一般來(lái)說(shuō)，靶核苷酸序列的檢測(cè)通過(guò)使互補(bǔ)的核酸探針與目的靶核苷酸序列結(jié)合，對(duì)其結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)來(lái)進(jìn)行。在多數(shù)場(chǎng)合下，靶核苷酸序列不是單獨(dú)存在于樣品中，而更多的是與含有多個(gè)不同序列的核酸共存、或存在于在其一部分含有靶核苷酸序列的靶核酸中，或許多具有同等序列的靶核苷酸序列和靶核酸集合存在。因此，靶核苷酸序列或含有該序列的靶核酸由于本身互補(bǔ)性產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，或與其他序列產(chǎn)生交叉雜交的可能性很大。如果產(chǎn)生那樣的沒(méi)有預(yù)料的結(jié)合，結(jié)果會(huì)使靶核苷酸序列的檢測(cè)的精度變低。然而，利用本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)可以抑制由于自身互補(bǔ)性或與其他序列的互補(bǔ)性造成的沒(méi)有預(yù)料的雜交的發(fā)生。
5.靶核苷酸序列檢測(cè)方法使用上述那樣基于本發(fā)明制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，對(duì)靶核苷酸序列或靶核酸進(jìn)行檢測(cè)的方法也包括在本發(fā)明中。
即，準(zhǔn)備作為該檢測(cè)對(duì)象的樣品。然后根據(jù)要求對(duì)含有目的序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。然后利用上述的基于本發(fā)明方式的方法制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。然后在適當(dāng)?shù)碾s交條件下使與檢測(cè)對(duì)象靶核酸互補(bǔ)的核酸探針和制造的該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)反應(yīng)。結(jié)果，當(dāng)該樣品中存在靶核酸時(shí)，在該核酸探針和靶核苷酸序列之間發(fā)生雜交。因此，對(duì)通過(guò)該雜交引起的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，就可以檢測(cè)樣品中的靶核苷酸序列或靶核酸的存在。
本發(fā)明中使用的核酸的擴(kuò)增手段只要是這方面眾所周知的擴(kuò)增手段就可以，例如，PCR擴(kuò)增、以及Nucleic acid strandamplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacementamplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic acids(ICANN)和Rolling circleamplification(RCA)法、Loop mediated amplification(LAMP)法等。在本發(fā)明中，可獲得的適當(dāng)雜交條件只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，都可以根據(jù)靶核苷酸序列中含有的堿基種類(lèi)、核酸探針固定基體所具備的核酸探針的種類(lèi)、樣品核酸的種類(lèi)以及他們的狀態(tài)等諸條件進(jìn)行適當(dāng)選擇。
另外在使用基于本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的靶核苷酸序列的檢測(cè)方法中使用的檢測(cè)手段可以是使用核酸探針實(shí)施的眾所周知的一般的檢測(cè)手段。例如，這樣的檢測(cè)手段可以是對(duì)核酸探針預(yù)先進(jìn)行熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和色素等可檢測(cè)的標(biāo)記物質(zhì)，檢測(cè)這些標(biāo)記物的檢測(cè)方法、利用對(duì)該結(jié)合部分可特異結(jié)合的嵌入劑進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)方法、以及使用通過(guò)電化學(xué)手段識(shí)別該結(jié)合部分的物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法等。
6.分析試劑盒(1)檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒依據(jù)本發(fā)明的方式，用于制造上述那樣的基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒也包括在本發(fā)明中。
基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒至少具備上述那樣的各種引物、核酸合成酶、核酸合成底物、為了得到終止核酸的必需試劑、核酸分解酶、用于核酸的核酸分解酶抗性化所必需的試劑、核酸探針、用于對(duì)核酸探針進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)記物質(zhì)以及其他試劑、以及至少一個(gè)所希望的基體，也可以具備他們中的幾個(gè)的組合。
(2)靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒本發(fā)明還提供使用上述那樣的基于本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)的靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒?；诒景l(fā)明的方式的靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒具備依據(jù)本發(fā)明方式的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)、核酸引物、用于檢測(cè)結(jié)合的可檢測(cè)的標(biāo)記物質(zhì)以及用于進(jìn)行檢測(cè)的各種試劑中的至少一個(gè)，也可以具備他們中幾個(gè)的組合。另外，在上述的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒具備的上述那樣的各種引物、核酸合成酶、核酸合成底物、為了得到終止核酸的必需試劑、核酸分解酶、用于核酸的核酸分解酶抗性化所必需的試劑、核酸探針、用于對(duì)核酸探針進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)記物質(zhì)和試劑、顆粒和基板等基體、以及核酸探針固定化基體等也可以至少具備一個(gè)，或他們中幾個(gè)組合的形式。
實(shí)施例1將使用上述終止核酸的圖5所示那樣的第4例子作為本發(fā)明的實(shí)施例1，再將得到的結(jié)果與用以往方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。用與含有MBL基因編碼區(qū)域的SNP的區(qū)域相對(duì)應(yīng)的單鏈DNA作為靶核酸，通過(guò)本發(fā)明和以往方法兩個(gè)方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。以下，使用用于檢測(cè)同區(qū)域上SNP的核酸探針固定化基體進(jìn)行MBL基因的SNP檢測(cè)。具體方法如下所述。
將帶有與在MBL基因中含有與要檢測(cè)的SNP區(qū)域同樣序列(即，序列編號(hào)1)的單鏈DNA作為靶核酸，將其濃度調(diào)整到終濃度為1012拷貝/mL程度。
另外保護(hù)鏈的延伸在終止核酸存在下使用引物進(jìn)行。即，用終濃度0.4μM的3’磷酸化寡DNA(序列編號(hào)2)作終止核酸，用終濃度0.2μM的寡DNA(序列編號(hào)3)作引物。將這些終止核酸和引物與終濃度0.04U/μL的耐熱性DNA合成酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)一起添加到上述靶核酸中。終止核酸和引物的序列如下。
序列編號(hào)2GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC序列編號(hào)3CATGGTCCTCACCTTGGTGT。
然后在最適酶反應(yīng)溶液組成中，于66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液，添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片作為核酸探針含有通過(guò)在3’末端導(dǎo)入巰基，被固定在基板上具備的金電極上的序列編號(hào)4和序列編號(hào)5所示的核酸。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
作為比較對(duì)照的以往方法如下進(jìn)行。將作為靶核酸的單鏈DNA與另外合成的單鏈保護(hù)鏈(即，序列編號(hào)6的核酸鏈)混合，在2×SSC緩沖液中，于95℃熱變性5分鐘后，通過(guò)30分鐘將95℃緩慢地冷卻至30℃，進(jìn)行退火。將上述退火后得到的利用以往方法的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)添加到作為探針含有序列編號(hào)4和序列編號(hào)5的核酸固定于基板的金電極上，與上述同樣的核酸探針固定化芯片上。然后于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
另外，作為另一個(gè)以往方法，用不含有保護(hù)鏈的單鏈靶核酸(序列編號(hào)1)作為檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)。添加到作為核酸探針含有序列編號(hào)4和序列編號(hào)5的與上述同樣的核酸探針固定化芯片，象上述那樣進(jìn)行雜交。雜交后用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
圖13給出了以上結(jié)果。以上的雜交結(jié)果表明，只是從使用作為終止核酸的序列編號(hào)2的3’磷酸化寡DNA和作為引物的序列編號(hào)3寡DNA，向他們中添加耐熱性DNA合成酶作出的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，使用該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行的本發(fā)明方法涉及到的實(shí)驗(yàn)區(qū)可以檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針的特異雜交發(fā)生的電流信號(hào)(圖13)。
另外，使用具有不同序列的靶核酸進(jìn)行同樣的比較實(shí)驗(yàn)，無(wú)論哪一種情況，只從使用本發(fā)明涉及到的方法作出的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)的情形可以檢測(cè)到穩(wěn)定而且特異的信號(hào)。另外，不帶有保護(hù)鏈，而是將靶核酸直接以單鏈DNA作為檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，或?qū)泻怂岷土硗夂铣傻幕パa(bǔ)鏈混合后通過(guò)熱變性和退火作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)等，使用以往方法不能得到與圖13所示結(jié)果幾乎同樣的好結(jié)果。
另外，依據(jù)圖7所示本發(fā)明的第6例作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。即，作為靶核酸使用雙鏈核酸，以互不相同的部位作為靶核苷酸序列，由雙鏈靶核酸中含有的各個(gè)鏈分別做成檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，同樣進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。其結(jié)果只在通過(guò)本發(fā)明的方法作出的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合可以確認(rèn)特異的雜交。
以上結(jié)果表明利用本發(fā)明的方法的檢測(cè)與以往方法比較，可以特異地、有效而且高靈敏度地檢測(cè)靶核酸。因此，作出靶DNA時(shí)的經(jīng)濟(jì)性和操作性提高。
實(shí)施例2作為實(shí)施例2，通過(guò)圖2所示的本發(fā)明第1例涉及到的方法，即調(diào)節(jié)引物的結(jié)合位置，實(shí)施制造所希望的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法，使用通過(guò)該方法得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。將通過(guò)該實(shí)施例得到的結(jié)果與通過(guò)以往方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。
將含有MxA基因的溶液作為樣品，將與含有MxA基因啟動(dòng)子的SNP區(qū)域?qū)?yīng)的單鏈DNA(序列編號(hào)7)作為靶核酸。另外，將含有該SNP的序列作為靶核苷酸序列。就上述樣品使用本發(fā)明的方法和以往方法兩個(gè)方法分別作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。靶核苷酸序列的檢測(cè)手段通過(guò)檢測(cè)對(duì)將具有與靶核苷酸序列互補(bǔ)的序列的核酸探針固定在基體上得到的核酸探針固定化基體有無(wú)雜交來(lái)進(jìn)行。通過(guò)這樣檢測(cè)，可以檢測(cè)MxA基因啟動(dòng)子的SNP的基因型。
將帶有與MxA基因中含有要檢測(cè)的SNP區(qū)域同樣的序列的靶單鏈DNA作為靶核酸，將其濃度調(diào)整到終濃度為1012拷貝/mL程度。作為引物準(zhǔn)備寡DNA(序列編號(hào)8)。將終濃度0.4μM的該引物和終濃度0.04U/μL的PCR用Pyrobest DNA聚合酶(Takara)一起添加到上述靶核酸中。引物的序列如下。
序列編號(hào)8GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
延伸反應(yīng)在最適酶反應(yīng)溶液組成中，于66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片，作為核酸探針?lè)謩e含有通過(guò)在5’末端導(dǎo)入巰基，固定于金電極的序列編號(hào)9和序列編號(hào)10所示的核酸探針。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
作為比較對(duì)照的以往方法如下進(jìn)行。將作為靶核酸的單鏈DNA與另外合成的單鏈保護(hù)鏈(即，序列編號(hào)11的核酸鏈)混合，在2×SSC緩沖液中，于95℃熱變性5分鐘后，用30分鐘將95℃緩慢地冷卻至30℃，進(jìn)行退火。上述退火后得到的利用以往方法的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)添加到將作為探針含有序列編號(hào)9和序列編號(hào)10的核酸固定于基板的金電極上的與上述同樣的核酸探針固定化芯片上。然后于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
另外，作為另一個(gè)以往方法，用不含有保護(hù)鏈的單鏈靶核酸(序列編號(hào)7)作為檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，對(duì)靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)。添加到作為核酸探針?lè)謩e含有序列編號(hào)9和序列編號(hào)10的與上述同樣的核酸探針固定化芯片上，與上述同樣進(jìn)行雜交，測(cè)定電流應(yīng)答。
結(jié)果只從使用本發(fā)明的方法作出的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)區(qū)可以檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針特異雜交進(jìn)行的電流信號(hào)(圖14)。另外，使用具有多種不同序列的靶核酸也同樣進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，無(wú)論哪一種情況，只從依據(jù)本發(fā)明的方法作出的樣品檢測(cè)到穩(wěn)定而且特異的信號(hào)。另外，沒(méi)有保護(hù)鏈，而是將靶核酸直接以單鏈DNA作為檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，或?qū)泻怂岷土硗夂铣傻幕パa(bǔ)鏈混合后通過(guò)熱變性和退火作成檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使用以往方法場(chǎng)合下，不能得到在與圖14所示結(jié)果幾乎同樣的好結(jié)果。
另外，依據(jù)圖4所示本發(fā)明的第3例作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。即，作為靶核酸使用雙鏈核酸，以互不相同的部位作為靶核苷酸序列，由雙鏈靶核酸中含有的各個(gè)鏈分別做成檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，另外再依據(jù)圖8所示的本發(fā)明的第7例作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。即，作為靶核酸使用雙鏈核酸，以相互互補(bǔ)的部位作為各個(gè)靶核苷酸序列，由雙鏈靶核酸中含有的各個(gè)鏈分別做成檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。依據(jù)以上那樣的本發(fā)明的方法由雙鏈靶核酸作出2種檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，使用該結(jié)構(gòu)實(shí)施檢測(cè)靶核苷酸序列的方法，結(jié)果無(wú)論對(duì)于什么樣的場(chǎng)合，都可以確認(rèn)對(duì)靶核苷酸序列的特異雜交。另外將這些結(jié)果與以往的方法進(jìn)行比較，本發(fā)明的方法與任一個(gè)以往的方法相比，可以高靈敏度地檢測(cè)靶核苷酸序列。
以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法的檢測(cè)與以往方法比較，可以特異地、有效而且高靈敏度地檢測(cè)靶核酸。因此，作出靶DNA時(shí)的經(jīng)濟(jì)性和操作性提高。
實(shí)施例3對(duì)使用上述終止核酸的本發(fā)明涉及到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)作出方法中的各種條件進(jìn)行研究。將與含有MBL基因編碼區(qū)域的SNP的區(qū)域?qū)?yīng)的單鏈DNA作為靶核酸，改變添加的作為引物使用的寡DNA的種類(lèi)作出靶核酸結(jié)構(gòu)。使用用于檢測(cè)同區(qū)域上SNP的核酸探針固定化基體進(jìn)行MBL基因的SNP檢測(cè)。
作為靶核酸準(zhǔn)備帶有含有與MBL基因中要檢測(cè)的SNP的區(qū)域同樣序列(序列編號(hào)1)的靶單鏈DNA。對(duì)其合成和擴(kuò)增，將其濃度調(diào)整到終濃度為1012拷貝/mL程度。終止核酸準(zhǔn)備用以下那樣的序列編號(hào)2、序列編號(hào)12、序列編號(hào)13和序列編號(hào)14所示的3’磷酸化寡DNA。向靶核酸中添加終濃度0.4μM的任一種終止核酸，即3’磷酸化寡DNA(序列編號(hào)2、序列編號(hào)12、序列編號(hào)13或序列編號(hào)14)、作為引物終濃度0.2μM的寡DNA(序列編號(hào)3)、和終濃度0.04U/μL的耐熱性DNA合成酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)。使用的終止核酸和引物的序列如下。
序列編號(hào)2GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC序列編號(hào)12GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA序列編號(hào)13CACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA序列編號(hào)14CCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC序列編號(hào)3CATGGTCCTCACCTTGGTGT。
然后在最適酶反應(yīng)溶液組成中，于66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)，進(jìn)行核酸延伸。反應(yīng)后，添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液，與預(yù)先在3’末端導(dǎo)入巰基固定在金電極的具有序列編號(hào)4和序列編號(hào)5所示的序列的核酸探針在35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
結(jié)果雖然由任一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)可以得到特異的信號(hào)，但就作為終止核酸的3’磷酸化寡DNA使用序列編號(hào)2或序列編號(hào)12，添加了這樣序列、作為引物的寡DNA序列編號(hào)3和耐熱性DNA合成酶的實(shí)驗(yàn)區(qū)來(lái)說(shuō)，與作為終止核酸的3’磷酸化寡DNA使用序列編號(hào)13或序列編號(hào)14時(shí)相比，可以更高靈敏度地檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針進(jìn)行特異雜交的電流信號(hào)。即，以上結(jié)果表明利用本發(fā)明的方法作出靶DNA時(shí)，更優(yōu)選設(shè)計(jì)成使得作為終止核酸的3’磷酸化寡DNA的3’末端和核酸探針的5’末端鄰接。
實(shí)施例4
就通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明涉及到的引物的結(jié)合位置，制造所希望的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法，對(duì)該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造條件進(jìn)一步研究。將與含有MxA基因啟動(dòng)子的SNP的區(qū)域?qū)?yīng)的單鏈DNA作為靶核酸。準(zhǔn)備多個(gè)使用的引物序列，使用這些序列作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。將得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)添加到用于檢測(cè)同一區(qū)域上的SNP的核酸探針固定化基體后，使其反應(yīng)，進(jìn)行MxA基因的SNP檢測(cè)。
將帶有含有與MxA基因中要檢測(cè)的SNP的區(qū)域同樣的序列的單鏈DNA(序列編號(hào)7)作為靶核酸。對(duì)這樣的靶核酸進(jìn)行合成、擴(kuò)增和調(diào)整。作為引物準(zhǔn)備含有3種序列(序列編號(hào)8、序列編號(hào)15或序列編號(hào)16)中的任一序列的核酸。將終濃度0.4μM的引物和終濃度0.04U/μL的PCR用Pyrobest DNA polymerase(Takara)添加到該靶核酸中。添加的引物的序列如下。
序列編號(hào)8GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC序列編號(hào)15CCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC序列編號(hào)16CGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
將上述靶核酸、引物和酶的混合物在最適酶反應(yīng)溶液組成中，于66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片作為核酸探針?lè)謩e含有在5’末端導(dǎo)入巰基固定于基板上具備的金電極上的序列編號(hào)9和序列編號(hào)5所示的核酸探針。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
結(jié)果由任一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)可以檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針進(jìn)行特異雜交的電流信號(hào)。更有趣的是看到了通過(guò)使用的引物的序列不同得到的信號(hào)強(qiáng)度的差異。信號(hào)強(qiáng)度與引物序列的關(guān)系依次是序列編號(hào)8＞序列編號(hào)15＞序列編號(hào)16的順序。即，由以上結(jié)果可知利用本發(fā)明的方法作出靶DNA時(shí)，更優(yōu)選設(shè)計(jì)成使得添加的引物的5’末端和核酸探針的3’末端鄰接。
實(shí)施例5使用上述圖6所示的第5例的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。在本實(shí)施例中，對(duì)將雙鏈核酸作為靶核酸時(shí)的條件進(jìn)行研究。即，將與含有MBL基因編碼區(qū)域的SNP的區(qū)域?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物作為靶核酸，在幾種不同的條件下作出本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。使用得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)和用于檢測(cè)同區(qū)域上的SNP的核酸探針固定化基體的核酸探針固定化芯片進(jìn)行MBL基因的SNP檢測(cè)。
以預(yù)先判明SNP型的人基因組DNA作為模板，以分別含有序列編號(hào)17和序列編號(hào)3的寡DNA作為引物進(jìn)行PCR法。通過(guò)該P(yáng)CR擴(kuò)增MBL基因中要檢測(cè)的含有SNP的區(qū)域。向該擴(kuò)增產(chǎn)物添加終濃度0.4μM的終止核酸3’磷酸化寡DNA(序列編號(hào)2)和終濃度0.04U/μL的耐熱性DNA合成酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)、以及作為第1引物的終濃度為0.2μM的寡DNA(序列編號(hào)17)和/或作為第2引物的終濃度為0.2μM的寡DNA(序列編號(hào)3)。使用的寡DNA的序列如下。
序列編號(hào)17GTCCCATTTGTTCTCACTGC序列編號(hào)3CATGGTCCTCACCTTGGTGT序列編號(hào)2GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC。
然后在最適酶反應(yīng)溶液組成中，于95℃下進(jìn)行5分鐘，66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mMEDTA溶液，然后添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片作為各個(gè)核酸探針含有通過(guò)在3’末端導(dǎo)入巰基，固定在基板具備的金電極上的序列編號(hào)4和序列編號(hào)5所示序列的核酸。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
結(jié)果只從向PCR產(chǎn)物添加作為引物的序列編號(hào)17的寡DNA和序列編號(hào)3的寡DNA、作為終止核酸的序列編號(hào)2的3’磷酸化寡DNA和耐熱性DNA合成酶的實(shí)驗(yàn)區(qū)檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針進(jìn)行特異雜交的電流信號(hào)。另外再準(zhǔn)備多種靶核酸，對(duì)這些靶核酸進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果任一場(chǎng)合下都能夠穩(wěn)定而且特異地檢測(cè)信號(hào)只是用與上述同樣的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合。與此相反，對(duì)于用其他方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合，幾乎所有的場(chǎng)合都得不到好的結(jié)果。另外象上述那樣將擴(kuò)增產(chǎn)物作為靶核酸使用時(shí)，即使是上述那樣的PCR法以外的任一種擴(kuò)增手段得到的擴(kuò)增產(chǎn)物也可以作為靶核酸使用。例如，對(duì)于ICAN產(chǎn)物也用與上述同樣的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)(參照?qǐng)D15)，使用得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)也可同樣確認(rèn)良好的靶核苷酸序列的特異檢測(cè)。以上結(jié)果表明，作為靶核酸使用雙鏈核酸作出本發(fā)明涉及到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)時(shí)，在與核酸探針?lè)磻?yīng)時(shí)，希望作為與靶核酸互補(bǔ)核酸游離的單鏈核酸不存在于雜交溶液中。因此，希望添加引物在要雜交時(shí)靶核酸的雙鏈的兩條鏈仍為雙鏈。
實(shí)施例6在本實(shí)施例中使用上述圖3所示第2例的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。在本實(shí)施例中，對(duì)將雙鏈核酸作為靶核酸時(shí)的條件進(jìn)行研究。即，將與含有MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的SNP的區(qū)域?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物作為靶核酸，在幾種不同的條件下作出本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。使用得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)和在用于檢測(cè)同區(qū)域上的SNP的基體上固定核酸探針的核酸探針固定化芯片進(jìn)行MxA基因的SNP檢測(cè)。
以預(yù)先判明SNP型的人基因組DNA作為模板，以分別含有序列編號(hào)18和序列編號(hào)19的寡DNA作為引物進(jìn)行PCR法。通過(guò)該P(yáng)CR擴(kuò)增MxA基因中要檢測(cè)的含有SNP的區(qū)域。向該擴(kuò)增產(chǎn)物添加終濃度為0.4μM的作為第1引物的寡DNA(序列編號(hào)18)和/或作為第2引物的寡DNA(序列編號(hào)8)以及終濃度0.04U/μL的PCR用酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)。添加的寡DNA的序列如下。
序列編號(hào)18GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC序列編號(hào)19CGCTAGTCTCCGCCACGAAC序列編號(hào)8GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
然后在最適酶反應(yīng)溶液組成中，于95℃下進(jìn)行5分鐘，66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。反應(yīng)后，添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mMEDTA溶液，然后添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片作為各個(gè)探針含有通過(guò)在5’末端導(dǎo)入巰基，固定于基板具備的金電極上的序列編號(hào)9和序列編號(hào)10所示的序列的核酸。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
結(jié)果只從向PCR產(chǎn)物添加作為引物的序列編號(hào)19的寡DNA和序列編號(hào)8的寡DNA以及耐熱性DNA合成酶的實(shí)驗(yàn)區(qū)檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針進(jìn)行特異雜交的信號(hào)。另外再準(zhǔn)備多種靶核酸，對(duì)這些靶核酸進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果任一場(chǎng)合下都能夠穩(wěn)定而且特異地檢測(cè)信號(hào)只是在用與上述同樣的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合。與此相反，對(duì)于用其他方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合，幾乎所有的場(chǎng)合都得不到好的結(jié)果。另外象上述那樣將擴(kuò)增產(chǎn)物作為靶核酸使用時(shí)，即使是上述那樣的PCR法以外的任一種擴(kuò)增手段得到的擴(kuò)增產(chǎn)物也可以作為靶核酸使用。例如，對(duì)于ICAN產(chǎn)物也用與上述同樣的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)(參照?qǐng)D16)，使用得到的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)也可同樣確認(rèn)良好的靶核苷酸序列的特異檢測(cè)。由以上結(jié)果表明作為靶核酸使用雙鏈核酸作出本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)時(shí)，在與核酸探針?lè)磻?yīng)時(shí)，希望作為與靶核酸互補(bǔ)游離的單鏈核酸不存在于雜交溶液中。因此，希望在添加引物要雜交時(shí)靶核酸的雙鏈的兩條鏈仍為雙鏈。
實(shí)施例7在本實(shí)施例中，就象上述圖11所示的第10例和圖12所示的第11例那樣，通過(guò)使用酶形成單鏈核酸部分的方法，可以制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)。通過(guò)該檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)檢測(cè)靶核苷酸序列的結(jié)果與利用通過(guò)以往方法做成的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)檢測(cè)靶核苷酸序列的結(jié)果進(jìn)行比較。作為靶核酸使用水稻基因組，利用固定了核酸探針的基體進(jìn)行含有靶核苷酸序列的水稻基因組PCR擴(kuò)增片段是否存在的判定。
首先，從精米中提取、制備水稻基因組。對(duì)該水稻基因組DNA使用以下4個(gè)引物通過(guò)PCR對(duì)利用這些引物所夾的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。使用的引物序列如下。
序列編號(hào)20tacCTGGTTGATGTATACAGATCTGGTT序列編號(hào)21ATCCCTCGATCCCTCtagCATTAT序列編號(hào)22TACCTGGTTGATGTAtacAGATCTGGTT序列編號(hào)23atcCCTCGATCCCTCTAGCATTAT其中，在序列編號(hào)20、序列編號(hào)21、序列編號(hào)22和序列編號(hào)23這些序列中，小寫(xiě)字母表示的堿基存在于其3’側(cè)的磷酸二酯鍵部分實(shí)施了硫代磷酸酯修飾。
向該擴(kuò)增產(chǎn)物中添加T7 Gene6核酸外切酶和附帶的緩沖液，在最適條件下進(jìn)行完全消化。反應(yīng)后，向酶反應(yīng)液添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片作為各個(gè)核酸探針是含有通過(guò)在5’末端導(dǎo)入巰基，固定于基板具備的金電極上的序列編號(hào)24和序列編號(hào)25以及序列編號(hào)26所示的序列的核酸。
核酸探針序列編號(hào)24TACCTGGTTGATGTA序列編號(hào)25ATCCCTCGATCCCTC序列編號(hào)26ACAACGCCTCCGATG(對(duì)照用)另外在進(jìn)行該雜交反應(yīng)時(shí)，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)就對(duì)PCR產(chǎn)物沒(méi)有進(jìn)行T7 Gene6核酸外切酶處理的產(chǎn)物、用沒(méi)有進(jìn)行硫代磷酸酯修飾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物、進(jìn)行了T7 Gene6核酸外切酶處理的產(chǎn)物根據(jù)以往方法「利用部分雙鏈DNA的DNA檢測(cè)方法”(特開(kāi)平11-332566)的方法作出的靶結(jié)構(gòu)也同樣進(jìn)行雜交。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
結(jié)果表明，在對(duì)PCR產(chǎn)物沒(méi)有進(jìn)行T7 Gene6核酸外切酶處理的情況、以及用沒(méi)有進(jìn)行硫代磷酸酯修飾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、進(jìn)行了T7 Gene6核酸外切酶處理的情況、用引物序列編號(hào)20和序列編號(hào)23的組合進(jìn)行PCR后用T7 Gene6核酸外切酶處理的情況中沒(méi)有獲得表示發(fā)生雜交的結(jié)果。而根據(jù)「利用部分雙鏈DNA的DNA檢測(cè)方法”(特開(kāi)平11-332566)作出的靶中，得到的某種程度的信號(hào)的背景的信號(hào)變大，為S/N＝1.2程度。與此相反，用引物序列編號(hào)20和序列編號(hào)21的組合進(jìn)行PCR時(shí)通過(guò)核酸探針序列編號(hào)24，以及用引物序列編號(hào)22和序列編號(hào)23的組合進(jìn)行時(shí)通過(guò)核酸探針序列編號(hào)25給出的特異信號(hào)都是S/N＞＞2(圖17)。在用引物序列編號(hào)21和序列編號(hào)22的組合進(jìn)行PCR時(shí)，可以確認(rèn)與序列編號(hào)24和序列編號(hào)25兩方的核酸探針的特異雜交以S/N＞＞2進(jìn)行。而另外，對(duì)于多個(gè)PCR片段同時(shí)存在的多重PCR產(chǎn)物也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果觀察到通過(guò)本發(fā)明的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合與以往方法相比有很高的特異性。以上結(jié)果表明在利用本發(fā)明的方法作出檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的場(chǎng)合與以往相比，經(jīng)濟(jì)性和操作性都提高、而且可以特異、有效和/或高靈敏度地檢測(cè)靶核酸。
實(shí)施例8對(duì)于多重PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用基于本發(fā)明的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法，以下對(duì)在通過(guò)雜交進(jìn)行檢測(cè)中使用利用該方法得到的產(chǎn)物的例子進(jìn)行說(shuō)明。
以預(yù)先判明SNP型的人基因組DNA作為模板，為了對(duì)MxA基因啟動(dòng)子區(qū)域和MBL基因編碼區(qū)域中含有SNP的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，使用序列編號(hào)17、序列編號(hào)3、序列編號(hào)18和序列編號(hào)19進(jìn)行多重PCR。向反應(yīng)后PCR產(chǎn)物添加終濃度0.4μM的引物(序列編號(hào)8)和終濃度0.4μM的終止核酸3’磷酸化寡DNA(序列編號(hào)2)、以及各個(gè)終濃度為0.2μM的2種引物(分別含有序列編號(hào)17或序列編號(hào)19)以及終濃度0.04U/μL的PCR用酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)。于95℃進(jìn)行5分鐘、66℃下進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。
其中使用的各個(gè)寡DNA的序列如下。
序列編號(hào)17GTCCCATTTGTTCTCACTGC序列編號(hào)3CATGGTCCTCACCTTGGTGT序列編號(hào)18GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC序列編號(hào)19CGCTAGTCTCCGCCACGAAC序列編號(hào)2GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC序列編號(hào)8GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC反應(yīng)后，向酶反應(yīng)液中添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到預(yù)先準(zhǔn)備的該核酸探針固定化芯片后，于35℃下進(jìn)行1小時(shí)雜交。這里使用的核酸探針固定化芯片，作為固定化核酸探針具備通過(guò)預(yù)先在3’末端導(dǎo)入巰基，固定于基板具備的金電極上的序列編號(hào)4和序列編號(hào)5的核酸，以及預(yù)先在5’末端導(dǎo)入巰基，固定于基板具備的金電極上的序列編號(hào)9和序列編號(hào)10的核酸。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。結(jié)果檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針特異雜交發(fā)生的電流信號(hào)。
以上結(jié)果表明，如果利用本發(fā)明的方法形成檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，并用于靶核苷酸序列的檢測(cè)中，即使多種DNA片段混合液作為樣品時(shí)，也可以高特異性地進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。
實(shí)施例9在本實(shí)施例中，就象上述圖9所示的第8例那樣，做成可以對(duì)存在于單鏈核酸的靶核酸上的2處靶核苷酸序列進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，通過(guò)利用該結(jié)構(gòu)的雜交進(jìn)行靶核苷酸序列的檢測(cè)。
將具有與作為MBL基因的序列，在兩端含有SNP區(qū)域的DNA區(qū)域同一的序列(序列編號(hào)27)的靶單鏈DNA作為靶核酸。對(duì)該靶核酸進(jìn)行合成、擴(kuò)增，將其濃度調(diào)整到終濃度為1012拷貝/mL程度，然后添加終濃度0.4μM的引物序列編號(hào)28、作為終止核酸的0.4μM 3’磷酸化寡DNA序列編號(hào)2，以及終濃度0.04U/μL的PCR用酶PyrobestDNA聚合酶(Takara)，于66℃下反應(yīng)10分鐘。這里使用的寡DNA的序列如下。
序列編號(hào)2GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC序列編號(hào)28CCCATCTTTGCCTGGGAAGCCGTTGATGCC反應(yīng)后，向酶反應(yīng)液中添加1/9量的20×SSC緩沖液、1/9量的10mM EDTA溶液。然后將該溶液添加到預(yù)先在3’末端導(dǎo)入巰基，固定在金電極上含有序列編號(hào)4和序列編號(hào)5的核酸探針，以及預(yù)先在5’末端導(dǎo)入巰基，固定在金電極上含有序列編號(hào)29以及序列編號(hào)30的核酸探針，于35℃下雜交1小時(shí)。雜交后，用0.2×SSC清洗15分鐘，最后測(cè)定ヘキスト33258的電流應(yīng)答。
結(jié)果檢測(cè)到表示與檢測(cè)對(duì)應(yīng)的SNP的核酸探針特異雜交發(fā)生的電流信號(hào)。另外通過(guò)同樣的設(shè)計(jì)，也利用圖10所示的第9例的那樣的本發(fā)明的方法，作出在單鏈的靶核酸上存在3處以上的靶核苷酸序列時(shí)的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)(圖10)。使用做成的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，對(duì)該4處靶核酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)確認(rèn)獲得了特異雜交。
以上結(jié)果表明利用本發(fā)明的方法，可以對(duì)存在于單鏈的靶核酸上的多處靶核苷酸序列同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
另外上述實(shí)施例1至實(shí)施例9中的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的檢測(cè)表示可以通過(guò)利用金電極上的電流應(yīng)答的電化學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行的例子。然而，實(shí)施例1至實(shí)施例9中的任一個(gè)例子也可以通過(guò)眾所周知的方法在制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)上附帶熒光標(biāo)記物質(zhì)，使他們與固定了對(duì)應(yīng)的核酸探針的基體進(jìn)行反應(yīng)后，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度也同樣可以進(jìn)行檢測(cè)。
就象上述詳細(xì)敘述的那樣，如果使用本發(fā)明的方法，在獲得靶核酸設(shè)計(jì)時(shí)的自由度的同時(shí)可以使靶核酸檢測(cè)中的特異性、有效性和靈敏度提高，而且低費(fèi)用和/或在短時(shí)間內(nèi)可以作出靶核酸結(jié)果。
1/10SEQUENCE LISTING<110>KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA<120>Method of preparing of target，method of detecting for target sequence，target，kit for making of target，and assay kit for detecting oftarget sequence<130>04S0167P<150>JP 2003-085670<151>2003-3-26<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>316<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gtcccatttg ttctcactgc cacggaaagc atgtttatag tcttccagca gcaacgccag60gtgtctaggc acagatgaac ccctccttag gatccccact gctcatcata gtgcctacct120ttgttaaagt actagtcacg cagtgtcaca aggaatgttt acttttccaa atccccagct180agaggccagg gatgggtcat ctatttctat atagcctgca cccagattgt aggacagagg240gcatgctcgg taaatatgtg ttcattaact gagattaacc ttccctgagt tttctcacac300caaggtgagg accatg316<210>2<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens
2/10<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’end.
<400>2gcctagacac ctggcgttgc tgctggaaga ctataaac38<210>3<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3catggtcctc accttggtgt20<210>4<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 3’end.
<400>4atgctttccg tggca 15<210>5<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 3’end.
<400>5atgctttcgg tggca 15<210>6
3/10<211>284<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6catggtcctc accttggtgt gagaaaactc agggaaggtt aatctcagtt aatgaacaca60tatttaccga gcatgccctc tgtcctacaa tctgggtgca ggctatatag aaatagatga120cccatccctg gcctctagct ggggatttgg aaaagtaaac attccttgtg acactgcgtg180actagtactt taacaaaggt aggcactatg atgagcagtg gggatcctaa ggaggggttc240atctgtgcct agacacctgg cgttgctgct ggaagactat aaac 284<210>7<211>238<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7cgctagtctc cgccacgaac gccgctctcc caatgccctt ctccgcgctc ctagcgcggt60tactgggcgc tgcccccaga agcgacactc accggtccct gcgcagtgct ggagtgcggc120ctccgctctc gcttcgcctc tttcaccccg cgcccagccc cgccccgcgc cgcgaagaaa180tgaaactcac agaccctgtg ctgagggcgg ctccgggcgc agaaacgaaa cctagctc 238<210>8<211>35<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8gccgccctca gcacagggtc tgtgagtttc atttc 35<210>9<211>15
4/10<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>9gtttctgcgc ccgga 15<210>10<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>10gtttctgctc ccgga 15<210>11<211>211<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11gccgccctca gcacagggtc tgtgagtttc atttcttcgc ggcgcggggc ggggctgggc60gcggggtgaa agaggcgaag cgagagcgga ggccgcactc cagcactgcg cagggaccgg120tgagtgtcgc ttctgggggc agcgcccagt aaccgcgcta ggagcgcgga gaagggcatt180gggagagcgg cgttcgtggc ggagactagc g 211<210>12<211>37<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’en
5/10d.
<400>12gcctagacac ctggcgttgc tgctggaaga ctataaa37<210>13<211>30<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’end.
<400>13cacctggcgt tgctgctgga agactataaa 30<210>14<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’end.
<400>14cctggcgttg ctgctggaag actataaac 29<210>15<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15ccgccctcag cacagggtct gtgagtttca tttc34
6/10<210>16<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16cgccctcagc acagggtctg tgagtttcat ttc 33<210>17<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17gtcccatttg ttctcactgc20<210>18<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18gagctaggtt tcgtttctgc20<210>19<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19cgctagtctc cgccacgaac20<210>20
7/10<211>28<212>DNA<213>Homo sapiens<223>Phosphorothioation is given to phosphodiester bonds on the 3’side of 1st，2nd and 3rd nucleotides.
<400>20tacctggttg atgtatacag atctggtt 28<210>21<211>24<212>DNA<213>Homo sapiens<223>Phosphorothioation is given to phosphodiester bonds on the 3’side of 16th，17th and 18th nucleotides.
<400>21atccctcgat ccctcragca ttat 24<210>22<211>28<212>DNA<213>Homo sapiens<223>Phosphorothioation is given to phosphodiester bonds on the 3’side of 16th，17th and 18th nucleotides.
<400>22tacctggttg atgtatacag atctggtt 28<210>23<211>24<212>DNA
8/10<213>Homo sapiens<223>Phosphorothioation is given to phosphodiester bonds on the 3’side of 1st，2nd and 3rd nucleotides.
<400>23atccctcgat ccctctagca ttat 24<210>24<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>24tacctggttg atgta 15<210>25<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>25atccctcgat ccctc 15<210>26<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>26acaacgcctc cgatg 15
9/10<210>27<211>464<212>DNA<213>Homo sapiens<400>27tgccacggaa agcatgttta tagtcttcca gcagcaacgc caggtgtcta ggcacagatg60aacccctcct taggatcccc actgctcatc atagtgccta cctttgttaa agtactagtc120acgcagtgtc acaaggaatg tttacttttc caaatcccca gctagaggcc agggatgggt180catctatttc tatatagcct gcacccagat tgtaggacag agggcatgct cggtaaatat240gtgttcatta actgagatta accttccctg agttttctca caccaaggtg aggaccatgt300ccctgtttcc atcactccct ctccttctcc tgagtatggt ggcagcgtct tactcagaaa360ctgtgacctg tgaggatgcc caaaagacct gccctgcagt gattgcctgt agctctccag420gcatcaacgg cttcccaggc aaagatgggc gtgatggcac caag 464<210>28<211>30<212>DNA<213>Homo sapiens<400>28cccatctttg cctgggaagc cgttgatgcc 30<210>29<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>29cttggtgcca tcacg 15
10/10<210>30<211>15<212>DNA<213>Homo sapiens<223>A thiol is introduced into the 5’end.
<400>30cttggtgaca tcacg 1權(quán)利要求
1.一種為了檢測(cè)靶核苷酸序列的有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法具備(1)包括在可獲得的適當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使至少含有由與位于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列、以及由與位于上述靶核酸的5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列的第1引物；與上述靶核酸的5’端附近的序列具有同源性，在5’端含有核酸分解酶抗性核酸的第2引物；具有核苷酸延伸活性的酶；由該靶核酸和其互補(bǔ)鏈構(gòu)成的雙鏈核酸核酸反應(yīng)，(2)利用能夠分解上述分解酶非抗性核酸的核酸分解酶對(duì)通過(guò)上述(1)的反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，通過(guò)上述反應(yīng)，獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列的區(qū)域的靶核酸和與該核酸互補(bǔ)的鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
2.一種為了檢測(cè)靶核苷酸序列的有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法包括(1)在可獲得的適當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，使至少含有由與位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列互補(bǔ)、而且核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列、以及與位于第1靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列的第1引物、至少含有與位于第2靶核酸的3’端附近的第2靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列、以及由與第2靶核苷酸序列5’端以外的5’側(cè)的序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列的第2引物、具有核苷酸延伸活性的酶和由該第1靶核酸和第2靶核酸構(gòu)成的雙鏈核酸反應(yīng)，(2)利用核酸分解酶對(duì)通過(guò)上述(1)的反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，通過(guò)上述反應(yīng)，獲得含有單鏈核酸部分和雙鏈核酸部分，在上述單鏈核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述雙鏈核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列的區(qū)域的靶核酸和與該核酸互補(bǔ)的鏈的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。
3.一種檢測(cè)靶核苷酸序列的方法，是具備如下工序的方法(1)通過(guò)使用權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，根據(jù)樣品中的靶核酸制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)，(2)在可獲得適當(dāng)雜交的條件下，使與上述靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸探針與上述(1)制造的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)反應(yīng)，(3)通過(guò)對(duì)利用上述(2)中反應(yīng)產(chǎn)生的雜交進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)上述靶核苷酸序列的存在。
4.用于實(shí)施權(quán)利要求1所述方法的分析試劑盒，包含，第1引物、第2引物和具有核苷酸延伸活性的酶，其中所述第1引物至少包含與靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列，以及與靶核酸的靶核苷酸中相對(duì)于5’端的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列；所述第2引物與上述靶核酸的5’端附近的序列互補(bǔ)，并且在5’端含有核酸分解酶抗性核酸。
5.用于實(shí)施權(quán)利要求2所述方法的分析試劑盒，包含，第1引物、第2引物和具有核苷酸延伸活性的酶，所述第1引物至少含有由核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的與第1靶核苷酸序列互補(bǔ)的序列、以及與第1靶核酸的第1靶核苷酸序列相對(duì)于5’端的5’側(cè)序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列；所述第2引物至少含有與第2靶核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分解酶非抗性核酸構(gòu)成的序列、以及與第2靶核酸的第2靶核苷酸序列相對(duì)于5’端的5’側(cè)的序列互補(bǔ)的核酸分解酶抗性核酸構(gòu)成的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供對(duì)檢測(cè)靶核苷酸序列有用的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的制造方法。提供由靶核酸(1)制造檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)的方法。靶核酸(1)在其一部分含有靶核苷酸序列2(圖1A)。按照本發(fā)明的方法，可以制造靶核酸(1)的靶核苷酸序列2以外的部分可形成雙鏈，使用引物進(jìn)行核酸的延伸的檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)4(圖1B)。還給出了通過(guò)本發(fā)明制造的檢測(cè)用靶結(jié)構(gòu)、使用該靶結(jié)構(gòu)的靶核苷酸序列檢測(cè)方法、檢測(cè)靶結(jié)構(gòu)制造用試劑盒、以及靶核苷酸序列檢測(cè)用分析試劑盒。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101074451SQ20071009669
公開(kāi)日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者堀內(nèi)秀紀(jì), 橋本幸二 申請(qǐng)人:株式會(huì)社東芝