專利名稱：：一種間充質干細胞保存液及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，尤其是一種間充質干細胞保存液及其用途。技術背景間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有以下特點而日益受到人們的關注l)造血支持和促植入。作為造血微環(huán)境主要細胞成分一一基質細胞系的干/祖細胞，MSCs通過細胞對細胞的直接作用、分泌細胞外基質及多種細胞因子，實現(xiàn)對造血的精細調控，支持造血干祖細胞的生長。與造血干細胞共同移植可促進造血干祖細胞的植入，對于提高臍血移植成功率，拓寬臍血移植適用范圍具有重要意義。2)免疫調控。MSCs表達MHC-]類分子，不表達CD80，CD86，HLA-DR等協(xié)同刺激分子，體外可抑制混合淋巴細胞反應，體內誘導免疫耐受，對于預防和治療異基因造血細胞移植后引起的移植物抗宿主病，誘導器官移植免疫耐受有較好的應用前景。3)基因治療。由于MSCs體外擴增、增殖能力強，町以作為基因操作的干細胞平臺，在基因治療中有著十分誘人的前景。4)多向分化潛能。在體內/外特定的誘導條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于組織工程。間充質干細胞MSCs是貼壁細胞，制備成懸液以后很容易聚集成團，在做動物實驗時通過血液輸注MSCs很容易發(fā)生細胞團栓塞血管，造成實驗動物的死亡。目前我國研制的用于白血病治療的"原始間充質干細胞"注射液期臨床研究。國家干細胞系統(tǒng)工程重要組成部分的臍帶間充質干細胞庫也在天津建立。今后間充質干細胞加速在臨床應用是大勢所趨，所以研究-種有效的間充質干細胞保存液是非常重要的。能使目前人間充質千細胞只能在國內小范圍應用擴展到全國，乃至周邊國家。而目前能進行人MSCs分離并大規(guī)模培養(yǎng)的單位很少，而且需要把細胞處理完成以后馬上輸注，一旦放置幾個小時之后，會出現(xiàn)MSCs大量聚集成團，給病人輸注帶來危險，使得能進行MS(:s臨床應用的范圍受到很大限制。目前多數實驗室一般用二乙胺四乙酸(EI〕TA)來抑制間充質千細胞聚集成團，EDTA(臨床用稱依地酸鹽)是一種螯合劑，臨床用依地酸的二鈉鹽或鈣二鈉鹽，在動物實驗中依地酸鹽有致畸作用，雖然鋅可對抗這種作用，但我們保存的為間充質干細胞，為慎重起見最好不用依地酸鹽。我們發(fā)現(xiàn)肝素也能用來抑制間充質千細胞聚集成團。肝素是目前臨床常用的抗凝血藥，臨床用的肝素一般為肝素鈉、肝素鈣、肝素鋰、低分子肝素鈉和低分子肝素鈣等肝素鹽。但低分子肝素與普通肝素比，具有半衰期長，生物活性高的優(yōu)點，出血副作用少，用低分子肝素時可以不用監(jiān)測凝血指標，比較安全。低分子肝素鈣的生物利用度高，抗血栓作用時間可長達24h，很少有出血傾向。所以在實驗中選用低分子肝素鈣來抑制MSCs聚集成團。目前保存細胞一般用含血清保持細胞的高存活率，但目前還沒有適合臨床輸注使用的人血清，而且血清成分復雜，質量不意控制，營養(yǎng)成分相對較多，在保持細胞的高存活率的同時能增加MSCs的聚集成團。而合適濃度的白蛋白在一定時間內也能保持細胞的高存活率。目前也有臨床廣泛使用的白蛋白制劑。在實驗和臨床應用中也有人單使用白蛋白保持細胞的高存活率。到目前為止未發(fā)現(xiàn)有人在間充質干細胞保存液中同時使用白蛋白和肝素的。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種間充質干細胞保存液及其用途，能使人間充質干細胞在運輸過程中的保持高存活率，減少了細胞之間和細胞與容器內壁的黏附，減少臨床輸注人間充質干細胞時血管內出現(xiàn)細胞團栓塞的可能性。為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是---種人間充質干細胞保存液，包含0.01%-20%白蛋白、卜5000AXalU/ml肝素和溶液介質。所述的白蛋白為臨床批準使用的人血白蛋白。所述肝素為臨床批準使用的肝素鹽。所述肝素鹽為低分子肝素鈣或低分子肝素鈉中的一種。所述的溶液介質為無細菌、病毒、支原體污染，內毒素含量〈5EU/ml的液態(tài)介質。所述的溶液介質主要含有生理鹽水、TC199的無血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液。如上所述的人間充質干細胞保存液，用于保存來源包括骨髓、血液、脂肪、臍帶、胎盤、羊水、皮膚、肝、肌肉、血管、神經、肺、腎、腦、流產胚胎/胎兒的全部或部分組織器官的間充質干細胞。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的間充質干細胞保存液，含人白蛋白和肝素作為主要成分，其他輔助試劑如人用細胞因子、磷酸根離子、金屬離子或單糖等一起，包含在保存人間充質千細胞所采用的緩沖溶液中。上述細胞保存液能使人間充質干細胞在運輸過程中的保持高存活率，減少了細胞之間和細胞與容器內壁的黏附，減少臨床輸注人間充質干細胞時血管內出現(xiàn)細胞團栓塞的可能性。本發(fā)明的細胞保存液可使間充質干細胞在環(huán)境溫度4-15"C時在24小時內保持單細胞懸液為主的狀態(tài)，本細胞保存液保存的間充質千細胞通過現(xiàn)代化交通工具可以送達全國各地以及周邊國家，大大增加了臨床使用人間充質千細胞的范圍，所用的成分為符合臨床使用的成分，可滿足臨床使用人間充質干細胞的需要。圖1為臍帶間充質干細胞的免疫表型分析的流式結果；圖2為人為設定判斷MSC聚集情況的標準，根據聚集程度的輕重分為四級s-1、H、.1++、++++;圖3為24小時后不同保存條件下各組聚集情況；從左至右分別是KDTA+in/。白蛋白組、低分子肝素鈣+1%白蛋白組和1%白蛋白組聚集程度的圖象。圖4為間充質千細胞在保存液中保存24小時后免疫表型分析的流式結果，上為0小時，下為24小時。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明的人間充質千細胞保存液，包含0.01%-20%白蛋白、1-5000AXa]U7ml肝素和溶液介質。所述的白蛋白為臨床批準使用的人血白蛋白。所述肝素為臨床批準使用的肝素鹽。所述肝素鹽為低分子肝素鈣或低分子肝素鈉中的一種。所述的溶液介質為無細菌、病毒、支原體污染，內毒素含量〈5EU/ml的液態(tài)介質。所述的溶液介質主要含有生理鹽水、TC199的無血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液。如上所述的人間充質干細胞保存液，用于保存來源包括骨髓、血液、脂肪、臍帶、胎盤、羊水、皮膚、肝、肌肉、血管、神經、肺、腎、腦、流產胚胎/胎兒的全部或部分組織器官的間充質干細胞。間充質干細胞保存液中的溶液介質可以用生理鹽水，無血清培養(yǎng)基等。/￡實驗中我們發(fā)現(xiàn)用間充質干細胞在生理鹽水，白蛋白，低分子肝素鈣配置成的保存液中保存超過6小時以后的存活率低于在TC199無血清培養(yǎng)基，白蛋白，低分子肝素鈣配置成的保存液中的存活率。而且目前TC199無血清培養(yǎng)基常被作為臨床骨髓移植時用來懸浮骨髓細胞的溶液介質。所以我們選用TC199無血清培養(yǎng)基作為保存液中的溶液介質?？鼓蜃覺a國際單位/毫升表示為AXalU/ml。實施例1人臍帶細胞的分離和培養(yǎng)及表型鑒定(1)在體外，將人臍帶由磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗，去除殘留的血液，剪碎至約lmm:'的小塊，加入原料重量0.196的膠原酶，37'C消化45分鐘；(2)加入原料重量O.125%的胰酶(Sigma,USA)37'C消化45分鐘，在消化過程中用轉子攪拌，加入適量的血清終止胰酶的作用；(3)消化液用篩網過濾，先后用100目及2()0目的濾網過濾，去除未消化的組織；(4)將過濾后的消化液用磷酸緩沖液稀釋，消化液與磷酸緩沖液比例為1:10比例；(5)離心，獲得細胞，離心機的轉速為1500rpm/min離心15min，獲得細胞；(6)細胞按12X10Vcm'接種于塑料培養(yǎng)瓶，用含DMEM-LG/F12培養(yǎng)基(Sigma，USA)，5%胎牛血清(FCS)(GibcoBRL,USA)的培養(yǎng)基，置37i:，5%0);:培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4-5滅后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3-4天半量換液。待細胞80%融合，0.25%胰酶消化，按l:3傳代。貼壁細胞常規(guī)消化后以F:TC標記的CD45、CD34、CD31和CD90，PE標記的(:l)29、CD44、CD73、CD105、HLA-DR抗體及其相應同型對照標記細胞，流式細胞儀(FACACa]ibur型，USA)檢測。以上熒光標記抗體均購自BD公司(USA)。臍帶間充質干細胞的流式免疫表型檢測結果顯示臍帶間充質干細胞高表達CD90、CD29、CD44、CD73和CD105，不表達CD45、CD34、CD31和HLA-DK。(圖1)實施例2保存液制備方法中的溶液介質選擇1.l.操作步驟1.1.l含19&人血清白蛋白的TC199和含1%人血清白蛋白生理鹽水的配制。1.1.2用含1%人血清白蛋白的TC199和含1%人血清白蛋白生理鹽水分別制備臍帶間充質干細胞懸液，5X10Vml/ml。分裝6管(每種保存液3支平行管)，2.5ml/管。1.1.3臍帶間充質干細胞懸液分別轉移到西林瓶中，置于4'C，8小時保存后，臺盼蘭染色計數細胞存活率。結果判斷死細胞能被臺盼蘭染.卜.色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3人血清白蛋白濃度的選擇1.l操作步驟1.1.1含5%、2%、1%及0.59&人血清白蛋白TC199的配制。1.1.2制備臍帶間充質干細胞懸液，5X107ml/ml。分裝12管(每種保存液3支平行管)，2.5ml/管。1.1.3800rpm，5min離心后，棄去上清。分別加入2.5ml配制好的各種保存液。1.1.4細胞混勻后分別轉移到12支西林瓶中，置于4°C，8小時保存后，臺盼蘭染色計數細胞存活率。結果判斷死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4EDTA，肝素鈉，低分子肝素鈣對臍帶原始間充質干細胞的影響l.l操作步驟1.1.1.用含1%人血清白蛋白的TC199分別配制配含0.01%EDTA,75AXalU/ml.肝素鈉，75AXalU/ml低分子肝素鈣的保存液。1.1.2制備臍帶間充質干細胞懸液，5X10h/ml。分裝9管(每種保存液3支平行管)，2.5ml/管。l丄3,pm，5min離心后，棄去上清。分別加入2.5ml配制好的各種保存液。1.l..4細胞混勻后分別轉移到9支西林瓶中，分別在保存的0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時時間點，取樣測定細胞存活率。1.1.5結果判斷死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例5EDTA，低分子肝素鈣對臍帶間充質干細胞聚集的影響l.l操作步驟1.1.1用含1%人血清白蛋白的TC199分別配制配含0.O"掘TA,75AXalU/ml低分子肝素鈣的保存液。I.1.2制備臍帶間充質干細胞懸液，5Xl(T/ml。分裝9管(每種保存液3支甲'行管)，2.5ml/管。1.1.3800rpm，5min離心后，棄去上清。分別加入2.5ml配制好的各種保存液。1.1.4細胞混勻后分別轉移到6支西林瓶中，分別在保存的0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時時間點，顯微鏡照4倍物鏡下成像。1..1.5結果判斷根據標準(圖2)判斷聚集情況。與所設定其中某一聚集程度相當時就為對應的+號數，如++;介于某兩個聚集程度之間的寫為前+號數/后一加好數，如+/+*。結果EDTA+l。/。白蛋白組++、低分子肝素鈣+l^白蛋白組-/+、1%白蛋白組+++/++++。(圖3)實施例6間充質干細胞在保存液中保存24小時后免疫表型的分析在保存液保存細胞0小時和24小時后分別取1X10H個細胞，用專業(yè)人員所熟悉的方法標記帶FITC標記的CD45，PE標記的CD73、CD105和HLA-DR流式抗體及其相應同型對照標記抗體，流式細胞儀(FACACalibur型，USA)檢測。以上熒光標記抗體均購自BI)公司(USA)。流式細胞儀檢測分別保存液保存前和保存24小時后的細胞免疫表型。結果顯示細胞高表達CD105、CD73，不表達造血細胞表型HLA-DR、CD45，免疫表型無明顯變化。流式圖見(圖4)實施例7保存液用與保持骨髄來源的間充質干細胞的效果將骨髓來源的間充質干細胞用專業(yè)人員熟知的方法消化、記數，用含1%人血清白蛋白和75AXalU/ml低分子肝素鈣的TC199制備骨髓間充質干細胞懸液，5X10Vml。細胞混勻后分別轉移到6支西林瓶中，分別在保存的O小時、2小時、6小時、12小吋、18小時、24小時時間點，顯微鏡照4倍物鏡下成像。根據標準(圖2)判斷聚集情況。結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>間充質干細胞，能使間充質千細胞在運輸過程中的保持高存活率，減少了細胞之間和細胞與容器內壁的黏附?？蓾M足臨床使用人間充質干細胞的需要，大大增加了臨床使用人間充質千細胞的范圍。權利要求1.一種人間充質干細胞保存液，其特征在于，包含0.01％-20％白蛋白、15000AXaIU/ml肝素和溶液介質。2、根據權利要求1所述的人間充質干細胞保存液，其特征在于，所述的白蛋白為臨床批準使用的人血白蛋白。3、根據權利要求1所述的人間充質干細胞保存液，其特征在于，所述肝素為臨床批準使用的肝素鹽。4、根據權利要求3所述的人間充質干細胞保存液，其特征在于，所述肝素鹽為低分子肝素鈣或低分子肝素鈉中的一種。5、根據權利要求1所述的人間充質千細胞保存液，其特征在于，所述的溶液介質為無細菌、病毒、支原體污染，內毒素含量〈5EU/ml的液態(tài)介質。6、根據權利要求5所述的人間充質干細胞保存液，其特征在于，所述的溶液介質主要含有生理鹽水、TC199的無血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液。7、如權利要求1所述的人間充質干細胞保存液，用于保存來源包括骨髓、血.液、脂肪、臍帶、胎盤、羊水、皮膚、肝、肌肉、血管、神經、肺、腎、腦、流產胚胎/胎兒的全部或部分組織器官的間充質干細胞。全文摘要本發(fā)明公開了一種間充質干細胞保存液及其用途，細胞保存液含人白蛋白和肝素作為主要成分，其他輔助試劑如人用細胞因子、磷酸根離子、金屬離子或單糖等一起，包含在保存人間充質干細胞所采用的緩沖溶液中。能使人間充質干細胞在運輸過程中的保持高存活率，減少了細胞之間和細胞與容器內壁的黏附，減少臨床輸注人間充質干細胞時血管內出現(xiàn)細胞團栓塞的可能性。可使間充質干細胞在環(huán)境溫度4-15℃時在24小時內保持單細胞懸液為主的狀態(tài)，大大增加了臨床使用人間充質干細胞的范圍，所用的成分為符合臨床使用的成分，可滿足臨床使用人間充質干細胞的需要。文檔編號C12N5/08GK101210232SQ200610130638公開日2008年7月2日申請日期2006年12月28日優(yōu)先權日2006年12月28日發(fā)明者劉擁軍,穎池,韓之波,韓忠朝,偉龔申請人:天津昂賽細胞基因工程有限公司