專利名稱：一種快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一類病因復雜又對人類危害廣泛的疾病，是人類目前最難對付的頑癥之一，亦是世界醫(yī)學的一大難題。在以往20年間，人類為戰(zhàn)勝惡性腫瘤付出了艱辛的努力，研制開發(fā)出許多抗腫瘤的藥物。但是現(xiàn)在藥物還遠遠不能滿足人類戰(zhàn)勝這一頑疾的需要，隨著人們對生活質(zhì)量的日益重視，開發(fā)低毒、更為有效的抗腫瘤藥物的要求日益迫切。因此，具有抗腫瘤活性新藥的開發(fā)與研制已成為近年來的重要課題。
天然產(chǎn)物，包括動植物，微生物，含有豐富的代謝產(chǎn)物，是發(fā)現(xiàn)和篩選抗腫瘤活性的來源，特別是近年從海洋生物如藻類中發(fā)現(xiàn)這類活性物質(zhì)報道越來越多，使得從天然物質(zhì)中研發(fā)抗癌藥物成為關(guān)注的熱點。由于藻類具有種類多、可再生性的特點，是一種取之不盡的藥源物質(zhì)，作為一種重要的生物資源越來越受到重視。但這些具有活性功能的物質(zhì)往往含量微，用常規(guī)的篩選技術(shù)很難快速、敏捷的檢測出來。
藥物篩選是基于早期認識到惡性增殖是腫瘤的最大特征，因此細胞毒活性的篩選模型是常規(guī)的篩選方法，但由于細胞毒活性的研究較為繁瑣，周期長，篩選通量受到一定程度的限制。并且，目前臨床上常用的抗腫瘤藥物主要是細胞毒類藥物，這類抗癌藥具有難以避免的選擇性差、毒副作用強、易產(chǎn)生耐藥性等缺點。近年來，隨著生命科學研究的飛速進展，惡性腫瘤細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導、細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞凋亡的誘導、血管生成以及細胞與胞外基質(zhì)的相互作用等各種基本過程正在被逐步闡明，開始建立基于機理的篩選模型等。
基于機理的篩選模型，是與細胞惡變相關(guān)的蛋白分子如受體、酶或者直接以突變的基因為作用靶點進行設(shè)計。因而可以進行無細胞離體體系進行篩選，具有簡便、靈敏、高通量的特點。酪氨酸蛋白激酶是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，它們能催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到許多重要蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使其發(fā)生磷酸化，調(diào)節(jié)著細胞體內(nèi)生長、分化、死亡等一系列生理化過程，其功能的失調(diào)則會引發(fā)生物體內(nèi)的一系列疾病，在細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路中占據(jù)了十分重要的地位。已有的資料表明，超過50％的原癌基因和癌基因產(chǎn)物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它們的異常表達將導致細胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進而導致腫瘤發(fā)生。此外，酪氨酸激酶的異常表達還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的化療抗性密切相關(guān)，因此酪氨酸激酶是重要的機理篩選模型的靶酶。
目前，本發(fā)明采用的酪氨酸激酶試劑盒是一種基于機理篩選模型，無輻射快速靈敏的測定激酶活性的方法，它是無輻射快速靈敏的測定激酶活性的方法，但本試劑盒僅供研究試用，而非診斷使用。根據(jù)操作規(guī)程需要測試磷酸肽的標準曲線和激酶標準曲線，將實驗結(jié)果與酪氨酸激酶活力標準曲線進行比較，從而判斷酪氨酸激酶的活性。由于需要多次實驗，需要使用多個試劑盒才能得到實驗結(jié)果，實驗費用高，不適用于抗腫瘤活性物質(zhì)初期篩選和活性跟蹤檢測的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種適用于抗腫瘤活性物質(zhì)初期篩選和活性跟蹤檢測的需要，效率高、費用低的從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法。
本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，包括下述步驟步驟一將來自天然產(chǎn)物胞內(nèi)或胞外的有機溶劑萃取物或水相提取物過濾，收集粒徑小于0.22μ的濾液，作為待測樣品；步驟二將待測樣品、蛋白濃度為1.3-1.7mg/ml的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力試劑盒底物、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液按照體積比為1∶1∶1∶1的比例混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，用酶標儀迅速讀取該反應試劑混合物的吸光度值；同時將與待測樣品相同的有機溶劑或除鹽海水、與待測樣品相同蛋白濃度的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力試劑盒底物、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液按照體積比為1∶1∶1∶1的比例混合，制成溶劑對照混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，再與待檢測樣品反應試劑混合物相同波長的條件下用酶標儀迅速讀取該溶劑對照混合物的吸光度值，將待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值與溶劑對照混合物的吸光度值進行計算比較，從而判斷是否存在抗腫瘤活性的物質(zhì)。
所述天然產(chǎn)物為藻胞內(nèi)提取物，所述藻胞內(nèi)提取物按照下述方法制備稱取藻粉，置研缽中，加入有機溶劑，研磨15min，轉(zhuǎn)入分液漏斗，震蕩、搖勻、靜置8-12小時，萃取3次；收集合并上清液，并過濾去除藻胞碎片，將上述上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到藻胞內(nèi)提取物。
所述有機溶劑為乙酸乙酯或正戊醇。
所述天然產(chǎn)物為藻液胞外水相樣品，所述藻液胞外水相樣品按照下述方法制備將處于對數(shù)期生長后期的藻液離心，取上清液，將其進行透析除鹽，再濃縮至原體積的十分之一，得到藻胞外水相提取物。
將待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值與溶劑對照混合物的吸光度值進行比較，如果判斷存在抗腫瘤活性的物質(zhì)，則將該檢測樣品進行薄層層析，分離得到各個組分，再將各個組分采用與權(quán)利要求1相同的方法進行篩選，篩選后，對于有活性的組分繼續(xù)用柱層析分離從而得到被分離純化的活性物質(zhì)。
所述酪氨酸激酶按照下述方法制備市售鮮豬肝按照每1g與4ml預冷的溶解緩沖液混勻均質(zhì)，12000×g，4℃離心10min，取上清液，即為酪氨酸激酶的粗提物。
本發(fā)明具有下述技術(shù)效果本發(fā)明的方法以酪氨酸激酶為靶點，利用酪氨酸激酶活力試劑盒和酪氨酸激酶，通過檢測對激酶活性抑制程度的大小，來判斷是否可能存在抗腫瘤活性的物質(zhì)，方便快速，時間僅為2小時，靈敏度比細胞毒篩選模型高一個數(shù)量級，可直接用于制備薄板層析后的活性跟蹤檢測。而且，由于只需要對待測樣品和溶劑對照，實驗次數(shù)少，使用的試劑盒量小，實驗效率高，實驗費用低，適用于抗腫瘤活性物質(zhì)初期篩選和活性跟蹤檢測的需要。


圖1為本發(fā)明的實驗原理圖；
圖2為本發(fā)明實驗的技術(shù)路線圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明詳細說明。
酪氨酸激酶的試劑盒選用CHEMICON公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，其提供的底物為10μg/ml肽，酪氨酸激酶試劑緩沖液的組成為50mmol/L Hepes pH7.2，含10mmol/L MgCl2、2mmol/L MnCl2、0.1mmol/L EDTA、0.4mmol/L EGTA、0.5mmol/L DTT、2.5mmol/L NaF、0.02％BSA小牛血清。測膜性PTK另含0.5％NP-40。
酪氨酸激酶、待檢測樣品采用常規(guī)方法提取。待檢測樣品可以是從微藻、微生物、動植物原材料等提取的有機溶劑萃取物或水相提取物。
式中OD(溶劑對照)為溶劑對照混合物的吸光度值，OD(樣品)為同樣波長的待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值，兩次吸光度值進行比較，得到抑制率。
實施例1選用正戊醇萃取的球等鞭金藻(Isochrysis galbana 3011)胞內(nèi)提取物為待測樣品，從其中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)的方法如下1.提取酪氨酸激酶市售鮮豬肝按照每1g與4ml預冷的溶解緩沖液混勻均質(zhì)，12000×g，4℃離心10min，取上清液，即為酪氨酸激酶的粗提物，使用時用試劑盒的樣品稀釋液稀釋至蛋白濃度為1.35mg/ml。
2.藻胞內(nèi)提取物的制備稱取1g球等鞭金藻3011干粉，置研缽中，加入20ml正戊醇研磨15min，轉(zhuǎn)入分液漏斗，震蕩、搖勻、靜置8-12小時，萃取三次。收集合并上清液，并濾紙過濾去除藻胞碎片，置于燒杯中。上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1ml，之后過濾收集粒徑小于0.22μ的濾液得到藻胞內(nèi)提取物，作為球等鞭金藻3011胞內(nèi)提取物待測樣品。
3.用酪氨酸激酶試劑盒檢測藻胞內(nèi)提取物樣品的抑制激酶的活性
將球等鞭金藻3011胞內(nèi)提取物待測樣品10μl、蛋白濃度為1.35mg/ml的酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒底物10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液10μl混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，用酶標儀迅速讀取該待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值。具體操作如下①.將上述待檢測樣品反應試劑混合物中加入10μl的5倍ATP/MgCl2溶液開始反應。
②.反應混合物的30℃培養(yǎng)期，40min。
③.加入10μl的激酶抑制劑120mM EDTA終止酶反應。
④.轉(zhuǎn)移反應混合物至鏈蛋白酶抗生素包被的96孔板上，每孔50μl，且在37℃下培養(yǎng)30min。
⑤.用1倍沖洗緩沖液沖洗4遍。徹底地清洗板對消除背景來說很重要。從孔中移除液體最好的方法是將板迅速倒置使液體從孔中流出，然后將板印跡在干凈的紙上。
⑥.在每個孔中加入200μl的阻斷緩沖液，且在37℃下培養(yǎng)30min。
⑦.丟棄阻斷緩沖液且在每個反應孔中加入100μl稀釋的鼠源抗-PY20-HRP。在搖床室溫培養(yǎng)1h。
⑧.根據(jù)上面第五步用1倍沖洗緩沖液沖洗4遍。
⑨.將TMB底物放置室溫。在每孔中加入100μl的TMB底物，在室溫下培養(yǎng)15min。
⑩.在每個孔中都加入終止反應液來停止酶反應。在波長為450nm的光照條件下用酶標儀迅速讀取結(jié)果，其吸光度為0.743。
4.同時將正戊醇10μl、蛋白濃度為1.35mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒底物10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液10μl混合，制成溶劑對照混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，其實驗方法與步驟①-⑩相同，在波長為450nm的光照條件下用酶標儀迅速讀取結(jié)果，其吸光度為1.217。
根據(jù)抑制率的計算公式計算抑制率為38.9％。由此可以得出在正戊醇萃取的球等鞭金藻的提取物中，存在著抑制激酶抑制劑的活性物質(zhì)，這種物質(zhì)可能具有抑制腫瘤細胞生長的作用，將正戊醇提取物濃縮十倍，用常規(guī)的MTT方法檢測HeLa細胞系得到的腫瘤細胞抑制率為51.21％，從而證明本實驗篩選出具有抑制酶活性的組分確實具有抑制腫瘤細胞的潛力。使用細胞毒活性法篩選一般檢測一個樣品需要4～5天，本實驗只需2h。而且添加樣品濃度為細胞毒活性的篩選模型的十分之一，從而顯示本實驗方法具有簡便易行，靈敏度高的優(yōu)勢。
由于球等鞭金藻3011胞內(nèi)提取物中存在抗腫瘤活性的物質(zhì)，則將該藻胞內(nèi)提取物進行薄層層析，采用展開系統(tǒng)丙酮-石油醚(1∶60，v/v)，可展開得到4個組分，Rf值從上到下依次為0.9068、0.6610、0.6186和0.5169。采用本發(fā)明的上述篩選方法活性跟蹤發(fā)現(xiàn)正戊醇萃取粗提物的4個組分之一(Rf 0.5169)有明顯的抑制激酶活性。將該組分用硅膠柱層析，以丙酮-石油醚為洗脫劑進行再次分離，得到5個組分。再采用本發(fā)明的上述篩選方法檢測，其中第4個組分其抑制激酶活性作用明顯，抑制率為86.13％，因此很快地的鎖定了目標活性物質(zhì)。
實施例2球等鞭金藻3011胞外水相為待測樣品進行篩選的方法如下藻液胞外水相樣品的制備將處于對數(shù)生長后期的藻液離心，取上清，將其進行透析除鹽，再濃縮至原體積的十分之一。之后過濾收集粒徑小于0.22μ的濾液作為藻液胞外水相待測樣品。
將藻胞外水相待測樣品10μl、蛋白濃度為1.68mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒底物10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液10μl混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，即實施例1中①-⑩的步驟，至酶反應結(jié)束，在波長450nm光照的條件下用酶標儀迅速讀取該待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值為1.852。
同時將經(jīng)除鹽處理用于培養(yǎng)金藻3011的培養(yǎng)基即除鹽海水10μl、蛋白濃度為1.68mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒底物10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液10μl混合，制成溶劑對照混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，其實驗方法與實施例1步驟①-⑩相同，在波長為450nm的光照條件下用酶標儀迅速讀取結(jié)果，其吸光度為1.822。
將該藻胞外水相待測樣品吸光度與除鹽海水的吸光度值對照，按照抑制率公式得出抑制率幾乎為0，可以得出該藻胞外水相中沒有抑制激酶活性的物質(zhì)。
實施例3選用乙酸乙酯萃取的球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)胞內(nèi)提取物為待測樣品，從其中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)的方法如下球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)胞內(nèi)提取物使用乙酸乙酯有機溶劑萃取、濃縮至1ml，之后過濾收集粒徑小于0.22μ的濾液作為藻胞內(nèi)提取物待測樣品。
將上述待測樣品10μl、蛋白濃度為1.52mg/ml酪氨酸激酶10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒底物10μl、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液10μl混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，在波長450nm光照的條件下用酶標儀迅速讀取該待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值為0.075。其它與實施例1相同，其對應的乙酸乙酯溶劑對照的吸光度值為0.877，按照抑制率的公式計算，抑制率為91.45％，因此在該藻粉的乙酸乙酯有機相中存在很強的激酶抑制活性的物質(zhì)。對其萃取物的石油醚∶乙醚(1∶1，v/v)薄層層析所得到的5個分離組分(Rf值分別為0.4820、0.1325、0.5060、0.9398和0.9759)采用本發(fā)明的實施例1的篩選方法檢測，其中Rf值為0.4820的分離組分對酪蛋白激酶的酶促反應有明顯的抑制作用，其ΔOD值為0.670，抑制率為76.05％，說明此組分中含有酪蛋白激酶抑制劑的有效組分，所以對該分離組分再進行硅膠柱層析分離，分別采用5種洗脫劑(石油醚∶乙醚(1∶1，v/v)、石油醚∶乙醚(1∶3，v/v)、石油醚∶乙醚(1∶6，v/v)、乙醇和甲醇)洗脫并收集得到的5個組分，用此方法進行檢測，其中用甲醇洗脫收集得到的組分相對而言對酪蛋白激酶的酶促反應有較強的抑制作用，其ΔOD值為0.672，抑制率為76.80％，對該組分進一步分離純化，可以篩選出具有抗腫瘤作用的生物活性物質(zhì)。
本發(fā)明的方法利用激酶(從豬肝中提取的粗酶制劑)將磷酸基團偶聯(lián)在預先制備的個短肽上，磷酸化的短肽與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸單抗偶聯(lián)，發(fā)生顯色反應。藻類中的有機溶劑萃取物中含有激酶抑制劑，就不發(fā)生顯色反應/抑制顯色反應，建立了一套藻類抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選方法，本發(fā)明快速便捷，只需要2個小時。
權(quán)利要求
1.一種快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，包括下述步驟步驟一將來自天然產(chǎn)物胞內(nèi)或胞外的有機溶劑萃取物或水相提取物過濾，收集粒徑小于0.22μ的濾液，作為待測樣品；步驟二將待測樣品、蛋白濃度為1.3-1.7mg/ml的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力試劑盒底物、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液按照體積比為1∶1∶1∶1的比例混合，制成待檢測樣品反應試劑混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，用酶標儀迅速讀取該反應試劑混合物的吸光度值；同時將與待測樣品相同的有機溶劑或除鹽海水、與待測樣品相同蛋白濃度的酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力試劑盒底物、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液按照體積比為1∶1∶1∶1的比例混合，制成溶劑對照混合物，再按照酪氨酸激酶試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，再與待檢測樣品反應試劑混合物相同波長的條件下用酶標儀迅速讀取該溶劑對照混合物的吸光度值，將待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值與溶劑對照混合物的吸光度值進行計算比較，從而判斷是否存在抗腫瘤活性的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述天然產(chǎn)物為藻胞內(nèi)提取物，所述藻胞內(nèi)提取物按照下述方法制備稱取藻粉，置研缽中，加入有機溶劑，研磨15min，轉(zhuǎn)入分液漏斗，震蕩、搖勻、靜置8-12小時，萃取3次；收集合并上清液，并過濾去除藻胞碎片，將上述上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到藻胞內(nèi)提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述有機溶劑為乙酸乙酯或正戊醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述天然產(chǎn)物為藻液胞外水相樣品，所述藻液胞外水相樣品按照下述方法制備將處于對數(shù)期生長后期的藻液離心，取上清液，將其進行透析除鹽，再濃縮至原體積的十分之一，得到藻胞外水相提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，將待檢測樣品反應試劑混合物的吸光度值與溶劑對照混合物的吸光度值進行比較，如果判斷存在抗腫瘤活性的物質(zhì)，則將該檢測樣品進行薄層層析，分離得到各個組分，再將各個組分采用與權(quán)利要求1相同的方法進行篩選，篩選后，對于有活性的組分繼續(xù)用柱層析分離從而得到被分離純化的活性物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶按照下述方法制備市售鮮豬肝按照每1g與4ml預冷的溶解緩沖液混勻均質(zhì)，12000×g，4℃離心10min，取上清液，即為酪氨酸激酶的粗提物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速從天然產(chǎn)物中篩選具有抗腫瘤活性物質(zhì)的方法，旨在提供一種適用于抗腫瘤活性物質(zhì)初期篩選和活性跟蹤檢測的需要，效率高、費用低的篩選方法。將胞內(nèi)或胞外的萃取物或水相提取物過濾，收集粒徑小于0.22μ的濾液，作為待測樣品；將待測樣品、酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力試劑盒底物、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液混合，按照試劑盒的常規(guī)方法進行操作，至酶反應結(jié)束，讀取其吸光度值；將與待測樣品相同的有機溶劑或除鹽海水、酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力試劑盒底物、酪氨酸激酶活力試劑盒的緩沖液混合，采用相同的方法處理后讀取其吸光度值，將兩個吸光度值進行計算比較，判斷是否存在抗腫瘤活性的物質(zhì)。
文檔編號C12N9/12GK1978661SQ20061013040
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者王雪青, 趙培, 胡蓓娟, 胡萍, 龐廣昌, 黃丹虹, 郭曉雪 申請人:天津商學院