專利名稱：融合基因腫瘤疫苗及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及融合基因腫瘤疫苗及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
目前，針對(duì)腫瘤的治療，廣泛采用的是手術(shù)、化療及放療，雖然用手術(shù)、化療及放射治療等常規(guī)一線治療可以清除大部分腫瘤細(xì)胞并能使多數(shù)癌癥患者的病情得到緩解，但這些治療方法很難達(dá)到完全根除癌細(xì)胞的效果，因此在大多數(shù)病人中腫瘤的復(fù)發(fā)是不可避免的。作為機(jī)體防御疾病的一個(gè)重要機(jī)制，免疫系統(tǒng)具有高效性、高特異性和持久性(免疫記憶)的特點(diǎn)，因此，利用主動(dòng)免疫的手段激發(fā)病人自身免疫力來治療腫瘤具有很大的臨床應(yīng)用潛能。
免疫系統(tǒng)由先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)兩大部分組成，免疫應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜并受到精密調(diào)控的過程。病毒、細(xì)菌等病原體在結(jié)構(gòu)上多具有它們所特有的并且相對(duì)保守的分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，簡(jiǎn)稱PAMP)，當(dāng)感染發(fā)生時(shí)，病原體通過PAMP與宿主細(xì)胞所表達(dá)的相應(yīng)受體的作用而首先激活先天免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生、釋放。這些因子不但對(duì)病原體具有直接的殺傷和抑制作用，而且還吸引和激活在抗原遞呈中起關(guān)鍵作用的DC。隨后，被激活并捕獲抗原的DC遷移至淋巴結(jié)等周圍淋巴器官并在此激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)為具有高度特異性和記憶特性的B細(xì)胞和T細(xì)胞的活化。這種先天免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)的密切配合既保證了機(jī)體能夠?qū)ν鈦聿≡w的侵害產(chǎn)生迅速的反應(yīng)和持久的監(jiān)控，也同時(shí)避免了激發(fā)對(duì)自體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)。在這一系列過程中，DC構(gòu)成了先天免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)有機(jī)聯(lián)結(jié)中的關(guān)鍵一環(huán)，CD4+T輔助細(xì)胞(CD4+Th)則通過釋放細(xì)胞因子和直接細(xì)胞接觸傳導(dǎo)信號(hào)的方式對(duì)B細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，簡(jiǎn)稱CTL)的激活、擴(kuò)張和免疫記憶的建立過程中起到了極為重要的作用。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigen，簡(jiǎn)稱TAA)，并且在腫瘤發(fā)生的病理過程中，由于組織損傷和細(xì)胞壞死等原因會(huì)導(dǎo)致一些炎性細(xì)胞因子、熱休克蛋白的釋放。因此，像對(duì)待微生物病原體感染一樣，免疫系統(tǒng)應(yīng)監(jiān)測(cè)到腫瘤快速生長(zhǎng)時(shí)釋放的這種“危險(xiǎn)”信號(hào)并做出相應(yīng)的反應(yīng)以抑制腫瘤生長(zhǎng)。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)也證實(shí)免疫系統(tǒng)確能對(duì)腫瘤的發(fā)生做出自發(fā)的免疫反應(yīng)，一些臨床試驗(yàn)更進(jìn)一步顯示主動(dòng)免疫(疫苗治療)能在某些病人中獲得一定的治療效果。然而，與抗微生物疫苗在預(yù)防傳染性疾病方面所獲得的成功相比，目前大多數(shù)癌癥疫苗的有效性還遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度，其主要原因是這些疫苗不能有效地激活免疫系統(tǒng)對(duì)“自身性”腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。因此，如何克服免疫系統(tǒng)對(duì)自身性腫瘤抗原的免疫耐受性是腫瘤疫苗能否在臨床上取得滿意療效所需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能克服免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的耐受性、增強(qiáng)抗腫瘤效力的融合基因腫瘤疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供一種融合基因腫瘤疫苗的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種融合基因腫瘤疫苗，用下列步驟構(gòu)建用重組DNA的方法將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因與腫瘤抗原基因連接，即制成一種融合基因腫瘤疫苗，所述大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因簡(jiǎn)稱EtxB。
所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2為PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到320bp DNA片段，與用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB，再以序列表SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5為PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化，得到796bp DNA片段，與用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化的所述pEtxB載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pBCL1-EtxB。
所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.2為PCR引物，用PCR的方法將編碼tPA信號(hào)肽的DNA片段與所述的EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到429 bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB質(zhì)粒DNA為模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11為引物把編碼CT26腫瘤CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原表位的DNA片段AH1與tPA-EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到456bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB-AH1。
一種融合基因腫瘤疫苗構(gòu)建方法，是由下述步驟組成用重組DNA的方法將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因與腫瘤抗原基因連接，即制成一種融合基因腫瘤疫苗，所述大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因簡(jiǎn)稱EtxB。
所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2為PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到320bp DNA片段，與用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB，再以序列表SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5為PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化，得到796bp DNA片段，與用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化的所述pEtxB載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pBCL1-EtxB。
所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.2為PCR引物，用PCR的方法將編碼tPA信號(hào)肽的DNA片段與所述的EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到429bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB質(zhì)粒DNA為模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11為引物把編碼CT26腫瘤CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原表位的DNA片段AH1與tPA-EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到456bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB-AH1。
本發(fā)明采用把弱免疫原性的腫瘤抗原與強(qiáng)免疫原性的細(xì)菌抗原(EtxB)相聯(lián)結(jié)的DNA疫苗設(shè)計(jì)。此融合疫苗設(shè)計(jì)的要旨在于免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌抗原會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在反應(yīng)中被激活的針對(duì)細(xì)菌抗原的CD4+Th細(xì)胞可通過鏈接輔助(Linked Help)的免疫學(xué)原理激活針對(duì)腫瘤抗原的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，本發(fā)明的一種融合基因腫瘤疫苗技術(shù)是克服免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原免疫耐受性的有效手段，適用于高效增強(qiáng)腫瘤疫苗的效力。


圖1為載體質(zhì)粒pEtxB的構(gòu)建策略。
圖2為融合基因腫瘤疫苗pBCL1-EtxB的構(gòu)建策略。
圖3為載體質(zhì)粒ptPA-EtxB的構(gòu)建策略。
圖4為融合基因腫瘤疫苗pEtxB-AH1的構(gòu)建策略。
圖5.融合基因腫瘤疫苗pBCL1-EtxB能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗BCL1免疫球蛋白抗體并顯著延長(zhǎng)小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的存活率。
圖6.融合基因腫瘤疫苗pEtxB-AH1能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生AH1特異性T細(xì)胞反應(yīng)并顯著延長(zhǎng)小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的存活率。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1融合基因腫瘤疫苗pBCL1-EtxB的構(gòu)建以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2為PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列為模板，擴(kuò)增并引入NotI和XbaI酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)的體積為50μl含0.1μgSEQ IDNo.3所述的EtxB DNA模版，20pmol SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶(德國(guó)Qiagen公司)及5μl 10×PCR緩沖液，PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)5輪；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃45sec.，循環(huán)25輪獲得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到320bp DNA片段，與用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3(Invitrogen公司)載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB，構(gòu)建策略見圖1，(圖中ID 1即為SEQ ID No.1，ID 2即為SEQ ID No.2，其它以此類推)；再以序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5為PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFvDNA序列為模板，擴(kuò)增引入HindIII和NotI酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)的體積為50μl含0.1μgBCL1 scFv DNA模版，20pmol SEQ ID No.4和SEQ ID No.5 PCR引物，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶及5μl 10×PCR緩沖液，PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)5輪；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)25輪，獲得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化，得到796 bp DNA片段，與用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化的所述pEtxB載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pBCL1-EtxB，構(gòu)建策略見圖2。
實(shí)施例2融合基因腫瘤疫苗pEtxB-AH1的構(gòu)建以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和ID No.2為PCR引物，用PCR的方法將編碼tPA信號(hào)肽的DNA片段與所述的EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到429bp DNA片段，PCR反應(yīng)的體積為50μl含0.1μg EtxB DNA模版，20pmol SEQ ID No.7、2pmol SEQ ID No.8、2pmol SEQ ID No.9、2pmol SEQ ID No.10和20pmol SEQ ID No.2引物，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶及5μl 10×PCR緩沖液，PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)5輪；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)25輪，擴(kuò)增獲得的EtxB片段用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒(Invitrogen公司)用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連結(jié)獲得ptPA-EtxB，構(gòu)建策略見圖3；再用PCR的方法用ptPA-EtxB質(zhì)粒DNA為模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11為引物把編碼CT26腫瘤CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原表位的DNA片段AH1與tPA-EtxB融合，PCR反應(yīng)的體積為50μl含0.1μg ptPA-EtxB DNA，20pmol SEQ ID No.7和SEQ IDNo.11PCR引物，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶及5μl 10×PCR緩沖液，PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)5輪；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循環(huán)25輪，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到456bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒(Invitrogen公司)，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB-AH1，構(gòu)建策略見圖4。
影響癌癥疫苗有效性的因素很多，而如何打破免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的耐受性則是最為關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)TAA是源于自身的抗原而不是外源抗原，所以在T細(xì)胞的整體構(gòu)成中能識(shí)別這種自我性的TAA的T細(xì)胞(簡(jiǎn)稱TAA-T細(xì)胞)的數(shù)量和它們對(duì)TAA的親和力都是非常有限的，這首先是因?yàn)樵谥醒朊庖吣褪軝C(jī)制的調(diào)控下那些對(duì)TAA有較強(qiáng)親和力的T細(xì)胞在胸腺中就被除掉了。此外，那些由于親和力較低而未被中央免疫耐受機(jī)制所清除的TAA-T細(xì)胞在進(jìn)入外周系統(tǒng)后也會(huì)在外周免疫耐受機(jī)制的作用下或者被清除或者失去對(duì)TAA的反應(yīng)能力。同樣，B細(xì)胞的整體構(gòu)成也受類似的免疫耐受機(jī)制的調(diào)控。由于CD4+Th在B細(xì)胞和CD8+CTL免疫反應(yīng)(激活、擴(kuò)張和記憶)建立過程中的決定性作用，如何克服CD4+Th系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的耐受性是腫瘤疫苗研究中所必須解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。對(duì)此，我們采用了把腫瘤抗原與具有強(qiáng)免疫原性的大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位(EtxB)融合的疫苗設(shè)計(jì)。這種融合疫苗的要旨在于免疫系統(tǒng)對(duì)EtxB這種外源抗原沒有耐受性，因此會(huì)對(duì)它產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在反應(yīng)中被激活的針對(duì)細(xì)菌抗原的CD4+Th細(xì)胞可通過鏈接輔助(Linked help)的免疫學(xué)原理高效激活針對(duì)腫瘤抗原的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外，EtxB除能起到提供鏈接輔助的作用外，它本身還有直接激活T、B和DC細(xì)胞的作用。還有，與絕大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原不同，EtxB能夠以受體介導(dǎo)的胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞并通過MHC-I(Major Histocompatibility Class I)途徑來激活CD8+CTL反應(yīng)，這對(duì)通過交叉遞呈機(jī)制(Cross Priming)激活CD8+CTL具有重要促進(jìn)作用。
材料1)菌株和細(xì)胞系大腸桿菌宿主菌JM103來自Promega公司。
BCL1為小鼠B細(xì)胞白血病/淋巴癌細(xì)胞系并表達(dá)IgM/λ，293T細(xì)胞系為人胚胎腎上皮細(xì)胞，CT26為小鼠腸癌細(xì)胞系，以上三種細(xì)胞系均來自ATCC細(xì)胞保藏中心。
2)EtxB基因和BCL1 scFv基因EtxB基因根據(jù)文獻(xiàn)1報(bào)道的核酸序列化學(xué)合成。BCL1 scFv基因片段按文獻(xiàn)2報(bào)道的核酸序列和文獻(xiàn)3報(bào)道的方法構(gòu)建。
文獻(xiàn)1 Leong，J.，Vinal，A.C.and Dallas，W.S(1985).Nucleotide sequence comparison betweenheat-labile toxin B-subunit cistrons from Escherichia coli of human and porcine origin.Infect.Immun.48(1)，73-77.
文獻(xiàn)2 Schreurs，M.W.J.，van den Berk，P.C.M.，van Oers，M.H.J.and Kersten，M.J(2000).MurineBCL1 lymphoma-derived single chain antibody(scFv)sequence.GeneBank accession numberAF239196.
文獻(xiàn)3 Hawkins RE，Zhu D，Ovecka M，Winter G，Hamblin TJ，Long A，Stevenson FK(1994).Idiotypic vaccination against human B-cell lymphoma.Rescue of variable region gene sequencesfrom biopsy material for assembly as single-chain Fv personal vaccines.Blood 833279-88.
3)基因工程用工具酶和其他化學(xué)試劑限制內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶以及分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)所需化學(xué)品和培養(yǎng)基等購自Promega、Invitrogen、New England Biolabs及Sigma等公司。
方法除以下詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)方法外，分子克隆及其它DNA遺傳操作均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)技術(shù)，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh EF，Maniatis T.Molecular CloningA Laboratory Manual 2nded.NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
實(shí)施例3融合基因腫瘤疫苗pBCL1-EtxB誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的研究ELISA檢測(cè)小鼠對(duì)pBCL1-EtxB抗腫瘤疫苗的抗體反應(yīng)選用4-6周齡的BALB/c小鼠，pBCL1-EtxB實(shí)驗(yàn)組、pBCL1、pEtxB載體對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組各8只。用無菌生理鹽水將DNA疫苗質(zhì)粒載體溶解至0.5mg/ml，然后在小鼠的兩只后肢四頭肌處分別注射50μl DNA疫苗。以后每隔3周以同樣方法進(jìn)行共兩次加強(qiáng)免疫注射。在每次疫苗接種前從小鼠尾部取血，經(jīng)凝血、離心后獲得血清用于ELISA抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示接受pBCL1-EtxB和pEtxB免疫接種的小鼠都產(chǎn)生了抗EtxB抗體反應(yīng)，而pBCL1和生理鹽水實(shí)驗(yàn)組則沒有抗EtxB抗體反應(yīng)。接受pBCL1-EtxB接種的小鼠產(chǎn)生了抗BCL1 IgM抗體反應(yīng)，而接受pEtxB和pBCL1接種以及生理鹽水對(duì)照組的小鼠則無抗BCL1 IgM抗體反應(yīng)。
腫瘤接種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pBCL1-EtxB抗腫瘤疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)作用在第3次接種3周后，通過靜脈注射給小鼠輸入2.5×105BCL1腫瘤細(xì)胞，此后每天觀察腫瘤在小鼠內(nèi)的生長(zhǎng)情況。觀察發(fā)現(xiàn)，只有pBCL1-EtxB接種才能有效地抑制BCL1腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)、顯著提高小鼠的存活率(圖5)。
以上結(jié)果表明僅表達(dá)BCL1scFv的DNA疫苗不能有效激活B細(xì)胞反應(yīng)，但pBCL1-EtxB融合疫苗則能非常有效地誘導(dǎo)抗腫瘤B細(xì)胞免疫反應(yīng)。
實(shí)施例4融合基因腫瘤疫苗pEtxB-AH1誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的研究ELISA檢測(cè)小鼠對(duì)pEtxB-AH1抗腫瘤疫苗的抗體反應(yīng)選用4-6周齡的BALB/c小鼠，pEtxB-AH1實(shí)驗(yàn)組、pEtxB空載體對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組各8只。用無菌生理鹽水將DNA疫苗質(zhì)粒載體溶解至0.5mg/ml，然后在小鼠的兩只后肢四頭肌處分別注射50μlDNA疫苗。以后隔3周以同樣方法進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫注射。在每次疫苗接種前從小鼠尾部取血，經(jīng)凝血、離心后獲得血清用于ELISA抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示接受pEtxB-AH1和pEtxB免疫接種的小鼠都產(chǎn)生了抗EtxB抗體反應(yīng)，但生理鹽水實(shí)驗(yàn)組則沒有抗EtxB抗體反應(yīng)。
腫瘤接種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pEtxB-AH1抗腫瘤疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)作用在第2次接種3周后，通過靜脈注射給小鼠輸入1×105CT26腫瘤細(xì)胞，此后每天觀察腫瘤在小鼠內(nèi)的生長(zhǎng)情況。觀察發(fā)現(xiàn)，只有pBCL1-EtxB接種才能有效地抑制CT26腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)、顯著提高小鼠的存活率(圖6)。
序列表<110>天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司<120>融合基因腫瘤疫苗及構(gòu)建方法<160>11<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<22 1>misc_difference<222>(1)…(31)<400>1tatagcggcc gctgctcctc agtctattac a 31<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(30)<400>2tatatctaga ctagttttcc atactgattg 30<210>3<211>312<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(312)<400>3gctcctcagtctattacagaactatgttcggaatatcacaacacacaaatatatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggcaaaagagaaatggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatggaaaactag<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(34)<400>4tataaagcttgccaccatgggttggagctgtatc
<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(31)<400>5tatagcggccgcacctaggacagtgaccttg<210>6<211>783<212>DNA<213>人工序列(小部分是人工序列，大部分來自小鼠(Mus musculus))<221>misc_difference<222>(1)…(783)<400>6atgggttggagctgtatcatcttctttctggtagcaacagctacaggtgtgcactcccaggtccagctgcagcagtctgggcctgaggtggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacacattcactgattatgctatgcactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattggagttattagtacttacaatggtaatacaaactacaaccagaagtttaagggcaaggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagatactatggtaactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaggctgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaactagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagctccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattttattttcggcagtggaaccaaggtcactgtcctaggt<210>7<211>49<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(49)<400>7tataaagcttgccaccatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtg<210>8<211>48<212>DNA<213>人工序列
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權(quán)利要求
1.一種融合基因腫瘤疫苗，其特征用下列步驟構(gòu)建用重組DNA的方法將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因與腫瘤抗原基因連接，即制成一種融合基因腫瘤疫苗，所述大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因簡(jiǎn)稱EtxB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合基因腫瘤疫苗，其特征是所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2為PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxBDNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到320bp DNA片段，與用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB，再以序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5為PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化，得到796bp DNA片段，與用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化的所述pEtxB載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pBCL1-EtxB。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合基因腫瘤疫苗，其特征是所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.2為PCR引物，用PCR的方法將編碼tPA信號(hào)肽的DNA片段與所述的EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到429bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB質(zhì)粒DNA為模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11為引物把編碼CT26腫瘤CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原表位的DNA片段AH1與tPA-EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到456bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB-AH1。
4.一種融合基因腫瘤疫苗構(gòu)建方法，其特征是由下述步驟組成用重組DNA的方法將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因與腫瘤抗原基因連接，即制成一種融合基因腫瘤疫苗，所述大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因簡(jiǎn)稱EtxB。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種融合基因腫瘤疫苗構(gòu)建方法，其特征是所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2為PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到320bp DNA片段，與用NotI和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB，再以序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5為PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列為模板，擴(kuò)增，獲得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化，得到796bp DNA片段，與用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶消化的所述pEtxB載體質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pBCL1-EtxB。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種融合基因腫瘤疫苗構(gòu)建方法，其特征是所述EtxB與腫瘤抗原基因的連接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.2為PCR引物，用PCR的方法將編碼tPA信號(hào)肽的DNA片段與所述的EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到429bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB質(zhì)粒DNA為模板、SEQ ID No.7和SEQ IDNo.11為引物把編碼CT26腫瘤CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原表位的DNA片段AH1與tPA-EtxB融合，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化，得到456bp DNA片段，與用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化的pcDNA3載體質(zhì)粒，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制成pEtxB-AH1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合基因腫瘤疫苗及構(gòu)建方法，構(gòu)建步驟是用重組DNA的方法將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因與腫瘤抗原基因連接，制成一種融合基因腫瘤疫苗，所述大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因簡(jiǎn)稱EtxB，本發(fā)明采用把弱免疫原性的腫瘤抗原與強(qiáng)免疫原性的細(xì)菌抗原EtxB相聯(lián)結(jié)的DNA疫苗設(shè)計(jì)，此融合基因腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的要旨在于免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌抗原會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在反應(yīng)中被激活的針對(duì)細(xì)菌抗原的CD文檔編號(hào)C12N15/09GK1966083SQ200610129599
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月27日
發(fā)明者朱德琳 申請(qǐng)人:天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司