專利名稱：殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種用于預(yù)防或治療結(jié)核病的疫苗及其制備方法和應(yīng)用，特別是一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病的死灰復(fù)燃是當(dāng)今全球重大的健康問題，由于人口密集度和流動性日益增加、常規(guī)BCG疫苗的無效性、結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)、以及AIDS病導(dǎo)致的結(jié)核并發(fā)感染，目前結(jié)核發(fā)病及死亡非常嚴(yán)重，全球每年有800萬活動性結(jié)核患者并導(dǎo)致300萬死亡；我國約有5. 5億人口曾經(jīng)感染結(jié)核，每年13萬人死于結(jié)核，每月約有12萬新發(fā)病人。2006年結(jié)核已一躍成為我國感染性疾病發(fā)病的首位，研制新型結(jié)核預(yù)防疫苗非常迫切。研究表明，結(jié)核分枝桿菌主要感染肺部巨噬細(xì)胞。誘導(dǎo)⑶4+Thl細(xì)胞及其分泌的高水平的IFNy，不僅能夠增強巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力，還可以通過促進(jìn)⑶8+CTL的誘導(dǎo)發(fā)揮特異性殺傷結(jié)核感染細(xì)胞，對于清除結(jié)核桿菌至關(guān)重要?；蛞呙缁蚍QDNA疫苗，是將外源目的基因構(gòu)建于真核表達(dá)質(zhì)粒、直接注射動物的第三代疫苗，由于可在體內(nèi)表達(dá)目的抗原，通過外源性、內(nèi)源性以及交叉抗原提呈激活DC細(xì)胞，有效激活⑶4+Thl和⑶8+T細(xì)胞，因此特別有利于誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答。然而，在機(jī)體的什么部位誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答同樣是一個關(guān)鍵問題，雖然誘導(dǎo)脾臟和淋巴結(jié)(全身性)Thl型免疫應(yīng)答是傳統(tǒng)疫苗的重點，但是，有關(guān)抗粘膜感染病原體免疫的國際前沿研究表明誘導(dǎo)肺粘膜局部的粘膜T細(xì)胞免疫應(yīng)答對于清除粘膜感染病原體更為重要。結(jié)核桿菌主要通過呼吸道粘膜入侵機(jī)體，粘膜免疫是人體免疫的第一道防線，可在感染的早期和最初感染部位有效控制感染，防止感染擴(kuò)散。誘導(dǎo)呼吸道和肺部特異性粘膜免疫應(yīng)答，可有效控制結(jié)核早期感染，防止細(xì)菌播散，因此誘生特異性粘膜免疫成為新型結(jié)核疫苗研制的熱點和重點。通過呼吸道給予粘膜疫苗可更好地模擬結(jié)核桿菌天然感染，誘導(dǎo)特異性粘膜免疫，在粘膜感染的第一時間清除病原體，產(chǎn)生更為有效的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用。然而，粘膜部位接種抗原通常很難誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，由于粘膜局部纖毛的頻繁擺動、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使得外來抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通過粘膜遞送系統(tǒng)來對DNA疫苗進(jìn)行組裝，而后行粘膜免疫。因此，申請人以已公開的基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗(基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用。專利申請?zhí)?00710171416.X)為基礎(chǔ)，以一種特定性質(zhì)
的天然多糖------殼寡糖(oligo-chitosan)通過共聚沉淀的方法與結(jié)核基因疫苗形成殼
寡糖-DNA納米顆粒復(fù)合物，而后進(jìn)行滴鼻免疫，誘導(dǎo)結(jié)核特異性全身和肺部粘膜Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗及其制備和應(yīng)用，所述的這種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗要解決現(xiàn)有技術(shù)中由于常規(guī)BCG疫苗的無效性、以及結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)和AIDS病導(dǎo)致的結(jié)核并發(fā)感染使得現(xiàn)有疫苗預(yù)防和治療結(jié)核病的效果不佳的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，由殼寡糖與結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒共聚交聯(lián)復(fù)合而成，所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒由一個載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因中嵌合有來自結(jié)核桿菌抗原的4個T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個T細(xì)胞表位分別是結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO 8所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65全長基因中的第438位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 228位基因、第486位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的Ag85B蛋白的420 459位基因之間以gccgcctac基因序列相連接。嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的4個T細(xì)胞表位基因的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO 12所示。進(jìn)一步的，所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自pcDNA3. 1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37RV株來源結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 2 位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 9所示。進(jìn)一步的，嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的4個T細(xì)胞表位基因的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 11 所示。進(jìn)一步的，所述的殼寡糖的分子量在3000 6000之間，脫乙酰度為75% -85%。進(jìn)一步的，本發(fā)明的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株DNA作為模板，用SEQ ID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO :14所示的下游引物通過PCR方法擴(kuò)增結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65編
碼基因；2)以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65基因作為模板，分別通過PCR擴(kuò)增彼此有17個堿基重疊的雙鏈DNA片段1、片段2、片段3 ；3)以SEQID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQID NO 15所示的Tl引物，通過PCR擴(kuò)增片段1，所述的片段1的雙鏈DNA的序列為atggccaagacaattgcgtacgacgaagaggcccgtcgcggcctcgagcggggcttgaac
taccggttctgttaacgcatgctgcttctccgggcagcgccggagctcgccccgaacttg
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cgctaaagccgcccactggtcaggtagc 4)以SEQ ID NO 16所示的T2引物和SEQ ID NO 17所示的El引物通過PCR擴(kuò)增片段2，所述的片段2的雙鏈DNA的序列為gggtgaccagtccatcggtgacctgatcgccgagggtctttcgatggct
cccactggtcaggtagccactggactagcggctcccagaaagctaccga
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5)以 SEQ ID NO 18 所示的 E2 引物和 SEQ ID NO 14所示的HSP65下游引物通過PCR擴(kuò)增片段3，所述的片段3的雙鏈DNA的序列為
ggaactcgccgcctaccagcag
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6)將上述的3段片段混合，變性成為單鏈，通過彼此重疊的17個堿基互補連接，以此作為模板，以SEQ ID NO 13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO 14所示的HSP65下游引物作為引物，通過PCR方法擴(kuò)增獲得嵌合了 4個T細(xì)胞表位的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65外源目的基因，將目的基因經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體連接，獲得所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒。具體的，是將上述的片段1和片段2混合，熱變性使各自成為單鏈DNA，由于片段1、2有17個堿基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈，再通過PCR法可擴(kuò)增獲得片段(1+2)的片段，再與片段3混合，熱變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有17個堿基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈，用SEQ ID NO :13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO:14所示的下游引物經(jīng)PCR可擴(kuò)增獲得片段(1+2+3)，即嵌合了 4個T細(xì)胞表位的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65外源目的基因。進(jìn)一步的，所述的載體選自pcDNA3. 1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了上述的一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒pECANS ；(2)將0. 1 0. 4%濃度、PH5. 2-5. 5的殼寡糖溶液，與18 25 μ g/ml編碼結(jié)核抗原的質(zhì)粒pECANS溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的殼寡糖溶液中，所述的殼寡糖的分子量在3000 6000之間，脫乙酰度75% 85%，所述的質(zhì)粒DNA溶解在IOmM的磷酸鹽緩沖液(PBQ中，通過共聚交聯(lián)作用，獲得的殼寡糖-DNA復(fù)合物呈球形納米顆粒，直徑在150 300nm之間。冷凍干燥，_70°C冷凍保存。本發(fā)明使用前，以無菌PBS溶解殼寡糖-DNA復(fù)合物，使DNA濃度為lmg/ml。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有有效量的上述的一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，以及藥學(xué)上接受的載體或者賦形劑。本發(fā)明還提供了上述的一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗在制備預(yù)防或治療結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過DNA預(yù)測軟件，從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的已知的4種關(guān)鍵抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP-10中各自篩選了一個T細(xì)胞表位，共4個T細(xì)胞表位，構(gòu)建含有4個T細(xì)胞表位的結(jié)核靶抗原編碼質(zhì)粒。由于表位僅有8-20個氨基酸，結(jié)構(gòu)太小和簡單，免疫原性很弱。因此選擇一種載體基因，將4個T細(xì)胞表位插入載體基因中，共同構(gòu)成結(jié)核外源目的基因。本發(fā)明選擇結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白65 (HSP65)作為嵌入T細(xì)胞表位的基因載體。HSP65是熱休克蛋白60家族成員，在細(xì)菌到人體細(xì)胞有很高的同源性。全長162;3bp，編碼540個氨基酸，分子量65kD。選擇結(jié)核桿菌來源HSP65作為嵌入T細(xì)胞表位的基因載體的原因有兩點1、HSP內(nèi)含有多個結(jié)核T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，本身就是重要的免疫保護(hù)性抗原，已證實HSP65作為目的抗原免疫小鼠可產(chǎn)生抗結(jié)核強保護(hù)性免疫應(yīng)答，且與產(chǎn)生IFN-Y的⑶87⑶44hi細(xì)胞有關(guān)。2、HSP作為細(xì)胞內(nèi)伴侶蛋白，參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位、折疊和裝配，可幫助嵌入的表位更好地折疊形成空間結(jié)構(gòu)。本發(fā)明選擇的4個T細(xì)胞表位來自以下4種結(jié)核抗原l)Ag85A，295氨基酸。結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個主要成分是Ag85復(fù)合體(antigen 85complex)，由Ag85A、Ag85B、Ag85C組成的相對分子質(zhì)量為38000蛋白家族。Ag85A可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，也可激發(fā)Thl型細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)⑶8+T細(xì)胞增殖和IL-2及IFN- γ等上升?！稟g85B，蛋白質(zhì)全長285氨基酸，分子量34. 6KD。又稱MPT59、Rvl886，是一種分枝桿菌轉(zhuǎn)移酶，與細(xì)菌細(xì)胞壁合成有關(guān)，具有多個τ細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)Thl反應(yīng)、IFN- γ的產(chǎn)生。3) ESAT-6，又稱Rv3875，全長^8bp，95個氨基酸，分子量9. 9KD，僅在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株等強毒株中有這種抗原。含有多個T細(xì)胞表位，能激活CD4+、CDS+T細(xì)胞，在抗結(jié)核保護(hù)性免疫應(yīng)答中起重要作用。ESAT-6還可刺激Mtb病人的外周血T細(xì)胞增殖，促進(jìn)IFN-Y釋放。用ESAT-6和佐劑制成的亞單位疫苗免疫小鼠具有較好的保護(hù)性。4) CFP-10,低分子量結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白，全長30!3bp，100個氨基酸，分子量10000,與結(jié)核分枝桿菌H37Rv株毒力有關(guān)，刺激機(jī)體產(chǎn)生強烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答并釋放高水平的IFN- y。BCG傳代過程中ESAT-6和CFP-10基因丟失，而在絕大多數(shù)毒株中這兩個基因都存在。本發(fā)明通過BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫比對、DNAstar生物軟件分析以及親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)的分析，選擇各類參數(shù)均較好的結(jié)構(gòu)區(qū)域作為候選疫苗表位區(qū)段；然后通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(http://www. syfpeithi. com/scripts/MHCServer. dll/home, htm)分析預(yù)測這些區(qū)段中存在的T細(xì)胞抗原表位、同時與HLAI、II類分子可高親和力結(jié)合的表位。經(jīng)過計算機(jī)分子預(yù)測最后獲得的4個T細(xì)胞表位分別是結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因(ESAT_6189_228)；結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因(Ag85A369_4Q5)；結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_2(17)；結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42C1_459)。分別插入到結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的HSP65基因的第438位堿基、第486位堿基、第1185位堿基后，構(gòu)建結(jié)核靶抗原編碼質(zhì)粒。本發(fā)明在pcDNA3. 1質(zhì)粒中，插入一段結(jié)核外源目的基因，作為靶抗原編碼質(zhì)粒，該結(jié)核外源目的基因由4個結(jié)核T細(xì)胞表位嵌合到結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的HSP65蛋白的3個非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)位置所共同構(gòu)成，經(jīng)分析，4個表位的嵌入不會影響HSP65本身的正常三級、四級空間結(jié)構(gòu)，因此將這一嵌合有4個T細(xì)胞表位的HSP65基因的靶抗原編碼質(zhì)粒稱為 ECANS(Epitope Cast in A Natural Structure，ECANS)。本發(fā)明的疫苗可以以滴鼻、口服或經(jīng)生殖道方式實施粘膜部位接種。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核粘膜基因疫苗的粘膜免疫方法如下1)首先對動物進(jìn)行輕度麻醉；2)在鼻腔、口腔或生殖道內(nèi)逐滴注入殼寡糖-pECANS納米顆粒，3) 二周后重復(fù)1)+2)的免疫過程，4)共免疫 3 4 次，pECANS DNA 總量在 150 200 μ g。本發(fā)明采用的殼寡糖(oligo-chitosan)，是甲殼類動物來源的天然生物多糖幾丁質(zhì)(chitin)的脫乙酰衍生物。chitin(幾丁質(zhì)，N-乙酰氨基葡萄糖多聚體)是一種廣泛存在于蝦、蟹外殼中的天然多糖。chitin與DNA復(fù)合可生成不溶于水的微米顆粒(microparticle)，是一種強有效的巨噬細(xì)胞激活劑，并上調(diào)Thl型細(xì)胞免疫。chitin經(jīng)脫乙?；罂裳苌鸀榉肿恿繌?20000 400000的chitosan多糖(殼多糖/殼聚糖，β _ (1 — 4) -2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖)，無毒，具有生物可容性和生物可降解性，天然帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的粘膜天然靜電吸附，具有增強粘膜黏附吸收作用，還具有促進(jìn)胞間運輸、緩釋和生物可降解等多種良好特性，已被廣泛用于藥物賦形劑與緩釋劑。殼寡糖(oligo-chitosan)又名殼聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide)，由殼聚糖(chitosan)經(jīng)酶解或水解制得，成分為3 10個β-(1 — 4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖寡糖。其最大的特點是具有水溶性，使容易被腸道吸收。此外，它具有激活巨噬細(xì)胞、T、NK細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF-α、活性氮、氧中間體(R0I、RNI)產(chǎn)生的特性，因此具有增強Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗胞內(nèi)菌感染潛能。以合適分子量和脫乙酰度的殼寡糖與質(zhì)粒DNA在特定的濃度、溫度、pH值、振蕩速度條件下，可形成大小不一的共聚復(fù)合物。本發(fā)明以特定性質(zhì)的殼寡糖制備特定溶液，與特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制備了直徑在150-300nm的納米顆粒復(fù)合物。優(yōu)選的選擇是0. 4%濃度、PH. 5. 5的殼寡糖(分子量約3000-6000，脫乙酰度75% 85% )溶液，與25 μ g/ml編碼靶抗原的質(zhì)粒DNA(pcDNA3. 1-ECANS)溶液(IOmM PBS)，在55°C下，以15000rpm速度高速混旋，通過共聚交聯(lián)作用，制備了殼寡糖-結(jié)核靶抗原DNA (pECANS)納米顆粒。經(jīng)冷凍干燥，置_70°C凍存?zhèn)溆?。使用時以無菌PBS溶解，使DNA濃度為lmg/ml。本發(fā)明中，將oligo-chitosan-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行以常規(guī)小鼠麻醉方法輕度麻醉小鼠，將小鼠鼻孔向上，以槍頭吸取< 20μ 1液體直接逐滴滴入鼻腔內(nèi)，待液滴隨小鼠呼吸自主進(jìn)入呼吸道后，再滴下一滴液體?？山惶娴稳雰蓚€鼻孔。液體總體積不宜超過50 μ 1。本發(fā)明中，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒的載體，包括任何可以轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的高效真核表達(dá)質(zhì)粒載體，包括但不限于pcDNA3. UpVAX以及常見和市售的真核質(zhì)粒載體。本發(fā)明中，“藥學(xué)上接受的”成分是適用于人和動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。本發(fā)明中，“藥學(xué)上接受的載體”成分是用于將具有活性的有效成分傳送給人或動物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于水、PBS緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。本發(fā)明的藥物組合物，含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載體。通常將其配制于無毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，PH值通常約5-8。綜上所述，本發(fā)明公開的一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，具有以下三大特性1)其核心是一種已申請并公開的多表位靶抗原編碼質(zhì)粒一一pECANS結(jié)核基因疫苗(基于T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用。專利申請?zhí)?00710171416.X)，其中編碼靶抗原包括結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的HSP65蛋白基因，和嵌入其中的4個結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的優(yōu)勢抗原的4個T細(xì)胞表位，理論上含有至少5種結(jié)核抗原，可誘導(dǎo)多抗原特異性的、更有效的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用。2)通過具有特定化學(xué)性質(zhì)的有市售的殼寡糖(oligo-chitosan)，與上述pECANS質(zhì)粒DNA形成共聚復(fù)合物后，再通過粘膜途徑接種該井殼聚糖遞送的結(jié)核粘膜基因疫苗，具有安全無毒性、緩釋性、親粘膜性等多種優(yōu)勢，可促進(jìn)粘膜局部特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。3)該結(jié)核粘膜基因疫苗通過優(yōu)化免疫途徑、免疫程序、免疫劑量、間隔時間，能更有效地誘導(dǎo)全身和粘膜T細(xì)胞和抗體應(yīng)答。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明的oligo-chitosan-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗通過滴鼻途徑免疫小鼠，有效誘導(dǎo)針對載體HSP65結(jié)核抗原的特異性抗體應(yīng)答和全身(脾臟和淋巴結(jié))特異性Thl性免疫應(yīng)答；更重要的是，能誘導(dǎo)肺粘膜局部很強的結(jié)核特異性分泌性SIgA和分泌高水平IFN γ的Thl應(yīng)答，效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)BCG結(jié)核疫苗和裸露的pECANS基因疫苗，因此具有作為新型結(jié)核預(yù)防和治療性疫苗的潛力。


圖1顯示了 pECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建示意圖。圖2顯示了通過HSP65上游引物/Tl、T2/E1、E2/HSP65下游引物三對引物分別擴(kuò)增得到的雙鏈DNA片段1 (l-508bp)、片段2 (491-1315bp)、片段3 (1298-1788bp)，而后通過彼此重疊的17個堿基互補相連得到嵌合4個T細(xì)胞表位的HSP65全長基因，其中，粗體帶下劃線的序列是插入的4個T細(xì)胞表位序列。圖3顯示了本發(fā)明中嵌合4個T細(xì)胞表位的HSP65全長基因的質(zhì)粒PCR (圖3A)、酶切(圖3B)及部分測序鑒定結(jié)果(圖3C)。圖4顯示了殼寡糖(oligo-chitosan)與pECANS質(zhì)粒形成的共聚復(fù)合物的示意圖；其中，圖A顯示了殼寡糖oligo-chitosan與pECANS質(zhì)粒形成共聚復(fù)合物示意圖；圖B顯示了殼寡糖-pECANS納米顆粒的掃描電鏡圖。圖5顯示了殼寡糖-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗滴鼻免疫小鼠誘生結(jié)核特異性抗體血清IgG水平，其中，圖A顯示HSP65抗原特異性IgG的水平；圖B顯示HSP65抗原特異性特異性IgG效價；圖C顯示HSP65抗原特異性特異性IgG亞類情況；圖D顯示特異性IgG親和力。圖6顯示了殼寡糖-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗誘導(dǎo)肺灌洗液中SlgA的水平。圖7顯示了 ELISP0T試驗檢測的殼寡糖-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗誘導(dǎo)的⑶4+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)目。其中，圖A顯示了免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng)結(jié)核抗原刺激后分泌IFN-Y的水平，圖B顯示了肺臟單個核細(xì)胞經(jīng)結(jié)核抗原刺激后分泌IFN- γ的水平。圖8顯示了以流式細(xì)胞術(shù)檢測的殼寡糖-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的免疫小鼠脾細(xì)胞和肺臟淋巴細(xì)胞中IFN-γ+⑶4+Thl細(xì)胞的比例。圖9顯示了殼寡糖-pECANS結(jié)核粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠經(jīng)大劑量BCG攻毒后肺臟組織HE染色病理結(jié)果圖。圖10顯示了殼寡糖-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗滴鼻免疫小鼠經(jīng)大劑量BCG攻毒后肺臟組織、脾臟組織菌落計數(shù)結(jié)果圖。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。
實施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動物及試劑如下結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)H37Rv株(上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)防科提供)。質(zhì)粒pcDNA3. 1 (-)、pVAX、宿主細(xì)菌DH5 α (Invitrogen公司)?；蚝铣?上海賽百盛公司)。oligo-chitosan (分子量在3000 6000之間，脫乙酰度為75% -85% )購自合肥博美生物有限公司、小鼠IFN- y ELISA檢測試劑盒購自R&D公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG/IgA多克隆抗體(Southern Biothech公司)；。HSP65蛋白為本實驗室自行表達(dá)(見200610027572. 4號專利)、多肽委托上海吉爾公司合成、Lipofectamin-2000購自invitrogen公司。限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR I,Hind III、T4DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP (TaKaRa 公司)；RNaseA (Ameresco公司)；LB培養(yǎng)基(英國0X0ID公司)，Tris (USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜公司)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen)。6-8周齡雌性BALB/c (H_2d)小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，清潔級飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)及操作符合國家相關(guān)規(guī)定。實施例1 :pcDNA3. I-ECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建1、ECANS結(jié)核基因疫苗的目的T細(xì)胞表位的預(yù)測通過BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫、DNAstar生物軟件、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(http://www. syfpeithi.com/scripts/MHCServer. dll/home. htm)分析，綜合親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性、與HLAI、II類分子結(jié)合、等參數(shù)，預(yù)測獲得的4個T細(xì)胞表位結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的189 228 位基因(ESAT-6189_228)；結(jié)核桿菌 Ag85A 蛋白的 369 405 位基因(Ag85A369_4。5)；結(jié)核桿菌CFP-10蛋白的162 207位基因(CFP10162_2Q7)；結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的420 459位基因(Ag85B42Q_459)。以pcDNA3. 1或pVAX為質(zhì)粒載體，以結(jié)核分枝桿菌HSP65基因作為嵌合表位的基因載體，在計算機(jī)預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在其中不影響關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的位置第438位堿基后插入ESAT-6189 2 表位基因、第486位堿基后插入Ag85A369 405、第1185位堿基后插入 CFP-10162 207 和 Ag85B420 459，CFP-10 和 Ag85B 之間以 gccgcctac 相連接，如圖1所示。實施例2pcDNA3. I-ECANS結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建為了不在HSP65基因和T細(xì)胞表位基因之間引入酶切位點，本發(fā)明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，從5 ‘和3’端依次擴(kuò)增三段彼此部分重疊的包含部分HSP65基因和T細(xì)胞表位的基因片段，變性后通過彼此重疊的互補序列連接，最后用5 ‘和3’兩端HSP65引物PCR擴(kuò)增出嵌合有4個T細(xì)胞表位的HSP65全長基因。同時在基因兩端分別帶上EcoRI和Hind III酶切位點，經(jīng)雙酶切后可連接入載體pcDNA3. 1(_)或原核表達(dá)載體pET3h。首先提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株DNA，作為模板，用HSP65上游引物(SEQ ID NO 13)和下游引物(SEQ ID N0 14)通過PCR方法擴(kuò)增獲得HSP65片段，回收并純化PCR產(chǎn)物。以HSP65基因作為模板，分別以引物HSP65上游引物(SEQ ID NO 13)和Tl引物(SEQ ID NO 15)通過PCR擴(kuò)增片段1 (如圖2所示HSP65上游引物和Tl相對，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的l_508bp雙鏈DNA片段)，所述的片段1的雙鏈DNA的序列為atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaactaccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttggccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaacgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt
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以 T2 引物(SEQ ID NO 16)和 El 引物(SEQ ID NO17)通過PCR擴(kuò)增片段2(如
圖2所示T2引物和El相對，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的491-1315bp雙鏈DNA片段)，所述片段2的雙鏈DNA的序列為
0165]gggtgaccagtccatcggtgacctgatcgccgagggtctttcgatggct0166]cccactggtcaggtagccactggactagcggctcccagaaagctaccga0167]gcttcttcggcgctgacgctggcgatggacaaggtgggcaacgagggcgtcatcaccgtc0168]cgaagaagccgcgactgcgaccgctacctgggccacccgttgctcccgcagtagtggcag0169]gaggagtccaacacctttgggctgcagctcgagctcaccgagggtatgcggttcgacaag0170]ctcctcaggttgtggaaacccgacgtcgagctcgagtggctcccatacgccaagctgttc0171]ggctacatctcggggtacttcgtgaccgacccggagcgtcaggaggcggtcctggaggac0172]ccgatgtagagccccatgaagcactggctgggcctcgcagtcctccgccaggacctcctg0173]ccctacatcctgctggtcagctccaaggtgtccactgtcaaggatctgctgccgctgctc0174]gggstgtaggacgaccagtcgaggttccacaggtgacagttcctagacgacggcgacgag0175]gagaaggtcatcggagccggtaagccgctgctgatcatcgccgaggacgtcgagggcgag0176]ctcttccagtagcctcggccattcggcgacgactagtagcggctcctgcagctcccgctc0177]gcgctgtccaccctggtcgtcaacaagatccgcggcaccttcaagtcggtggcggtcaag0178]cgcgacaggtgggaccagcagttgttctaggcgccgtggaagttcagccaccgccagttc0179]gctcccggcttcggcgaccgccgcaaggcgatgctgcaggatatggccattctcaccggt0180]cgagggccgaagccgctggcggcgttccgctacgacgtcctataccggtaagagtggcca0181]ggtcaggtgatcagcgaagaggtcggcctgacgctggagaacgccgacctgtcgctgcta0182]ccagtccactagtcgcttctccagccggactgcgacctcttgcggctggacagcgacgat0183]ggcaaggcccgcaaggtcgtggtcaccaaggacgagaccaccatcgtcgagggcgccggt0184]CCgttCCgggcgyyccagcaccagtggttcctgctctggtggtagcagctcccgcggcca0185]gacaccgacgccatcgccggacgagtggcccagatccgccaggagatcgagaacagcgac0186]ctgtggctgcggtagcggcctgctcaccgggtctaggcggtcctctagctcttgtcgctg
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將上述的片段1和片段2混合，變性使各自成為單鏈DNA，由于片段1、2有17個堿
基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈，再以HSP65上游引物和El引物通過PCR法可擴(kuò)增獲得片段(1+2)的片段，再與片段3混合，變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有17個堿基的重疊DNA序列，因此可互補成為雙鏈，以HSP65上游引物(SEQ ID N0:13)和HSP65下游引物(SEQ ID NO :14)作為引物，通過PCR方法擴(kuò)增獲得獲得片段(1+2+3)，即嵌合了 4個T細(xì)胞表位的HSP目的基因即ECANS編碼基因(如圖2所示)。PCR鑒定結(jié)果顯示產(chǎn)物為1807bp，如圖3A所示。再將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切，回收酶切片段，與經(jīng)相應(yīng)酶切的載體PCDNA3. 1(_)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落。經(jīng)酶切(圖3Β)及測序鑒定(圖3C)，成功構(gòu)建了 pcDNA3-ECANS真核表達(dá)質(zhì)粒。
將重組質(zhì)粒ECANS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，經(jīng)LB(Ampl00l·! g/ml)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)15h，收集菌體，按照QIAGENPlasmid Mega Kit去除雜蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素，得到純化質(zhì)粒。
實施例3分離小鼠肺臟淋巴細(xì)胞取末次免疫后10天小鼠肺組織，稱重約IOOmg/只，每組3只小鼠肺臟混合，剪碎置于IOml消化液中(膠原酶(lmg/ml)、DNA酶(5U/ml)、1640-10%胎牛血清)，于37°C搖床180rpm振搖120min。將混懸液過尼龍指套去除碎塊，1500rpm離心5min，細(xì)胞重懸于細(xì)140% Percoll中，輕柔加至等體積70% Percoll上方，2400rpm離心30min，吸取淋巴細(xì)胞，IOml PBS洗滌1次，重懸于1640-10%胎牛血清培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度為5X106/ml備用。實施例4殼寡糖-pECNAS結(jié)核黏膜基因疫苗的制備1)質(zhì)粒DNA的大量制備依照QIAGEN Plasmid Mega Kit進(jìn)行。2)分別制備oligo-chitosan溶液和pcDNA3. 1-pECANS溶液，方法如下首先制備0. 4%,pH5. 5 的 oligochitosan 溶液，稱取 0. 4g 殼寡糖 oligo-chitosan(MW約 3000-6000，脫乙酰度75% -85% )，先以100ml IOmM的PBS (PH7. 4)將其緩慢溶解，37 °C放置Ihr。0.4ym的濾膜過濾而后保存?zhèn)溆谩cDNA3. Ι-pECANS質(zhì)粒以IOmM PBS溶解，DNA濃度為25yg/ml，-20°C 保存?zhèn)溆谩?)采用共沉淀法(共凝聚法)制備oligochitosan-DNA納米顆粒，方法如下在55°C水浴中，將0. 4%,pH5. 2的oligochitosan溶液逐滴滴入25ug/ml質(zhì)粒DNA溶液中，同時15000rpm高速振蕩30秒，即可形成均一略帶混濁的oligochitosan-DNA納米顆粒(圖4A)。掃描電鏡證實該復(fù)合物顆粒的直徑約為150-300nm(圖4B)。而后將該溶液冷凍干燥，繼而用無菌PBS溶解為lmg/ml的濃度，按50 μ gDNA/50ul的量滴鼻免疫小鼠。實施例5殼寡糖-pECNAS結(jié)核粘膜基因疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠將6-8 周 BALB/c 雌鼠分為 6 組，分別為oligochitosan-pECANS、oligochitosan-pHSP65、pcDNA3. 1-ECANS (簡稱 pECANS)、pcDNA3. l_pHSP65 (簡稱 pHSP65)；BCG, mock組，每組8只小鼠。滴鼻免疫程序如下以0. 75%戊巴比妥鈉80-120 μ 1經(jīng)腹腔注射小鼠，使輕微麻醉。以含有50 μ g質(zhì)粒DNA的oligochitosan-pECANS等疫苗溶液逐滴滴入小鼠兩側(cè)鼻腔。BCG采用皮下免疫，程序如下以含有BCG(1X IO5CFU)的PBS于小鼠背部皮下多點接種，總量100 μ 1。每兩周經(jīng)眼眶后眥靜脈采血，37°C靜置30min，4000rpmX IOmin,收集血清，分裝凍存于_70°C。實施例6殼寡糖-pECANS滴鼻免疫可增強結(jié)核特異性SlgA抗體應(yīng)答間接ELISA法檢測免疫小鼠血清特異IgG水平。以5 μ g/ml HSP65蛋白包被聚苯乙烯微孔板(co-star)(包被液0. IM Na2CO3, pH9. 6)4°C過夜。以5% milk-PBS封閉板，200μ 1/孔，37°C lh。依次加 1 1000 ； 1 10000 ； 1 100000 稀釋血清、100 μ 1/孔，37 0C lh，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG 37 °C lh，洗板后以TMB顯色15min，2N H2SO4終止反應(yīng)后測A45tl值。如圖5顯示0lig0-chit0San-pECANS結(jié)核粘膜基因疫苗免疫一次以后在小鼠體內(nèi)誘生了 HSP65特異性IgG，在免疫第4周即可檢測到HSP65特異性血清IgG，其水平隨時間不斷增高，于第10周達(dá)到OD值1.4，抗體滴度為1 100000，顯著高于mock對照組，同時也高于 chitosan-pECANS 和 chitosan_pHSP65 組。但 IgG 水平低于 pECANS、pHSP65 滴鼻組和BCG皮下注射組(圖5A)。BCG免疫組在第8w誘導(dǎo)的IgG已達(dá)峰值，滴度為1 4 X IO5 (圖5B)；此外，誘導(dǎo)的IgG均以IgGh為主，提示為Thl型免疫(圖5C)；抗體親和力方面，oligochitosan-pECANS誘導(dǎo)的數(shù)值為40，高于BCG對照組的34，但無顯著性差異(圖5D)。
肺灌洗液中SlgA的分泌代表肺局部黏膜分泌型抗體的誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)僅有殼聚糖組裝的結(jié)核基因疫苗誘導(dǎo)了 SlgA的分泌。Oligo-chitosan-pECANS誘導(dǎo)的SlgA效價水平最高，達(dá)到1 1250，顯著高于其他組(圖6)，這將在肺粘膜局部早期阻斷M.tb感染起到關(guān)鍵作用?？傊瑲す烟?PECANS疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)了較強的結(jié)核抗原特異性全身和黏膜抗體應(yīng)答。實施例7殼寡糖-pECANS滴鼻免疫可增強脾、肺臟淋巴細(xì)胞中特異性IFN y +Thl型細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)(1)小鼠脾臟和肺淋巴細(xì)胞IFN- γ +Thl細(xì)胞的ELISP0T檢測以ELISP0T方法直接檢測末次免疫4周后淋巴細(xì)胞中分泌IFNy的Thl細(xì)胞。以5 μ g/ml IFN- γ包被抗體100 μ 1/孔4°C包被過夜，吸去孔內(nèi)液體，用200 μ 1完全164037°C封閉》ir。去液體，取末次免疫后#小鼠脾臟，重懸于含20U/ml IL-2的完全1640中，以1 X IO6細(xì)胞/孔加入ELISP0T板，隨后分別加入滅活的BCG、特異性抗原HSP65蛋白(20 μ g/ml)、表位多肽 Ag85A/B、ESAT-6 和 CFP-10 混合刺激物(20 μ g/ml)、瞬轉(zhuǎn) pHSP65 質(zhì)粒24小時的SP2/0細(xì)胞(標(biāo)記為SP2/0-HSP65)、陽性對照ConA(10 μ g/ml)，置37°C，5%CO2培養(yǎng)60hr。吸棄各孔液體，加200 μ 1冰預(yù)冷的去離子水，在冰上放置lOmin，PBST洗3次。加100 μ 1生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-Y檢測抗體Qy g/ml)，37°C放置lhr。去液體，PBST 洗 3 次。加 100 μ 1 HRP 標(biāo)記鏈親和素(Streptavidin-HRP)，37°C lhr, PBST 洗 4 次，PBS洗2次，拍干。WlOOyl AEC底物避光顯色30min，用自來水沖洗終止反應(yīng)，室溫下干燥板，在免疫斑點成像分析儀下計數(shù)斑點。結(jié)果顯示，與其他各組相比，oligo-chitosan-pECANS粘膜疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的BCG特異性IFN- y +T細(xì)胞數(shù)目最高，達(dá)310/106脾淋巴細(xì)胞(圖7A)，顯著高于BCG和其他各組；該組誘導(dǎo)的HSP65特異性IFN- y +T細(xì)胞數(shù)目達(dá)155/106脾細(xì)胞(圖7A)，顯著高于其他各組(P < 0. 05)。SP2/0-pHSP65和四肽混合物的刺激效果較低。提示chitosan-pECANS可誘生強烈的結(jié)核特異性脾臟淋巴細(xì)胞IFN-Y+Thl細(xì)胞免疫。更有意義的是，分離肺臟淋巴細(xì)胞，進(jìn)行ELISP0T檢測，發(fā)現(xiàn)僅有殼寡糖-pECANS滴鼻免疫和BCG皮下免疫誘導(dǎo)了較高水平的IFN- y +Thl細(xì)胞免疫，HSP65和BCG特異性Thl細(xì)胞超過200/106肺淋巴細(xì)胞(圖7B)，顯著高于其他各組(ρ < 0. 05)，提示殼寡糖-pECANS黏膜基因疫苗有效增強了肺局部黏膜Thl細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。有助于在感染早期和感染局部有效清除結(jié)核桿菌。(2)小鼠脾臟和肺臟⑶4+IFN- y +T細(xì)胞的胞內(nèi)染色和流式檢測取末次免疫后4周小鼠脾臟，制備淋巴細(xì)胞懸液，重懸于含有20U/ml IL_2和HSP65蛋白O0g/ml)的完全1640中，37°C 5% C02培養(yǎng)12h。收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為3 X IO6/ml，用Percp-抗小鼠⑶4單抗4°C避光染色30min，洗滌、固定、穿膜。用FITC-抗小鼠IFN- γ的單抗在染色30min后，上流式細(xì)胞儀檢測。流式檢測脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)分泌IFN γ的⑶4+Thl細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)與mock組和BCG免疫小鼠相比，oligo-chitosan-pECANS滴鼻免疫組誘導(dǎo)的HSP65特異性CD4+IFN- γ +T細(xì)胞數(shù)目最高，達(dá)到了 2. 15%，5倍于pECANS組(0. 48% )0 (圖8)。肺臟淋巴細(xì)胞同樣經(jīng)HSP65蛋白刺激后，發(fā)現(xiàn)肺臟淋巴細(xì)胞內(nèi)正^^+^4+1111細(xì)胞比例顯著高于脾臟淋巴細(xì)胞，仍舊是oligo-chitosan-pECANS復(fù)合物滴鼻組誘導(dǎo)了最高
16比例的Thl細(xì)胞，達(dá)到7. 31%，顯著高于pECANS裸露基因疫苗組和BCG組的6. 3-6. 4% (ρ< 0. 005，圖 8)。以上實驗標(biāo)明0lig0-chit0San遞送組裝的pECANS結(jié)核基因疫苗，與裸露pECANS基因疫苗相比，在脾臟和肺臟中均顯著增強了結(jié)核抗原特異性IFNY+CD4+Thl應(yīng)答的誘導(dǎo)。與其他各組相比，誘導(dǎo)了相對最強的全身和黏膜特異性Thl細(xì)胞應(yīng)答，有助于更好地清除肺內(nèi)感染的結(jié)核分枝桿菌。實施例8殼寡糖-pECNAS結(jié)核黏膜基因疫苗誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫保護(hù)效果(1)肺組織H&E病理切片末次免疫后4周，以大劑量IX IO7CFU BCG(100 μ 1)鼻腔內(nèi)攻毒。4周后處死小鼠，取小鼠肺臟組織做石蠟切片，行Η&Ε染色。發(fā)現(xiàn)不免疫小鼠(mock)攻毒后產(chǎn)生了嚴(yán)重的肺部炎癥灶和組織損傷，提示產(chǎn)生了肺結(jié)核。各免疫組相比，裸質(zhì)粒疫苗滴鼻免疫的保護(hù)效果有限，肺臟中可見炎性病灶，肺泡間隔增厚，肺泡結(jié)構(gòu)有擴(kuò)張性改變。經(jīng)殼聚糖遞送的粘膜基因疫苗的免疫保護(hù)顯著增強，特別是oligo-chitosan-pECANS組，僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡間隔增厚(圖9)。(2) BCG攻毒后小鼠脾臟和肺臟結(jié)核桿菌數(shù)目取攻毒后4周的部分肺臟和脾臟勻菜，倍比稀釋后接種7H9培養(yǎng)基，培養(yǎng)21- 天，進(jìn)行BCG菌落計數(shù)試驗。結(jié)果顯示對照組的脾臟和肺臟結(jié)核桿菌數(shù)達(dá)到IO5-6CFU,顯示嚴(yán)重的結(jié)核桿菌增殖；BCG皮下免疫組使結(jié)核桿菌數(shù)目降至6000-8000CFU/g組織，具有一定的控制結(jié)核桿菌生長效應(yīng)。裸質(zhì)?；蛞呙缑庖呓M小鼠有3000-4000CFU/g組織的結(jié)核桿菌，顯示了一定保護(hù)效果；而oligochitosan-pECANS組在肺組織內(nèi)沒有細(xì)菌生長，僅在脾臟組織中發(fā)現(xiàn)100CFU以內(nèi)的結(jié)核桿菌生長，顯示了最好的免疫保護(hù)效果(圖10)。免疫病理和菌落計數(shù)結(jié)果強烈提示結(jié)核基因疫苗pECANS具有一定的免疫保護(hù)效果，而以殼聚糖組裝形成共聚復(fù)合物后進(jìn)行滴鼻免疫，顯著增強了肺粘膜Thl細(xì)胞和SlgA的誘導(dǎo)，從而有效提高了對脾臟和肺內(nèi)感染的結(jié)核分枝桿菌的清除，顯著增強了抗結(jié)核免疫保護(hù)力。
權(quán)利要求
1.一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于由殼寡糖與結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒共聚交聯(lián)復(fù)合而成，所述的結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒由一個載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因中嵌合有來自結(jié)核桿菌抗原的4個T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個T細(xì)胞表位分別是結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因的DNA序列如SEQ ID NO 8所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65全長基因中的第438位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因、第486位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因、第1185位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因，所述的CFP-10蛋白的162 207位基因和所述的Ag85B蛋白的420 459位基因之間以gccgcctac基因序列相連接。嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的4個T細(xì)胞表位基因的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO 12所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自pcDNA3. 1質(zhì)?；騪VAXl質(zhì)粒中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列SEQ ID如NO :1所 示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的189 2 位基因的氨基酸序列如SEQID NO 3 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85A蛋白的369 405位基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 5所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的CFP-10蛋白的162 207位基因的氨基酸序列如SEQID NO 7 所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的420 459位基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 9所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的4個T細(xì)胞表位基因的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因所構(gòu)成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，其特征在于所用的殼寡糖的分子量在3000 6000之間，脫乙酰度為75% -85%。
10.權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)構(gòu)建結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒；(2)將0.1 0. 4%濃度、PH5. 2-5. 5的殼寡糖溶液，與18 25 μ g/ml編碼結(jié)核抗原的質(zhì)粒的溶液在55-60°C下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的殼寡糖溶液中，所述的殼寡糖的分子量在3000 6000之間，脫乙酰度75% 85%，所述的質(zhì)粒DNA溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，通過共聚交聯(lián)作用，獲得的殼寡糖-結(jié)核抗原質(zhì)粒納米顆粒為球形，直徑在150 300nm之間。
11.一種藥物組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗以及藥學(xué)上接受的載體或者賦形劑。
12.權(quán)利要求1所述的殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗在制備預(yù)防或治療結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種殼寡糖遞送系統(tǒng)組裝的結(jié)核粘膜基因疫苗，由殼寡糖與結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒共聚交聯(lián)復(fù)合而成，結(jié)核抗原編碼質(zhì)粒中插入有結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白HSP65的全長基因，HSP65全長基因中插入來自結(jié)核桿菌分枝桿菌H37Rv株來源的抗原中的4個T細(xì)胞表位基因ESAT-6189-228、Ag85A369-405、CFP10162-207和Ag85B420-459。本發(fā)明還公開了這種結(jié)核粘膜基因疫苗的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的結(jié)核黏膜基因疫苗可誘導(dǎo)結(jié)核特異性血清抗體和全身Th1型免疫應(yīng)答；能誘導(dǎo)肺粘膜局部增強的結(jié)核特異性分泌型SIgA和IFNγ+Th1應(yīng)答，效果顯著優(yōu)于裸露的pECANS基因疫苗。
文檔編號C07K14/35GK102580115SQ20111000523
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者徐薇, 熊思東, 艾文清 申請人:復(fù)旦大學(xué)