一種殼寡糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種殼寡糖的制備方法，尤其涉及窄分布?xì)す烟堑闹苽洹?br>【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，而且是自然界中唯一存在的天然堿性多糖，其 脫乙酰后游離的氨基基團(tuán)帶有正電荷，使得殼聚糖具有很獨(dú)特的特性，具有多種生物活性。 雖然殼聚糖的應(yīng)用很多，但是因?yàn)槠浞肿恿枯^大，通常在幾十萬(wàn)到上百萬(wàn)左右，只溶于稀酸 溶液，不溶于水，限制了殼聚糖的應(yīng)用。
[0003] 殼寡糖是由2-20個(gè)氨基葡萄糖單元以β -1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，通常由 殼聚糖經(jīng)過(guò)特定的方法降解獲得。殼寡糖是自然界中唯一帶正電荷陽(yáng)離子堿性氨基低聚 糖。與殼聚糖相比，殼寡糖具有相對(duì)分子質(zhì)量小、水溶性好、生物活性高、易于吸收、應(yīng)用范 圍廣等優(yōu)點(diǎn)。殼寡糖具有免疫調(diào)節(jié)，能防癌、抗癌、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，能調(diào)節(jié)血脂，能調(diào)節(jié)血 壓，能調(diào)節(jié)血糖，強(qiáng)化肝臟功能，增強(qiáng)胃腸功能，抗衰老和抗疲勞，清除自由基，排除重金屬 離子等生物活性，被稱(chēng)為"生命第六要素"，其中尤以殼五糖和殼六糖的抗腫瘤效果最優(yōu)。
[0004] 目前制備殼寡糖的方法包括化學(xué)法、酶解法、物理法等。其中化學(xué)法的成本較低， 操作簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但是得到的殼寡糖的分子量分布難以控制，且殼寡糖結(jié)構(gòu)容易 被破壞，產(chǎn)品安全性飽受質(zhì)疑。物理法包括超聲波法，微波法，輻射法，光波法，物理法的優(yōu) 點(diǎn)是污染小，操作較為簡(jiǎn)單，但是通常產(chǎn)物聚合度較大，分子量分布也較寬，單獨(dú)使用效果 不佳，而且設(shè)備投資較大。酶法降解是用專(zhuān)一性酶或非專(zhuān)一性酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解而得到 殼寡糖的方法，具有反應(yīng)條件溫和、污染小等優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)的比較理想的綠色制備方 法。目前殼寡糖的制備方法存在著殼寡糖產(chǎn)物不均一，分子量分布指數(shù)大的缺點(diǎn)，導(dǎo)致殼寡 糖在一些高端行業(yè)的應(yīng)用受到了限制。
[0005] 專(zhuān)利CN103304686A采用超聲微波協(xié)同氧化制備殼寡糖，然后采用有機(jī)試劑進(jìn)行 沉淀分離出窄分布的殼寡糖。該法可以制備出一定窄分布的殼寡糖，但是從其色譜圖結(jié)果 看出，該法制備的殼寡糖分布仍較寬，而且該制備方法采用氧化降解，容易發(fā)生歧化反應(yīng)， 使得副產(chǎn)物增多。
[0006] 因而，如何制得分子量和性質(zhì)均一的低聚窄分布?xì)す烟?，并且提高降解效率、降?成本、減少對(duì)環(huán)境的污染是殼寡糖制備中的重要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種制備窄分布?xì)す烟堑姆椒?。采用殼聚糖酶降解殼聚糖?成殼寡糖溶液后，經(jīng)超濾與電滲析聯(lián)用技術(shù)達(dá)到去除溶液中的單糖和殼二糖，制備出殼三 糖~殼六糖含量在90%以上的窄分布?xì)す烟恰?br>[0008] 本發(fā)明的工藝流程：殼聚糖溶液-加酶水解-反應(yīng)液除雜-反應(yīng)液濃縮-超濾與 電滲析聯(lián)用-濃縮一干燥得殼寡糖。
[0009] 具體操作方法： 第一步溶解，取一定量的殼聚糖于10 -100倍(質(zhì)量體積比）的水中，然后加入一定量 的無(wú)機(jī)酸，攪拌溶解l-10h。所述無(wú)機(jī)酸為鹽酸或醋酸中的一種； 本發(fā)明技術(shù)方案，每100g殼聚糖加無(wú)機(jī)酸0. 2~1. Omol ; 本步驟優(yōu)選的技術(shù)方案為殼聚糖與水的質(zhì)量體積比為1:10-20 ; 第二步酶解，按照2U/g-10U/g的加酶量，加入殼聚糖酶，在酶的適宜溫度下 (25~55°C)反應(yīng) l_8h ; 所采用的殼聚糖酶為殼聚糖專(zhuān)一性酶(浙江金殼藥業(yè)，GS-殼聚糖酶）； 本步驟優(yōu)選的反應(yīng)溫度為35~45°C ;酶活力的定義為在最適條件下，1分鐘轉(zhuǎn)化1毫克 的殼聚糖為水溶性的組分所需要的酶量為IU ; 第三步除雜，酶解結(jié)束后，酶解液90°C加熱IOmin滅活，溶液經(jīng)過(guò)離心、0. 45 μ m濾膜 過(guò)濾處理； 第四步濃縮，將去除雜質(zhì)的反應(yīng)液進(jìn)行減壓濃縮，至殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%~30%的濃 度； 第五步超濾與電滲析聯(lián)用精制，電滲析裝置的半透膜更換為截留分子量500-1000Da 的超濾膜。利用電滲析動(dòng)力帶正電荷的殼寡糖向陰極移動(dòng)，且只有小分子的殼寡糖和小分 子鹽可以穿過(guò)超濾膜，從而與目標(biāo)殼寡糖分離。溶液中的陰離子雜質(zhì)移向陽(yáng)極，減少了目標(biāo) 產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量。超濾膜內(nèi)即剩余窄分子量分布的殼寡糖的溶液； 第六步濃縮干燥，將窄分子量分布?xì)す烟堑娜芤哼M(jìn)行濃縮后冷凍干燥或者噴霧干燥 獲得產(chǎn)品。
[0010]
【附圖說(shuō)明】： 圖1、處理前殼聚糖的HPLC圖（3-6糖含量76. 51%)，其中1-7分別為氨基葡萄糖，殼二 糖，殼三糖，殼四糖，殼五糖，殼六糖，殼七糖； 圖2、實(shí)施例二HPLC圖（3-6糖含量91. 60%)，其中1-7分別為氨基葡萄糖，殼二糖，殼 三糖，殼四糖，殼五糖，殼六糖，殼七糖。
[0011] 與現(xiàn)有殼寡糖制備方法相比，本方法的優(yōu)點(diǎn)為： 1) 本工藝采用超濾及電滲析聯(lián)用的方法，既發(fā)揮超濾截留分子量的功能去除小分子量 的殼寡糖，又能利用電滲析技術(shù)去除溶液中的帶負(fù)電荷的小分子雜質(zhì)，提高了殼寡糖的純 度； 2) 本工藝制備出的殼寡糖聚合度集中，殼三糖-殼六糖的含量在90%以上，生物活性 商； 3) 與有機(jī)試劑沉淀法相比較，本工藝省去有機(jī)試劑的使用，操作過(guò)程安全、簡(jiǎn)單，同時(shí) 減少了廢棄有機(jī)試劑的排放，降低了環(huán)境污染。
[0012] 具體實(shí)施方法 實(shí)施例1 取100g殼聚糖于IL的水中，然后加入物質(zhì)的量為IM的濃鹽酸，攪拌溶解lh。加入 1000U殼聚糖酶，在45°C下反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，溶液經(jīng)過(guò)高速離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾 處理，減壓濃縮至400mL。再經(jīng)過(guò)截留分子量為1000道爾頓的超濾與電滲析聯(lián)用裝置進(jìn)行 精制，獲得的溶液經(jīng)過(guò)減壓濃縮、冷凍干燥獲得類(lèi)白色粉末狀產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中殼三 糖-殼六糖的含量為91. 31%。
[0013] 實(shí)施例2 取100g殼聚糖于IOL的水中，然后加入物質(zhì)的量為0. 2M的醋酸，攪拌溶解10h。加 入600U殼聚糖酶，在45°C下反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液經(jīng)過(guò)高速離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾 處理，減壓濃縮至400mL。再經(jīng)過(guò)截留分子量為500道爾頓的超濾與電滲析聯(lián)用裝置進(jìn)行 精制，獲得的溶液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥獲得類(lèi)白色粉末狀產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中殼三 糖-殼六糖的含量為91.60%。
[0014] 實(shí)施例3 取100g殼聚糖于8L的水中，然后加入物質(zhì)的量為0. 8M的醋酸，攪拌溶解8h。加入500U 殼聚糖酶，在45°C下反應(yīng)7h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液經(jīng)過(guò)高速離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾處理，減 壓濃縮至400mL。再經(jīng)過(guò)截留分子量為500道爾頓的超濾與電滲析聯(lián)用裝置進(jìn)行精制，獲得 的溶液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥獲得淡黃色粉末狀產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中殼三糖-殼六糖的 含量為90. 42%。
[0015] 實(shí)施例4 取100g殼聚糖于5L的水中，然后加入物質(zhì)的量為0. 4M的鹽酸，攪拌溶解4h。加入800U 殼聚糖酶，在45°C下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液經(jīng)過(guò)高速離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾處理，減 壓濃縮至500mL。再經(jīng)過(guò)截留分子量為1000道爾頓的超濾與電滲析聯(lián)用裝置進(jìn)行精制，獲 得的溶液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥獲得類(lèi)白色粉末狀產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中殼三糖-殼六糖 的含量為91. 53%。
[0016] 實(shí)施例5 取100g殼聚糖于6L的水中，然后加入物質(zhì)的量為0. 2M的醋酸，攪拌溶解4h。加入900U 殼聚糖酶，在45°C下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液經(jīng)過(guò)高速離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾處理，減 壓濃縮至400mL。再經(jīng)過(guò)截留分子量為1000道爾頓的超濾與電滲析聯(lián)用裝置進(jìn)行精制，獲 得的溶液經(jīng)減壓濃縮、噴霧干燥獲得類(lèi)白色粉末狀產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中殼三糖-殼六糖 的含量為90. 81%。
[0017] 實(shí)施例6 取100g殼聚糖于8L的水中，然后加入物質(zhì)的量為0. 5M的醋酸，攪拌溶解6h。加入200U 殼聚糖酶，在45°C下反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液經(jīng)過(guò)高速離心、0.45 μ m濾膜過(guò)濾處理，減 壓濃縮至330mL。再經(jīng)過(guò)截留分子量為500道爾頓的超濾與電滲析聯(lián)用裝置進(jìn)行精制，獲得 的溶液經(jīng)減壓濃縮、噴霧干燥獲得淡黃色粉末狀產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其中殼三糖-殼六糖的 含量為90. 22%。
[0018] 對(duì)按照實(shí)施例1- 6的方法制備得到的殼寡糖及降解后未處理直接噴霧干燥獲得 的殼寡糖進(jìn)行性能質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1 : 表1.不同實(shí)施例制備的殼寡糖相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種殼寡糖的制備方法，其特征在于，按以下步驟制備：殼聚糖溶解一加酶水解一 過(guò)濾除雜一濃縮反應(yīng)液一超濾與電滲析聯(lián)用精制一干燥。
2. 權(quán)利要求1所述殼寡糖的制備方法，其特征在于， 第一步溶解，取一定量的殼聚糖于10~1〇〇倍(質(zhì)量體積比)的水中，然后加入一定量 的無(wú)機(jī)酸，攪拌溶解，所述無(wú)機(jī)酸為鹽酸或醋酸中的一種； 第二步酶解，按照2U/g~10U/g的加酶量，加入殼聚糖酶，25~55°C反應(yīng)； 第三步除雜，酶解結(jié)束后，酶解液90°C加熱IOmin滅活，0.45iim濾膜離心過(guò)濾； 第四步濃縮，將去除雜質(zhì)的反應(yīng)液進(jìn)行減壓濃縮，至殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%~30%的 濃度； 第五步超濾與電滲析聯(lián)用精制，電滲析裝置的半透膜更換為截留分子量500~1000 Da的超濾膜； 第六步干燥。
3. 權(quán)利要求2所述殼寡糖的制備方法，其特征在于，第一步每100g殼聚糖加無(wú)機(jī)酸 0. 2~I. 0摩爾。
4. 權(quán)利要求2所述殼寡糖的制備方法，其特征在于，第一步殼聚糖與水的質(zhì)量體積比 為 1:10 ~20。
5. 權(quán)利要求2所述殼寡糖的制備方法，其特征在于，第二步的反應(yīng)溫度為35~45°C。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種殼寡糖的制備方法，尤其涉及窄分布?xì)す烟堑闹苽?。本發(fā)明的技術(shù)方案是：將殼聚糖溶解，然后加酶水解，過(guò)濾除雜，濃縮反應(yīng)液，然后超濾與電滲析聯(lián)用精制，干燥得殼三糖～殼六糖含量在90%以上的窄分布?xì)す烟?。本發(fā)明技術(shù)方案解決了殼寡糖產(chǎn)品殼三糖～殼六糖含量低的問(wèn)題。
【IPC分類(lèi)】C12P19-14, C12P19-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104726519
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410467487
【發(fā)明人】夏文水, 李廣生, 邵先祥, 曲欣欣
【申請(qǐng)人】迪沙藥業(yè)集團(tuán)有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2014年9月15日