專利名稱：：聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬化合物及其合成方法，涉及聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物及其合成方法，以及聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤一直是直接威脅人類健康的重大疾病，腫瘤化療由于藥物本身缺乏分子耙向性，因而出現(xiàn)治愈率低、毒副作用巨大等重大治療問題。通過合適的載體技術(shù)，將藥物直接靶向病變組織(器官)、細(xì)胞是解決癌癥化療治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家通過載體技術(shù)在腫瘤藥物的組織(器官)和細(xì)胞靶向上取得了一定的進(jìn)展，但并沒有取得突破性的療效，其本質(zhì)在于絕大多數(shù)抗腫瘤藥物的分子作用耙點(diǎn)位于細(xì)胞內(nèi)，因此腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物分子作用靶點(diǎn)(亞細(xì)胞器)靶向性載體材料技術(shù)的研究開發(fā)是突破癌癥化療瓶頸的關(guān)鍵。靶向載體的設(shè)計(jì)主要包括載體的病灶臟器耙向性，以及在此基礎(chǔ)上穿越病灶臟器內(nèi)的病灶細(xì)胞靶向，從而完成針對(duì)藥物分子靶標(biāo)的亞細(xì)胞器耙向。早期的組織器官耙向，利用微粒的小粒徑被動(dòng)耙向到肝等組織，通過"增強(qiáng)的透過及滯留效應(yīng)"(enhancedpermeabilityandretentioneffect)聚集到腫瘤組織等。當(dāng)前，研究者利用腫瘤細(xì)胞表面某些受體(如葉酸受體)過度表達(dá)的特性，將配體修飾載體材料成功應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。從而達(dá)到腫瘤細(xì)胞的耙向，提高細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥物濃度，增強(qiáng)抗腫瘤藥物本身的療效。近年來，聚合物膠團(tuán)在藥物制劑學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及高分子領(lǐng)域已經(jīng)引起了人們廣泛的重視。聚合物膠團(tuán)是由兩親性的嵌段或接枝共聚物在水性介質(zhì)中自聚形成，具有核-殼結(jié)構(gòu)。其疏水性鏈段構(gòu)成膠團(tuán)的內(nèi)核，親水性鏈段形成膠團(tuán)的外殼。疏水核可為難溶性藥物提供儲(chǔ)庫(kù)的作用；親水性外膜保持膠團(tuán)在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性，并可進(jìn)行理化性質(zhì)修飾以達(dá)到特定的目的，如膠團(tuán)的主動(dòng)耙向等。聚合物膠團(tuán)作為一種藥物傳輸系統(tǒng)，有許多優(yōu)勢(shì)通過調(diào)整材料的溶解性、pH值、Zeta電位等可以控制藥物在生物體內(nèi)的釋放；由于膠團(tuán)粒徑很小，故可穿過血腦屏障、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)，也可促進(jìn)腸胃黏膜等的良好吸收，到達(dá)大尺寸粒子無法通過的部位，達(dá)到被動(dòng)靶向的目的；聚合物膠團(tuán)骨架對(duì)藥物的保護(hù)和屏蔽作用，可在一定程度上避免藥物的分解，保持藥物的穩(wěn)定性，降低藥物的毒性；與脂質(zhì)體相比，聚合物膠團(tuán)的載藥量較高；聚合物材料的多樣性，使得以聚合物為載體的藥物制劑亦多樣化，能滿足各種使用需求。有報(bào)道指出，在藥物載體中進(jìn)行親水性的聚乙二醇修飾，可以減少血漿蛋白對(duì)載體的吸附作用，同時(shí)可減少巨噬細(xì)胞對(duì)藥物載體的吞噬作用，使載體在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期延長(zhǎng)?；诖嗽诰酆衔锬z團(tuán)的親水外殼上進(jìn)行聚乙二醇修飾，可以減少血漿蛋白對(duì)聚合物膠團(tuán)的調(diào)理作用，從而減少巨噬細(xì)胞對(duì)聚合物膠團(tuán)的攝取，延緩聚合物膠團(tuán)從血漿中被清除的過程。通過"增強(qiáng)的透過及滯留效應(yīng)"，可進(jìn)一步提高聚合物膠團(tuán)在腫瘤組織的被動(dòng)靶向功能。本發(fā)明在我們前期的研究工作基礎(chǔ)上，利用殼寡糖脂肪酸嫁接物形成的膠團(tuán)，進(jìn)行表面聚乙二醇修飾，合成了可以避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別的長(zhǎng)循環(huán)性殼寡糖脂肪酸嫁接物，并應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供聚乙二醇修飾的殼寡糖脂肪酸嫁接物，其具有代表性的結(jié)構(gòu)通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中x，y為聚合度；n=12-22;殼寡糖的分子量為1100kDa，脫乙酰度為70-100%;殼寡糖鏈上的部分自由氨基被聚乙二醇取代。本研究中所采用的殼寡糖脂肪酸嫁接物己在發(fā)明專利ZL2005100507981中公開，所述的熒光標(biāo)記疏水改性殼寡糖聚合物，具有以下結(jié)構(gòu)通式殼寡糖的分子量小于200kDa，殼寡糖鏈上的部分自由氨基被烷基取代，氨基取代度為150%，其中R,為熒光基團(tuán)，R2為垸基鏈，n為殼寡糖的聚合度，帶有正電荷，zeta電位在580mV，粒徑在51000nm，共價(jià)結(jié)合熒光分子。其中的疏水改性殼寡糖聚合物通過以下步驟實(shí)現(xiàn)取分子量450kDa，殼聚糖,在556(TC和pH5.0條件下攪拌溶解，按纖維素酶與殼聚糖重量比為0.5:IOO加入纖維素酶降解，過濾除去雜質(zhì)，以超濾膜超濾分級(jí)，濾液冷凍干燥，得分子量小于200kDa的低分子量殼寡糖，凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量，取上述殼寡糖水溶液，按照殼寡糖、脂肪酸、交聯(lián)偶合劑碳二亞胺摩爾比1:150:150，控制5(TC9(TC，反應(yīng)548小時(shí)，終反應(yīng)液透析純化，冷凍干燥得到疏水改性殼寡糖。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)的聚乙二醇修飾方法，通過以下方案實(shí)現(xiàn)分別稱取適量殼寡糖脂肪酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇(端醛基化聚乙二醇和殼寡糖脂肪酸的摩爾比例分別為1:5、1:1、5:1、10:1、20:1中的一種)，加入50ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解(400w，工作2秒，間歇3秒)，室溫下400rpm攪拌過夜后停止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories(光譜實(shí)驗(yàn)室)，LagunaHills(舊金山)，CA(加尼福利亞州))透析48小時(shí)，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物固體粉末。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)作為長(zhǎng)循環(huán)性載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益之處是所制備得到的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物，具有在水性介質(zhì)中通過自聚集形成膠團(tuán)的特性，聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物的臨界膠團(tuán)濃度在15pg/ml左右，明顯低于一般表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度?？娠@著減少殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞中的攝取，并且隨著聚乙二醇修飾比例的增加，膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞中的攝取逐漸減少。聚乙二醇修飾后，膠團(tuán)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和永生化正常肝細(xì)胞BRL-3A的攝取沒有顯著影響。以絲裂霉素C為模型藥物制備的，嫁接物膠團(tuán)給藥系統(tǒng)的抗腫瘤藥效學(xué)研究表明，聚乙二醇修飾的殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)負(fù)載絲裂霉素C后，細(xì)胞毒性作用可以與負(fù)載絲裂霉素C的殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)保持在同一水平，與游離絲裂霉素C相比，藥效提高了14倍左右。圖h聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞RAW264.7中的定量攝取。圖2:聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在肝癌細(xì)胞HepG2中的定量攝取。圖3:聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在永生化正常肝細(xì)胞BRL-3A中的定量攝取。圖4:聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物(A)、殼寡糖硬脂酸嫁接物(B)和端醛基化聚乙二醇(C)的氫譜核磁共振圖譜。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一1、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備與理化性質(zhì)測(cè)定利用端醛基化聚乙二醇中具有強(qiáng)反應(yīng)活性的醛基與嫁接物中殼寡糖主鏈上未被硬脂酸取代的氨基之間的席夫反應(yīng)，合成聚乙二醇修飾的嫁接物。精密稱取殼寡糖-硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇2.68mg(端醛基化聚乙二醇和殼寡糖-硬脂酸嫁接物的摩爾比例為1:5)，溶于50mL去離子水中，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，室溫下磁力攪拌(400rpm)過夜，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills,CA)中，透析48h，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸聚合物固體粉末。經(jīng)微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定，1.0mg/mL該嫁接物膠團(tuán)在PBS中的粒徑為119.2土7.5nm，表面電位為14.5±5.8mV。采用芘熒光法，測(cè)得嫁接物膠團(tuán)在PBS中的臨界膠團(tuán)濃度為12.5pg/ml。2、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在不同細(xì)胞系中的攝取研究取聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶于2mL去離子水中，探頭超聲20次(400w,工作2s間歇3s)后，加入200異硫氰基熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)的乙醇溶液(2.0mg/mL)，在避光與磁力攪拌(400rpm)條件下，連續(xù)反應(yīng)24h。將終反應(yīng)液置透析袋(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，用去離子水透析24h，除去未反應(yīng)的FITC。透析液冷凍干燥，得到聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物的熒光標(biāo)記產(chǎn)物。取RAW264.7、HepG2、BRL-3A細(xì)胞，在含有10%胎牛血清的DMEM(RAW264.7和HepG"和含有10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液(BRL-3A)中連續(xù)培養(yǎng)(5。/。C02,37。C孵箱)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后用培養(yǎng)液稀釋，按每孔lx105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板(NalgeNuneInterational，Naperville,IL，USA)孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)液中加入異硫氰基熒光素標(biāo)記的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液孵育。膠團(tuán)濃度控制為100pg/ml。培養(yǎng)1.5，3，6，12，24h后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，然后用胰酶消化。收集細(xì)胞消化液，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，得到細(xì)胞裂解液。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞裂解液中的熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞對(duì)聚乙二醇修飾的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的攝取百分?jǐn)?shù)，并用蛋白校正。按(1)式計(jì)算細(xì)胞對(duì)膠團(tuán)的攝取量Pt(%)=Ft/F。X100%(1)其中，Pt是t時(shí)間內(nèi)細(xì)胞對(duì)膠團(tuán)的攝取百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)t和F。分別是t時(shí)間和0時(shí)間的熒光吸收(已通過蛋白校正)。嫁接物膠團(tuán)的細(xì)胞攝取結(jié)果見圖1-3。孵育12h后，該膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中的攝取量為41.4%，與未修飾的殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在相同時(shí)間內(nèi)的攝取量(56.3%)相比，攝取量減少了15%左右，并且攝取已基本達(dá)到平衡。該膠團(tuán)在腫瘤細(xì)胞HepG2以及正常細(xì)胞BRL-3A中的攝取與未修飾膠團(tuán)相比，沒有顯著性區(qū)別。3、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用取聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物適量，溶于PBS中，加入適量絲裂霉素C的PBS溶液，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，得到負(fù)載絲裂霉素c的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液，膠團(tuán)溶液中嫁接物的濃度為5mg/ml，藥物的包封率為30%左右。以肝癌細(xì)胞HepG2為模型細(xì)胞，負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的抗腫瘤療效通過給藥系統(tǒng)與細(xì)胞共孵育后的IC50值(細(xì)胞的半數(shù)致死率)來評(píng)價(jià)。細(xì)胞存活率試驗(yàn)采用四唑鹽比色法(MTTAssay)測(cè)定。細(xì)胞于24孔板預(yù)培養(yǎng)24h貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度的絲裂霉素C溶液(溶劑為PBS)和不同濃度的負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，并設(shè)對(duì)照孔，每組重復(fù)3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60pL孵育4h后棄去上清液，PBS溶液沖洗2次，每孔加入DMSO400pL，終止反應(yīng)。將培養(yǎng)板水平振蕩10min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570nm處測(cè)定吸收度，按(2)式計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率(％)=八57()(樣品)/A57o(對(duì)照)xlOOX(2)其中A^(樣品)為加入游離藥物或載藥膠團(tuán)后的細(xì)胞的吸收度，A^(對(duì)照)為空白對(duì)照的細(xì)胞的吸收度。絲裂霉素C溶液的IC5o值為1.97士0.2pg/ml，負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)IC5o值為0.12i0.03pg/ml，藥效提高了約14倍。與負(fù)載絲裂霉素C的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)IC5o值(0.13±0.02tig/ml)相比，聚乙二醇修飾后不影響載藥膠團(tuán)的抗腫瘤活性。實(shí)施例二1、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備與理化性質(zhì)測(cè)定利用端醛基化聚乙二醇中具有強(qiáng)反應(yīng)活性的醛基與嫁接物中殼寡糖主鏈上未被硬脂酸取代的氨基之間的席夫反應(yīng)，合成聚乙二醇修飾嫁接物。精密稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇13.4mg(端醛基化聚乙二醇和殼寡糖-硬脂酸嫁接物的摩爾比例為1:1)，溶于50mL去離子水中，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，室溫下磁力攪拌(400rpm)過夜，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，透析48h，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸聚合物固體粉末。經(jīng)微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定，1.0mg/mL該嫁接物膠團(tuán)在PBS中的粒徑為161.2±4.8nm，表面電位為14.3±4.6mV。采用芘熒光法，測(cè)得嫁接物膠團(tuán)在PBS中的臨界膠團(tuán)濃度為11.5ng/ml。2、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在不同細(xì)胞系中的攝取研究取聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物10mg,精密稱定，溶于2mL去離子水中，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)后，加入200異硫氰基熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)的乙醇溶液(2.0mg/mL)，在避光與磁力攪拌(400rpm)條件下，連續(xù)反應(yīng)24h。將終反應(yīng)液置透析袋(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，用去離子水透析24h，除去未反應(yīng)的FITC。透析液冷凍干燥，得到聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物的熒光標(biāo)記產(chǎn)物。取RAW264.7、HepG2、BRL-3A細(xì)胞，在含有10%胎牛血清的DMEM(RAW264.7和HepG2)和1640培養(yǎng)液(BRL-3A)中連續(xù)培養(yǎng)(5%C02,37。C孵箱)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后用培養(yǎng)液稀釋，按每孔^105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板(NalgeNuneInterational，Naperville,IL,USA)孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)液中加入異硫氰基熒光素標(biāo)記的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液孵育。膠團(tuán)濃度控制為100pg/ml。培養(yǎng)1.5，3，6，12，24h后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，然后用胰酶消化。收集細(xì)胞消化液，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，得到細(xì)胞裂解液。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞裂解液中的熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞對(duì)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的攝取百分?jǐn)?shù)，并用蛋白校正。按(1)式計(jì)算細(xì)胞對(duì)膠團(tuán)的攝取量Pt(%)=Ft/F。X100%(1)其中，Pt是t時(shí)間內(nèi)細(xì)胞對(duì)膠團(tuán)的攝取百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)t和Fo分別是t時(shí)間和0時(shí)間的熒光吸收(已通過蛋白校正)。嫁接物膠團(tuán)的細(xì)胞攝取結(jié)果參見圖1-3。孵育24h后，該膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中的攝取量為29.6%，與未修飾的殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在相同時(shí)間內(nèi)的攝取量(58.4%)相比，攝取量減少了30%左右。與修飾比例為l:5聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在24h的攝取量(45%)相比，該膠團(tuán)在RAW264.7細(xì)胞中的攝取進(jìn)一步減少。該膠團(tuán)在腫瘤細(xì)胞HepG2以及正常細(xì)胞BRL-3A中的攝取與未修飾膠團(tuán)相比，沒有顯著性區(qū)別。圖1是FITC標(biāo)記的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在RAW264.7細(xì)胞中的攝取情況(o》殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)；(a):聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為1:5);(x)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為l:l);(□)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為5:1)。圖2是FITC標(biāo)記的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在H印G2細(xì)胞中的攝取情況(o):殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)；(a):聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為1:5);(x)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為l:l);(□)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為5:1)。圖3是FITC標(biāo)記的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在HepG2細(xì)胞中的攝取情況(o):殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)；(a):聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖脂酸嫁接物的摩爾比例為1:5);(x)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為l:l);(□)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)(聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為5:1)。3、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用取聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物適量，溶于PBS中，加入適量絲裂霉素C的PBS溶液，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，得到負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液，膠團(tuán)溶液中嫁接物的濃度為5mg/ml，藥物的包封率為30%左右。以肝癌細(xì)胞HepG2為模型細(xì)胞，負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的抗腫瘤療效通過給藥系統(tǒng)與細(xì)胞共孵育后的IC50值(細(xì)胞的半數(shù)致死率)來評(píng)價(jià)。細(xì)胞存活率試驗(yàn)采用四唑鹽比色法(MTTAssay)測(cè)定。細(xì)胞于24孔板預(yù)培養(yǎng)24h貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度的絲裂霉素C溶液(溶劑為PBS)和不同濃度的負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，并設(shè)對(duì)照孔，每組重復(fù)3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60pL孵育4h后棄去上清液，PBS溶液沖洗2次，每孔加入DMSO400nL,終止反應(yīng)。將培養(yǎng)板水平振蕩10min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570nm處測(cè)定吸收度，按(2)式計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率(％)=八57()(樣品)/As7。(對(duì)照)xl00X(2)其中A570(樣品)為加入游離藥物或載藥膠團(tuán)后的細(xì)胞的吸收度，A57。(對(duì)照)為空白對(duì)照的細(xì)胞的吸收度。絲裂霉素C溶液的IC5。值為1.97士0.2ng/ml，負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)IC5o值為0.14士0.04嗎/ml，藥效提高了約14倍。與負(fù)載絲裂霉素C的殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)IC5o值(0.13±0.02pg/ml)相比，聚乙二醇修飾后不影響載藥膠團(tuán)的抗腫瘤活性。實(shí)施例三1、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備與理化性質(zhì)測(cè)定利用端醛基化聚乙二醇中具有強(qiáng)反應(yīng)活性的醛基與嫁接物中殼寡糖主鏈上未被硬脂酸取代的氨基之間的席夫反應(yīng)，合成聚乙二醇修飾的嫁接物。精密稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇67mg(端醛基化聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為5:1)，溶于50mL去離子水中，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，室溫下磁力攪拌(400rpm)過夜，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，透析48h，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸聚合物固體粉末。經(jīng)微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定，1.0mg/mL該嫁接物膠團(tuán)在PBS中的粒徑為171.8±9.2nm,表面電位為15.9±5.3mV。采用芘熒光法，測(cè)得嫁接物膠團(tuán)在PBS中的臨界膠團(tuán)濃度為11.7嗎/ml。聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物、殼寡糖硬脂酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇的氫譜核磁共振圖譜見參圖4(圖中(A):聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物、(B)殼寡糖硬脂酸嫁接物、(C)端醛基化聚乙二醇)，由圖4可見聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物中出現(xiàn)了聚乙二醇重復(fù)單元乙二醇的質(zhì)子峰(3=3-3.6);而端醛基化聚乙二醇中的醛基的質(zhì)子峰(5=9.6)，沒有在聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物的圖譜中出現(xiàn)，表明聚乙二醇與殼寡糖硬脂酸嫁接物是以化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合的。2、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在不同細(xì)胞系中的攝取研究取聚乙二醇修飾的殼寡糖硬脂酸嫁接物10mg，精密稱定，溶于2mL去離子水中，探頭超聲20次(400w,工作2s間歇3s)后，加入200異硫氰基熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)的乙醇溶液(2.0mg/mL)，在避光與磁力攪拌(400rpm)條件下，連續(xù)反應(yīng)24h。將終反應(yīng)液置透析袋(截留分子量為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，用去離子水透析24h，除去未反應(yīng)的FITC。透析液冷凍干燥，得到聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物的熒光標(biāo)記產(chǎn)物。取RAW264.7、HepG2、BRL-3A細(xì)胞，在含有10%胎牛血清的DMEM(RAW264.7和HepG2)和1640培養(yǎng)液(BRL-3A)中連續(xù)培養(yǎng)(5%C02，37。C孵箱)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后用培養(yǎng)液稀釋，按每孔^105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板(NalgeNuneInterational，Naperville，IL，USA)孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)液中加入異硫氰基熒光素標(biāo)記的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液孵育。膠團(tuán)濃度控制為100]Lig/ml。培養(yǎng)1.5，3，6，12，24h后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，然后用胰酶消化。收集細(xì)胞消化液，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，得到細(xì)胞裂解液。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞裂解液中的熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞對(duì)聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的攝取百分?jǐn)?shù)，并用蛋白校正。按(1)式計(jì)算細(xì)胞對(duì)膠團(tuán)的攝取量Pt(%)=Ft/FoX100%(1)其中，Pt是t時(shí)間內(nèi)細(xì)胞對(duì)膠團(tuán)的攝取百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)t和Fo分別是t時(shí)間和0時(shí)間的熒光吸收(已通過蛋白校正)。嫁接物膠團(tuán)的細(xì)胞攝取結(jié)果見圖1-3。孵育24h后，該膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中的攝取量為17.7%，與未修飾的殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在相同時(shí)間內(nèi)的攝取量(58.4%)相比，攝取量減少了40%左右。與修飾比例為1:1聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在24h的攝取量(29.6%)相比，該膠團(tuán)在RAW264.7細(xì)胞中的攝取進(jìn)一步減少。該膠團(tuán)在正常細(xì)胞BRL-3A中的攝取與未修飾膠團(tuán)相比，沒有顯著性區(qū)別；在腫瘤細(xì)胞HepG2中，12h之內(nèi)該膠團(tuán)的攝取與未修飾膠團(tuán)相比略有減少，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到24h后，兩者之間的攝取已沒有明顯差異。3、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用取聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物適量，溶于PBS中，加入適量絲裂霉素C的PBS溶液，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，得到負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)溶液，膠團(tuán)溶液中嫁接物的濃度為5mg/ml，藥物的包封率為30%左右。以肝癌細(xì)胞HepG2為模型細(xì)胞，負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的抗腫瘤療效通過給藥系統(tǒng)與細(xì)胞共孵育后的IC50值(細(xì)胞的半數(shù)致死率)來評(píng)價(jià)。細(xì)胞存活率試驗(yàn)采用四唑鹽比色法(MTTAssay)測(cè)定。細(xì)胞于24孔板預(yù)培養(yǎng)24h貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度的絲裂霉素C溶液(溶劑為PBS)和不同濃度的負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，并設(shè)對(duì)照孔，每組重復(fù)3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60pL孵育4h后棄去上清液，PBS溶液沖洗2次，每孔加入DMSO400pL，終止反應(yīng)。將培養(yǎng)板水平振蕩10min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570nm處測(cè)定吸收度，按(2)式計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率(％)=八57()(樣品)/A57o(對(duì)照)xlOOX(2)其中A57。(樣品)為加入游離藥物或載藥膠團(tuán)后的細(xì)胞的吸收度，A570(對(duì)照)為空白對(duì)照的細(xì)胞的吸收度。絲裂霉素c溶液的IQo值為1.97±0.2pg/ml，負(fù)載絲裂霉素C的聚乙二醇修飾殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)IQo值為0.11±0|ag/ml，藥效提高了約14倍。與負(fù)載絲裂霉素C的殼寡糖-硬脂酸嫁接物膠團(tuán)IC5o值(0.13±0.02^ig/ml)相比，聚乙二醇修飾后不影響載藥膠團(tuán)的抗腫瘤活性。實(shí)施例四1、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備與理化性質(zhì)測(cè)定利用端醛基化聚乙二醇中具有強(qiáng)反應(yīng)活性的醛基與嫁接物中殼寡糖主鏈上未被硬脂酸取代的氨基之間的席夫反應(yīng)，合成聚乙二醇修飾嫁接物。精密稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇134mg(端醛基化聚乙二醇和殼寡糖-硬脂酸嫁接物的摩爾比例為1:10)，溶于50mL去離子水中，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，室溫下磁力攪拌(400rpm)過夜，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中(截留分子量為7000Da,SpectrumLaboratories,LagunaHills,CA)中，透析48h，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸聚合物固體粉末。經(jīng)微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定，1.0mg/mL該嫁接物膠團(tuán)在PBS中的粒徑為178.2±3.2nm，表面電位為15.5±4.8mV。采用芘熒光法，測(cè)得嫁接物膠團(tuán)在PBS中的臨界膠團(tuán)濃度為12.9pg/ml。實(shí)施例五1、聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的制備與理化性質(zhì)測(cè)定利用端醛基化聚乙二醇中具有強(qiáng)反應(yīng)活性的醛基與嫁接物中殼寡糖主鏈上未被硬脂酸取代的氨基之間的席夫反應(yīng)，合成聚乙二醇修飾的嫁接物。精密稱取殼寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇268mg(端醛基化聚乙14二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例為1:20),溶于50mL去離子水中，探頭超聲20次(400w，工作2s間歇3s)，室溫下磁力攪拌(400rpm)過夜，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中(截留分子量為7000Da,SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，透析48h，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸聚合物固體粉末。經(jīng)微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定，1.0mg/mL該嫁接物膠團(tuán)在PBS中的粒徑為185.2±5.5nm，表面電位為16.1±3.7mV。采用芘熒光法，測(cè)得嫁接物膠團(tuán)在PBS中的臨界膠團(tuán)濃度為13.5pg/ml。表l聚乙二醇修飾前后殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)的粒徑、表面電位與臨界膠團(tuán)濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注a指殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，b、c、d指聚乙二醇修飾殼寡糖硬脂酸嫁接物膠團(tuán)，聚乙二醇和殼寡糖硬脂酸嫁接物的摩爾比例分別為1:5、1:1和5:1。權(quán)利要求1.一種聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物，其特征是具有以下結(jié)構(gòu)通式其中x，y為聚合度；n＝12-22；殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70-100％；殼寡糖鏈上的部分自由氨基被聚乙二醇取代。本研究中所采用的殼寡糖脂肪酸嫁接物被發(fā)明專利ZL2005100507981所覆蓋。1.一種聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物，其特征是具有以下其中x,y為聚合度；n=12-22;殼寡糖的分子量為1100kDa，脫乙酰度為70-100%;殼寡糖鏈上的部分自由氨基被聚乙二醇取代。本研究中所采用的殼寡糖脂肪酸嫁接物被發(fā)明專利ZL2005100507981所覆蓋。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物，其特征是-該聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物具有在水性介質(zhì)中通過自聚集形成膠團(tuán)的特性，可顯著減少殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞中的攝取，而在肝癌細(xì)胞HepG2和永生化正常肝細(xì)胞BRL-3A的攝取沒有顯著影響。3.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物的制備方法，其特征是由聚乙二醇的醛基與殼寡糖的氨基的席夫反應(yīng)合成得到，具體步驟為分別稱取適量殼寡糖脂肪酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇，加入50ml蒸餾水后探頭超聲20次使溶解，室溫下400rpm攪拌過夜后停止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中透析48小時(shí)，以除去未反應(yīng)的端醛基化聚乙二醇，然后將透析液冷凍干燥，得聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物固體粉末。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物的制備方法，其特征是:端醛基化聚乙二醇和殼寡糖脂肪酸的摩爾比例分別為1:5、1:1、5:1、10:1或20:1中的一種。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物的制備方法，其特征是探頭超聲溶解條件400w，工作2秒，間歇3秒。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物的制備方法，其特征是反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋中的截留分子量選為7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾殼寡糖脂肪酸嫁接物在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供聚乙二醇修飾的殼寡糖脂肪酸嫁接物，稱取殼寡糖脂肪酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇，加入蒸餾水超聲溶解，攪拌，透析，透析液冷凍干燥，得目的物。本發(fā)明的嫁接物具有在水性介質(zhì)中通過自聚集形成膠團(tuán)的特性，可顯著減少殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞中的攝取，并且隨著聚乙二醇修飾比例的增加，膠團(tuán)在巨噬細(xì)胞中的攝取逐漸減少。研究表明膠團(tuán)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和永生化正常肝細(xì)胞BRL-3A的攝取沒有顯著影響，細(xì)胞毒性作用可以與負(fù)載絲裂霉素C的殼寡糖脂肪酸嫁接物膠團(tuán)保持在同一水平，與游離絲裂霉素C相比，藥效提高了14倍左右，可長(zhǎng)循環(huán)性載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)通式如圖。文檔編號(hào)C08B37/08GK101293933SQ200810062568公開日2008年10月29日申請(qǐng)日期2008年6月17日優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日發(fā)明者杜永忠,胡富強(qiáng),盼蒙,弘袁申請(qǐng)人:浙江大學(xué)