優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其重組質(zhì)粒和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其重組質(zhì)粒和應(yīng)用。優(yōu)化的編碼PCV2Cap蛋白的基因，序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示。所述的重組質(zhì)粒，為含有本發(fā)明所述基因的pVAX1載體。Western?Blot試驗結(jié)果證明這些重組在體外能夠有效進行表達，并具有較好的免疫原性。動物免疫實驗表明Cap蛋白改造后的重組質(zhì)粒DNA能夠有效誘導小鼠和豬體產(chǎn)生細胞和體液免疫應(yīng)答，為PCV2基因疫苗的研究方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其重組質(zhì)粒和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因及其重組質(zhì)粒和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus2, PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等多種疾病，臨床上表現(xiàn)進行性消瘦、皮膚蒼白等特點。該病毒無囊膜，基因組為一條長約1.76kb的共價閉合環(huán)狀單鏈DNA。PCV2基因組含有3個主要的開放閱讀框，即0RF1，0RF2和0RF3。PCV20RF2由702或705個堿基組成，編碼233或234個氨基酸，構(gòu)成病毒的衣殼蛋白(Cap)，是主要的免疫原性蛋白。圍繞Cap蛋白構(gòu)建基因工程核酸疫苗已逐漸成為研究熱點。核酸疫苗以其構(gòu)建容易、成本低廉、穩(wěn)定性高和安全性好等優(yōu)點，成為國際疫苗研究領(lǐng)域最熱門的課題之一。
[0003]雖然應(yīng)用天然PCV20RF2構(gòu)建DNA疫苗具有一定的可行性，但天然0RF2在真核表達系統(tǒng)的表達量非常低，嚴重影響了 DNA疫苗的免疫效果。有研究報道，將PCV20RF2密碼子偏嗜性改為哺乳動物豬屬可明顯提高其在真核系統(tǒng)中的表達量。本研究通過修飾PCV20RF2基因，并采用KOZAK序列和FMDV2A基因蛋白設(shè)計新的Cap序列，進一步提高了基因疫苗免疫的效果。
[0004]核酸疫苗在疫病防制中具備了許多優(yōu)點，但使用普通方法免疫進入機體細胞的效率較低，沙門氏菌屬于腸桿菌科，是一組胞內(nèi)侵襲性致病菌，故能有效遞呈抗原，激發(fā)抗沙門氏菌和誘導外源蛋白的特異性體液免疫反應(yīng)與細胞免疫反應(yīng)，并能同時誘導黏膜免疫與全身免疫。近年來，通過減毒沙門氏菌運送DNA疫苗，被認為是一種很有前途的方法。
[0005]分子克隆技術(shù)，基因合成及PCR擴增獲得優(yōu)化處理后的基因克隆至pVAXl載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒后經(jīng)轉(zhuǎn)染、western blot鑒定重組蛋白表達情況。
[0006]動物免疫試驗，以重組質(zhì)粒免疫小鼠后測定抗體和淋巴細胞增殖指數(shù)，篩選出最佳改造基因，將最佳改造基因轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌進行豬體免疫實驗和攻毒保護實驗，證明改造后的基因具有很好的免疫原性和免疫保護性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是證明以改造后的Cap蛋白基因為基礎(chǔ)構(gòu)建的基因疫苗在動物體內(nèi)的免疫特性。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是初步驗證核酸疫苗能否用于PCV2的防控。
[0009]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]優(yōu)化的編碼PCV2Cap蛋白的基因，序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2或SEQ IDN0.3所示。其中SEQ ID N0.1為根據(jù)哺乳動物偏嗜性，對天然的PCV20RF2基因密碼子進行優(yōu)化，改成豬偏嗜的基因， 并添加KOZAK序列，命名為SynCap ；SEQ ID N0.2為在SEQID N0.1的基礎(chǔ)上將PCV20RF2基因起始密碼子ATG后的第一個堿基C突變成G，命名為SynCap (m)；SEQ ID N0.3為通過2A蛋白編碼序列連接兩個SynCap (m)基因所得，命名為SynCap-2A-SynCap。
[0011]所述的優(yōu)化的編碼PCV2Cap蛋白的基因，優(yōu)選序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]含有所述的優(yōu)化的編碼PCV2Cap蛋白的基因的重組質(zhì)粒。
[0013]所述的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為含有本發(fā)明所述基因的pVAXl載體，進一步優(yōu)選含有SynCap 或 SynCap (m)基因的 pVAXl 載體。
[0014]含有本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌，優(yōu)選含有pVAX-SynCap (m)的減毒沙門氏菌。
[0015]本發(fā)明所述的基因在制備抗豬圓環(huán)病毒2型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒在制備抗豬圓環(huán)病毒2型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明所述的減毒沙門氏菌在制備抗豬圓環(huán)病毒2型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
[0018]有益效果
[0019]本發(fā)明根據(jù)PCV2Cap蛋白序列按照豬源密碼子偏嗜性進行優(yōu)化處理，并在此基礎(chǔ)上做了一系列的改造優(yōu)化。利用真核表達載體PVAXl構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pVAX-SynCap、pVAX-SynCap (m)和 pVAX-SynCap-2A_SynCap。Western Blot 試驗結(jié)果證明優(yōu)化后的 Cap蛋白能夠在體外表達。小鼠和豬體免疫實驗證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒和攜帶重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌能夠有效地誘導機體的免疫應(yīng)答，同時對PCV2攻毒具有很好的免疫保護作用。證明所構(gòu)建的圓環(huán)病毒核酸疫苗具有一定的應(yīng)用和開發(fā)價值。
[0020]本發(fā)明構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pVAX-SynCap、pVAX-SynCap (m)和pVAX-SynCap-2A-SynCap, Western Blot試驗結(jié)果證明這些重組在體外能夠有效進行表達，并具有較好的免疫原性。首免后6周pVAX-SynCap (m )和pVAX-SynCap組可檢測到ELISA 抗體，首免后 9 周 pVAX-SynCap (m)組 ELISA 抗體達到 1:4000, pVAX-SynCap 組抗體水平為1:1500。首免后9周，各組刺激孔的細胞上清中均可檢測到細胞因子分泌，其中，pVAX-SynCap(m)免疫組產(chǎn)生的IL-4及IFN-Y細胞因子應(yīng)答高于其他各免疫組(P〈0.05)，其次為 pVAX-SynCap 及 pVAX-SynCap-2A_SynCap 免疫組，pVAX-Cap 免疫組中 IL-4 及IFN- y的分泌量較低，陰性對照組和pVAXl免疫組的最低。
[0021]基于以上研究成果，可見Cap蛋白改造后的重組質(zhì)粒DNA能夠有效誘導小鼠和豬體產(chǎn)生細胞和體液免疫應(yīng)答，為PCV2基因疫苗的研究方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1Cap蛋白改造方案
[0023]SynCap:Cap蛋白全基因序列按豬源密碼子偏嗜性進行改造；
[0024]SynCap (m):突變一個堿基的Cap蛋白全基因合成；
[0025]SynCap-2A-SynCap:將兩個合成的的Cap蛋白基因通過口蹄疫2A基因進行串聯(lián)；
[0026]圖2重組真核質(zhì)粒的雙酶切鑒定
[0027]M:DNA Ladder DL5000 ；1:pVAXl 的 Xho I 和 BamH I 的雙酶切；2:pVAX-Cap 的 XhoI 和 BamH I 的雙酶切；3:pVAX-SynCap 的 Xho I 和 BamH I 的雙酶切；4:pVAX-SynCap (m)的 Xho I 和 BamH I 的雙酶切；5:pVAX-SynCap-2A_Cap 的 Xho I 和 BamH I 的雙酶切。[0028]圖3重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Western-blot鑒定
[0029]I:pVAX-SynCap ；2:pVAX-SynCap (m) ；3:pVAX-Cap ；4:pVAX-SynCap-2A-Cap ；5:p VAX 1.[0030]圖4重組質(zhì)粒免疫小鼠后的體液免疫應(yīng)答(a)ELISA抗體應(yīng)答；(b)中和抗體應(yīng)答
[0031]在不同時間點收集血清樣品(n=5)和應(yīng)用間接ELISA檢測血清抗體(a)和中和抗體(b).[0032]中和抗體的滴度應(yīng)用血清平均稀釋度的倒數(shù)表示，數(shù)據(jù)用平均值土S.D來表示。
[0033]圖5重組真核質(zhì)粒免疫小鼠后的細胞免疫應(yīng)答 [0034]首免42天和63天收集脾臟細胞樣品(n=5)，然后應(yīng)用純化的PCV2SH毒株進行刺激，每組設(shè)定3個重復。刺激72小時后，應(yīng)用傳統(tǒng)的MTT法測定增殖應(yīng)答。數(shù)據(jù)用平均值土 S.D來表不。
[0035]圖6重組真核質(zhì)粒免疫小鼠后的細胞因子應(yīng)答
[0036]首免42天和63天收集脾臟細胞樣品(n=5)，然后應(yīng)用純化的PCV2SH毒株進行刺激，每組設(shè)定3個重復。刺激72小時后，收集細胞上清測定上清中細胞因子的含量。數(shù)據(jù)用平均值土 S.D來表不。
[0037]圖7攜帶沙門氏菌的重組質(zhì)粒免疫豬攻毒后病毒血癥狀態(tài)
[0038]圖8淋巴組織中病毒含量的檢測
[0039]圖9組織病理變化情況
[0040]攻毒28天后，對動物進行撲殺，固定組織制備病理組織切片，SynCap Cm)(a), pVAX-SynCap (m) (b), pVAXl (c), SL3263 (d)和陽性對照(e) (HE staining, 400X.)
[0041]生物材料保藏信息
[0042]PCV2SH毒株，分類命名為豬圓環(huán)病毒2型，于2008年3月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0.2389。
【具體實施方式】:
[0043]實施列ICap基因人工改造的設(shè)計、擴增和獲得
[0044]為了提高Cap蛋白免疫特性，本研究對PCV20RF2基因進行了修飾，包括(I)根據(jù)哺乳動物密碼子偏嗜性，對天然的Cap基因密碼子進行優(yōu)化，改成哺乳動物豬偏嗜的基因，并添加KOZAK序列，命名為SynCap，序列如SEQ ID N0.1所示；(2)在優(yōu)化方案(I)的基礎(chǔ)上將PCV20RF2基因起始密碼子ATG后的第一個堿基C突變成G，命名為SynCap (m)，序列如SEQID N0.2所示；(3)通過2A蛋白連接兩個SynCap (m)基因，命名為SynCap-2A_SynCap,序列如SEQ ID N0.3所示。SynCap基因通過化學合成獲得。合成的基因序列兩端帶有BamHI和Xho I酶切位點。
[0045]根據(jù)PCV20RF2基因序列設(shè)計合成一對特異性引物，以本實驗室構(gòu)建的pMD18T-Cap為模板，擴增Cap基因，序列如SEQ ID N0.4所示。
[0046]上游引物PCV2-Cap.15，-ATTAGGATCCGCCACCATGACGT-3，(SEQ ID N0.5)
[0047]下游引物PCV2-Cap.25，-GCGCTCGAGTCACTTAGGGITAAGTG-3，(SEQ ID N0.6)，上下游引物分別含有BamH I和Xho I酶切位點。[0048]取模板pMD18T-Cap0.5u L,加入 PCR 混合液 24.5 u L (2.5 y LlOXbuffer、2 y LdNTP (2.5mM)U.5u L Mg2+ (25mM)、兩條引物各 I y L (20pM)、0.2 y L Taq 酶(2.5U)、滅菌雙蒸水16.3uL)0反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94°C預(yù)變性IOmin ;94°C變性45s ;58°C退火30s ;72°C延伸30s，共進行35個循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增產(chǎn)物。
[0049]其余衍生序列SynCap (m)、SynCap-2A_SynCap以合成的SynCap為模板經(jīng)PCR及分子克隆獲得。
[0050]用于擴增SynCap的弓丨物見表1。
[0051]表1不同Cap蛋白基因擴增所需的引物
[0052]
【權(quán)利要求】
1.優(yōu)化的編碼PCV2Cap蛋白的基因，其特征在于序列如SEQID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的編碼PCV2Cap蛋白的基因，其特征在于序列如SEQIDN0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的基因的重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒， 其特征在于為含有權(quán)利要求1所述基因的pVAXl載體。
5.含有權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌。
6.權(quán)利要求1所述的基因在制備抗豬圓環(huán)病毒2型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒在制備抗豬圓環(huán)病毒2型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5所述的減毒沙門氏菌在制備抗豬圓環(huán)病毒2型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK103614387SQ201310594258
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】姜平, 楊香林 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學