一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的serpina1分子標(biāo)記育種方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種豬SERPINA1基因編碼區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在豬抗豬圓環(huán)病毒病育種中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在不同品種豬中SERPINA1編碼區(qū)存在多處突變，其中編碼區(qū)第445堿基處存在G>A突變，進(jìn)而導(dǎo)致錯(cuò)義突變：谷氨酸>賴氨酸。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在健康狀態(tài)下，AA型個(gè)體的SERPINA1血清含量最高，AG型次之，GG型最低。而在感染PCV2后，GG型個(gè)體的SERPINA1血清含量迅速上升，而AG型和AA型個(gè)體的含量卻迅速下降，此結(jié)果與抗豬圓環(huán)病毒病較強(qiáng)的萊蕪豬群體含有GG型頻率高于西方豬種，且SERPINA1基因的mRNA表達(dá)水平高相一致?？梢娡ㄟ^檢測豬基因組中SERPINA1基因編碼區(qū)445位點(diǎn)的基因型作為與豬抗豬圓環(huán)病毒病性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，不僅方法簡便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。
【專利說明】
-種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的化RPINA1分子標(biāo)巧育種方法及 其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及了一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的育種方 法，通過判斷豬SERPINA1基因編碼區(qū)突變位點(diǎn)的多態(tài)性來進(jìn)行選種，并人為的應(yīng)用該突變 位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)優(yōu)良育種。
【背景技術(shù)】
[0002] 自 1982年Tischer等在PK15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus，PCV)W 來，對其的研究已有約34年的歷史。PCV分為無致病性的PCVl和強(qiáng)致病性的PCV2兩種亞型。 PCV2主要感染5~15周齡的豬，致死率約為15%。它是引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (PWMS)、呼吸道疾病綜合征(PRDS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的主要病原（Stevenson et al .，2001) "PCV2感染機(jī)體后能引起免疫抑制，在與其它病原體一同共感染或繼發(fā)感染時(shí)， 將會加重病情，嚴(yán)重的則會造成機(jī)體死亡。豬的抗病性狀屬于中等遺傳力水平的闊性狀，對 病毒引起的疾病所產(chǎn)生的抗性是可W遺傳的。Opriessnig等的研究發(fā)現(xiàn)在感染PCV2后，皮 特蘭豬所表現(xiàn)出的臨床癥狀最為嚴(yán)重，長白豬次之，杜洛克豬和大白豬的癥狀表現(xiàn)相對較 輕。同時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)在感染PCV2后，大長雜交豬出現(xiàn)日增重減慢、體溫升 高、腹瀉、皮膚出現(xiàn)紫斑W及肺臟和脾臟出現(xiàn)充血、出血等癥狀，而萊憲豬卻表現(xiàn)溫和，無明 顯病變。W上結(jié)果表明不同品種豬對PCV2的抗性存在遺傳差異，地方品種豬抗PCV2的能力 較強(qiáng)。豬不同品種間對PCV2的抗性存在遺傳差異，運(yùn)為抗豬圓環(huán)病毒病豬的育種提供了基 礎(chǔ)和前提。
[0003] 萊憲豬具有抗病耐粗、多胎高產(chǎn)、哺育力強(qiáng)、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性。調(diào)查顯示，自2000 年W來，在西方豬種PCV2感染率及死亡率呈逐漸升高的趨勢，而我國地方品種萊憲豬未出 現(xiàn)PCV2感染的報(bào)道，表現(xiàn)出對PCV2強(qiáng)的抗感染能力。本研究團(tuán)隊(duì)利用數(shù)字表達(dá)譜測序?qū)Ρ?了抗病性強(qiáng)的萊憲豬和易感病的大長雜交豬感染PCV2后肺臟組織表達(dá)譜的差異，篩選出大 量的差異表達(dá)基因，并根據(jù)定量驗(yàn)證的結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒后萊憲豬肺臟的SERPINA1基因 mRNA表 達(dá)水平顯著升高，而大長雜交豬無變化(李艷平，2015)。運(yùn)提示了 SERPINA1基因可能與豬圓 環(huán)病毒病的抗性有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)萊憲豬在感染PCV2后，血清中SERPINA1的含量逐漸 升高，在21化i達(dá)到頂峰(P<0.05)，并且在感染PCV2期間的含量平均值一直高于Odpi的含 量。同時(shí)，NE的血清含量變化與SERPINA1的變化具有相似趨勢，使"蛋白酶-抗蛋白酶"系統(tǒng) 在萊憲豬中一直處于較為平衡的狀態(tài)（圖1)。然而，大長雜交豬在感染PCV2后的4dpi至 l(Wpi，SERPINAl的血清含量一直顯著下降(P<0.05)，在l(Mpi降到最低，隨后其含量一直處 于較低且平穩(wěn)的狀態(tài);而肥的血清含量在感染PCV2的早期階段出現(xiàn)升高趨勢，"蛋白酶-抗 蛋白酶"系統(tǒng)在大長雜交豬中失衡（圖1)，加重了肺組織的炎癥反應(yīng)?？梢?，尋找出豬體感染 PCV2后，沈RPINAl能夠迅速高表達(dá)的關(guān)鍵分子標(biāo)記至關(guān)重要。
[0004] 豬SERPINA1(Serpin peptidase inhibitor,clade A(alpha-1 antiproteinase, antitrypsin) ,member I)基因也稱為AAT基因，是SERPIN超家族中至關(guān)重要的一員。研究發(fā) 現(xiàn)SERPINAl主要表達(dá)于肝組織中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，同時(shí)在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨隧細(xì)胞、腸 上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋己細(xì)胞等也有少量的表達(dá)，運(yùn)些局部組織表達(dá)的SERPINA1在維持 局部細(xì)胞的正常功能和局部組織器官的穩(wěn)態(tài)具有一定作用（Brantly et al.，1988)。 SERPINAl作為一種糖蛋白，是血漿中最主要的蛋白酶抑制子，其能抑制多種蛋白酶例如：中 性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE )、纖溶酶、酶組織蛋白酶G、糜蛋白酶、蛋白酶3、膜蛋白酶、凝血酶、 等（Janciauskiene et al. ,2011)。因 SERPINAl的分子量較小，具有較強(qiáng)的血管透過性，使 其在組織中的含量較其它SERPIN家族成員要高，進(jìn)而在保護(hù)機(jī)體各組織免受酶解損傷的過 程中起到重要作用(M化nt et al. ,2012)。同時(shí)，AAT也是一種急性期反應(yīng)蛋白。當(dāng)組織細(xì) 胞因感染病原微生物而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)時(shí)，AAT蛋白在各組織中迅速合成，其血清含量會升高 3~4倍，甚至10倍，大量的SERPINAl通過血液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)炎癥部位，直接祀向蛋白水解酶或者 病原體，使組織細(xì)胞免受水解酶的破壞，進(jìn)而抑制炎癥的過度發(fā)展，保護(hù)組織細(xì)胞的正常結(jié) 構(gòu)和功能化ee et al.，2003)。
[0005] 通過對比萊憲豬和大長雜交豬SERPINAl基因的編碼區(qū)序列，找到多處核巧酸序列 的不同。對編碼區(qū)445位點(diǎn)存在的G〉A(chǔ)多態(tài)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。我們的研究表明GG型個(gè)體的 SERPINAl血清含量在豬感染PCV2后迅速升高，而AG型和AA型個(gè)體的血清含量在感染PCV2后 迅速下降，提示該位點(diǎn)等位基因?yàn)镚的SERPINAl蛋白具有正常的生物學(xué)功能，而等位基因?yàn)?A的SERPINAl蛋白喪失部分或全部生物學(xué)活性。由于在攻毒后SERPINAl的高表達(dá)和豬抗圓 環(huán)病毒病相一致，因此通過檢測該分子標(biāo)記，選擇SERPINAl生物學(xué)功能正常的豬只組建基 礎(chǔ)群進(jìn)行育種，對于提高豬群體的抗圓環(huán)病毒病特性具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于上述的原因，本發(fā)明通過篩選出豬抗豬圓環(huán)病毒病相關(guān)的基因標(biāo)記，建立豬 分子標(biāo)記輔助育種方法，為豬抗病品種培育提供基因標(biāo)記和技術(shù)方法。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)明 人通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬SERPINAl編碼區(qū)445位點(diǎn)的G〉A(chǔ)突變中影響了SERPINAl的表達(dá) 量及感染PCV2后的表達(dá)變化，可見檢測與突變相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記不僅方法簡便快速，而且 不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。
[0007] 本發(fā)明提供的一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的SERPINAl分子標(biāo)記育種方法，該方法 通過測定從該動(dòng)物獲得的DNA樣品中SERPINAl基因中多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)的；通過多態(tài)性的測定 結(jié)果，選出具有與所需特征相關(guān)的豬進(jìn)行育種；
[0008] 所述的多態(tài)性是與抗豬圓環(huán)病毒病相關(guān)的多態(tài)性。
[0009] 其具體方法如下：
[0010] (1)豬CDNA 的獲得；
[0011] (2)分別W上述豬CDNA為模板，擴(kuò)增SERPINAl基因的編碼區(qū)序列；
[0012] (4)鑒定SERPINAl基因編碼區(qū)的多態(tài)性；
[0013] (5)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定SERPINAl血清含量與不同基因型的關(guān)系；
[0014] (6)群體檢測445位點(diǎn)的多態(tài)性及標(biāo)記輔助育種。
[0015] 具體的標(biāo)記方法為：
[0016] 采用標(biāo)記引物沈RPINA1M，包括
[0017] 沈3?1臟1]\^:5'-664466〔417646414〔6-3'其序列如569 10齡：3所示；
[001 引 S邸PINAlMR:5'-GTTCACCAGAGCAAATACG-3'其序列如SeqIDNo:4所示；
[0019] 我們的研究表明GG型個(gè)體的SERPINAl血清含量在豬感染PCV2后迅速升高，而AG型 和AA型個(gè)體的血清含量在感染PCV2后迅速下降，提示該位點(diǎn)等位基因?yàn)镚的SERPINA1蛋白 具有正常的生物學(xué)功能，而等位基因?yàn)锳的SERPINAl蛋白喪失部分或全部生物學(xué)活性。結(jié)合 基因表達(dá)譜及巧光定量PCR結(jié)果可W看出SERPINAl基因的高表達(dá)與對豬圓環(huán)病毒病的抗性 有關(guān)。通過分子標(biāo)記篩選含有GG型的豬群進(jìn)行育種，可W獲得感染豬圓環(huán)病毒病后 SERPINAl高表達(dá)的個(gè)體，對于提高豬群的抗豬圓環(huán)病毒病特性具有重要意義。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬SERPINAl編碼區(qū)445位點(diǎn)的G〉A(chǔ)突變在體內(nèi)攻 毒豬圓環(huán)病毒試驗(yàn)中改變了 SERPINAl基因在攻毒后的表達(dá)變化，可見檢測與突變相關(guān)聯(lián)的 分子標(biāo)記不僅方法簡便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。
【附圖說明】
[0021] 圖1為豬血清中SERPINAl和肥蛋白含量在豬感染后PCV2后不同天數(shù)的倍數(shù)變化結(jié) 果，其中A為萊憲豬，B為大長雜交豬，*表示與Odpi相比差異顯著P<0.05;
[0022] 圖2為沈RPINA1CF和沈RPINA1CR引物PCR擴(kuò)增豬沈RPINAl完整編碼區(qū)片段電泳圖， 其中 M為 DL2000Maker;
[0023] 圖3為豬SERPINAl基因編碼區(qū)突變的查找結(jié)果，其中A為編碼區(qū)的堿基突變，B為多 膚鏈中相應(yīng)的氨基酸突變；
[0024] 圖4為在健康狀態(tài)下，不同基因型個(gè)體SERPINAl血清含量的化ISA檢測結(jié)果，其中 不同字母間表示差異極顯著P<〇. OOl;
[0025] 圖5為不同基因型個(gè)體在感染PCV2后不同時(shí)期的SERPINAl血清含量化ISA檢測結(jié) 果，其中*表示與前一個(gè)時(shí)期相比差異顯著P<〇. 05;
[0026] 圖6為沈RPINA1MF和沈RPINA1MR引物PCR擴(kuò)增豬沈RPINAl部分基因序列電泳圖，其 中 M 表示 DLl OOOMaker。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 在本說明書的上下文中，除非特別指明否則本說明書所用的任何術(shù)語具有本領(lǐng)域 技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)試驗(yàn)方法 或按照供應(yīng)商所建議的操作說明書進(jìn)行的。
[0028] 實(shí)施例1豬SERPINAl編碼區(qū)序列的克隆及突變位點(diǎn)的查找
[00巧]RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：取萊憲豬和大長雜交豬肺組織，按照TIANGEN公司RNAsimple Total RNA Kit的說明書進(jìn)行肺組織總RNA的提取。隨后按照化KaRa公司PrimeScript? RT reagent Kit with曲NA Erase;r(F*erfect Real Time)試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得 cDNA。
[0030]根據(jù)沈RPINAl基因的mRNA序列（NCBI Reference Sequence:NM_214395.1)設(shè)計(jì)如 下引物SERPINAlCF基因序列如SeqIDNo:l所示，SERPINAlCR基因序列如SeqIDNo:2所 示，它包含了SERPINAl基因 mRNA序列的第8堿基到第1273堿基的范圍（序列如Seq ID No:5 所示）。
[0031]
[0032] 利用SERPINAICF和SERPINAICR引物擴(kuò)增SERPINAl基因 mRNA序列的第8堿基到第 1273堿基的片段，擴(kuò)增體系為 2XPrimeSTAR GC Buffer(Mghpius)IOiiUdNTPs l.&iL，引物 (1〇山0各0.扣L，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase(抓/化）0.化L，cDNA 0.祉L，力時(shí)地2〇至總 體積 25 化。PCR 反應(yīng)條件為 94°C5min; 98°C IOs，58°C30s，72°C lmin30s，34 個(gè)循環(huán)；72°C8min。 得到PCR產(chǎn)物1266bp，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物與6 X Loading Buffer混合后，上樣于I. 5% TAE瓊脂 糖凝膠，5V/cm電泳15min置于紫外下觀察，PCR擴(kuò)增SERPINAl編碼區(qū)片段電泳圖如圖2。
[0033] 將PCR產(chǎn)物送往上海銷尚生物技術(shù)公司測序。檢測發(fā)現(xiàn)在SERPINAl基因編碼區(qū)的 第445堿基存在G〉A(chǔ)突變，進(jìn)而導(dǎo)致所編碼的多膚鏈第149位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?(圖 3)。
[0034] 實(shí)施例沈LISA檢測不同基因型的SERPINAl血清含量
[00巧]取萊憲豬和大長雜交豬在感染PCV2后0、4、7、10、14、21、28和35天的血清，根據(jù)豬 絲氨酸蛋白酶抑制因子USERPINA1/A1AT)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的說明書檢測SERPINAl的 血清含量。檢測結(jié)果如圖4和圖5所示:在健康狀態(tài)下，AA型個(gè)體的血清含量最高，AG型個(gè)體 的含量次之，GG型個(gè)體的含量最低(P<0.0 Ol)(圖4)。而在感染PCV2后，GG型個(gè)體的SERPINAl 血清在4dpi時(shí)出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，同時(shí)在l(Mpi時(shí)其血清含量再次顯著升高(P<0.05)， 并且在感染PCV2期間，其蛋白含量平均值一直高于Odpi的血清含量;然而AG型個(gè)體在感染 PCV2后，在7dpi出現(xiàn)顯著下降（P<0.05)，隨后一直處于較低水平，雖然其含量在21化i出現(xiàn) 一定上升(P<〇.05)，但仍低于健康水平;AA型個(gè)體在感染PCV2后，沈RPINAl蛋白血清含量從 4dpi至l(Mpi持續(xù)下降(P<0.05)，隨后血清含量變化不大，在攻毒期間其蛋白含量平均值一 直低于健康狀態(tài)時(shí)的血清含量(圖5)。
[0036] 實(shí)施例3群體檢測445位點(diǎn)的多態(tài)性及標(biāo)記輔助育種
[0037] 根據(jù)沈RPINAl的基因序列（NCBI Reference Sequence:NC_010449.4)設(shè)計(jì)如下引 物沈RPINAlMF基因序列如SeqIDNo:3所示，S邸PINAlMR基因序列如SeqIDNo:4所示，它 包含了SERPINAl基因全序列從第4760位點(diǎn)到第5629位點(diǎn)的范圍。
[00；3 引
[0039] 利用沈RPINA1MF和SERPINA1MR引物擴(kuò)增SERPINAl基因全序列4760位點(diǎn)到5629位 點(diǎn)片段，擴(kuò)增體系為：2 XPrimeSTAR GC Buffer(Mghpius) 10化，dNTPs 1.化L，引物（IOiiM)各 0.5化，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase(抓/化）0.化L，基因組DNA 1化，加(1地2〇至總體積 25 化。PCR 反應(yīng)條件為 941：5111111;98°(：103,561：303,72°(：1111111，34個(gè)循環(huán)；721：8111111。得到口〇? 產(chǎn)物87化P，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物與6 X Loading Buffer混合后，上樣于1.5%TAE瓊脂糖凝膠， 5V/cm電泳15min置于紫外下觀察，結(jié)果如圖6所示。
[0040] 將PCR產(chǎn)物送往上海銷尚生物技術(shù)公司測序。不同豬種的檢測結(jié)果表一所示，等位 基因 G在萊憲豬和大蒲蓮豬中占優(yōu)勢，而在大長雜交豬W及西方豬種杜洛克豬、長白豬和大 約克豬中此基因頻率很低(表1)。將SERPINA1基因編碼區(qū)445位點(diǎn)的等位基因 G的有無作為 抗病相關(guān)基因標(biāo)記，將攜帶該抗病基因標(biāo)記的豬進(jìn)行繁殖，在仔豬出生后，鑒定該標(biāo)記，通 過綜合選種，從中篩選出抗豬圓環(huán)病毒病強(qiáng)的豬，培養(yǎng)抗豬圓環(huán)病毒病的優(yōu)良豬種。
[0041 ]表1編碼區(qū)445位點(diǎn)等位基因在不同品種豬的分布 [C -
[C
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種篩選抗豬圓環(huán)病毒病豬的輔助育種方法，其特征在于：該方法通過測定從該動(dòng) 物獲得的DNA樣品中SERPINA1基因的多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)的；通過多態(tài)性的測定結(jié)果，選出具有與 所需特征相關(guān)的豬進(jìn)行育種； 所述的多態(tài)性是指能使SERPINA1基因高表達(dá)并與抗豬圓環(huán)病毒病相關(guān)的多態(tài)性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:具體方法如下： (1) 豬基因組DNA的獲得； (2) 以上述豬基因組DNA為模板，擴(kuò)增SERPINA1基因部分基因序列； (3) 鑒定SERPINA1基因編碼區(qū)445位點(diǎn)的多態(tài)性； 其中步驟（3)中所述SERPINA1基因的編碼區(qū)445位點(diǎn)的多態(tài)性是指以Seq ID N〇:3 (SERPINA1MF)和Seq ID No:4(SERPINAlMR)所示的特異性引物PCR擴(kuò)增所得到的Seq ID No: 6所示序列的第676位的核苷酸序列； (4) 檢測并篩選在SERPINA1基因編碼區(qū)445處多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG型的豬，其基因序 列如Seq ID N〇:6所示序列的第676位的核苷酸，進(jìn)行抗豬圓環(huán)病毒病豬的輔助育種。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861704SQ201610327501
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】姜運(yùn)良, 劉浩, 孫億, 劉根, 鹿宏宇, 王巖超, 張萍, 王昱丁, 馬才
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)