專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法不用直接接觸細(xì)胞，就能準(zhǔn)確地判斷移植用細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
背景技術(shù)：
目前，采用骨填補(bǔ)材料補(bǔ)充缺失的骨來對(duì)由于切除骨瘤或外傷等而導(dǎo)致的骨缺失部位的骨進(jìn)行修復(fù)。然而，對(duì)于骨逐漸變脆的骨質(zhì)疏松癥的情況或?qū)τ诠侨笔Р课桓采w的面積非常大等情況，用上述方法解決問題是困難的。
因此，近年來，有必要嘗試一種新方法，在該方法中，包括從患者采集骨髓，將所述采集的骨髓中含有的間葉干細(xì)胞人工分化為成骨細(xì)胞，在成骨細(xì)胞增殖充分后，將其重新輸回所述患者的體內(nèi)。在這種情況下，由于所述的成骨細(xì)胞由采集自患者本身的骨髓增殖而來，隨后又重新輸回同一患者，這樣可激活骨形成而不引起免疫反應(yīng)。
然而，采用上述方法人工培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)，有必要準(zhǔn)確地判斷所述的成骨細(xì)胞是否已達(dá)到充分增殖。由于將所述的成骨細(xì)胞最終輸回患者體內(nèi)，所以希望盡可能避免與細(xì)胞接觸，然而，由于通常不能目視判斷成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)，因此必須采用某種方式將其處理成樣品以判斷其增殖狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到上述情況，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法不用直接接觸細(xì)胞，就能準(zhǔn)確地判斷移植用細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟在相同的條件下，培養(yǎng)移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞；以及利用所述的檢查用細(xì)胞判斷所述的移植用細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
另外，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法還包括以下步驟在培養(yǎng)容器中獨(dú)立地放置所述移植用細(xì)胞和所述檢查用細(xì)胞，所述的培養(yǎng)容器具有多個(gè)隔間以在同一容器中獨(dú)立地放置多個(gè)樣品。
另外，本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法還包括以下步驟在開始培養(yǎng)時(shí)，使每單位體積中所述移植用細(xì)胞和所述檢查用細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的數(shù)量級(jí)相同。
根據(jù)本發(fā)明，由于以隔開的狀態(tài)培養(yǎng)移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞，所以可輕易地從容器中取出所述檢查用細(xì)胞而不接觸所述的移植用細(xì)胞。此外，由于在同一培養(yǎng)容器中培養(yǎng)所述的移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞，通過移動(dòng)所述的培養(yǎng)容器可使所述的移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞始終保持在相同的環(huán)境中。


圖1為簡(jiǎn)單闡述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的概圖。
圖2為闡述在培養(yǎng)中心2中實(shí)施的培養(yǎng)步驟的流程圖。
圖3為顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中描述的培養(yǎng)容器的簡(jiǎn)圖。
具體實(shí)施例方式
以下參考附圖闡述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。
首先，參考圖1簡(jiǎn)單闡述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的概要，本實(shí)施方式中描述的細(xì)胞培養(yǎng)方法適用于該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
在圖1中，將在醫(yī)院1中采集自患者的骨髓放置在規(guī)定的運(yùn)送容器中并運(yùn)送到培養(yǎng)中心2以形成培養(yǎng)的骨。其中，可以將所述的運(yùn)送容器放置在約37℃，也可以保存在4℃或冷凍條件下。
在培養(yǎng)中心2，進(jìn)行初次培養(yǎng)，其中對(duì)運(yùn)送的骨髓中含有的間葉干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；進(jìn)行二次培養(yǎng)，其中通過將培養(yǎng)的間葉干細(xì)胞加到基礎(chǔ)材料上(稱為骨填補(bǔ)材料)而形成培養(yǎng)的骨；進(jìn)行檢查等，以檢測(cè)骨髓和培養(yǎng)液等中是否含有細(xì)菌和真菌，然后，將最終形成的所述培養(yǎng)的骨放置在規(guī)定的運(yùn)送容器中并運(yùn)送到醫(yī)院1。其中，可以將所述的運(yùn)送容器放置在約37℃，也可以保存在4℃溫度下或冷凍條件下。
此外，在二次培養(yǎng)中使用的骨填補(bǔ)材料由骨填補(bǔ)材料提供中心3提供。
以下將參考圖2簡(jiǎn)單闡述在培養(yǎng)中心2進(jìn)行的培養(yǎng)步驟。
首先，將在醫(yī)院1采集自患者的骨髓放置在規(guī)定的運(yùn)送容器中并運(yùn)送到培養(yǎng)中心2。
在培養(yǎng)中心2，取出放置于運(yùn)送容器中的一部分骨髓細(xì)胞，并進(jìn)行檢查以確定在采集的骨髓中是否含有細(xì)菌或真菌等(步驟SP1)。
如果檢測(cè)結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)異常，就將所述的骨髓轉(zhuǎn)入培養(yǎng)步驟，以使骨髓液中含有的間葉干細(xì)胞增殖(步驟SP2)。其中，使所述間葉干細(xì)胞增殖的培養(yǎng)步驟稱為初次培養(yǎng)。在該初次培養(yǎng)中，將在步驟SP1中同樣經(jīng)過檢查的骨髓加入培養(yǎng)基中，所述的培養(yǎng)基含有經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)沒有真菌、細(xì)菌、內(nèi)毒素等的血清(在該培養(yǎng)基中使用人或牛血清)，然后，培養(yǎng)間葉干細(xì)胞并使之增殖。
當(dāng)間葉干細(xì)胞增殖至用于形成培養(yǎng)的骨所需的足夠量時(shí)，隨后對(duì)其進(jìn)行檢查，以確定其是否含有真菌、細(xì)菌等(步驟SP3)，如果檢測(cè)后的結(jié)果顯示沒有問題，將其轉(zhuǎn)入二次培養(yǎng)以形成培養(yǎng)的骨。(步驟SP4)。
在二次培養(yǎng)中，由初次培養(yǎng)增殖而來的間葉干細(xì)胞附著于稱為骨填補(bǔ)材料的基礎(chǔ)材料上，并分化為成骨細(xì)胞以形成骨組織(培養(yǎng)的骨)。
所述的骨填補(bǔ)材料為由β-TCP(β-磷酸三鈣)形式的多孔磷酸鈣構(gòu)成的基礎(chǔ)材料。通過使間葉干細(xì)胞附著于所述的骨填補(bǔ)材料，促進(jìn)了間葉干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，從而形成骨組織。另外，此時(shí)可加入生長(zhǎng)因子等以進(jìn)一步促進(jìn)分化為成骨細(xì)胞。另外，可使用多孔的羥基磷灰石等骨填補(bǔ)材料代替上述的β-TCP。
然后，將采用上述方式形成的培養(yǎng)的骨轉(zhuǎn)入運(yùn)送前檢查步驟，所述的檢查確定培養(yǎng)的骨是否含有例如病毒、支原體、真菌或細(xì)菌等(步驟SP5)，如果沒有異常，將所述的培養(yǎng)的骨轉(zhuǎn)移到規(guī)定的運(yùn)送容器中并運(yùn)送到醫(yī)院1。
在收到培養(yǎng)的骨的醫(yī)院中，在事先安排的手術(shù)日，進(jìn)行移植手術(shù)以將所述的培養(yǎng)的骨移植到患者體內(nèi)。
接著，詳細(xì)描述上述的二次培養(yǎng)。
首先，在二次培養(yǎng)中，由初次培養(yǎng)增殖而來的間葉干細(xì)胞附著于移植用骨填補(bǔ)材料上和檢查用骨填補(bǔ)材料上。在下述闡述中，將附著于移植用骨填補(bǔ)材料的細(xì)胞稱為移植用細(xì)胞200，而將附著于檢查用骨填補(bǔ)材料的細(xì)胞稱為檢查用細(xì)胞300。將所述的移植用細(xì)胞200和所述的檢查用細(xì)胞300在相同的條件下培養(yǎng)。將相同大小和形狀的骨填補(bǔ)材料用作移植用骨填補(bǔ)材料和檢查用骨填補(bǔ)材料，在其上分別附著移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300，以在相同的條件下培養(yǎng)所述的細(xì)胞，而且使用同一批號(hào)的培養(yǎng)基在相同的恒溫恒濕容器中培養(yǎng)所述的移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300。此外，優(yōu)選調(diào)節(jié)所述的移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300，以使每單位體積的細(xì)胞數(shù)的數(shù)量級(jí)相同。更優(yōu)選，將所述的移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300調(diào)至106-107個(gè)細(xì)胞/厘米3。
接著，將所述的移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300連同移植用骨填補(bǔ)材料和檢查用骨填補(bǔ)材料分別放置在如圖3所示的培養(yǎng)容器100中。如圖3所示，培養(yǎng)容器100具有多個(gè)隔間，以使多個(gè)樣品分別獨(dú)立地放置在同一容器中。更具體地，由多個(gè)隔間形成的多個(gè)孔101(凹陷處)中可容納樣品，所述的移植用樣品(含有移植用細(xì)胞200和移植用骨填補(bǔ)材料)和檢查用樣品(含有檢查用細(xì)胞300和檢查用骨填補(bǔ)材料)獨(dú)立地放置在這些孔101中。此外，優(yōu)選將該培養(yǎng)容器100設(shè)計(jì)為能容納約3至50個(gè)左右的移植用樣品和檢查用樣品的形式。
然后，將容納有移植用細(xì)胞200(移植用樣品)和檢查用細(xì)胞300的培養(yǎng)容器100放置在進(jìn)行二次培養(yǎng)的環(huán)境中，即放置在適于進(jìn)行二次培養(yǎng)的條件下。例如，將培養(yǎng)容器100放置在以下環(huán)境中溫度保持在37±0.5℃，二氧化碳濃度保持在體積為5％。結(jié)果，附著于骨填補(bǔ)材料的間葉干細(xì)胞吞噬β-TCP并分化為成骨細(xì)胞，在開始進(jìn)行二次培養(yǎng)后約10天至2周左右，形成了骨組織。
接著，在開始進(jìn)行二次培養(yǎng)后2天至30天左右，優(yōu)選10天，取出放置在培養(yǎng)容器100中的檢查用細(xì)胞300(檢查用樣品)，檢測(cè)這些檢查用細(xì)胞300中的成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)，以確定骨組織的形成狀態(tài)，使用該結(jié)果判斷移植用細(xì)胞200的骨組織形成狀態(tài)。
例如，以下判斷技術(shù)是確定在上述二次培養(yǎng)中確定檢查用細(xì)胞300形成的骨組織狀態(tài)的技術(shù)的例子。
(1)基于堿性磷酸酶活性程度的判斷破碎檢查用細(xì)胞，測(cè)定破碎后的檢查用細(xì)胞300的堿性磷酸酶活性程度。堿性磷酸酶是顯示成骨細(xì)胞活性程度的組分，所以檢測(cè)堿性磷酸酶的活性程度就可確定二次培養(yǎng)中成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)，由此確定骨組織的形成狀態(tài)。
(2)使用顯微鏡判斷(a)使用共聚焦顯微鏡獲得的圖像利用圖像處理進(jìn)行判斷使用共聚焦顯微鏡獲得檢查用骨填補(bǔ)材料的表面的圖像，利用圖像處理選取成骨細(xì)胞。然后，通過檢測(cè)選取的細(xì)胞數(shù)目是否超過規(guī)定的數(shù)目，以判斷成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)，從而確定骨組織的形成狀態(tài)。
(b)使用圓珠筆型共聚焦顯微鏡(Ball Pen-Type ConfocalMicroscope)進(jìn)行判斷當(dāng)使用的骨填補(bǔ)材料在中心具有圓柱狀孔時(shí)，將圓珠筆型共聚焦顯微鏡插入該骨填補(bǔ)材料的圓柱狀孔中，通過確定孔(在骨填補(bǔ)材料中)的表面上成骨細(xì)胞的存在來確定骨組織的形成狀態(tài)。
(c)通過熒光染色進(jìn)行判斷在破碎檢查用細(xì)胞300并對(duì)破碎的檢查用細(xì)胞300中含有的成骨細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后，進(jìn)行熒光測(cè)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行判斷以確定骨組織的形成狀態(tài)，所述測(cè)定結(jié)果與熒光染色的細(xì)胞數(shù)相對(duì)應(yīng)，表示成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)。可使用顯微鏡對(duì)熒光染色的成骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)等來進(jìn)行上述的熒光測(cè)定。
如果通過這些判斷技術(shù)，能夠確定在檢查用細(xì)胞300中的間葉干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖，則確定已充分進(jìn)行了骨組織的形成，然后，將移植用細(xì)胞200從培養(yǎng)容器100中取出，從而完成了二次培養(yǎng)。然后，對(duì)這些移植用細(xì)胞200按照?qǐng)D2中顯示的檢測(cè)步驟進(jìn)行下列步驟。
另一方面，當(dāng)檢查用細(xì)胞300中的成骨細(xì)胞增殖不充分時(shí)，對(duì)培養(yǎng)容器100中剩余的移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在該培養(yǎng)容器100中，容納有用于判斷二次培養(yǎng)狀態(tài)的檢查用細(xì)胞300(檢查用樣品)。當(dāng)幾天后，考慮到骨組織的形成狀態(tài)優(yōu)選經(jīng)過3天至7天左右，再次從培養(yǎng)容器100中取出一部分檢查用細(xì)胞300(檢查用樣品)，對(duì)取出的檢查用細(xì)胞300中的成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行判斷。
如果其結(jié)果確定了成骨細(xì)胞的增殖并且充分形成了骨組織，則將移植用細(xì)胞200轉(zhuǎn)入檢查步驟，而如果未充分形成骨組織，再繼續(xù)進(jìn)行二次培養(yǎng)。
如上所述，按照本實(shí)施方式中描述的培養(yǎng)方法，通過在相同的條件下培養(yǎng)移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300，可認(rèn)為檢查用細(xì)胞300的增殖狀態(tài)與移植用細(xì)胞200的增殖狀態(tài)基本相同。這樣，通過確定檢查用細(xì)胞300的細(xì)胞增殖狀態(tài)可確定移植用細(xì)胞200的細(xì)胞增殖狀態(tài)，而不直接接觸移植用細(xì)胞200。
另外，由于在培養(yǎng)容器100中分別且獨(dú)立地放置并培養(yǎng)移植用細(xì)胞200(移植用樣品)和檢查用細(xì)胞300(檢查用樣品)，所以可防止每個(gè)樣品相互接觸，其中所述培養(yǎng)容器具有多個(gè)隔間以使多個(gè)樣品獨(dú)立地放置在同一容器中。從而，可簡(jiǎn)單地把檢查用細(xì)胞300(檢查用樣品)從培養(yǎng)容器100中取出而不接觸移植用細(xì)胞200。這樣，當(dāng)把檢查用細(xì)胞300(檢查用樣品)從培養(yǎng)容器100中取出時(shí)，可避免真菌和細(xì)菌污染移植用細(xì)胞200。另外，通過在開始進(jìn)行二次培養(yǎng)時(shí)將既容納有移植用細(xì)胞200又容納有檢查用細(xì)胞300的培養(yǎng)容器100放置在適于二次培養(yǎng)的環(huán)境中，可簡(jiǎn)單地使移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
此外，盡管在上述實(shí)施方式中描述了對(duì)骨髓液中的間葉干細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)，在二次培養(yǎng)過程中間葉干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并使成骨細(xì)胞增殖，但是也可采集胎盤血或外周血等代替骨髓液，然后可在這些樣品的基礎(chǔ)上進(jìn)行初次培養(yǎng)。選擇性地，可將骨髓液或胎盤血等直接接種到骨填補(bǔ)材料上而不進(jìn)行初次培養(yǎng)，間葉干細(xì)胞可在骨填補(bǔ)材料上增殖并隨后進(jìn)行分化。
另外，除了間葉干細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞也可以是體性干細(xì)胞、ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)、骨相關(guān)細(xì)胞或軟骨細(xì)胞等。此外，所述的細(xì)胞可以是自體細(xì)胞或異體細(xì)胞。另外，可以直接移植所述的干細(xì)胞而不進(jìn)行分化。
另外，在培養(yǎng)過程中可加入合適的生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子的例子包括，BMP(骨形態(tài)形成蛋白)、FGF(成纖維細(xì)胞增殖因子)、TGF-β(β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)、VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、IGF(胰島素樣生長(zhǎng)因子)、PDGF(血小板衍生生長(zhǎng)因子)和HGF(干細(xì)胞生長(zhǎng)因子)等。
另外，在二次培養(yǎng)過程中，可用以下物質(zhì)代替β-TCP。即，只要對(duì)生物體組織具有親和性的任何材料都可以被使用，可被生物體吸收的材料更好。另外，所述材料可以是多孔的。所述多孔材料的例子包括具有生物兼容性的多孔陶瓷、膠原蛋白、聚乳酸或多孔金屬等，而且只要這些多孔材料具有大量的孔，對(duì)它們沒有特別的限制。另外，也可將諸如磷灰石和β-磷酸三鈣(β-TCP)等基于磷酸鈣的陶瓷、膠原蛋白或聚乳酸等用作多孔材料。另外，也可將基于磷酸鈣的陶瓷與膠原蛋白聯(lián)合使用或?qū)⒒诹姿徕}的陶瓷與聚乳酸聯(lián)合使用。β-磷酸三鈣、膠原蛋白和聚乳酸具有可被生物降解而被生物體吸收的特性，而磷灰石具有高強(qiáng)度的特性。
此外，顯而易見本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)移植部位等適當(dāng)?shù)剡x擇并使用合適種類的多孔材料。
盡管以上參考附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是具體的組成并不限于所述的實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明主旨的范圍內(nèi)也包括其他方式等。
工業(yè)應(yīng)用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法，由于在相同的條件下培養(yǎng)移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞，移植用細(xì)胞的增殖狀態(tài)可根據(jù)檢查用細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行判斷，所以可以確定移植用細(xì)胞的準(zhǔn)確的增殖狀態(tài)而無論如何也不用接觸移植用細(xì)胞。這樣，當(dāng)判斷增殖狀態(tài)時(shí)，可避免移植用細(xì)胞被真菌或細(xì)菌等污染。
另外，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法，由于在能夠分別并獨(dú)立地容納多個(gè)樣品的培養(yǎng)容器中分別獨(dú)立地放置并培養(yǎng)移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞，所以可防止每種細(xì)胞間相互接觸，并且即使在取出檢查用細(xì)胞時(shí)也可輕易將細(xì)胞取出。
此外，通過將移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞放置在同一培養(yǎng)容器中，并在開始進(jìn)行二次培養(yǎng)時(shí)將所述的培養(yǎng)容器放置在適于二次培養(yǎng)的環(huán)境中，可以很容易地在相同的條件下培養(yǎng)移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞。這樣，可顯著減少操作人員在二次培養(yǎng)中需投入的工作量。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟在相同的條件下培養(yǎng)移植用細(xì)胞和檢查用細(xì)胞；以及利用所述檢查用細(xì)胞判斷所述移植用細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法還包括以下步驟將所述移植用細(xì)胞和所述檢查用細(xì)胞獨(dú)立地放置在培養(yǎng)容器中，而該培養(yǎng)容器具有多個(gè)隔間以在同一容器中獨(dú)立地放置多個(gè)樣品。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法還包括以下步驟在開始進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)使每單位體積中所述移植用細(xì)胞和所述檢查用細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的數(shù)量級(jí)相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法不用直接接觸細(xì)胞，就能準(zhǔn)確地確定移植用細(xì)胞的增殖狀態(tài)。所述細(xì)胞培養(yǎng)方法由以下步驟組成將移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300分別且獨(dú)立地放置在培養(yǎng)容器100中，該培養(yǎng)容器具有多個(gè)隔間以在同一容器中獨(dú)立地放置多個(gè)樣品；在相同的條件下培養(yǎng)移植用細(xì)胞200和檢查用細(xì)胞300；根據(jù)檢查用細(xì)胞300的增殖狀態(tài)判斷移植用細(xì)胞200的增殖狀態(tài)。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1592790SQ0380155
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者井上晃, 入江洋之, 日比野浩樹, 小柳秀樹 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社