專利名稱：p18AβrP基因和 p18AβrP蛋白、通過與所述基因 /蛋白相互作用抑制細胞死亡的新型基因 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型基因即p18AβrP，該基因的表達在少突膠質(zhì)細胞中由于淀粉狀蛋白-β蛋白(下文簡稱為Aβ)而增加。本發(fā)明基因及其產(chǎn)物即p18AβrP蛋白具有以下新的功能通過與熱激蛋白Hsp 70和腫瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)突延伸的促進作用和生存維持作用，從而促進細胞死亡。本發(fā)明也涉及應用這些事件的篩選系統(tǒng)、使用該篩選系統(tǒng)鑒定的細胞死亡抑制基因和蛋白(p60TRP)、以及細胞死亡促進物質(zhì)和它們的基因。另外，本發(fā)明涉及應用這些細胞死亡抑制或促進物質(zhì)診斷、治療和預防與細胞死亡相關的疾病。
背景技術：
目前，尚不了解早老性癡呆(Alzheimer’s disease)的病因。然而，有關其病理學特征—由細胞死亡引起的老年斑、神經(jīng)纖維纏結、大腦皮質(zhì)和海馬的明顯腦萎縮等已有報道。Hyman等(Science，225，1168(1984))和Braak等(Acta Neuropathol.，82，239(1991))分別在內(nèi)嗅皮層區(qū)及其周圍發(fā)現(xiàn)隨早老性癡呆的早期病理學改變有特異性變性，并且Braak等報道了在內(nèi)嗅皮層中，其病因懷疑是由于給神經(jīng)細胞供應營養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞的變性引起的(Alzheimer’s Res.，3，235(1997))。然而，尚未進行探索其查證法的任何研究。
發(fā)明的公開鑒于這些情況，本發(fā)明人進行了深入的研究。結果，當使用大鼠少突膠質(zhì)細胞并且加入Aβ(受早老性癡呆影響的大腦中存在的老年斑的主要成分)時，他們觀察到細胞死亡。對參與所述細胞死亡的基因進行篩選，導致發(fā)現(xiàn)一個新型基因p18AβrP。另外，對該基因的功能進行檢查，得到這樣的一個結果在表達該基因的細胞中，由神經(jīng)營養(yǎng)因子觸發(fā)的細胞分化的誘導受到抑制，從而引起細胞死亡。另外，證明本發(fā)明蛋白即該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下新的功能通過與熱激蛋白Hsp 70和/或腫瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制神經(jīng)突的延伸和分支以及抑制生存維持，從而促進細胞死亡。此外，對抑制所述細胞死亡的基因/蛋白進行篩選，導致發(fā)現(xiàn)一個新型基因/蛋白p60TRP。
本發(fā)明人向大鼠少突膠質(zhì)細胞CG-4細胞中加入Aβ1-42(含有β-淀粉狀蛋白的氨基酸1-42；以10μg/ml、37℃下處理60小時)，后者為被認為是早老性癡呆的神經(jīng)毒素的β-淀粉狀蛋白(Aβ)的一個實施例，結果，在大約50％的細胞中觀察到細胞死亡(Brain Aging，2，30(2002))。用其它Aβ肽例如Aβ25-35(含有β-淀粉狀蛋白的氨基酸25-35)、Aβ1-40(含有β-淀粉狀蛋白的氨基酸1-40)或Aβ1-43(含有β-淀粉狀蛋白的氨基酸1-43)也鑒定出同上述一樣的細胞死亡(參見例如Cell.Mol.Life.Sci.，57，705(2000)；J.Neurosci.，21，9235(2001))，因此，認為引起細胞死亡的特性對于Aβ肽而言是普遍性的。因而，本發(fā)明人對參與由Aβ誘導的細胞死亡的基因進行了篩選，結果，觀察到本發(fā)明基因的表達增加(參見實施例和圖2)。本發(fā)明cDNA表現(xiàn)出與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類基因(J.Biol.Chem.，277.，7540(2002))和小鼠基因(Gene Data BankAK013396，AK018385，AK020147，AK011454；Hayashizaki，Y.等，2000)同源，但是它是一個新型基因并且在所編碼的氨基酸序列中與人和小鼠的序列有差異。另外，證明p18AβrP蛋白具有以下新的功能由于與熱激蛋白Hsp 70和腫瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，因而抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)突延伸效應，從而誘導細胞死亡(參見實施例和圖3)。此外，對在表達本發(fā)明基因的細胞中觀察到的所述細胞死亡的抑制因子進行篩選，導致發(fā)現(xiàn)一個新型基因/蛋白(p60TRP)。
因此，本發(fā)明提供依照以下(1)-(31)的DNA、蛋白質(zhì)、物質(zhì)、載體、轉(zhuǎn)化子、藥用組合物和試劑盒(1)一種p18AβrP cDNA，所述p18AβrP cDNA包含SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列；(2)一種mRNA，所述mRNA與依照(1)的cDNA互補；(3)一種p18AβrP蛋白，所述p18AβrP蛋白具有SEQ ID NO4的氨基酸序列；(4)一種編碼p18AβrP蛋白的DNA，所述p18AβrP蛋白在依照(3)的蛋白質(zhì)中有一個或多個氨基酸插入、缺失或取代并且具有以下特性a)由于Aβ而增加表達，b)與Hsp70和/或Tid-1相互作用，和c)抑制細胞分化；(5)一種DNA，所述DNA在嚴謹條件下可與依照(1)的DNA雜交并且編碼一種具有以下特性的p18AβrP蛋白a)由于Aβ而增加表達，b)與Hsp70和/或Tid-1相互作用，和c)抑制細胞分化；(6)一種由依照(4)或(5)的DNA編碼的p18AβrP蛋白；(7)一種載體，所述載體含有依照(1)、(4)和(5)中任一項的DNA；(8)一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子借助依照(7)的載體經(jīng)歷了基因轉(zhuǎn)移；(9)一種篩選細胞死亡促進或抑制物質(zhì)的方法，所述方法包括讓表達p18AβrP的細胞與受試物質(zhì)在存在分化誘導因子的情況下接觸，并且測定細胞死亡的抑制或促進；(10)一種與p18AβrP相互作用從而抑制細胞死亡的物質(zhì)；(11)一種與p18AβrP相互作用從而抑制細胞死亡的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)通過依照(9)的細胞測定系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的；
(12)一種依照(10)或(11)的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用來抑制細胞死亡；(13)一種cDNA，所述cDNA包含SEQ ID NO5的核苷酸82-1701的堿基序列；(14)一種mRNA，所述mRNA與依照(13)的cDNA互補；(15)一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO6的氨基酸序列；(16)一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)在依照(15)的蛋白質(zhì)中有一個或多個氨基酸插入、缺失或取代，并且具有與依照(15)的蛋白質(zhì)相似的細胞死亡抑制作用；(17)一種DNA，所述DNA在嚴謹條件下可與依照(13)的DNA雜交，并且編碼一種具有與依照(15)的蛋白質(zhì)相似的細胞死亡抑制作用的蛋白；(18)一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由依照(16)或(17)的DNA編碼，并且具有與依照(15)的蛋白質(zhì)相似的細胞死亡抑制作用；(19)一種依照(15)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是p60TRP或具有與p60TRP相似的細胞死亡抑制作用的其變異型蛋白；(20)一種載體，所述載體含有依照(13)、(16)和(17)中任一項的DNA；(21)一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子借助依照(20)的載體經(jīng)歷了基因轉(zhuǎn)移；(22)一種用于治療與細胞死亡相關的疾病的藥用組合物，所述藥用組合物含有依照(10)-(21)中任一項的蛋白質(zhì)、DNA、載體或轉(zhuǎn)化子；(23)一種與p18AβrP相互作用從而促進細胞死亡的物質(zhì)；(24)一種與p18AβrP相互作用從而促進細胞死亡的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)是通過依照(9)的細胞測定系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的；(25)一種依照(23)或(24)的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用來促進細胞死亡；(26)一種用于治療和/或預防由細胞增殖過多引起的疾病的藥用組合物，所述藥用組合物含有依照(23)-(25)中任一項的物質(zhì)；(27)一種用于診斷與細胞死亡相關的疾病的方法，其特征在于，測定p18AβrP基因或p18AβrP蛋白在得自受治療者的細胞或組織中的表達水平；(28)一種用于診斷與細胞死亡相關的疾病的試劑盒，其特征在于，測定p18AβrP基因或p18AβrP蛋白在得自受治療者的細胞或組織中的表達水平；(29)一種物質(zhì)，所述物質(zhì)通過與p60TRP相互作用抑制經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號，來增強p60TRP的細胞死亡抑制作用；(30)一種物質(zhì)，所述物質(zhì)通過與p60TRP相互作用抑制對經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號的抑制作用，來減弱p60TRP的細胞死亡抑制作用；和(31)一種依照(22)的藥用組合物，所述藥用組合物還含有依照(29)的增強p60TRP的細胞死亡抑制作用的物質(zhì)。
附圖簡述

圖1顯示p18AβrP cDNA的堿基序列(圖1a)和氨基酸序列(圖1b)。圖1c顯示本發(fā)明的大鼠p18AβrP蛋白(R)、及人(H)和小鼠(M)同源蛋白、和人短同源蛋白(sH)的氨基酸序列的比較。在圖1c中下劃線的氨基酸序列表示推定的nNOS PDZ結構域。
圖2(左圖)顯示在加入Aβ1-42(10μg/ml)于37℃保溫60小時后大鼠CG4少突膠質(zhì)細胞裂解液的DNA印跡第1泳道，對照；第2泳道，Aβ處理(Aβ)。圖2(右圖)顯示所述p18AβrP mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量測定。數(shù)值以6個獨立實驗中p18AβrP的PCR產(chǎn)物和S12的光密度測定比±標準誤表示(相對于對照組的顯著性水準，**P＜0.01)。
圖3顯示在加入NGF后表達或不表達p18AβrP的細胞中的神經(jīng)突延伸。在加入NGF后120小時時，p18AβrP陽性細胞沒有顯示出神經(jīng)突延伸(箭頭所指)，而不表達的細胞清楚地顯示出神經(jīng)突延伸。圖面i的比例尺相當于25μm。該長度的比例尺在圖面a中相當于75μm，而在圖面b-h中相當于50μm。p18AβrP陽性細胞在其表達后存活不超過2周，并且全部被殺死。
圖4顯示p18AβrP表達模式的研究結果。顯示在所檢查的所有22種組織中其mRNA都被表達。所述表達在以下組織中得到證實1，腦；2，心臟；3，腎；4，脾；5，肝；6，結腸；7，肝；8，小腸；9，肌肉；10，胃；11，睪丸；12，唾液腺；13，甲狀腺；14，腎上腺；15，胰腺；16，卵巢；17，子宮；18，前列腺；19，皮膚；20，白細胞；21，骨髓；和22，胎腦。
圖5a顯示大鼠p60TRP cDNA的核苷酸序列，圖5b顯示大鼠p60TRP蛋白的氨基酸序列。
圖6a顯示人同源性p60TRP cDNA的核苷酸序列，圖6b顯示人p60TRP蛋白的氨基酸序列。
圖7顯示在存活細胞(PC12細胞)中存在p60TRP以及RT-PCR的結果。圖A顯示存活集落，圖B顯示培養(yǎng)3天的存活集落，圖C顯示RT-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳。
圖8顯示通過RT-PCR對mRNA表達的半定量，代表p60TRP的組織特異性表達M泳道，分子量標記；第1泳道，心臟；第2泳道，腦；第3泳道，腎；第4泳道，肝；第5泳道，脾；第6泳道，胰腺；第7泳道，肺；和第8泳道，骨骼肌。
圖9顯示p60TRP-GFP和p60TRP-DsRedI在CHO細胞中的熒光圖象。每幅圖都具有相同的放大倍數(shù)。圖A代表p60TRP-CT-GFP，其它圖(圖B-F’)代表p60TRP-CT-DsRed1。圖B顯示在細胞質(zhì)中存在p60TRP，而圖C顯示在細胞核中存在p60TRP。圖D和圖D’、圖E和圖E’、及圖F和圖F’分別顯示其在細胞核中存在，并且從用撇號標記的圖面也可以看出細胞周邊的圖象。在圖F’中，比例尺的長度相當于50μm。
圖10顯示由于表達p60TRP對PC12細胞的影響。顯示了熒光顯微鏡圖象，所述圖象是在借助p60TRP-IRES-GFP使p60TRP與GFP共表達，在表達后24小時加入NGF(50ng/ml)，然后再培養(yǎng)120小時后拍攝的。表達p60TRP的細胞可以根據(jù)從GFP發(fā)射的熒光來鑒別。在PC12細胞中，p60TRP不影響NGF誘導的神經(jīng)突延伸。比例尺相當于50μm。每幅圖都具有相同的放大倍數(shù)。
圖11顯示PP2A的蛋白質(zhì)印跡分析的結果。第1泳道表示分子量標記，而第2泳道表示當使用已經(jīng)導入p60TRP-IRES-GFP的PC12細胞時，用多克隆山羊抗PP2A抗體沉淀的蛋白。第3泳道表示用多克隆兔抗p60TRP抗體沉淀的蛋白，其中在大約60 kDa檢測出單個條帶。
圖12顯示經(jīng)p60TRP基因敲除的PC12細胞的細胞存活百分率。將每個存活百分率以8個獨立實驗的平均值±標準誤作圖。相對于對照-1的存活百分率為100％而言，在僅表達GFP的對照-2中沒有觀察到變化，其存活百分率為102％，而p60TRP敲除的p60TRP-siRNA的存活百分率顯著降至76％。顯著性水準*P＜0.05(相對于對照)。
發(fā)明詳述下文將進一步詳細地描述本發(fā)明。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列的p18AβrP cDNA。本發(fā)明也涉及一種與上述cDNA互補的mRNA。上述cDNA編碼一種如SEQ ID NO4中所示的p18AβrP蛋白，因此本發(fā)明的p18AβrP蛋白具有SEQ ID NO4的氨基酸序列。通?？梢酝ㄟ^使用實施例中方法一節(jié)中描述的方法，例如RT-PCR法、cDNA差別法等等其它方法，獲得上述cDNA，所述方法是本領域技術人員已知的。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的p18AβrP蛋白?？梢岳缤ㄟ^實施例中方法一節(jié)中描述的方法，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行分析。該蛋白質(zhì)由SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列編碼。該蛋白質(zhì)具有以下特性a)由于Aβ而增加表達，b)與Hsp70和/或Tid-1相互作用，和c)抑制細胞分化。
就如上所述的特性a)而論，本發(fā)明人當進行通過使用大鼠少突膠質(zhì)細胞并且向所述細胞中加入從其前體蛋白APP切割的Aβ蛋白(老年斑的主要成分)進行的實驗時，鑒定出細胞死亡，因而對參與該細胞死亡的基因進行篩選，導致發(fā)現(xiàn)一個新型基因p18AβrP。也就是說，Aβ增加p18AβrP蛋白的表達?？梢栽趍RNA和蛋白質(zhì)水平上都觀測到增加的表達可以例如通過RT-PCR、互補雜交、RNA酶保護分析等，檢查mRNA量的增加；以及可以例如通過蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測定法、熒光抗體法、免疫抗體法等，檢查蛋白質(zhì)表達的增加。就特性b)而論，如上所述，本發(fā)明人揭示出新的功能p18AβrP蛋白通過與熱激蛋白Hsp70和/或腫瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制分化誘導因子引起的神經(jīng)突的延伸和分支以及存活的維持，從而促進細胞死亡(參見實施例)。此外，就特性c)而論，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，表達該基因的細胞抑制由神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導的細胞分化并且導致細胞死亡(參見實施例)。因此，可以通過檢查這種分化抑制和細胞死亡的程度(例如經(jīng)歷細胞死亡的細胞百分比，細胞死亡的時間)，測定該蛋白的活性。用于測量活性的方法的實例是包括下述步驟的方法將編碼p18AβrP蛋白的基因?qū)胍环N合適的載體中，用所述載體轉(zhuǎn)化細胞、優(yōu)選神經(jīng)細胞，在分化誘導因子(例如NGF)的作用下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，將所述細胞死亡與在相同條件下培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)化細胞(對照)的細胞死亡進行比較。為了評價是否已經(jīng)引起細胞死亡，常常采用顯微鏡檢查法。當發(fā)生細胞死亡時，可觀察到例如細胞凝聚、空泡形成、表面平滑化、細胞和細胞核碎裂等等。
本發(fā)明的p18AβrP蛋白也包括SEQ ID NO4的蛋白的變異體。也就是說，具有上述特性a)、b)和c)的任何蛋白質(zhì)，即使在SEQ ID NO4的蛋白質(zhì)中插入、缺失或取代一個或多個氨基酸，也在本發(fā)明的p18AβrP蛋白范圍內(nèi)。本發(fā)明也包括編碼這種蛋白的任何DNA。通過已知的方法，例如定點誘變和PCR，可以進行一個或多個氨基酸的插入、缺失或取代。因此，即使一種蛋白中有一個或多個氨基酸被插入、缺失或取代，這樣的蛋白也保留上述特性a)、b)和c)，也屬于本發(fā)明的p18AβrP蛋白。
本發(fā)明還涉及一種在嚴謹條件下可與包含SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列的cDNA雜交的DNA。該DNA編碼具有上述特性a)、b)和c)的p18AβrP蛋白。嚴謹條件是本領域技術人員熟知的，并且例如在許多教科書和文獻中有介紹。以下條件是嚴謹條件的例子在含有6X SSC、5X Denhardt氏試劑、0.5％SDS和100μg/ml鮭精DNA的溶液中于42℃雜交。
本發(fā)明還涉及基于包含SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列的cDNA，核苷酸序列同源性為至少60％或60％以上、優(yōu)選70％或70％以上、更優(yōu)選80％或80％以上、最優(yōu)選90％或90％以上且低于100％的DNA。
在本發(fā)明的p18AβrP蛋白中也包括由任一上述DNA編碼的蛋白質(zhì)。
在再一實施方案中，本發(fā)明涉及一種含有編碼所述p18AβrP蛋白的任一上述DNA的載體?？梢杂脕韺刖幋a所述p18AβrP蛋白的任一上述DNA以轉(zhuǎn)化神經(jīng)細胞的載體，使用文獻中描述的各種各樣的載體或市售的載體，例如pVgRXR、pIND、pIND/V5-His、pIND/GFP、pcDNA3.1或pcDNA3.1/myc或pcDNA3.1/His或pcDNA3.1/V5-His或pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO或諸如LNCX2的病毒載體。轉(zhuǎn)化方法是已知的，例如，磷酸鈣法、Super Fector試劑法和應用LipofectAMINE試劑的脂質(zhì)介導法等等。進行篩選所用的細胞可以使用任何種類的細胞，最好是神經(jīng)細胞。優(yōu)選的神經(jīng)細胞的實例包括PC12細胞、NB2a、Neuro-2A、B104、SHSY-5Y、原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞等。上述載體、細胞轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)細胞的條件根據(jù)不同的細胞來確定，并且在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)或者可以容易地確定。這樣的轉(zhuǎn)化子包括在本發(fā)明內(nèi)。最好是將可檢測標志與待表達的p18AβrP蛋白連接，致使可以容易地檢測出p18AβrP蛋白的表達。所述標志可以在DNA水平上連接例如，可以表達與編碼p18AβrP蛋白的DNA序列融合的綠色熒光蛋白DNA、紅色熒光蛋白DNA、myc基因等。特別是，與綠色熒光蛋白融合既簡便又靈敏，因此可以建議所述方法。在對表現(xiàn)出表達的細胞進行選擇后，必需檢查上述特性a)、b)和c)。
p18AβrP蛋白可以通過下述方法分離出來用本領域技術人員已知的合適方法(例如使用p18AβrP特異性抗體的免疫沉淀)，對表達p18AβrP蛋白的細胞進行提取，然后純化(例如使用上述抗體作為載體的Sepharose柱)。
本發(fā)明還涉及一種篩選細胞死亡促進或抑制物質(zhì)的方法，所述方法包括讓表達p18AβrP的細胞與受試物質(zhì)在存在分化誘導因子的情況下接觸，并且測定細胞死亡的抑制或促進。
篩選與p18AβrP相互作用從而抑制其功能或者通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用從而抑制細胞死亡的物質(zhì)的方法的實例包括一種這樣的方法所述方法包括將編碼p18AβrP蛋白的基因?qū)胍环N合適的載體中，用所述載體轉(zhuǎn)化細胞、優(yōu)選神經(jīng)細胞，在分化誘導因子(例如NGF)的作用和受試物質(zhì)的存在下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，就神經(jīng)細胞而論，分析神經(jīng)突延伸和細胞死亡，并且與沒有受試物質(zhì)和/或沒有分化誘導因子(即對照系統(tǒng))獲得的結果進行比較。合適的載體和細胞是本領域技術人員已知的，并且包括上述實例。在表達p18AβrP的細胞中，也在給定濃度的分化誘導因子的存在下，神經(jīng)突延伸受到抑制(就神經(jīng)細胞而論)，致使可以觀察到細胞死亡。另一方面，與p18AβrP相互作用從而抑制其功能或者通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用從而抑制細胞死亡的物質(zhì)的存在，使神經(jīng)突可以生長(就神經(jīng)細胞而論)，從而避免細胞死亡。在這種情況下，可能所述受試物質(zhì)是與p18AβrP相互作用抑制其功能進而抑制細胞死亡或者通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用從而抑制細胞死亡的物質(zhì)。
篩選與p18AβrP相互作用從而促進其功能或者通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用從而促進細胞死亡的物質(zhì)的方法的實例包括一種這樣的方法所述方法包括將編碼p18AβrP蛋白的基因?qū)胍环N合適的載體中，用所述載體轉(zhuǎn)化細胞、優(yōu)選神經(jīng)細胞，在分化誘導因的作用和受試物質(zhì)的存在下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，測定神經(jīng)突延伸和細胞死亡，并且與不存在受試物質(zhì)的情況下獲得的結果進行比較。合適的載體和細胞是本領域技術人員已知的，并且包括上述實例。在存在的分化誘導因子的濃度高于在篩選與p18AβrP相互作用從而抑制其功能的物質(zhì)中所使用的濃度時，加入受試物質(zhì)至神經(jīng)突延長的神經(jīng)細胞或不引起細胞死亡的細胞中，從而神經(jīng)突的生長受到抑制(就神經(jīng)細胞而論)或者觀察到細胞死亡，則可能所述受試物質(zhì)是與p18AβrP相互作用而促進其功能進而促進細胞死亡或者通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用從而促進細胞死亡的物質(zhì)。
評價是否引起細胞死亡的方法的實例包括如上所述通過顯微鏡檢查法的方法。
本發(fā)明還涉及與p18AβrP相互作用從而抑制或促進細胞死亡的物質(zhì)。所述物質(zhì)是與p18AβrP相互作用的物質(zhì)，本發(fā)明也包括通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用從而抑制或促進細胞死亡的物質(zhì)。細胞死亡抑制或促進物質(zhì)最好是通過上述篩選方法獲得的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)可以是任何種類的分子，包括例如蛋白質(zhì)、肽和諸如其它低分子量有機化合物的小分子。
本發(fā)明的細胞死亡抑制物質(zhì)可用于預防和/或治療例如與神經(jīng)細胞的細胞死亡相關的腦內(nèi)神經(jīng)變性性疾病，例如早老性癡呆、唐氏綜合征(Down’s syndrome)、和其它癡呆、以及亨廷頓舞蹈病(Huntington’schorea disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓小腦變性性疾病、帕金森病(Parkinson’s disease)等。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉一種用于治療和/或預防與細胞死亡相關的疾病的藥用組合物，所述藥用組合物含有如上所述的細胞死亡抑制物質(zhì)。通常，藥用組合物含有藥學上可接受的載體或賦形劑。藥用組合物的生產(chǎn)方法、劑型和藥學上可接受的載體或賦形劑根據(jù)受治療者的病癥、待治療的部位、給藥途徑和其它因素進行選擇，并且可以容易地由本領域技術人員來選擇。
在本發(fā)明的上述篩選期間，發(fā)現(xiàn)了一個編碼抑制細胞死亡的p60TRP蛋白的60TRP新基因和由所述基因編碼的p60TRP蛋白。
因此，在再一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含SEQ ID NO5的核苷酸82-1701的堿基序列的cDNA。本發(fā)明也涉及一種與上述cDNA互補的mRNA。上述cDNA是編碼SEQ ID NO6的蛋白的cDNA。SEQ ID NO6的氨基酸序列為大鼠p60TRP蛋白的氨基酸序列，因而SEQ ID NO5的核苷酸序列(核苷酸82-1701)編碼大鼠p60TRP蛋白。在下文，大鼠p60TRP簡稱為p60TRP。因此，本發(fā)明的p60TRP蛋白具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。通?？梢酝ㄟ^使用實施例中方法一節(jié)中描述的方法，例如RT-PCR法、cDNA差別法等等其它方法，獲得上述cDNA，所述方法是本領域技術人員已知的。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種編碼變異型p60TRP蛋白的DNA，所述變異型p60TRP蛋白在所述p60TRP蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)中有一個或多個氨基酸插入、缺失或取代并且表現(xiàn)出與具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白相似的細胞死亡抑制作用；本發(fā)明還涉及一種編碼變異型p60TRP蛋白的DNA，所述DNA在嚴謹條件下可與上述DNA雜交，而所述變異型p60TRP蛋白表現(xiàn)出與具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白相似的細胞死亡抑制作用。嚴謹條件在許多教科書和文獻中有介紹，并且是本領域技術人員熟知的。以下條件是嚴謹條件的例子在含有6X SSC、5X Denhardt氏試劑、0.5％SDS和100μg/ml鮭精DNA的溶液中于42℃雜交。
本發(fā)明還涉及基于包含SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列的cDNA，其核苷酸序列同源性為至少高于60％、優(yōu)選70％或70％以上、更優(yōu)選80％或80％以上、最優(yōu)選90％或90％以上且低于100％的DNA。
由任一上述DNA編碼的蛋白也包括在本發(fā)明的p60TRP蛋白內(nèi)。
在本說明書中，如上所述的變異型p60TRP蛋白可以稱為p60TRP蛋白，只要它具有與具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白(也就是p60TRP蛋白)相似的細胞死亡抑制作用。另外，來自除大鼠以外的物種的p60TRP同源蛋白例如人p60TRP蛋白，可以稱為變異型p60TRP蛋白或者簡稱為p60TRP蛋白，只要它具有與具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白(也就是p60TRP蛋白)相似的細胞死亡抑制作用。基于大鼠p60TRP蛋白，這樣一種同源p60TRP蛋白的同源性為至少60％或60％以上、優(yōu)選70％或70％以上、更優(yōu)選80％或80％以上、最優(yōu)選90％或90％以上且低于100％。
在再一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種含有編碼上述p60TRP蛋白(包括變異體)的DNA的載體，本發(fā)明還涉及一種用所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子例如細胞。
可以用來導入編碼p60TRP蛋白的任一上述DNA以轉(zhuǎn)化神經(jīng)細胞的載體，使用文獻中描述的各種各樣的載體和各種各樣的市售載體，例如pVgRXR、pIND、pIND/V5-His、pIND/GFP、pcDNA3.1或pcDNA3.1/myc或pcDNA3.1/His或pcDNA3.1/V5-His或pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO或諸如LNCX2的病毒載體。轉(zhuǎn)化方法是已知的，例如，磷酸鈣法、Super Fector試劑法和應用LipofectAMINE試劑的脂質(zhì)介導法等等。進行篩選所用的細胞可以使用任何種類的細胞，最好是神經(jīng)細胞。優(yōu)選神經(jīng)細胞的實例包括PC12細胞、NB2a、Neuro-2A、B104、SHSY-5Y、原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞等。上述載體的構建、細胞轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)細胞的條件根據(jù)不同的細胞來確定，并且在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)或者可以容易地確定。這樣的轉(zhuǎn)化子也包括在本發(fā)明內(nèi)。最好是將可檢測標志與待表達的p60TRP蛋白連接，致使可以容易地檢測出p60TRP蛋白的表達。所述標志可以在DNA水平上連接例如，可以表達與編碼p60TRP蛋白的DNA序列融合的綠色熒光蛋白DNA、紅色熒光蛋白DNA、myc基因等。特別是，與綠色熒光蛋白融合既簡便又靈敏，因此可以建議所述方法。在對表現(xiàn)出表達的細胞進行選擇后，必需用本文中描述的篩選測定來檢查細胞死亡抑制作用。
p60TRP蛋白可以通過下述方法分離出來用本領域技術人員已知的合適方法(例如使用p60TRP特異性抗體的免疫沉淀)，對表達p60TRP蛋白的細胞進行提取，然后純化(例如使用上述抗體作為載體的Sepharose柱)。
在再一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于抑制細胞死亡的藥用組合物，所述藥用組合物含有上述p60TRP蛋白(包括變異體)、編碼所述蛋白的DNA、含有編碼上述p60TRP蛋白(包括變異體)的DNA的載體或用所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。另外，本發(fā)明也涉及一種用于抑制受治療者體內(nèi)細胞死亡的方法，其特征在于，將所述物質(zhì)之一或所述轉(zhuǎn)化子給予所述受治療者；本發(fā)明還涉及它們用于生產(chǎn)抑制細胞死亡的藥物方面的應用。藥用組合物的生產(chǎn)方法、劑型和藥學上可接受的載體或賦形劑根據(jù)受治療者的病癥、待治療的部位、給藥途徑和其它因素進行選擇，并且可以容易地由本領域技術人員來選擇。用于抑制細胞死亡的這些組合物、方法和應用可供用于治療和/或預防與細胞死亡相關的各種腦內(nèi)神經(jīng)變性性疾病，例如早老性癡呆、唐氏綜合征、和其它癡呆、以及亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓小腦變性性疾病、帕金森病等。在上述治療中，當使用p60TRP基因或含有所述基因的載體時，提供基因治療，在基因治療中可以將所述基因或載體導入得自受治療者的細胞中，可以培養(yǎng)所述細胞，然后將其回輸給所述受治療者，或者可以將p60TRP基因或含有所述基因的載體直接引入受治療者體內(nèi)。
另外，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)(促進或抑制)p60TRP的細胞死亡效應的物質(zhì)。具體地說，這樣的物質(zhì)是通過與p60TRP相互作用抑制經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號而促進p60TRP的細胞死亡抑制作用的物質(zhì)(p60TRP激動劑)，及通過與p60TRP相互作用抑制經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號來減弱p60TRP的細胞死亡抑制作用的物質(zhì)(p60TRP拮抗劑)。這些調(diào)節(jié)p60TRP的細胞死亡抑制作用的物質(zhì)包括但不限于天然或合成的蛋白質(zhì)、肽、核酸等，并且可以是天然或合成的低分子量化合物。p60TRP激動劑的實例例如是PP2A、Ran BP5和其它蛋白質(zhì)。為了篩選這類p60TRP激動劑和拮抗劑，一般可以如下所述使用的雙雜交系統(tǒng)。
另外，例如，可以將p60TRP激動劑加入到含有p60TRP的藥用組合物中，以進一步增強細胞死亡抑制作用，從而使得可以更有效地治療或預防與細胞死亡相關的疾病，例如早老性癡呆。
本發(fā)明的細胞死亡促進物質(zhì)可用于例如建立細胞死亡系統(tǒng)及各種與細胞死亡相關的研究，例如闡明與神經(jīng)細胞的細胞死亡相關的疾病(例如早老性癡呆)的機理。此外，本發(fā)明的細胞死亡促進物質(zhì)可用于治療和/或預防由細胞增殖過多引起的疾病，例如癌癥和自身免疫病。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于治療和/或預防由細胞增殖過多引起的疾病的藥用組合物，所述藥用組合物含有如上所述的細胞死亡促進物質(zhì)。藥用組合物的生產(chǎn)方法、劑型和藥學上可接受的載體或賦形劑根據(jù)受治療者的病癥、待治療的部位、給藥途徑和其它因素進行選擇，并且可以容易地由本領域技術人員來選擇。
本發(fā)明也涉及一種用于治療和/或預防受治療者體內(nèi)由細胞增殖過多引起的疾病的方法，其特征在于，給予所述受治療者一種如上所述的細胞死亡促進物質(zhì)。本發(fā)明也涉及如上所述的細胞死亡促進物質(zhì)在生產(chǎn)用于治療和/或預防由細胞增殖過多引起的疾病的藥物中的應用。如上所述的基因治療也可以用于治療和/或預防由細胞增殖過多引起的疾病。
本發(fā)明還涉及一種檢查細胞、特別是神經(jīng)細胞中細胞死亡的方法，以及涉及一種用于診斷與這種細胞死亡相關的疾病的方法，其特征在于，檢查得自受治療者的細胞和組織中p18AβrP基因或p18AβrP蛋白的表達水平。人們可以在例如在mRNA水平上檢測得自受治療者的細胞和組織樣品中的p18AβrP基因，或者可以檢測細胞樣品中的p18AβrP蛋白。可以通過本領域技術人員熟知的方法，例如使用與p18AβrP基因互補的探針(最好是用例如放射性同位素、熒光團、酶等標記的探針)的雜交，或者通過利用與針對p18AβrP蛋白的單克隆抗體(最好是用例如放射性同位素、熒光團、酶等標記的單克隆抗體)的結合，實現(xiàn)所述檢測。在這種情況下，通過檢查所述標記的信號強度來測定p18AβrP基因的表達強度或p18AβrP蛋白的量是可行的。
本發(fā)明也涉及一種用于檢測細胞、特別是神經(jīng)細胞中細胞死亡的試劑盒，并且涉及一種用于診斷與這種細胞死亡相關的疾病的試劑盒，其特征在于，檢查得自受治療者的細胞和組織中p18AβrP基因或p18AβrP蛋白的表達水平。作為試劑盒的組分，包括例如與p18AβrP基因互補的探針(最好是用例如放射性同位素、熒光團、酶等標記的探針)和/或針對p18AβrP蛋白的單克隆抗體(最好是用例如放射性同位素、熒光團、酶等標記的單克隆抗體)。所述試劑盒通常附有其操作說明。
實施例以下實施例描述了本發(fā)明，但絕對是用來說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明的。
I.實驗方法大鼠細胞的制備將CG4(一種少突膠質(zhì)細胞前體細胞，由Kazuhiro IKENAGA教授饋贈，Department of Neuronal Information，National Institute for Physiological Sciences，Okazaki National ResearchInstitutes)在補充N1(5mg/l胰島素、16.1mg/l腐胺、50mg/l運鐵蛋白、4.6mg/l D-半乳糖、8mg/l亞硒酸鈉、2.4g/l HCO3)的和30％(v/v)B104細胞無血清培養(yǎng)基的DMEM/F-12(1∶1v/v)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了誘導少突膠質(zhì)細胞的分化，將CG-4細胞培養(yǎng)24小時，加入無促細胞分裂因子的B104細胞，然后加入2％FCS(Gibco)，以提高存活率。
RT-PCR方法采用RT-PCR(Heese等，Eur.J.Neurosci.，15，79(2002))，對mRNA進行分析，并且進行p60TRP的分離。簡而言之，按照TRIzolReagent方案(Gibco BRL，NT，USA)，制備細胞的總RNA。用氯仿抽提mRNA后，向水層中加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，用75％乙醇沖洗，溶于無RNA酶的水中，在分光光度計上測量吸光度(260nm)。每個樣品的總RNA(0.2μg/ml)首先反轉(zhuǎn)錄成cDNA(oligo(dT)-primed-SMARTTMcDNA-synthesis(Clontech，Tokyo，Japan)；Superscript IITM(Gibco BRL，NY，USA))，然后采用p18AβrP特異性引物(有義引物5’-atgagtgaatggacgaagaaaagccccttagaatgggaggat-3’(SEQ IDNO1)；反義引物5’-tctgggaagctgaaagatggccttgaataagatcctgaattcggg-3’(SEQ ID NO2))，使用0.5μl等份樣品進行PCR反應(反應體積25μl)。擴增每種cDNA所用的循環(huán)反應的次數(shù)依照the ElongaseTM酶混合物方案在線性范圍內(nèi)設定。在擴增步驟中于94℃進行1分鐘的變性，用特異性引物，于65℃進行50秒的退火，然后再于68℃保溫1分鐘或更長時間(65℃，24個循環(huán))。用來源于大鼠腦cDNA文庫(pAP3neo，Takara)的引物，通過5’-RACE-RT-PCR制備大鼠p60TRP cDNA。用以下方法(Heese等，Eur.J.Neurosci.，15，79(2002))，進行p60TRP的分離。簡而言之，按照TRIzolReagent方案(Gibco BRL)，分離細胞的總RNA。用氯仿抽提后，向水層中加入異丙醇，沉淀RNA，用75％乙醇沖洗，重新溶于無RNA酶的水中，在分光光度計上定量(260nm)。每個樣品的總RNA(0.2μg/ml)首先轉(zhuǎn)錄成cDNA(oligo(dT)-primed-SMARTTMcDNA-synthesis；Clontech；Superscript IITM(Gibco))，然后采用大鼠(r)和人(h)p60TRP特異性引物(對于分離而言有義引物5’-gcgtaatacgactcactatagggaattcgacgt-3’(SEQ ID NO9)，反義引物5’-cgcgacgtacgatttaaattaaccctcactaaa-3’(SEQ ID NO10)；r-有義引物5’-atgactggctcaaagaataaggctcgggctcaggctaaactg-3’(SEQ ID NO11)，r-反義引物5’-ttacattctttcaataatccctttaacttcacggaatatggcagt-3’(SEQ ID NO12)；h-有義引物5’-atggctgggactaagaataagacaagagcccaggccaaaac-3’(SEQ ID NO13)；h-反義引物5’-cattgtttcaataatctctttaacttccctgaaaatggccatgag-3’(SEQ ID NO14))，使用0.5μl等份樣品進行PCR擴增反應(反應體積25μl)。循環(huán)數(shù)依照theElongaseTM酶混合物方案(Gibco)在線性范圍內(nèi)設定。如下進行PCR于94℃變性0.5分鐘，于65℃退火50秒(退火溫度)，然后于68℃延伸2分鐘(退火溫度65℃，16個循環(huán))。
用組成型表達核糖體蛋白S12的PCR擴增反應(60℃，16個循環(huán))來測定所引入的RNA。用不進行逆轉(zhuǎn)錄、使用RNA樣品或無RNA的對照來確定不存在DNA的污染。通過在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，分析PCR反應物，將DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，讓其與熒光標記的DNA探針雜交。用FluoroImager 595(Image Quant ver.5.0(MolecularDynamics，Tokyo，Japan))，對所述膜進行分析。除了非參數(shù)統(tǒng)計學分析(Kruskal-Wallis檢驗)之外，還應用方差分析(ANOVA)，對結果進行統(tǒng)計學分析，誤差以標準誤表示。
cDNA示差(differential)為了測定加入Aβ1-42以誘導細胞死亡的多組細胞和對照細胞之間在已表達的mRNA方面的差別，進行PCR-SelectTMcDNA示差(Clontech)。簡而言之，將CG-4細胞在胎牛血清(FCS)±Aβ1-42(10μg/ml)的條件下孵育60小時，然后進行cDNA示差(Heese等，Neurosci.Lett.，288，37(2000)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，289，924(2001))。用SMARTTM-PCR-cDNA synthesis(Clontech)并且使用一種經(jīng)修飾的寡聚dT引物(CDS引物)，將每組的mRNA轉(zhuǎn)變成cDNA，進行第一鏈的合成。用SMARTTM-寡核苷酸-錨定序列和polyA+序列作為用于從頭到尾的cDNA擴增(LD-PCR)的通用引發(fā)位點。讓來源于Aβ1-42處理細胞組的cDNA和來源于對照細胞組的cDNA進行雜交，以除去這些cDNA，而未經(jīng)雜交的cDNA被稱為用Aβ1-42活化的差別cDNA。將所述差別cDNA克隆到TOPO-T/A克隆載體(Invitrogen)中，通過蛋白質(zhì)印跡法進行鑒定。在測序儀(ABIPRIMTMBigDyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin-Elemer；測序儀ABI PRISM 310型))上，分析堿基序列。
cDNA克隆在cDNA扣除后，通過運用根據(jù)數(shù)據(jù)庫的部分cDNA/EST序列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)設計的寡核苷酸，并且在5’-RACE(cDNA末端快速擴增)和RT-PCR實驗中，運用大鼠腦cDNA文庫(ClonCapture ReadyTMSuper DNA；Clontech，Tokyo，Japan)進行篩選，獲得大鼠p18AβrP的EST序列的全長cDNA。通過將大鼠p18AβrPcDNA插入到pCRII-TOPOT/A克隆載體(Invitrogen，Tokyo，Japan)中，構建供分析用的p18AβrP構建體。通過將供表達綠色熒光蛋白(GFP)用的pcDNA3.1 CT-GFP-TOPO(Invitrogen，Tokyo，Japan)在p18AβrP的C末端插入到大鼠p18AβrP cDNA中，構建供表達用的p18AβrP構建體(p18AβrP-CT-GFP)。
p18AβrP cDNA序列和氨基酸的分析除對于非重疊GenBankCDS翻譯使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blastp 2.0程序(Nucleic Acids Res.，25，3389(1997))以及使用UniGene數(shù)據(jù)庫(NCBI)(Nucleic Acids Res.，25，2289(1997))外，還運用PDB、SwissProt、PIF和PRF，對p18AβrP cDNA序列和氨基酸序列進行分析。運用Blast和FASTA(Wisconsin Package ver.10.0，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，WI)算法和BestFit(Eisconsin Package Version10.0 GCG)，進行同源性搜索。運用PROSITE-Profile和BLOCKS程序、ProDom程序、PRINTS程序、Pfam程序和PSORT II程序(Nucleic AcidsRes.，27，260(1999)，Intellig.Syst.Mol.Biol.，4，109(1996)；Intellig.Syst.Mol.Biol.，5，147(1997))，搜索氨基酸序列的基序。運用NetPhos 2.0(J.Mol.Biol.，294，1351(1999))，搜索磷酸化位點，而不僅運用ExPASywww服務器(http//www.expasy.ch)，而且運用http//www.sofiberry.com/index.html和氨基酸組成搜索(AACompIdent)http//kr.expasy.org/tools/aacomp/，進行其它分析。已確測的p18AβrPcDNA序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO3(圖1a)和SEQ ID NO4(圖1b)中。另外，圖1c顯示本發(fā)明的大鼠p18AβrP蛋白與人和小鼠同源蛋白的氨基酸序列的比較。
p18AβrP表達組織的分析按照常規(guī)方法，獲取大鼠的22種組織，以制備如下樣品1＝腦；2＝心臟；3＝腎；4＝脾；5＝肝；6＝結腸；7＝肝；8＝小腸；9＝肌肉；10＝胃；11＝睪丸；12＝唾液腺；13＝甲狀腺；14＝腎上腺；15＝胰腺；16＝卵巢；17＝子宮；18＝前列腺；19＝皮膚；20＝白細胞；21＝骨髓；和22＝胎腦(編號對應于圖4中的泳道編號)。用先前描述的方法(參見RT-PCR一節(jié))，通過從每個組織樣品制備cDNA，制備組織樣品。為了檢查p18AβrP的組織特異性表達，使用Rapid-ScanTM-Gene-Expression panels(OrigeneTechnologies，MD，USA)。用標準2％DNA電泳瓊脂糖E-gelTM(Invitrogen)，分析PCR產(chǎn)物。
篩選細胞死亡抑制和/或促進物質(zhì)的方法—獲得細胞死亡抑制物質(zhì)p60TRP的方法在表達p18AβrP的PC12細胞中，盡管加入了NGF，但是沒有觀察到細胞分化、存活和神經(jīng)突延伸，而當在這些細胞中表達大鼠cDNA文庫時，盡管表達p18AβrP，但是導致發(fā)現(xiàn)存活細胞。因此，通過死亡陷阱篩選方法(death trap screening method)(Semin，Immunol.，9，17(1997))，從這些存活細胞中，用RT-PCR發(fā)現(xiàn)涉及該存活的基因，命名為p60TRP基因。此外，將由該基因編碼的細胞死亡抑制蛋白命名為p60TRP蛋白。
p60TRP cDNA堿基序列和蛋白質(zhì)一級結構的分析運用作為搜索工具的、運用UniGene數(shù)據(jù)庫(NCBI)(Nucleic Acids Res.，25，3389(1997))和GenBank CDS translation+PDB+Swiss Prot+PIR+PRF數(shù)據(jù)庫的NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blast 2.0程序，對p60TRP cDNA和p60TRP蛋白進行序列分析。對于同源性搜索，運用Blast和FASTA(Wisconsin Package Version 10.0，GCG(GeneticsComputer Group))算法，并且運用BestFit(Wisconsin Package Version10.0 GCG)，進行序列比對。運用ExPASy-www服務器(http//www.expasy.ch)、softberryhttp//www/softberry.com/index.html和氨基酸組成搜索(AACompIdent)http//kr.expasy.org/tools/aacomp/，測定蛋白質(zhì)序列。運用PROSITE Profile、BLOCKS-ProDom-PRINTS-Pfam程序和PSORT II程序(Nucleic Acids Res.，27，260(1999)，Mol.Biol.，4，109(1996)；Mol.Biol.，5，147(1997))，搜索所述氨基酸序列中的基序。運用NetPhos 2.0蛋白質(zhì)磷酸化搜索服務器(J.Mol.Biol.，294，1351(1999))，搜索磷酸化位點。
各組織中p60TRP表達的分析使用Rapid-ScanTM-Gene-Expressionpanels(Origene Technologies，Rockville，MD，USA)，分析p60TRP的組織特異性基因表達，對組織cDNA進行半定量RT-PCR分析。用標準1.5％DNA電泳瓊脂糖E gelTM(Invitrogen，Brain Aging，2，30(2002))，分析PCR產(chǎn)物。
細胞培養(yǎng)在5％CO2/95％空氣的條件下，將大鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞B104(例如可得自Kazuhiro Ikenaka教授，National Institute forPhysiological Sciences，Okazaki National Research Institutes)和PC12細胞(例如可得自ATCC(American Type Culture Collection(美國典型培養(yǎng)物保藏中心))，ATCC No.CRL-1721)在含有N2補充10％胎牛血清(FCS；Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)/F12(1∶1v/v)中于37℃培養(yǎng)，而將CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系在補充10％FCS的DMED中于37℃培養(yǎng)。將CG4(一種少突膠質(zhì)細胞前體細胞)在補充N1(5mg/l胰島素、16.1mg/l腐胺、50mg/l運鐵蛋白、4.6mg/l D-半乳糖、8mg/l亞硒酸鈉、2.4g/l HCO3)和30％(v/v)B104細胞無血清培養(yǎng)基的DMEM/F-12(1∶1v/v)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了誘導少突膠質(zhì)細胞的分化，將CG-4細胞培養(yǎng)24小時，加入無促細胞分裂因子的B104細胞，然后加入2％FCS(Gibco)，以提高存活率。為了誘導細胞死亡，將細胞在加入FCS±Aβ(Peptide Institute，Inc.，Osaka，Japan；以1mg/l磷酸緩沖鹽溶液(PBS)pH 7.4溶于無血清溶液中，至10μg/ml，然后于37℃孵育24小時)的情況下培養(yǎng)60-72小時，然后用Promega試劑盒(CellTiter96AQueousOne Solution細胞增殖測定)，測量存活細胞。為了誘導神經(jīng)突延伸，用p18AβrP-CT-GFP或?qū)φ蛰d體對PC12細胞進行基因轉(zhuǎn)移，然后用NGF(50ng/ml)誘導24小時。
將基因轉(zhuǎn)移到細胞中構建在p18AβrP的C末端引入GFP(綠色熒光蛋白)的p18AβrP-CT-GFP；構建分別在大鼠p60TRP cDNA的C末端引入GFP(pcDNA3.1 CT-GFP-TOPO(Invitrogen)或DsRed1(NheI和HindIII限制性酶克隆位點，Clontech，Tokyo，Japan)的p60TRP-CT-GFP和p60TRP-CT-DsRed1。另外，將p60TRP亞克隆到pIRES2-EGFP(Clontech)中，以便允許與GFP(p60TRP-IRES-GFP)一起從同一mRNA進行共表達。將p18AβrP-CT-GFP或p60TRP-DsRed1、p60TRP-GFP、p60TRP-IRES-GFP和GFP(Clontech，Tokyo Japan)表達載體或空載體(對照)瞬時基因轉(zhuǎn)移到CHO細胞(例如可得自ATCC，ATCC No.CCL-61)和PC12細胞(例如可得自ATCC，ATCC No.CCL-1271)(SuperFector，B-Bridge，San Jose，Ca，USA)中，所述細胞用補充10％胎牛血清(FCS，Gibco BRL，Tokyo)的D-MEM/F12(1∶1)/含N2培養(yǎng)基在5％CO2/95％空氣的條件下于37℃培養(yǎng)?；蜣D(zhuǎn)移的效率通過GFP和p53-/PKC-DsRed1(Clontech)的共表達加以證實，以便效率總是為50-60％(Eur.J.Neurosci.，15，79(2002))。在熒光顯微鏡(Olympus IX70，Olympus，Tokyo，Japan)下，在基因轉(zhuǎn)移后48小時時，評估細胞死亡/存活。此外，24小時后，加入NGF(鼠類NGF 2.5S，50ng/ml；Invitrogen)至所述PC12細胞中，120小時后，用CellTiter96AQueousAssay(Promega，Madison，WI，USA)測量存活細胞，并且在熒光顯微鏡下進行觀察。
雙雜交系統(tǒng)使用酵母菌株MaV203(例如可得自Invitrogen)。將大鼠p18AβrP或大鼠p60TRP亞克隆到具有來自pENTR/D-TOPO的GAL4 DNA結合結構域的pDESTTM32載體(Invitrogen)中。此外，用pEXP-AD502作為具有ProQuestTM雙雜交大鼠腦cDNA文庫(Invitrogen)的激活結構域的表達載體。為了根據(jù)活性進行選擇，使用三個報道基因—HIS3、URA3和lacZ。這些基因中的每個基因都在不同位點穩(wěn)定地整合到酵母基因中，HIS3、lacZ和URA3的啟動子區(qū)是不同的，只是GAL4結合結構域除外。據(jù)報道ProQuestTM雙雜交系統(tǒng)使得可以從各自不同的染色體上發(fā)生三個獨立的轉(zhuǎn)錄，從而與標準雙雜交系統(tǒng)相比，產(chǎn)生的假陽性反應減少。HIS3和URA3報道基因的誘導取決于所述雙雜交，分別使得細胞也能夠在缺乏組氨酸或尿嘧啶的平板上生長，致使可以將細胞區(qū)分開來。另一方面，lacZ基因的誘導可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)來進行，產(chǎn)生藍色。另外，由于5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶所產(chǎn)生的毒性，因此URA3的誘導使得細胞能夠在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長，而在含有5-FOA的培養(yǎng)基中抑制細胞生長。因此，該系統(tǒng)使得能夠?qū)λ姆N表型進行篩選，也就是說，通過His(3AT)、β-gal、Ura+和5-FOAs，蛋白質(zhì)表現(xiàn)出真實的相互作用，因而消除了假陽性反應。ARS/CEN載體的應用也可以降低表達水平和毒性。通過重新轉(zhuǎn)化，可以鑒定出陽性克隆。當含有互作蛋白質(zhì)時，酵母細胞與db-大鼠p60TRP或db-大鼠p18AβrP和ad-Y(其中Y例如是PP2A或TID-1)結合。可以通過電穿孔，將來自含有上述基因的酵母菌株的質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌細胞中，轉(zhuǎn)化子可以用氨芐青霉素進行選擇，或者db-大鼠p18AβrP可以用慶大霉素進行選擇。這些大腸桿菌細胞的質(zhì)粒DNA即ad-Y(其中Y例如是PP2A或TID-1)可以與pDBleu或db-大鼠p18AβrP或db-大鼠p60TRP一起導入到MaV203中，并且用db-大鼠p18AβrP或pdb-大鼠p60TRP誘導報道基因?qū)玫秸嬲年栃苑磻?br> 抗p60TRP抗體的產(chǎn)生制備并使用對p60TRP的N端結構域(氨基酸(aa)-35至aa-45；RGAGKNRDKGK-cys)具有高親和性的兔抗p60TRP抗體。
蛋白質(zhì)免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析將p60TRP-IRES-GFP瞬時基因轉(zhuǎn)移到約5×106PC12細胞后24小時，再連續(xù)培養(yǎng)48小時。此后，細胞用Tris鹽水緩沖液(TBS，pH 7.2)洗滌兩次，用0.5ml冰冷的緩沖液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 8.0、1％NP40、2％甘油、1mMPMSF、10μg/ml抑蛋白酶肽、1μg/ml亮抑蛋白酶肽、0.5mM釩酸鈉)于4℃裂解細胞，通過于4℃離心除出細胞核。于4℃與抗體(抗p60TRP)一起保溫2小時后，加入500μl 50％ Protein-A SepharoseCL-4B，再保溫2小時。洗滌免疫沉淀三次，加入50μl Laemmli-protein緩沖液(Bio-Rad，Tokyo，Japan)，然后進行蛋白質(zhì)印跡分析。簡而言之，將蛋白質(zhì)在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，以進行分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)(Bio-Rad，Tokyo，Japan)中，然后與抗PP2A(調(diào)節(jié)亞基)抗體(SantaCruz，CA，USA)免疫反應，加入第二熒光素綴合的抗山羊抗體和第三堿性磷酸酶綴合的抗熒光素抗體，與堿性磷酸酶的底物(ECFTM)蛋白質(zhì)印跡試劑盒，Amersham/Pharmacia，Tokyo，Japan)一起保溫。
細胞死亡的評價培養(yǎng)PC12細胞至50-80％匯合，基因轉(zhuǎn)移前用胰蛋白酶處理24小時，在缺乏抗生素的新鮮培養(yǎng)基中稀釋5倍(1-3×105細胞/ml)，轉(zhuǎn)移至24孔板(500μl/孔)，然后進行培養(yǎng)。在用于評價細胞死亡的實驗中，對不表達GFP的細胞(對照-1)、僅表達GFP的細胞(對照-2)和通過SiRNA敲除了p60TRP基因的細胞進行研究。使用Oligofectamine并且每孔導入0.5μg siRNA，通過SiRNA進行基因敲除(Brain Aging，2，44，(2002))。在1μg GFP表達載體和0.2μg siRNA共表達后，在熒光顯微鏡下測定基因轉(zhuǎn)移的效率(Mol.Brain Res.，104，127，(2002)；Nature，411，494(2001))。通過the Cell-Titer 96AQueousOnesolution assay(Promega，Madison，WINeurosci.Lett.，288，37(2000))，在表達后48小時測定因SiRNA引起的細胞死亡/存活百分率。用于p60TRP的siRNA序列使用相對于起始密碼子的nt 310至nt 330的序列。p60TRP特異性21聚體核酸(21-nucleic acid)雙鏈體siRNA得自Dharmacon Research(Lafayetta，CO，USA；B-Bridge International，Tokyo，Japan)。
如上所述的實驗程序通常是本領域已知的，本領域技術人員將會認識到或者應該容易地設想其變化和替代程序。
II.實驗結果依照本發(fā)明的實驗結果描述如下(1)本發(fā)明的大鼠p18AβrP cDNA的堿基序列與人和小鼠序列同源，并且比較其氨基酸序列，結果示于圖1c中。因此，證明本發(fā)明的大鼠p18AβrP cDNA的堿基序列是一種不同于上述文獻中描述的人堿基序列和在the Gene Data Bank(基因數(shù)據(jù)庫)中發(fā)現(xiàn)的序列的新型序列，從圖1c可以看出，p18AβrP蛋白的氨基酸序列是一種不同于人和小鼠序列的新型序列。
(2)已經(jīng)表明，在加入Aβ1-42(10μg/ml)于37℃保溫60小時后，當通過蛋白質(zhì)印跡法檢查時，p18AβrP在大鼠CG4少突膠質(zhì)細胞裂解物中的表達因Aβ1-42而增加(參見圖2中的左圖)第1泳道，對照；第2泳道，Aβ處理(Aβ)。通過光密度測量法定量，導致發(fā)現(xiàn)p18AβrPmRNA轉(zhuǎn)錄的量因加入Aβ1-42而增加(參見圖2中的右圖)。
(3)在經(jīng)歷通過NGF誘導的分化的PC12細胞中，p18AβrP引起對神經(jīng)突延伸的抑制，并且導致細胞死亡。為了研究p18AβrP在神經(jīng)細胞中的功能，將GFP與p18AβrP的C末端融合的蛋白質(zhì)的基因?qū)隤C 12細胞中，48小時后鑒定其表達。接下來，24小時后，加入NGF(50ng/ml)，120小時后進行熒光顯微鏡觀察，結果如圖3所示，盡管存在NGF，但是神經(jīng)突的延伸受到抑制，并且觀察到細胞死亡，2周后，所有細胞全部被殺死。反之，在無所述基因表達(沒有熒光)的細胞中，NGF明顯地促進神經(jīng)突延伸，使得細胞可以存活。這些模式中的某些模式示于圖3中的圖面a-i。例如，在圖面c和f中觀察到，發(fā)射GFP熒光的p18AβrP陽性細胞(如箭頭所指)皺縮，引起細胞死亡和漂浮。也觀察到在圖面d中箭頭所指的細胞保持細胞形態(tài)，盡管神經(jīng)突延伸受到抑制。
(4)應用以上解釋的雙雜交系統(tǒng)，篩選與本發(fā)明p18AβrP相互作用的一種或多種蛋白質(zhì)，結果，發(fā)現(xiàn)了這樣一種與熱激蛋白Hsp70和腫瘤抑制蛋白Tid-1相互作用的蛋白。可能如上所述的誘導細胞死亡和抑制細胞分化的效應由這種相互作用所致。
(5)關于p18AβrP mRNA在大鼠各種組織中的表達，通過RT-PCR對mRNA表達進行非定量分析。如圖4所示，在包括腦在內(nèi)的22種器官和組織中鑒定出其表達。
(6)p60TRP的分離、表征以及在組織和細胞中的表達在p18AβrP和大鼠腦cDNA文庫的基因轉(zhuǎn)移后，通過RT-PCR在存活細胞中發(fā)現(xiàn)了p60TRP(圖7)。這種新基因的大鼠cDNA的堿基序列示于SEQ ID NO5和圖5A中，其氨基酸序列示于SEQ ID NO6和圖5B中，同時進行比較，其同源的人基因cDNA示于SEQ ID NO7和圖6A中，其氨基酸序列示于SEQ ID NO8和圖6B中。由大鼠cDNA(SEQ ID NO5的核苷酸82-1701)編碼的蛋白是由SEQ ID NO6的539個氨基酸組成的蛋白，其分子量約為59.72 kDa。該大鼠p60TRP cDNA的堿基序列及其氨基酸序列明顯不同于人序列，因而是新型序列。大鼠p60TRP蛋白和人p60TRP同源蛋白之間的氨基酸同源性提示，人p60TRP同源蛋白也具有與大鼠p60TRP蛋白相似的細胞死亡抑制作用。根據(jù)其序列，p60TRP蛋白可能構成一個新的蛋白質(zhì)家族并且具有bHLH結構域(SEQ ID NO6序列的氨基酸491-507)。具有這樣一種結構域的p60TRP蛋白質(zhì)家族成員包括O43168、Q96D09、QBVZ3、Q9CVV3、Q9H969、Q920R4、Q9BE11、Q9C0G2、Q9CXQ7、Q9UJC4、Q8R095、O60267、Q9NPE4/Q9UH62、Q9NTS2、Q9BTM6、Q9H2Q0、Q9P291、Q9NWJ13、Q9CX19、Q9DC32、Q9CZ87、Q9CUN3、Q9D0L7、Q9CS81和Q9CX83。
此外，用RT-PCR研究組織中的表達模式，結果，在腦、腎和脾中鑒定出高表達水平的所述mRNA，并且也在心臟和骨骼肌中鑒定出所述mRNA，在而肺和肝中沒有檢測到表達(圖8)。圖9顯示p60TRP-GFP和p60TRP-DsRed1在CHO細胞中的熒光圖象。在CHO細胞中，p60TRP-GFP或p60TRP-DsRed1融合蛋白具體定位于細胞質(zhì)中(圖9中的圖面A和B)，但也存在于細胞核中(圖9中的圖面C-F)。
另外，p60TRP在PC12細胞中并不影響由NGF誘導的神經(jīng)突延伸。如圖10所示，當p60TRP在PC12細胞中表達后24小時加入NGF(50ng/ml)、再培養(yǎng)120小時時，在共表達p60TRP和GFP的細胞中能夠觀察到NGF的神經(jīng)突延伸作用不受抑制的事實。
(7)與p60TRP相互作用的蛋白質(zhì)雙雜交系統(tǒng)揭示出，兩種蛋白質(zhì)即PP2A(蛋白質(zhì)磷酸酶2A，在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中負責關鍵性的去磷酸化反應)和RanBP5(Ran結合蛋白5)與p60TRP的相互作用，涉及bHLH轉(zhuǎn)錄因子從細胞質(zhì)至細胞核的轉(zhuǎn)運。如圖11所示，免疫沉淀及其蛋白質(zhì)印跡分析表明，p60TRP與PP2A結合?？赡躳60TRP與這些蛋白質(zhì)相互作用，并且抑制經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號，從而導致抑制細胞死亡。
(8)p60TRP和PP2A的免疫沉淀圖11表示p60TRP和PP2A的免疫沉淀的蛋白質(zhì)印跡分析的結果。通過免疫沉淀實驗證實，在PC12細胞中表達的p60TRP通過與PP2A相互作用并復合而在大約60kDa處共沉淀。
(9)通過p60TRP基因敲除使細胞存活百分率降低與對照組相比，通過p60TRP特異性siRNA進行基因敲除，顯著降低PC12存活細胞的百分率。也就是說，如圖12所示，對照-1表現(xiàn)出存活百分率為100％，并且對照-2 GFP沒有改變存活百分率，存活百分率為102％，而敲除p60TRP的p60TRP-siRNA顯著降低存活細胞的百分率至76％(p＜0.05)。這進一步證實了p60TRP蛋白的細胞死亡抑制作用。
因此，參考實施例具體而詳細地描述了本發(fā)明。然而，本領域技術人員可以進行以上所述之外的修改和變化，例如易選擇合適的細胞系來實施本發(fā)明。
工業(yè)應用性按照本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)了一個其表達在少突膠質(zhì)細胞中因淀粉狀蛋白-β蛋白(下文稱為Aβ)而增加的新型基因p18AβrP并且證明了其功能。也就是說，證明本發(fā)明基因及其產(chǎn)物p18AβrP蛋白具有以下新的功能通過與熱激蛋白Hsp70和腫瘤抑制蛋白Tid-1相互作用，抑制通過神經(jīng)營養(yǎng)因子促進神經(jīng)突延伸的作用，支持細胞死亡、進而促進細胞死亡。因此，本發(fā)明提供應用這些事件的篩選系統(tǒng)、可使用這樣的篩選系統(tǒng)獲得的參與促進和抑制細胞死亡的物質(zhì)、應用所述物質(zhì)診斷和預防疾病。通過上述篩選系統(tǒng)，本發(fā)明還首次發(fā)現(xiàn)大鼠細胞死亡抑制蛋白p60TRP及其編碼基因，也首次鑒定出p60TRP蛋白的作用和效應，即細胞死亡的抑制效應。因此，本發(fā)明提供應用所述基因/蛋白診斷和預防與細胞死亡相關的疾病。
序列表的獨立文本SEQ ID NO1有義引物，用于擴增p18AβrP cDNA。
SEQ ID NO2反義引物，用于擴增p18AβrP cDNA。
SEQ ID NO3編碼p18AβrP蛋白的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO4p18AβrP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO5編碼大鼠p60TRP蛋白的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO6大鼠p60TRP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO7編碼人p60TRP蛋白的cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO8人p60TRP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO9有義引物(對于大鼠/人p60TRP特異性的)，用于擴增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO10反義引物(對于大鼠/人p60TRP特異性的)，用于擴增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO11有義引物(對于大鼠p60TRP特異性的)，用于擴增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO12反義引物(對于大鼠p60TRP特異性的)，用于擴增p60TRPcDNA。
SEQ ID NO13有義引物(對于人p60TRP特異性的)，用于擴增p60TRP cDNA。
SEQ ID NO14反義引物(對于人p60TRP特異性的)，用于擴增p60TRP cDNA。
序列表<110>株式會社BF研究所(BF Research Institute，Inc.)<120>P18AβRP基因和P18AβRP蛋白、以及抑制細胞死亡的新型基因/蛋白(P60TRP)和通過與所述基因/蛋白相互作用促進細胞死亡的物質(zhì)<130>663496<150>JP 2002-61749<151>2002-03-07<150>JP 2002-312715<151>2002-10-28<160>14<210>1<211>42<212>DNA<213>
<400>1atgagtgaat ggacgaagaa aagcccctta gaatgggagg at 42<210>2<211>45<212>DNA<213>
<400>2tctgggaagc tgaaagatgg ccttgaataa gatcctgaat tcggg 45<210>3<211>1089<212>DNA
<213>大鼠<400>3gcagctctgg gtatggcggc ctcaaggcag gacccagtct tcgagctcta gagcttcgct 60ggagcgtcct cagcgcttta tgaggaaatt ggcgcaaacc ccgcggagaa tcatctagaa 120agagtagatc tagccagctg gtaaccatga gtgaatggac gaagaaaagc cccttagaat 180gggaggatca cgtttacaaa gaagtgagag tgatagccag tgagaaggag tataaaggat 240ggctgctaac cacagaccca gtctctgcca acattgtcct cgtgaacttc cttgaagatg 300gcagactatg tgtgactgga attatgggac attctgtgca gacagtggaa actgtaagcg 360aaggggacca cagagtaaga gagaagctga tgcatctgtt cacacctgca gattgtaaag 420ggtacagccc tgaggatctg gaaaagaaga aaaccagcct aaagaaatgg cttgagaaga 480accacatccc tgtcactgaa gagggagaca cacaaaggac tctctgtgtg gctggggttc 540ttactataga cccaccatat gctccagaaa attgcagcag ctctaacgag tttattctgt 600cccgaattca ggatcttatt caaggccatc tttcagcttc ccagtgagag gccgcacgag 660gagcacactg acttcactgt ttggttctgt attaaattct tccagtgtaa gttgattata 720ttacaagact tcaaagcaca tgactactat gtgtatatgc gcacattttt ttttttcttt 780ttcttttttt tcggagctgg ggaccgaacc cagggccttg cgtttgctag gcaagcgctc 840taccactgag ctaaatcccc aaccccatat gcgtacattt taagtttttg tttaggtcaa 900atcagaggaa gtgaaggcac cagaacagtg tcccttgtcc tgaaaagaac acaggagagt 960caaatttgga aggagatttc cttgcatatg atttaagata aatcacccta tttgtgagac 1020aagggtgcat tttgaatagg tgtaacaatg tgaaataaac ttgtaaattt caatataaga 1080tattaaagt 1089<210>4<211>166<212>PRT<213>大鼠<400>4Met Ser Glu Trp Thr Lys Lys Ser Pro Leu Glu Trp Glu Asp His Val1 5 10 15Tyr Lys Glu Val Arg Val Ile Ala Ser Glu Lys Glu Tyr Lys Gly Trp20 25 30Leu Leu Thr Thr Asp Pro Val Ser Ala Asn Ile Val Leu Val Asn Phe35 40 45Leu Glu Asp Gly Arg Leu Cys Val Thr Gly Ile Met Gly His Ser Val50 55 60
Gln Thr Val Glu Thr Val Ser Glu Gly Asp His Arg Val Arg Glu Lys65 70 75 80Leu Met His Leu Phe Thr Pro Ala Asp Cys Lys Gly Tyr Ser Pro Glu85 90 95Asp Leu Glu Lys Lys Lys Thr Ser Leu Lys Lys Trp Leu Glu Lys Asn100 105 110His Ile Pro Val Thr Glu Glu Gly Asp Thr Gln Arg Thr Leu Cys Val115 120 125Ala Gly Val Leu Thr Ile Asp Pro Pro Tyr Ala Pro Glu Asn Cys Ser130 135 140Ser Ser Asn Glu Phe Ile Leu Ser Arg Ile Gln Asp Leu Ile Gln Gly145 150 155 160His Leu Ser Ala Ser Gln165<210>5<211>2701<212>DNA<213>大鼠<400>5agttaccaag tataaagata ccagcctgga acagagaact aaggataaga ctggacaggt 60gtatataact gtgcttcaac catgactggc tcaaagaata aggctcgggc tcaggctaaa 120ctggaaaaga gggcaagtgc acaagccaaa gctgcagcag agagagaggc tgctaatgca 180ggcagaggtg caggcaaaaa ccgggacaaa gggaagggta aggcaggctc taaaacagat 240gcagtggcag aggcgaaggc gggctctaag agcaaggtag ttgctgagac aaaagaagga 300gcaagaccag aatctaaggc tgtagcaaaa ggcacatcag atttcaacca taaggctgag 360aacaagtacg ctagatccgc acgtaaagat aagcccagta gtgatagctg gttttgggct 420ggagaagatt ctggtatcaa ttcctggttc tggaagggag aagaggttag taacaattct 480gttgccaagt gtgaaaataa acctagtact agtatccagg cccgtgtgga ggagcacacg 540cctagaacca gccacaagtc taggtcagga gctgaggaag aggaggaaga gaatgttata 600gggaactggt tttgggaagg agatgacact ggttttgatt ctgatcctaa acctgtgttc 660aaaatagtaa aacctcagcc agtagatgaa ataaatgaaa aggataggcc aaaggactgg 720tccgaggtaa ctatctggcc caaagctcct gctgtaactc cagcagtgtt aggttataga 780tctcaggact catctgaggg aaggccctct tcatatattg ttctggcctc aaatgaagag 840gaaacttcaa caacctgtac taagaatact cgttcaagcc tccagcctat acctgagtat 900ccatttggat ctgatccttg catacagacc ttagatgaaa ttagacagca aatcaagatc 960
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Met Thr Gly Ser Lys Asn Lys Ala Arg Ala Gln Ala Lys Leu Glu Lys1 5 10 15Arg Ala Ser Ala Gln Ala Lys Ala Ala Ala Glu Arg Glu Ala Ala Asn20 25 30Ala Gly Arg Gly Ala Gly Lys Asn Arg Asp Lys Gly Lys Gly Lys Ala35 40 45Gly Ser Lys Thr Asp Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Gly Ser Lys Ser50 55 60Lys Val Val Ala Glu Thr Lys Glu Gly Ala Arg Pro Glu Ser Lys Ala65 70 75 80Val Ala Lys Gly Thr Ser Asp Phe Asn His Lys Ala Glu Asn Lys Tyr85 90 95Ala Arg Ser Ala Arg Lys Asp Lys Pro Ser Ser Asp Ser Trp Phe Trp100 105 110Ala Gly Glu Asp Ser Gly Ile Asn Ser Trp Phe Trp Lys Gly Glu Glu115 120 125Val Ser Asn Asn Ser Val Ala Lys Cys Glu Asn Lys Pro Ser Thr Ser130 135 140Ile Gln Ala Arg Val Glu Glu His Thr Pro Arg Thr Ser His Lys Ser145 150 155 160Arg Ser Gly Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Val Ile Gly Asn Trp165 170 175Phe Trp Glu Gly Asp Asp Thr Gly Phe Asp Ser Asp Pro Lys Pro Val180 185 190Phe Lys Ile Val Lys Pro Gln Pro Val Asp Glu Ile Asn Glu Lys Asp195 200 205Arg Pro Lys Asp Trp Ser Glu Val Thr Ile Trp Pro Lys Ala Pro Ala210 215 220Val Thr Pro Ala Val Leu Gly Tyr Arg Ser Gln Asp Ser Ser Glu Gly225 230 235 240Arg Pro Ser Ser Tyr Ile Val Leu Ala Ser Asn Glu Glu Glu Thr Ser245 250 255Thr Thr Cys Thr Lys Asn Thr Arg Ser Ser Leu Gln Pro Ile Pro Glu260 265 270Tyr Pro Phe Gly Ser Asp Pro Cys Ile Gln Thr Leu Asp Glu Ile Arg275 280 285Gln Gln Ile Lys Ile Arg Glu Glu Asn Gly Ile Lys Pro Phe Ala Cys
290 295 300Pro Cys Lys Met Glu Cys Tyr Leu Asp Ser Pro Glu Phe Glu Lys Leu305 310 315 320Val Asn Ile Leu Lys Ser Thr Thr Asp Pro Leu Ile His Lys Ile Ala325 330 335Gln Ile Ala Met Gly Ile His Lys Val His Pro Phe Ala Gln Glu Phe340 345 350Ile Asn Glu Val Gly Val Val Thr Leu Ile Glu Ser Leu Leu Ser Phe355 360 365Ser Ser Pro Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Val Ile Thr Leu Asn Ser370 375 380Ser Gly Asp Asp Arg Gln Gln Met Val Glu Phe His Val Lys His Met385 390 395 400Cys Lys Glu Thr Val Ser Phe Pro Leu Asn Ser Pro Gly Gln Gln Ser405 410 415Gly Leu Lys Ile Ile Gly Gln Leu Thr Thr Glu Ser Val His His Tyr420 425 430Ile Val Val Ser Tyr Phe Ser Glu Leu Phe His Leu Leu Ser Gln Gly435 440 445Asn Arg Lys Thr Arg Asn Leu Val Leu Lys Val Phe Leu Asn Met Ser450 455 460Glu Asn Pro Lys Ala Ala Arg Asp Met Ile Asn Met Lys Ala Leu Ala465 470 475 480Ala Leu Lys Leu Ile Phe Asn Gln Lys Glu Ala Lys Ala Asn Leu Val486 490 495Ser Ala Val Ala Ile Phe Ile Asn Ile Lys Glu His Ile Arg Lys Gly500 505 510Ser Ile Val Val Val Asp His Leu Ser Tyr Asn Thr Leu Thr Ala Ile515 520 525Phe Arg Glu Val Lys Gly Ile Ile Glu Arg Met530 535<210>7<211>1647<212>DNA<213>人類
<400>7accatggctg ggactaagaa taagacaaga gcccaggcca aaactgaaaa aaaggctgct 60atacaagcta aagctggagc agagagggag gctactggtg ttgttaggcc tgtagccaag 120accagggcca aagcaaaagc caagacaggg tctaagacag atgcagtagc agagatgaag 180gcagtgtcta agaacaaggt tgttgctgag acgaaggaag gagctctgtc agagcctaag 240actctgggca aagccatggg agatttcact cccaaggctg ggaatgagtc caccagctcc 300acatgtaaaa atgaggctgg tactgatgcc tggttctggg ctggggaaga ggccactatc 360aattcctggt tctggaatgg agaagaggct ggtaatagtt tcagcactaa gaatgataaa 420cctgaaattg gtgcccaggt ctgtgctgag gagttggaac ctgcggctgg ggccgattgc 480aaacctaggt caggggctga ggaggaggag gaagagaatg ttattgggaa ctggttttgg 540gaaggagatg atactagttt tgaccctaat cctaaacctg tgagcaggat agttaagcct 600cagcctgtgt atgaaattaa tgaaaaaaat aggcccaagg actggtctga ggtaactatc 660tggcccaatg cccctgctgt aactccagct gtgttaggat ttagatccca ggcaccatct 720gaggcaagtc ctccttcata tattgttctg gcctccgctg aagaaaatgc ctgttctttg 780cctgtggcaa cagcttgccg cccttctagg aacactcgct catgctcaca gcctatccct 840gagtgtcgtt ttgattctga cccctgcatc cagaccatag atgagattag acgtcaaatc 900aggatcaggg aggtaaatgg gattaagcca tttgcttgtc cttgcaaaat ggaatgctat 960atggattctg aggaatttga aaaacttgtt agcttactta agtcaactac tgatcctctt 1020attcataaaa tagcacggat tgcaatgggt gtccataatg ttcacccatt tgcccaagag 1080tttattaacg aagtaggtgt agtgacactt attgaaagct tgctcagttt tccttcccct 1140gaaatgagaa aaaagactgt aattactctg aatcctcctt ctggggatga aagacaacgc 1200aaaattgaat tacatgttaa gcatatgtgt aaagaaacca tgtcatttcc tttgaactca 1260ccgggacagc aatctggatt aaagatacta ggacaactga ctactgattt tgtccatcac 1320tacattgttg ccaattactt ttcagagctt ttccatttgc tgtcctcagg aaattgcaaa 1380accagaaatc ttgttttgaa actactttta aatatgtctg aaaatccaac tgcagccaga 1440gacatgatca atatgaaggc attggcagca ttaaaactca tctttaacca gaaagaggca 1500aaagccaatc ttgttagtgg tgtggccata tttattaaca taaaggagca tatcagaaaa 1560ggctcaattg tagttgttga tcacttgagt tataatacac tcatggccat tttcagggaa 1620gttaaagaga ttattgaaac aatgtag 1647<210>8<211>547<212>PRT<213>人類<400>8Met Ala Gly Thr Lys Asn Lys Thr Arg Ala Gln Ala Lys Thr Glu Lys
1 5 10 15Lys Ala Ala Ile Gln Ala Lys Ala Gly Ala Glu Arg Glu Ala Thr Gly20 25 30Val Val Arg Pro Val Ala Lys Thr Arg Ala Lys Ala Lys Ala Lys Thr35 40 45Gly Ser Lys Thr Asp Ala Val Ala Glu Met Lys Ala Val Ser Lys Asn50 55 60Lys Val Val Ala Glu Thr Lys Glu Gly Ala Leu Ser Glu Pro Lys Thr65 70 75 80Leu Gly Lys Ala Met Gly Asp Phe Thr Pro Lys Ala Gly Asn Glu Ser85 90 95Thr Ser Ser Thr Cys Lys Asn Glu Ala Gly Thr Asp Ala Trp Phe Trp100 105 110Ala Gly Glu Glu Ala Thr Ile Asn Ser Trp Phe Trp Asn Gly Glu Glu115 120 125Ala Gly Asn Ser Phe Ser Thr Lys Asn Asp Lys Pro Glu Ile Gly Ala130 135 140Gln Val Cys Ala Glu Glu Leu Glu Pro Ala Ala Gly Ala Asp Cys Lys145 150 155 160Pro Arg Ser Gly Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Val Ile Gly Asn165 170 175Trp Phe Trp Glu Gly Asp Asp Thr Ser Phe Asp Pro Asn Pro Lys Pro180 185 190Val Ser Arg Ile Val Lys Pro Gln Pro Val Tyr Glu Ile Asn Glu Lys195 200 205Asn Arg Pro Lys Asp Trp Ser Glu Val Thr Ile Trp Pro Asn Ala Pro210 215 220Ala Val Thr Pro Ala Val Leu Gly Phe Arg Ser Gln Ala Pro Ser Glu225 230 235 240Ala Ser Pro Pro Ser Tyr Ile Val Leu Ala Ser Ala Glu Glu Asn Ala245 250 255Cys Ser Leu Pro Val Ala Thr Ala Cys Arg Pro Ser Arg Asn Thr Arg260 265 270Ser Cys Ser Gln Pro Ile Pro Glu Cys Arg Phe Asp Ser Asp Pro Cys275 280 285Ile Gln Thr Ile Asp Glu Ile Arg Arg Gln Ile Arg Ile Arg Glu Val290 295 300
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<210>14<211>
<212>DNA<213>
<400>14cattgtttca ataatctctt taacttccct gaaaatggcc atgag4權利要求
1.一種p18AβrP cDNA，所述p18AβrP cDNA包含SEQ ID NO3的核苷酸147-647的堿基序列。
2.一種mRNA，所述mRNA與權利要求1的cDNA互補。
3.一種p18AβrP蛋白，所述p18AβrP蛋白具有SEQ ID NO4的氨基酸序列。
4.一種編碼p18AβrP蛋白的DNA，所述p18AβrP蛋白在權利要求3的蛋白質(zhì)中有一個或多個氨基酸插入、缺失或取代并且具有以下特性a)由于Aβ而增加表達，b)與Hsp70和/或Tid-1相互作用，和c)抑制細胞分化。
5.一種DNA，所述DNA在嚴謹條件下可與權利要求1的DNA雜交并且編碼一種具有以下特性的p18AβrP蛋白a)由于Aβ而增加表達，b)與Hsp70和/或Tid-1相互作用，和c)抑制細胞分化。
6.一種p18AβrP蛋白，所述p18AβrP蛋白由權利要求4或5的DNA編碼。
7.一種載體，所述載體含有權利要求1、4和5中任一項的DNA。
8.一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子借助權利要求7的載體經(jīng)歷了基因轉(zhuǎn)移。
9.一種篩選細胞死亡促進或抑制物質(zhì)的方法，所述方法包括讓表達p18AβrP的細胞與受試物質(zhì)在存在分化誘導因子的情況下接觸，并且測定細胞死亡的抑制或促進。
10.一種物質(zhì)，所述物質(zhì)與p18AβrP相互作用從而抑制細胞死亡。
11.一種與p18AβrP相互作用從而抑制細胞死亡的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)是通過權利要求9的細胞測定系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的。
12.一種權利要求10或11的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用來抑制細胞死亡。
13.一種cDNA，所述cDNA包含SEQ ID NO5的核苷酸82-1701的堿基序列。
14.一種mRNA，所述mRNA與權利要求13的cDNA互補。
15.一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
16.一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，所述蛋白質(zhì)在權利要求15的蛋白質(zhì)中有一個或多個氨基酸插入、缺失或取代，并且具有與權利要求15的蛋白質(zhì)相似的細胞死亡抑制作用。
17.一種DNA，所述DNA在嚴謹條件下可與權利要求13的DNA雜交，并且編碼一種具有與權利要求15的蛋白質(zhì)相似的細胞死亡抑制作用的蛋白。
18.一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由權利要求16或17的DNA編碼，并且具有與權利要求15的蛋白質(zhì)相似的細胞死亡抑制作用。
19.一種權利要求15的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是p60TRP或具有與p60TRP相似的細胞死亡抑制作用的其變異型蛋白。
20.一種載體，所述載體含有權利要求13、16和17中任一項的DNA。
21.一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子借助權利要求20的載體經(jīng)歷了基因轉(zhuǎn)移。
22.一種用于治療與細胞死亡相關的疾病的藥用組合物，所述藥用組合物含有權利要求10-21中任一項的蛋白質(zhì)、DNA、載體或轉(zhuǎn)化子。
23.一種物質(zhì)，所述物質(zhì)與p18AβrP相互作用從而促進細胞死亡。
24.一種與p18AβrP相互作用從而促進細胞死亡的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)是通過權利要求9的細胞測定系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的。
25.一種權利要求23或24的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過影響p18AβrP與Hsp70和/或Tid-1的相互作用來促進細胞死亡。
26.一種用于治療和/或預防由細胞增殖過多引起的疾病的藥用組合物，所述藥用組合物含有權利要求23-25中任一項的物質(zhì)。
27.一種用于診斷與細胞死亡相關的疾病的方法，所述方法包括測定p18AβrP基因或p18AβrP蛋白在得自受治療者的細胞或組織中的表達水平。
28.一種用于診斷與細胞死亡相關的疾病的試劑盒，其特征在于，測定p18AβrP基因或p18AβrP蛋白在得自受治療者的細胞或組織中的表達水平。
29.一種物質(zhì)，所述物質(zhì)通過與p60TRP相互作用抑制經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號，來增強p60TRP的細胞死亡抑制作用。
30.一種物質(zhì)，所述物質(zhì)通過與p60TRP相互作用抑制對經(jīng)由p18AβrP的細胞死亡信號的抑制作用，來減弱p60TRP的細胞死亡抑制作用。
31.一種權利要求22的藥用組合物，所述藥用組合物還含有權利要求29的增強p60TRP的細胞死亡抑制作用的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供具有促進細胞死亡的新功能的p18AβrP基因及其產(chǎn)物p18AβrP蛋白。本發(fā)明也提供應用這些基因/蛋白的篩選系統(tǒng)、可通過所述篩選系統(tǒng)獲得的細胞死亡促進或抑制物質(zhì)、以及含有所述物質(zhì)、用于治療和/或預防疾病的藥用組合物。
文檔編號C12N1/15GK1507492SQ0380022
公開日2004年6月23日 申請日期2003年3月5日 優(yōu)先權日2002年3月7日
發(fā)明者K·希塞, 山田孝, 永井康雄, 澤田徹, K 希塞, 雄 申請人:株式會社Bf研究所